（生物化学与分子生物学专业论文）人线粒体trnaleuuur基因a3243g点突变的研究.pdf

人线粒体t r n a k “( u u r ) 基因a 3 2 4 3 g 点突变的研究 摘要 f 线粒体是细胞内重要的细胞器，许多重要生化反应都发生在线粒 体内，特别是通过氧化磷酸化作用产生生命活动所需要的a t p 的能量 代谢。它含有自身特有的d n a 基因组，尽管大部分线粒体蛋白由核基 因组编码，线粒体d n a 仅编码1 3 种蛋白质，但这些蛋白质是呼吸链的重 要组成成分，即呼吸链中参与氧化磷酸化的1 3 个酶。线粒体含有2 2 种t r n a ，均由线粒体d n a 编码，与相应氨基酸种类之比基本是1 ：l 。 在线粒体中，目前尚未发现来自胞浆的t r n a ，因此，线粒体中的每一 种t r n a 必需具有正常的生物学活性，否则就会影响线粒体氧化磷酸 化酶的合成导致组织细胞能量代谢的障碍。 近年研究表明，许多线粒体病与线粒体的t r n a 基因突变有关。1 9 9 0 年日本学者首先在线粒体脑肌病伴乳酸性酸中毒及中风样发作综合症 ( m i t o c h o n d r i a le n c e p h a l o m y o p h t h y ，l a c t i ca c i d o s i sa n ds t r o k e l i k ee p i s o d e s s y n d r o m e ，m e l a s ) 病人中发现异质性线粒体t r n a h ( u u r ) 基因n p 3 2 4 3 a g 点突变。随后相继发现该突变也与i i 型糖尿病，神经性耳聋及心肌 病有关。迄今，线粒体t r n a m ( u u r ) 基因n p 3 2 4 3 a g 点突变的致病机 理尚不清楚。然而，原位杂交结果表明，在m e i a s 病人中，线粒体内 t r n a k “( u u r ) 的表达量并没有下降。提示该突变可能影响t r n a l e u ( u u “的 生物学活性。但研究线粒体t r n a 生物学活性的主要难点之一在于缺 乏有效制备一定量的有活性的线粒体氨酰t r n a 合成酶i 本研究的目 的是选择合适的氨酰t r n a 合成酶，用基因克隆和体外转录的方法获得 修饰和未修饰的线粒体t r n a k ”( u u r ) 及其突变体，探讨该突变对线粒体 t r n a k “( u u r ) 生物学活性的影响，为阐明该突变的致病机理提供理论和实 验依据。同时建立一种快速，可靠，灵敏的定性和定量检9 n , 1 方法，为 该突变的临床检测提供方便。 一，催化线粒体t r n a 氨酰化酶的选择 用化学法合成人，水稻和酵母的线粒体t r n a t 7 p 基因并分别克隆到 载体p g e m 一9 z f ( 一) 中。用体外转录方法获得三种线粒体t r n a t w ，分别 用枯草杆菌t r p r s 和鼠肝胞浆t r p r s 测定了它们的氨酰化活性，结果 显示枯草杆菌t r p r s 可催化三种线粒体t r n a 了r p 氨酰化，但三种线粒体 t r n a t w 均不能被鼠肝胞浆t r p r s 识别，这一现象支持了线粒体起源的 内源共生学说，表明原核氨酰t r n a 合成酶可以代替线粒体氨酰t r n a 合成酶催化线粒体t r n a 氨酰化。 二，人线粒体t r n a h ”( u u r ) 及其突变体的基因克隆，表达，纯化和活性比较 化学法合成的人线粒体t r n a k “( u u “) 及其突变体f m t r n a l e u ( u u m ) 基因 ( a 3 2 4 3 g ) 分别连接到载体p g e m 一9 z f ( ) 中，并转化大肠杆菌j m l 0 9 中 得到两个转化体分别为l e u w 和l e u m 。在i p t g 的诱导下，t r n a l “( u u r ) 和m t r n a k “( u u r 的表达量可达总小分子r n a 的1 9 1 0 和1 7 7 6 。经 d e a e s e p h e r o s ec l 4 b 柱层析可使它们的纯度提高3 倍。最后用1 5 的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化分别得到t r n a l 。u ( u u r ) 0 6 m g 和 m t r n a 。“0 5 m g 。用m t r n a 。“( u u r 和t r n a 。”( u u r 分别测定了大肠 杆菌亮氨酰t r n a 合成酶( l e u r s ) 氨酰化反应动力学常数。结果显示， 大肠杆菌l e u r s 对底物m t r n a h ”( u u r 的k c a t k m 值约为t r n a l e ( u u r ) 的1 7 3 ，提示该突变可使t r n a m ( ”“) 的氨基酸接受能力明显下降。 三，人线粒体t r n a k “( u u r ) 及其突变体的体外转录及活性比较 用化学方法合成人线粒体野生型和突变型( a 3 2 4 3 g ) t r n a k “u u 8 基 因，分别克隆到p g e m 9 z f ( 一) 载体中，并在t 7 r n a 聚合酶的体外转录 系统中转录出不含修饰核苷酸的野生型和突变型t r n a k ”( u u r ) ，其转录 产物可达模板量的1 0 0 倍。用野生型和突变型t r n a k ”( u u r 分别测定了 大肠杆菌亮氨酰t r n a 合成酶( l e u r s ) 氨酰化反应动力学常数。结果显 示，l e u r s 对底物m t r n a h “( u u r 的k c a t k m 值约为t r n a m ( u u r 的4 0 ， 提示该突变可使未修饰的t r n a k “( u u r 氨基酸接受能力明显下降。 