（法医学专业论文）六个ministr基因座群体遗传学研究.pdf

中文摘要六个m i n i s t r 基因座群体遗传学研究摘要目的：短串联重复序y l j ( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) 遗传标记系统，由于在人类基因组中分布广泛，具有高度的遗传多态性以及简单快捷的检测方法，已成为法医物证鉴定的主流技术。然而，在法医学实践中经常会面临高度降解的检材，如使用商品化s t r 试剂盒进行扩增，片段较大的s t r 基因座往往无法得到正确的分型或是分型失败。m i n i s t r 基因座分析技术即是在设计引物时，使其尽可能靠近核心重复序列从而缩短扩增片段长度，以提高检测的灵敏度及降解片段的检出率。m i n i s t r 基因座已被欧洲d n a 分型工作组( t h ee u r o p e a nd n ap r o f i l i n gg r o u p ，e d n a p ) 定义为继s t r 之后的新一代遗传标记，2 0 0 6 年美国a b 公司已经研制开发了m i n i f i l e r 试剂盒。m i n i s t r ，m i n i x s t r ，m i n i v s t r 的研究己显示了其在法医学领域的重要价值。m i n i s t r 应用于法医学时，进行准确、快速、方便的分型检测显得至关重要，因此对其分型结果的准确性、公正性和可靠性提出了更高的要求。而等位基因分型标准物( a l l e l i cl a d d e r , 简称a l ) 的制备又是实现基因座准确分型命名的关键。只有具备了一套精确的、国际标准化命名的分型标准物，才有可能对m i n i s t r 分型结果做出正确判型和命名，才有可能在各国、各实验室之间实现m i n i s t r分型的可比性。为研究更多的m i n i s t r 基因座用于法医学鉴定，解决一些疑难检材的d n a 分型，本课题拟采用分子克隆技术制备六个m i n i s t r 基因座d 1 0 s 1 2 4 8 、d 2 s 4 4 1 、d 1 s 1 6 7 7 、中文摘要d 9 s 1 1 2 2 、d 1 0 s 1 4 3 5 矛i d l 7 s 1 3 0 1 等位基因分型标准物，解决m i n i s t r 分型的准确性和标准化问题，并应用于湖南汉族群体遗传学研究中，探讨该方法制备的等位基因分型标准物在法庭科学实践中的应用价值。方法：采用c h e l e x 1 0 0 法提取1 5 5 份湖南汉族无关健康个体全血基因组d n a 。采用p c r 扩增，1 0 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，银染显色，在所选样本中筛选、分离六个m i n i s t r 基因座所有目的等位基因，用p r o m e g a 公司凝胶回收试剂盒纯化后，将其分别插入到p g e m t 载体中，转染d h 5 a 1 m 感受态大肠杆菌，扩大培养，4 琼脂糖凝胶电泳初步筛选阳性克隆，测序证实连接正确目的等位基因的核心序列结构和重复次数，并按照国际法庭血液遗传学学会( i n t e m a t i o n a ls o c i e t yo ff o r e n s i ch a e m o g e n e t i c s ，i s f h ) 推荐的命名原则对各等位基因命名；提取重组质粒，以其为模板进行p c r 扩增，根据琼脂糖检测的显色强度或g e n e q u a n t微量蛋白核酸检测仪对扩增产物的定量结果，调整各成分的比例，使峰高尽可能达到平衡，混合各等位基因p c r 扩增产物，即获得各m i n i s t r 基因座的等位基因分型标准物。应用自制m i n i s t r 基因座等位基因分型标准物进行所选样本的群体遗传学研究：将基因座d 1 0 s 1 2 4 8 和d 1 7 s 1 3 0 1上游引物5 端用6 - f a m 荧光标记，基因座d 2 s 4 4 1 和d 9 s 11 2 2 上游引物5 端用h e x 荧光标记，基因座d 1 s 1 6 7 7和d 1 0 s 1 4 3 5 上游引物5 端用t a m r a 荧光标记，进行p c r扩增，扩增产物与自制等位基因标准分型标准物在a b ip r i s m3 1 0 基因分析仪上同步电泳，结果用g e n e m a p p e r3 2分析扩增产物片段相对大小并进行样本基因分型。利用统计中文摘要遗传学研究，发现该六个m i n i s t r 基因座具有中高度遗传多态性，可用于法医学个人识别和亲权鉴定，并在高度降解检材的检测中具有较高的应用价值。