在体内t r n a 的初始转录物必需剪接，碱基修饰等加工后才形成 成熟的t r n a ，而体外转录产物为未修饰的t r n a 。我们用大肠杆菌表 达及体外转录的m t r n a h “( u u r 和t r n a k ”( u u r l 分别测定了大肠杆菌亮 氨酰t r n a 合成酶( l e u r s ) 氨酰化反应动力学常数。 以大肠杆菌l e u r s 对底物t r n a 的k c a t k m 值表示该t r n a 的氨基酸接受能力，实验结果 显示，大肠杆菌l e u r s 对修饰和未修饰的m t r n a h “( u u r 的k c a t k m 值 约为相应t r n a ( u “对的1 7 3 和4 0 ，提示该突变可使修饰和未修饰的 t r n a k “( u u r 的氨基酸接受能力分别下降8 2 7 和6 0 。这可能是因为： ( 1 ) 该突变点位于t r n a h “u u 8 d h u 环的第一位碱基，资料显示从人到 海胆的该位点碱基非常保守。它与氨基酸接受臂上的t 碱基形成第三 级氢键，对稳定t r n a 的活性构象具有意义。由于突变导致t r n a l e u ( u u r ) 空间构象的改变降低其被l e u r s 识别的能力。( 2 ) 该突变还可能影响 t r n a k “( u u r 的核苷酸修饰模式。由于t r n a l 。“( u u 8 ) 的核苷酸修饰模式的 1 差异可进一步影响l e u r s 对其的识别，使其氨基酸接受能力进一步下 降( 从6 0 到8 2 3 ) 。因此，我们认为该点突变通过改变t r n a h “o “的 空间构象和核苷酸修饰模式两个方面而影响其生物学活性。 四，伴线粒体t r n a h ( u u r 基因a 3 2 4 3 g 点突变糖尿病的p a s a 诊断方 法： 根据等位基因特异性p c r ( p a s a ) 原理，建立由线粒体t r n a “( u u r j 基因a 3 2 4 3 g 点突变引起的糖尿病的基因诊断新方法。设计并合成四 个寡合苷酸引物，引物1 ，引物2 ，引物3 为5 端引物，分别特异性 地对应于突变型t r n a ”“( u u r 基因，野生型t r n a ”“( u u r 基因和线粒体 d n a ( m t d n a ) ，引物4 为共用3 端引物。定性p c r 试验使用引物1 和引物4 ，半定量p c r 试验使用上述四种引物。我们对p c r 反应条件 进行了优化，并对其特异性进行验证。结果显示，选择p c r 退火温度 为5 2 ，引物具有较高的特异性，无交叉反应，最低样品检测量达 o s g l ( 0 0 2 n g d n a ) ，半定量p c r 试验选择2 5 次循环较为理想，1 例糖 尿病伴耳聋的病人的线粒体t r n a ”“( u u r ) 基因突变率为5 1 8 。结论：定 性p c r 试验可用于线粒体t r n a ”“( u u r 基因a 3 2 4 3 g 点突变的检测，半 定量p c r 试验有助于进一步了解该基因的突变程度与临床病情的关 系。、 关键词：人线粒体t r n a h ( u u r l ，突变体，基因克隆，表逮，纯化， 体外转录，活性测定，糖尿病，基因诊断，p a s a ，线粒体 t r n a t m s t u d i e so nh u m a n m i t o c h o n d r i a lt r n a l e u ( 删r ) g e n ea 3 2 4 3 g p o i n tm u t a t i o n a b s t r a c t m i t o c h o n d r i a a r et h e i m p o r t a n to r g a n e l l e i n c e l l m a n yi m p o r t a n t b i o c h e m i c a lr e a c t i o na r et a k ep l a c ei nt h e m ，e s p e c i a l l yp r o d u c e a t p t h r o u g h o x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o n m i t o c h o n d r i ah a v e a s e p a r a t ea u t o n o m o u s 。l y r e p l i c a t i n g d n a g e n o m e a l t h o u g hm o s t o ft h e p r o t e i n sp r e s e n t i nt h e m i t o c h o n d r i o na r ee n c o d e db y n u c l e a r d n a ，a f e wa r ec o d e d b y m i t o c h o n d r i a l ( m t ) d n a a n da r es y n t h e s i z e db yt h es e p a r a t em tt r a n s l a t i o n s y s t e m t h e ya r et h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so fr e s p i r a t o r y c h a i n e n z y m 0 8 t h e r ea r et w e n t y 。t w ot r n a s i nm tt r a n s l a t i o ns y s t e ma n da l la r ee n c o d e db y m t d n a 巨e n o m e ，a l m o s to n e t o o n ec o r r e s p o n d e n c eb e t w e e nt r n a sa n d t h e i r c o g n a t e a m i n oa c i d s n oh u m a nm t r n a sh a v eb e e n s h o w nt ob e i m p o r tf r o mt h ec y t o p l a s m t h u s ，i ti s n e c e s s a r yt h a te a c ho f t h em t r n a s m u s tb ei nn o r m a lb i o l o g i c a lp r o p e r t i e s r e c e n ts t u d i e ss h o wt h a tm a n ym i t o c h o n d r i a ld i s e a s e sa r ea s s o c i a t e dw i t h m t r n a g e n em u t a t i o n s ah e t e r o p l a s m i ca - g t r a n s i t i o na tp o s i t i o n3 2 4 3i n m t r n a t m ( u u r ) g e n ew a si d e n t i f i e d i nm e l a s ( m y o p a t h y , e n c e p h a l o p a t h y , l a c t i ca c i d o s i s ，s t r o k e 1 i k ee p i s o d e ) p a t i e n t s i n19 9 0 a n dr e c e n t l y t h i s m u t a t i o nh a sa l s ob e e n f o u n di n c p e o ( c h r o n i cp r o g r e s s i v e e x t e r n a l o p h t h a l m o p l e g i a ) ，m y o c l o n u s w i t h a t a x i a ，m a t e m a l l y i n h e r i t e d t y p e i i d i a b e t e sm e l l i t u s ，d e a f n e s sa n dc a r d i o m y o p a t h y t h em e c h a n i s m sb yw h i c h t h e3 2 4 3m u t a t i o nw i t h i nm t r n a k “( u “8 ) g e n ec a np r o d u c es u c had i v e r s i t y o fc l i n i c a la n db i o c h e m i c a lp h e n o t y p e s a r en o tu n d e r s t o o d i nm e l a s p a t i e n t ，h o w e v e r ，i n s i t uh y b r i d i z a t i o nd on o ti n d i c a t ea n y d e c r e a s ei nt r n a s 5 y n t h e s i s - s u g g e s t i n gi t i sr e a s o n a b l et oh y p o t h e s i z et h a tt h ed e s c r i b e d p o i n t m u t a t i o nm a y c h a n g e t h e b i o l o g i c a lp r o p e r t i e so f t h em t r n a l e u ( o u r ) b u to n e o ft h ec r i t i c a lp r o b l e m si ns t u d yo f t h e b i o a c t i v i t yo fm i t o c h o n d r i a lt r n ai s t h el a c ko fa na v a i l a b l ew a y f o ro b t a i n i n gs o m eb i o a c t i v ea m i n o a c y lt r n a s y n t h e t a s e t h eg o a lo ft h i sr e s e a r c hp r o j e c ti st o s e l e c tp r o p e ra m i n o a c v l t r n a s y n t h e t a s ea n di n v e s t i g a t et h ee f f e c t so ft h ed e s c r i b e dd o i n tm u t a t i o n 0 1 3t h eb i o a c t i v i t yo ft h em t r n a l e u ( “r ) w i t ht h em e t h o d so f g e n ec l o n i n g a n dt r a n s c r i p t i o n i n v i t r o ，a n dd e v e l o p sar a p i d ，s e n s i t i v em e t h o df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h ed e s c r i b e d p o i n tm u t a t i o n 1 ，s e l e c t i o no f a m i n