关键词：分子克隆技术；等位基因分型标准物；m i n i s t r ；d n a 分型英文摘要i n v e s t i g a t i o no ft h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s mo ft h es i xm i n i s t rl o c ii nh u n a nh a np o p u l a t i o n sa b s t r a c to b j e c t i v e ：s h o r tt a n d e mr e p e a t ( s t r ) g e n e t i cm a r k e rs y s t e m ，w h i c hi sw i d e l yd i s t r i b u t e di nh u m a ng e n o m ea n dh a sh i g hg e n e t i cp o l y m o r p h i s ma n dt h ef a s tt e s tm e a n s h a sb e c a m et h em a i n s t r e a mt e c h n o l o g yi nf o r e n s i ci d e n t i f i c a t i o np r a c t i c e h o w e v e r , i nm a n yo t h e rf o r e n s i cc a s e s ，d n as a m p l e sa r eh i g h l yd e g r a d e df o rm a n yr e a s o n s ，al o s so fs i g n a li st y p i c a l l yo b s e r v e dw i t hl a r g e r - s i z e ds t rp r o d u c t sa n di ti sd i f f i c u l tt oh a v eac o m p l e t eg e n o t y p ew h e nu s i n gc u r r e n tc o m m e r c i a l l yc o n v e n t i o n a lm u l t i p l e xs t rk i t s m i n i s t rt e c h n o l o g yc o u l dr e d u c et h es i z eo fp c rp r o d u c t sb ym o v i n gt h ep r i m e r sa sc l o s ea sp o s s i b l et ot h es t rr e p e a tr e g i o n s om i n i s t rt e c h o n o l o g yw a sa p p l i e dt oe x a m i n eh i g h l yd e g r a d e dd n as a m p l e sa n ds h o w e dh i g h e rs u c c e s s f u lr a t et h a nc o m m o ns t rt e c h o n o l g y m i n i s t rl o c ia r ed e f i n e da san e wg e n e r a t i o no fg e n e t i cm a r k e rf o l l o w i n gs t rb ye u r o p e a nd n ap r o f i l i n gg r o u p ( e d n a p ) i n2 0 0 6 ，t h ec o r p o r a t i o no fa p p l i e db i o s y s t e m sd e v e l o p e dac o m m e r c i a lm i n i s t rk i tn a m e dm i n i f i l e rc o n s i s to fe i g h tc o d i sl o c iw i t hs h o r t e rp c rp r o d u c t s m a n ys t u d i e sa b o u tm i n i s t r ，m i n i x - s t ra n dm i n i y - s t rh a v es h o w ni t sv a l u ei nt h ef i e l d so ff o r e n s i cs c i e n c e w h e na p p l i e dt of o r e n s i cs c i e n c e ，a c c u r a t e ，r a p i da n dc o n v e n i e n tt y p i n gd e t e c t i o ni sc r u c i a l t o英文摘要c o n f i r mt h ea c c u r a c yo fd n at y p i n g c o n s t r u c t i n gas t a n d a r da l l e l i cl a d d e r ( a l ) i si m p o r t a n t o n l yw h e nw eh a v eas e to fp r e c i s ea l l e l i cl a d d e rs y s t e m ，w h i c hw a sn a m e db yi n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d ，i tw o u l db ep o s s i b l et om a k ear i g h tt y p i n ga n dc h