o a c y l t r n a s y n t h e t a s e c a t a l y z i n g t h e a m i n o a e y l a t i o no fm i t o c h o n d r i a lt r n a m i t o c h o n d r i a lt r n a 耶g e n e sw e r es y n t h e s i z e dc h e m i c a l l ya n dc o n e di n t o p g e m _ 9 z f ( _ ) v e c t o r t h r e em i t o c h o n d r i a l t r n a t 叩sw e r e o b t a i n e db v t r a n s c r i p t i o ni nv i t r o t h ea m i n o a c y l a t i o na c t i v i t i e so f t h e mw e r em e a s u r e d w i t hb s u b t i l i s t r y p t o p h a n y l - t r n as y n t h e t a s ea n dc r u d ea m i n o a c y l t r n a s y n t h e t a s ef r o mt h ec y t o p l a s mo fr a tl i v e rc e l l t h er e s u l t ss h o w e d 也a t t h e b 5 u b t i l i st r y p t o p h a n y l t r n as y n t h e t a s ec o u l dc a t a l y z et h ea m i n o a c y l a t i o n o fa l lt h r e em i t o c h o n d r i a lt r n a t n o s b u tt h et h r e em i t o c h o n 出i a lt r n a 砷s c o u l dn o tb e r e c o g n i z e db yc r u d e a m i n o a c y l t r n as y n t h e t a s ef r o mt h e 。y t 叩l a s m o fr a tl i v e rc e l l t h i s p h e n o m e n o ns u p p o r t e dt h e x e n o g e n o u s h y p o t h e s i s a b o u tt h e o r i g i n o f m i t o c h o n d r i o na n d i n d i c a t e dt h a t p r o k a r y o t i c a m i n o a c y lt r n as y n t h e t a s ec o u l ds u b s t i t u t e m i t o c h o n d r i a l 8 m i n o a c y l t r n a s y n t h e t a s ef o r c a t a l y z i n g t h e a m i n o a c y l a t i o n o f 6 m i t o c h o n d “a l t r n a 2 ，g e n ec l o n i n g ，e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fh u m a nm i t o c h o n d r i a l t r n a 。”( u u r la n di t sm u t a n t g e n e so fh u m a nm i t o c h o n d r i a lt r n a o 。“( u u r a n d i t sm u t a n t ( m t r n a 咖u u 8 1 ) w e r es y n t h e s i z e da n di n s e r t e di n t ot 1 1 ep l a s m i dp g e m 9 z f ( 一) r e s p e c t i v e l y e c o l i j m10 9w a st r a n s f o r m e db yt h er e c o m b i n a n t p l a s m i d sc o n t a i n i n gt h et a r g e tg e n e s t h et r n a 。“( “) a n dm t r n a 。“( “8 ) w e r ee x p r e s s e du pt o1 9 1 0 a n d1 7 7 6 o f t o t a ls m a l lr n a r e s p e c t i v e l y t h e i r p u r i t i e s w e r ee l e v a t e dt h r e et i m e s b yd e a e s e p h e r o s e c l 4 b c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d f i n a l l yr e p u r i f i e db y 15 p a g e u r e a t h e k i n e t i cp a r a m e t e r so fe c o l il e u r sw e r em e a s u r e dw i t hm t r n a l e u ( u u r ) a n d t r n a ( “鼬r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ev a l u eo fk t k mo f e c o l il e u r sf o rm t r n a l 。