a n g ed a t ab e t w e e nd i f f e r e n tl a b si nt h ew o r l d t h e r e f o r e t oe x p l o r em o r em i n i s t rt y p i n gs y s t e r m st ob eu s e di nt h ed e t e c t i o no fh i g h l yd e g r a d e ds a m p l e s ，i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ec o n s t r u c t e dt h es t a n d a r da lf o rd 1 0 s 1 2 4 8 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 11 2 2 d 1 0 s 1 4 3 5a n dd 1 7 s 1 3 0 1s i xm i n i s t rl o c ib ym o l e c u l a rc l o n i n gt e c h n o l o g y , a n di n v e s t i g a t et h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s mo ft h es i xm i n i s t rl o c i i nt h eh a np o p u l a t i o ni nh u n a np r o v i n c ea n de v a l u a t e dt h ev a l u eo fc o n s t r u c t i n ga l l e l i cl a d d e ri nt h ec o u r tp r a c t i c e m e t h o d s ：g e n o m ed n as a m p l e sw e r ee x t r a c t e df r o mw h o l eb l o o do f15 5u n r e l a t e dh e a l t h yi n d i v i d u a l so ft h eh u n a nh a np o p u l a t i o nb yu s i n gc h e l e x10 0 a f t e rb e i n ga m p l i f i e db yp c r ，d i f f e r e n tm i n i s t ra l l e l i cf r a g m e n t sw e r ei s o l a t e df r o mt h e1o d e n a t u r i n gp a g ee l e c t r o p h o r e s i sa n ds l i v e rs t a i n i n g t h em i n i s t ra l l e l i cf r a g m e n t sw e r ec u tf r o mt h eg e la n dr e c y c l e db yw i z a r ds vg e la n dp c rc l e a nu ps y s t e ma n dt h e nw e r eb l u n t - e n ds u b c l o n e di n d i v i d u a l l yi n t ot h el a g e m tp l a s m i dv e c t o r s n e x tt h ep g e m 。tp l a s m i dv e c t o r sw e r et r a n s f e c t e di n t oc o m p e t e n te c o l id h 5 t xc e l l s w h i c hw e r ec u l t i v a t e do ns e l e c t i v em e d i a p o s i t i v ec l o n e sw e r es e l e c t e db y4 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h e nt h es i z ea n ds t r u c t u r eo ft h ei n s e r t sw e r ec o n f i r m e db yd n as e q u e n c i n g e a c ha l l e l e6英文摘要w a sn a m e da c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l er e c o m m e n d e db yi s f h t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sd n aw i t ht h ei n s e r t sw e r et h e nu s e da st e m p l a t ef o rr e a m p l i f i c a t i o n a d j u s t i n gt h ep r o p o r t i o no fe a c hc o m p o n e n ti na c c o r d a n c ew i t hb a n di n t e n s i t yo rq u a n t i t a t i v er e s u l t s ，t h ep e a kh e i g h to fa l la l l e l e sw a sm a d et ob ea p p r o x i m a t e l ye q u a l t h e nt h ep c rp r o d u c t so fa l la l l e l e sw e r em i x e dt og e n e r a t et h es t a n d a r da l l e l i cl a d d e rf o re a c hl o c u s u s i n gt h e s ea l ，t h eg e n e t i cp o l y m o r p h i s m so fs i xm i n i s t rl o c ii nh u n a nh a np o p u l a t i o nw e r es t u d i e d f o r w a r dp r i m e r so fd 1 0 s 1 2 4 8a n dd 1 7 s 1 3 0 1w e r ef l u o r e s c e n t l yl a b e l e db y6 - f a mi n5 e n d ，d 2 s 4 41a n dd 9 s112 2l a b e l e db yh e xi n5 e n d d 1 s 1 6 7 7a n dd 1 0 s 1 4 3 5l a b e l e db yt a m r ai n5 e n d t h e yw e r ea m p lif i e dt h e nb o t ht h ep r o d u c t sa n dt h ea l l e l i cl a d d e rw e r ea n a l y z e do nt h ea b ip r i s m310g e n e t i ca n a l y z e r t h ed a t aw a sc o l l e c t e db y310d a t ac o l l e c t i o ns o f t w a r ea n da n a l y z e db yg e n e m a p p e r3 2s o f t w a r e t h ea l l e l ef r e q u e n c ya n dg e n e t i cp a r a m e t e r sw e r ec a l c u l a t e du s i n gp o w e r s t a t s v1 2a n dg e n a l e x 6s o f t w a r e r e s u l t s ：s t a n d a r da l l e l i cl a d d e ro fs i xm i n i s t rw e r ec o n s t r u c t e db yt e c h n o l o g yo fm o l e c u l a rc l o n i n g 9 ，7 ，7 ，6 ，7a n d8a l l e l e sw e r er e s p e c t i v e l yd e t e c t e di nt h es i xm i n i s t rl o c id 1 0 s 1 2 4 8 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 11 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5a n dd 17 s13 01 t h es e q u e n c i n gr e s u l t sc o n f i r m e dt h a tt h es i z ea n dt h er e p e a tu n i to ft h e s i xl o c iw e r er e s p e c t i v e l y g g a a ， t c t a ， g g a a ，【t a g a ， t a t c 】a n d【a g a t i n v e s t i g a t i o no fp o p u l a t i o ng e n e t i c ss h o w e dt h a t9 ，7 ，7 ，6 ，77英文摘要a n d8a l l e l e sa n d2 1 ，1 8 ，1 5 ，1 5 ，2 2a n d2 0g e n o t y p e sw e r er e s p e c t i v e l yd e t e c t e di n15 5u n r e l a t e dh e a l t h yi n d i v i d u a l s n od e v i a t i o nf r o mh a r d y w e i n b e r ge q u il i b r i u mw a so b s e r v e di nt h es i xl