“( “) w a sa b o u t17 3 o ft h mf o rt r n a t m ( u u r ) a n di n d i c a t e dt h el e u c i n ea c c e p t a b i l i t yo fm t r n a o 。“8 1w a sm u c hl o w e r t h a nt h a to ft r n a o 。u ( u u r ) 3 ，c h a r a t e r i s t i c so fh u m a nm i t o c h o n d r i a it r n a l 。”( u u r ) a n di t sm u t a n t p r o d u c e db yt r a n s c r i p t i o ni nv i t r o t h e w i l d t y p e a n dm u t a n t - t y p eh u m a nm i t o c h o n d r i a l t r n a 。“( “) w e r e s y n t h e s i z e da n dc l o n e di n t op l a s m i dp g e m 一9 z f ( 一) r e s p e c t i v e l y t h eg e n e s w e r et r a n s c r i b e di nv i t r ow i t ht 7r n a p o l y m e r a s e ，a n dt h eu n m o d i f i e d w i l d t y p ea n dm u t a n t t y p eh u m a nm i t o c h o n d r i a lt r n a 。“( u u r ) w e r eo b t a i n e d a sh i g ha s10 0t i m e so ft r a n s c r i p t i o nt e m p l a t e t h ek i n e t i c p a r a m e t e r so f e c o l il e u r sw e r em e a s u r e dw i t ht h eu n m o d i f i e dw i l d t y p ea n dm u t a n t - t y p eh u m a nm i t o c h o n d r i a lt r n a 。“( “8 ) r e s p e c t i v e l yt h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ev a l u eo fk 。k 。o fe c o l il e u r sf o rt h em u t a n t t y p et r n a ( “u 8 w a sa b o u t4 0 o ft h a t f o rt h e w i l d t y p e i n d i c a t e dt h a tt h eh u m a n 7 m i t o c h o n d r i a lt r n a t m ( “8 ) g e n ea 3 2 4 3 gp o i n tm u t a t i o nc a nr e m a r k a b l y a f f e c tt h e b i o a c t i v i t yo f t r n a 。“8 1 i nv i v o ，t h ep r i m a r yt r a n s c r i p t so ft r n a sm u s tb ep r o c e s s e da n dm o d i f i e d b e f o r et h e yb e c o m et h em a t u r ef o r l l l i nv i t r o ，t h e t r a n s c r i p t so f t r n a sb y t 7r n ap o l y m e r a s ea r eu n m o d i f i e d t h ek i n e t i c p a r a m e t e r s o fe c o l i l e u r sw e r em e a s u r e dw i t hm t r n a 。”( u u r ) a n dt r n a 。“( “u r ) o b t a i n e d i n v i v oa n di nv i t r or e s p e c t i v e l y i ft h ea m i n oa c i da c c e p t a b i l i t yo ft r n aw a s i n d i c a t e dw i t ht h ev a l u eo f k c “f k m o f e c o l il e u r sf o ri t t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ea m i n oa c i d a c c e p t a b i l i t y o ft h em o d i f i e d o ru n m o d i f i e d m t r n al e u ( ”u 鼬w a sa b o u t17 3 o r4 0 o ft h a t o fi t s c o u n t e r p a r t t r n al e u ( u u m t h a tm e a n st h ed e s c r i b e d p o i n tm u t a t i o nc a nm a k et h ea m i n o a c i d a c c e p t a b i l i t y o ft h em o d i f i e da n du n m o d f i e dt r n a 。