o c i t h eh e t e r o z y g o t eo b s e r v e d ( h o ) w e r er e s p e c t i v e l yo 7 2 9 ，o 7 3 5 ，0 6 6 5 ，0 7 8 7 ，o 6 7 7a n do 6 71 ；a n dp o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o m p o n e n t ( p i c ) w e r er e s p e c t i v e l yo 6 9 9 ，o 7 1 6 ，0 5 9 1 ，0 6 9 8 ，0 7 5 2a n d0 6 6 3f o rd 1 0 s 1 2 4 8 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 11 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5a n dd 1 7 s 1 3 0 1 t h ep o w e ro fe x c l u s i o n ( p e ) w e r e0 4 7 5 ，0 7 3 5 ，o 3 7 6 ，o 5 7 5 ，o 3 8 4a n do 3 8 5 ；a n dt h ep o w e ro fd i s c r i m i n a t i o n ( d p ) w e r e0 8 8 8 ，0 8 8 9 ，o 814 ，0 8 7 5 ，0 9 21a n do 8 6 9r e s p e c t i v e l y t h ea c c u m u l a t e dp o w e ro fe x c l u s i o na n dp o w e ro fd i s c r i m i n a t i o no ft h es i xm i n i s t rl o c iw e r er e s p e c t i v e l yo 9 8a n d0 9 9 9 9 9 7 c o n c l u s i o n s ：u s i n gm o l e c u l a rc l o n i n gt e c h n o l o g y , w ec o n s t r u c t e ds i xs e t so fa l l e l i cl a d d e rf o rs i xm i n i s t rl o c ii n c l u d i n gd 1 0 s 1 2 4 8 ，d 2 s 4 4 1 ，d 1 s 1 6 7 7 ，d 9 s 11 2 2 ，d 1 0 s 1 4 3 5a n dd 1 7 s 1 3 0 1 ，e a c hc o n t a i n s9 ，7 ，7 ，6 ，7a n d8a l l e l e sr e s p e c t i v e l y t h e s es e t so fa l l e l i cl a d d e ra r et h ek e yc o m p o n e n to fm i n i s t rt y p i n gs y s t e r m t h ei n v e s t i g a t i o no fp o p u l a t i o ng e n e t i c su s i n gt h e s el a d d e r ss h o w e dt h a tt h es i xm i n i s t rl o c ih a v eh i g hg e n e t i cp o l y m o r p h i s m ，w h i c hc o u l db eu s e df o rp e r s o n a li n d e n t i f i c a t i o na n dp a t e r n i t yt e s t i n gi n f o r e n s i cm e d i c i n e ，e s p e c i a l l yb ev a l u a b l ef o rt h ed n at y p i n go fh i g h l yd e g r a d e ds a m p l e s k e yw o r d s ：m o l e c u l a rc l o n i n g ；a 1 m i cl a d d e r ；m i n i s t r ；英文摘要d n ap r o f i li n g9河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。一虢榷翮虢譬薹共施一章圈砷年岁月28 日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。i研究生签名：德导师签章：尽参驮、砷年5 月坶日研究论文六个m i n i s t r 基因座群体遗传学研究上-jl-莉再9 0 年代初s t r 基因座多态性的发现，为d n a 检验技术向高通量、自动化、标准化方向发展奠定了理论基础，复合p c r 技术检测多个s t r 基因座，可获得较高概率的认定结论，实现了从否定到高概率肯定的飞跃，目前已能满足大部分法医个人识别和亲子鉴定的需求。但对于法医实践中一些高度降解的检材，应用常规s t r 技术及现有商品化试剂盒常常得不到完整分型或分型失败【1 1 。小片段d n a 分析技术( 即m i n i s t r 技术) 就是通过将s t r 遗传标记引物设计得尽可能接近重复区域而缩短p c r 扩增产物片段长度，以提高高度降解检材的d n a 分型成功率。继c o b l e 和b u t l e r 2 1首次于2 0 0 5 年报道了6 个c o d i s 系统以外的m i n i s t r 基因座以来，日本、西班牙 3 , 4 1 等越来越多的国家都投身于m i n i s t r 基因座的研究中。我国目前此类研究和应用还为数不多，要建立适合我国人群的m i n i s t r 检测体系，首先应实现d n a 分型技术的标准化，制备精确且国际化命名的等位基因分型标准物( a l l e l i cl a d d e r ，简称a l ) 对m i n i s t r 分型结果进行正确的判型和命名，然后再进行群体遗传学研究。因此，等位基因分型标准物的构建是非常重要的基础工作。目前国内学者大多采用混合不同基因型的模板d n a 或p c r 产物，二次p c r 扩增产物作a l 用。但这种由实验室自行制备的a l 没有经过测序并按照国际统一标准命名，不能解决实验室间的统一标准化问题。本研究采用分子克隆技研究论文术制备d 1 0 s 1 2 4 8 、d 2 s 4 4 l 、d 1 s 1 6 7 7 、d 9 s 1 1 2 2 、d 1 0 s 1 4 3 5和d 1 7 s 1 3 0 1 六个m i n i s t r 基因座等位基因分型标准物，具有永久的同一性，无限的可繁殖性，既可大量地生产，又具有国际统一标准命名，还可解决m i n i s t r d n a 分型的标准化问题。应用自制的等位基因分型标准物进行了群体遗传学的研究，作为中国汉族数据库的必要补充。材料与方法1 材料1 1 主要仪器8 0 m d f 3 8 2 e 型超低温冰箱微量移液器t g l 16 g 台式高速离心机3 k1 8 型低温超速离心机t d a 8 0 0 2 型电热恒温水浴箱 i t s 3 0 2 0 型高压消毒锅x w - 8 0 a 旋涡混合器7 9 1 磁力加热搅拌器l i b 1 0 0 恒温加热模块n d 1 0 0 微量蛋白核酸检测仪d y v i i i 垂直电泳槽d y v i i i 水平电泳槽d y v i i i 稳压稳流电泳仪v s 1 3 0 0 l u 超净工作台s p x 1 6 0 1 3 生化培养箱日本s a n y o 公司法国g i l s o n 公司上海医用分析仪器厂美国s i g m a 公司天津市泰斯特仪器有限公司日本s a n y o 公司上海医科大学仪器厂上海浦东物理光学仪厂杭州博日科技有限公司基因有限公司北京六一仪器厂北京六一仪器厂北京六一仪器厂苏州安泰空气技术有限公司上海福马试验设备有限公司研究论文荧光一紫外分析仪s p h 11 0 2 c 恒温培养振荡器m i l l i qs y n t h e s i s 超纯水仪p t c 2 0 0p c r 扩增仪a b ip 刚s m3 1 0 基因分析仪g e n e m a p p e r3 2 软件1 2 主要试剂c h e l e x1 0 0蛋白酶k引物d n t p10 x p c r 反应缓冲液m g c l 2t a q d n a 聚合酶t 4d n a 连接酶溴化乙锭e b溴酚兰大肠杆菌d h 5 a质粒p g e m tv e c t o r琼脂糖a g a r o s e胰化蛋白胨t r y p t o n e酵母提取物y e a s te x r t a c tw i z a r dp c r 产物纯化试剂盒d p 10 3 质粒小提试剂盒t r i s 碱( 三羟甲基胺基甲烷)e d t a ( 乙- - 胺四乙酸二钠)北京六一仪器厂上海世平实验设备有限公司美国密理博公司美国m j 公司美国a b 公司美国a b 公司美国s i g m a 公司美国p r o m e g a 公司上海生工生物工程技术有限公司上海生工生物工程技术有限公司上海生工生物工程技术有限公司上海生工生物工程技术有限公司上海生工生物工程技术有限公司美国p r o m e g a 公司美国p r o m e g a 公司美国a m r e s c o 公司河北医科大学微生物教研室惠赠美国p r o m e g a 公司美国a m r e s c o 公司o x o i d 公司o x o i d 公司美国p r o m e g a 公司t i a n g e n 生化科技有限公司北京化学试剂公司天津化学试剂一厂研究论文氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p )河北医科大学微生物教研室惠赠2 0 b pd n al a d d e rm a r k e r宝生物工程有限公司去离子甲酰胺美国a b 公司g s 5 0 0 l i z美国a b 公司电极缓冲液美国a b 公司p o p 4 液体胶美国a b 公司1 3 主要试剂的制备1 3 1d n a 提取主要试剂5 c h e l e x 一1 0 0 储备液：c h e l e x 1 0 0 颗粒5 9 ，灭菌去离子1 0 0 m l ，1 mn a o h 调p h 值至9 - 11 。