u f u u “1 d e c r e a s e 8 2 3 a n d6 0 r e s p e c t i v e l yt h em u t a n t p o i n tw a sa tt h ef i r s tb a s eo ft h e d i h y d r o u r i d i n el o o pa n di ss t r i c t l yi n v a r i a n tf r o mh u m a n st os e au r c h i n s t h i sb a s ea l s of o r m sa t e r t i a r yh y d r o g e nb o n dw i t ht h etr e s i d u eo fa m i n o a c i d a c c e p t o ra r mp o s i t i o na r o u n dat u r no fl s h a p es t r u c t u r e s oi ti s r e a s o n a b l et h a t a n ys u b s t i t u t i o n a tt h i s p o s i t i o nm a ya f f e c tt h eb i o l o g i c a l f u n c t i o no fm i t o c h o n d r i a lt r n a l e u ( “鼬t h em u t a n tp o i n tm a ya l s oc h a n g e t h e p a t t e r n o fn u c l e o t i d e m o d i f i c a t i o n t h e c h a n g e o ft h e p a t t e r n o f n u c l e o t i d em o d i f i c a t i o nm u s t i n f l u e n c et h e a b i l i t y o ft r n a l e u ( u u r ) r e c o g n i z e db yl e u r s a n df u r t h e rd e c r e a s ei t sa m i n oa c i da c c e p t a b i l i t y ( f r o m 6 0 t o8 2 7 、s ow et h i n ke f f e c t so ft h ea 3 2 4 3 g p o i tm u t a t i o no nt h e b i o a c t i v i t yo f t h em i t o c h o n d r i a lt r n a 。”n “1 m a y b ec a u s e db yt h ec h a n g e o fi t sc o n s t i t u t i o na n dn u c l e o t i d em o d i f i c a t i o n p a t t e m 4 ，t h ee s t a b l i s h m e n to ft h em e t h o df o rt h eg e n e d i a g n o s i so fd i a b e t e s m e l l i t u sa s s o c i a t e dw i t hm i t o c h o n d r i a lt r n a 。“”“8 1 g e n e a 3 2 4 3 g p o i n t m u t a t i o n t od e v e l o pan e wm e t h o db a s e do nt h ep r i n c i p l eo fp c r a m p l i f i c a t i o no f s p e c i f i ca l m e s ( p a s a ) f o r t h eg e n ed i a g n o s i so fd i a b e t e sm e l l i t u sa s s o c i a t e d w i t hm i t o c h o n d r i a l t r n a l 。“( “鼬g e n e a 3 2 4 3 g p o i n t m u t a t i o n f o u r o l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d p r i m e r1 ，p r i m e r2 a n d p r i m e r 3a s5 p r i m e r sw e r e s p e c i f i cf o rm u t a n tt y p et r n a “u 鼬g e n e w i l dt y p et r n a l 。“u mg e n ea n dm i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) p r i m e r4w a s a sac o m m o n 3 p r i m e r q u a l i t a t i v ep c ra s s a yw a s e s t a b l i s h e dw i t hp r i m e r 1a n d p r i m e r4 s e m i q u a n t i t a t i v ep c ra s s a yw a s s e tu pw i t ha l lf o u r p r i m e r s t h er e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d a n dt h es p e c i f i c i t yw a st e s t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r ew a s o p t i m i z e da t5 2 。