1 3 2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂1 0 变性聚丙烯酰胺凝胶：3 0 a p l o m l ，5 x t b e3 m l ，1 0 a p s3 5 0 9 l ，t e m e d1 6 9 l ，尿素7 。2 9 ，灭菌去离子水定容至3 0 m l 。2 x s t r 变性上样缓冲液：1 mn a o h1 0 0 1 t l ，9 5 甲酰胺9 5m l ，溴酚兰5 m g ，二甲苯兰5 m g ，灭菌去离子水定容至1 0 m l 。电泳缓冲液5 x t b e ：t r i s 碱5 4 9 ，硼酸2 7 5 9 ，o 5 me d t a2 0 m l ，灭菌去离子水定容至10 0 0 m l 。1 3 3 琼脂糖凝胶电泳试剂4 琼脂糖凝胶：琼脂糖粉4 9 ，e b5 “l ，1x t b e 定容至l o o m l 。1 3 4 细菌培养基及相关试剂2 y t 液体培养基：胰化蛋白胨1 6 9 ，酵母提取物1 o g ，n a c lo 5 9 ，溶于9 5 m l 蒸馏水中，1 mn a o h 调p h 至7 2 ，加水定容至1 0 0 m l ，高压灭菌。2 y t 固体培养基：l o o m l2 y t 液体培养基中加入2 9 琼脂粉，研究论文1 mn a o h 调p h 至7 2 ，高压灭菌。o 1 m c a c l 2 ：无水c a c l 2o 5 5 9 ，灭菌去离子水4 5 m l ，充分溶解后定容至1 0 0 m l ，用0 2 2 t m 滤器过滤除菌后，分装2 0 。c 保存。氨苄青霉素：称取2 9 氨苄青霉素溶于2 0 m l 生理盐水中，配制成储存液( 浓度为10 0 m g m 1 ) ，经过0 2 2 1 t m 滤器过滤除菌后，分装2 0 。c 保存。1 4 样本来源枸橼酸钠抗凝血( 由株洲市第一医院提供) 采自湖南无血缘关系汉族健康个体，f t a 卡常温保存。2 实验方法2 1 样本d n a 的提取中国湖南汉族无关健康个体f t a 卡血样采用5 c h e l e x 1 0 0 法【5 】提取：用干净的眼科剪从血痕中间位置剪出3 m m x 3 m m 大小的血痕，放于1 5 m le p 管中( 眼科剪用7 5 酒精浸泡擦干) ；向装有检材的e p 管中加入5 0 0 9 l 高温灭菌水，盖好管盖震荡混匀，室温2 5 静置2 0 分钟( 期间每隔2 3 分钟上下颠倒一次) ，5 6 水浴加热1 0 分钟；振荡混匀，1 3 0 0 0 转分，离心3 分钟；弃去上清液( 约4 5 0 4 6 0 9 1 ) ，留3 0 5 0 9 l 覆盖住沉淀即可；加入1 0 0 t l5 c h e l e x 1 0 0 溶液，加入时要不断振荡以使c h e l e x 1 0 0 颗粒加入量均匀；5 6 水浴加热3 0 分钟，振1 0 秒；1 0 0 水浴加热1 0 分钟，振1 0 秒；1 3 0 0 0 转分，离心3 分钟；仔细吸取8 0 9 l 上清液并转移到相应编号的新e p 管中。2 2 引物按照如下原则，选择基因座：研究论文( 1 ) 目前商品化荧光标记毛细管电泳激光自动分析试剂盒以外的并且与之无连锁关系的基因座；( 2 ) 基因座扩增片段长度 1 2 5 b p ，简单重复；( 3 ) 引物之间特别是3 端不出现互补序列；根据上述要求及参照文献【6 7 】选择并获得d 1 0 s 1 2 4 8 、d 2 s 4 4 1 、d 1 s 1 6 7 7 、d 9 s 11 2 2 、d 1 0 s 1 4 3 5 和d 1 7 s 1 3 0 1 六个m i n i s t r 基因座及其引物序列，各基因座相关信息见t a b l e l 2 。每个m i n i s t r 基因座分别合成普通无荧光标记和荧光标记两套引物。基因座d 1 0 s 1 2 4 8 和d 1 7 s 1 3 0 1 上游引物5 端用6 - f a m ( 羧基荧光素，蓝色) 荧光标记；基因座d 2 s 4 4 1 和d 9 s 1 1 2 2 上游引物5 端用h e x ( 六氯荧光素，绿色) 荧光标记；基因座d 1 s 1 6 7 7 和d 1 0 s 1 4 3 5 上游引物5 端用t a m r a ( 羧基四甲基罗丹明，黄色) 荧光标记。六个基因座的下游引物5 端均加一个鸟嘌呤修饰。以上引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。2 3d n a 完整性测定采用琼脂糖凝胶电泳法。取2 9 ld n a 样品，加0 4 9 l上样缓冲液，混匀后加样于含o 1 5 p l m l 溴化乙锭的2 琼脂糖凝胶内电泳，电泳缓冲液为l x t b e ，1 0 0 v 恒压电泳3 0分钟后，紫外灯下观察。2 4d n a 含量测定采用g e n e q l u a n t 微量蛋白核酸检测仪准确定量d n a 样本。2 “l 无菌去离子水进行初始化，数值o ，进行空白对照后，取2 p ld n a 样本置于分析仪点样孔，即可得到各样本精确浓度。2 5 六个m i n i s t r 基因座等位基因分型标准物的制备研究论文2 5 1 目的等位基因的制备2 5 1 1p c r 反应扩增目的等位基因参照文献f 8 】的方法略加改动。2 0 p l 反应体系内含10 x p c r 缓冲液2 0 p l ，2 5 m m o l lm g c l 2 1 0 9 l ，10 m m o l ld n t p s ( d a t p ，d c t p ，d g t p ，d t t p ) o 4 1 a l ，5 0 p m o l l 各基因座上、下游引物( 无荧光标记) 均为0 4 9 l ，1 u p lt a q 聚合酶1 o p l ，浓度为l 1 0 n g p l 的模板d n a2 0 1 2 1 ，超纯水1 2 8 9 l 。样品混合后在p t c 2 0 0 热循环仪上进行p c r 扩增。热循环参数：9 4 预变性3 分钟，9 4 变性3 0 秒，5 5 退火3 0 秒，7 2 延伸3 0 秒，3 0 个循环，最后6 0 延伸4 5分钟，4 保存备检。2 5 1 2p c r 产物的分离1 0 变性聚丙烯酰胺凝胶( p a g e 、) 垂直板电泳，恒压2 0 0 v ，3 小时3 0 分钟。同时加样2 9 l2 0 b pd n am a r k e r 作为分子量标记。硝酸银染色，显色液( 含n a o h2 0 9 l ) 显色后1 9 , 1 0 1 ，根据分子量标准确定的片段范围内，不同d n a 样本p c r 产物的泳动距离不同，筛选出各m i n i s t r 基因座所有泳动距离有明显差异且条带清晰规整，无非特异性杂带的等位基因。银染显色详见附录1 。2 5 1 3p c r 产物的回收从聚丙烯酰胺凝胶中回收目的等位基因片段，参考文献并加以改进 1 l , 1 2 ：在凝胶尚未完全干燥时用手术刀片切取目的d n a 条带，加l o o p l 双蒸水洗涤，旋即离心并吸去双蒸水，再加3 0 5 0 p l 双蒸水，并用枪头尖将凝胶碾碎，浸泡1 0 分钟以上，短暂离心后取上清液1 9 l 作为再次p c r 扩增的模板。研究论文2 5 1 4 等位基因的再扩增、纯化及鉴定以上述回收的d n a 片段为模板，每个片段扩增1 0 0 9 l ，p c r 扩增反应体系及热循环参数见2 5 1 1 。取9 0 1 a l 扩增产物进行4 琼脂糖凝胶电泳( 剩余1 0 t l 备用) ，采用p r o m e g a公司胶回收试剂盒回收p c r 产物( 附录2 ) 。取2 肛l 回收纯化的产物与剩余的10 i t lp c r 扩增产物同步进行4 琼脂糖凝胶电泳，比对鉴定，凡与原p c r 产物位于同一水平且无非特异性扩增带的片段认为是正确的凝胶回收产物。2 5 2 目的等位基因的克隆2 5 2 1 已纯化的等位基因扩增产物与p g e m t 载体连接【1 3 】取3 a l 纯化后的p c r 产物进行连接反应( 采用p r o m e g a公司p g e m tv e c t o rs y s t e mi 试剂盒) 。连接反应中插入片段与载体片段的摩尔数之比为3 ：l 4 ：1 。反应混合物置1 6 1 2 1 6 小时。具体连接反应体系见表t a b l e3 。2 。5 2 2 氯化钙法感受态e c o l id h 5 a 的制备【1 4 】：取7 0 保存的e c o l id h 5 a 菌株，于2 y t 平板上划线接种，3 7 过夜培养。挑取直径2 3 m m 单菌落，接种于3 m l无抗生素2 y t 液体培养基，3 7 振荡( 2 0 0 转分) 过夜培养。取过夜培养菌液6 0 9 l 转种到3 m l2 y t 液体培养基中( 接种比例为1 ：5 0 ) ，3 7 。c 振荡( 2 0 0 转分) 培养3 小时至o d 6 0 0 约0 2 0 4 之间。每3 m l 菌液分装2 个e p p e n d o r f 管，4 4 0 0 0转分，离心1 0 分钟，弃上清，收集菌体，重悬于新鲜配制冰预冷的0 1 m c a c l 2 3 0 0 9 l 管，冰浴静置l 小时后，4 。c4 0 0 0转分，离心1 0 分钟，弃上清，收集菌体，加0 1 mc a c l 21 2 0 t l ，用于转化。2 5 2 3 连接产物转化感受态菌【14 】研究论文取2 5 2 1 连接好的质粒1 0 “l 加入1 2 0 p ld h 5 0 t 感受态大肠杆菌中，冰浴3 0 分钟，4 2 热休克9 0 秒，迅速冰浴2 分钟，加入8 8 0 p , 1 无抗生素2 y t 液体培养基，3 7 振荡培养4 5 分钟，4 0 0 0 转分，离心4 分钟，吸去8 5 0 1 a l 上清，其余部分吹打混匀后均匀涂布于含l o o p g m la m p i c i l l i n 的2 y t 固体培养基上，室温放置2 0 分钟，待液体吸干后，3 7 倒置培养1 2 1 6 小时，初步筛选阳性克隆。同时设立阳性克隆和阴性克隆对照：阳性对照是对质粒是否有活性的检测，在连接反应的体系中不加目的等位基因片段；阴性对照是检测感受态大肠杆菌是否污染，将4 0 p ld h 5 0 t 感受态大肠杆菌直接涂布于2 y t 培养基，不加连接产物。2 5 - 3 阳性克隆的筛选用灭菌牙签从转化平皿中挑取单个、边缘光滑的阳性菌落接种于