c t h e p r i m e r s h a d h i g hs p e c i f i c i t y n o c r o s s r e a c t i o nw a sf o u n d t h el o w e s t v o l u m eo fs a m p l e b e i n g t e s t e dr e a c h e dt o 0 5 9 lf 0 0 2 n gd n a ) i nt h e s e m i q u a n t i t a t i v ep c ra s s a y , 2 5c y c l e sw e r es e l e c t e d o n ed i a b e t i cp a t i e n t w i t hd e a f n e s sw a se x a m i n e d t h em u t a t i o nr a t eo f m i t o c h o n d r i a lt r n a l e u ( u u r ) g e n e w a s51 8 c o n c l u s i o n s ：t h e q u a l i t a t i v e p c ra s s a yc a nu s e dt o e x a m i n et h e p r e s e n c eo fm i t o c h o n d r i a l t r n a l 。“”“1 g e n ea 3 2 4 3 gp o i n t m u t a t i o n t h es e m i q u a n t i t a t i v ep c r a s s a yc a nb eu s e dt ol e a mf u r t h e rt h e r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x t e n to f t h em u t a t i o na n dt h ec l i n i c a lp h e n o t y p e k e vw o r d s ：h u m a nm i t o c h o n d r i a lt r n a l 。“( “，t r n a l 。”( “u 鼬m u t a n t ， g e n e c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，t r a n s c r i p t i o n i n v i t r o ，a c t i v i t y m e a s u r e m e n t ，d i a b e t e sm e l l i t u s ，g e n ed i a g n o s i s ，p a s a ，m i t o c h o n d r i a l t r n a 唧 9 人线粒体t r n a h u ( u u r ) 基因a 3 2 4 3 g 点突变的研究 前言 线粒体作为真核细胞的能量代谢中心早已被人们所熟知，但直 到1 9 6 3 年n a s s 在对鸡卵母细胞的研究中才第一次发现其拥有自己 特异的遗传物质一一线粒体d n a 。同年，s c h a t z 在纯化的酵母线粒 体中分离到完整的m t d n a ，进一步证实了m t d n a 的存在。1 9 8 1 年， a n d e r s o n 等人对人线粒体d n a 进行了全顺序测定。目前的研究表 明人线粒体d n a 是一条全长为1 6 5 6 9 b p 的双链闭环分子( 附图) 。一 条为重链( h 链) ，另一条为轻链( l 链) ，两条链均有编码功能，共编 码1 6 s ，1 2 s2 个r r n a ，2 2 个线粒体蛋白质装配必需的t r n a ，和 1 3 条与细胞氧化磷酸化有关的多肽链( n a d h 一辅酶q 还原酶中的7 个亚单位：n d i ，2 ，3 ，4 l ，4 ，5 ，6 ；泛酿一细胞色素c 还原酶 复合物中的细胞色素b ；细胞色素c 氧化酶复合物中的3 个亚单位 c o i ，c o i i 和c oi i i 以及a t p 合成酶中的亚单位6 和8 ) 。其中，t r n a 的基因作为间隔( s p a c e r ) 分开各蛋白质和r r n a 的基因。这些多肽链 与核基因编码的其它亚单位一起组成呼吸链。 m t d n a 利用不同的起始点和启动子分别复制和转录h 链和l 链。复制起始点o h 和o l 相距l 3 个分子，而转录启动子p h 和 p l 则都位于o h 处。此处是m t d n a 中唯一的1 0 0 0 b p 不编码控制区， 其中包括d 环区。m t d n a 的h 链和l 链分别转录成两个巨大的全 长前体r n a ，经加工后h 链形成所有的r r n a 和m r n a 分子以及 大部分t r n a 分子，l 链形成其余的8 个t r n a 分子。与核d n a 相 比，m t d n a 有其独特的遗传学特征1 2 ， 4 】： ( 1 ) m t d n a 存在于细胞质中，所以其遗传方式为母系遗传，父系 从不将其m t d n a 传递给后代，因此父母系的线粒体很少混合而且 也未检测到不同m t d n a 品系之间的重组。在生殖细胞中的突变能 引起母系家族性的疾病，而发生在发育过程中或体细胞中的突变则 会引起散发性的疾病和与年龄有关的氧化磷酸化活性的降低。 ( 2 ) 一般每个细胞含