（动物学专业论文）原羚属及羚羊亚科属间系统发育关系研究.pdf

浙江大学硕上学位论文 a n t i l o p i n a e e x c e p tf o r t h e4 以，f ，。p 8a n dt h e g a 三p ? 拙，t h e c o m p o n e m ( 萋出垂馨鹫写妾 鬻i l ! 重堇科强垂霄”荤耄l 缓尹毒羹蓼垂誉! 蠹；l 享i 融莹差耕墅姜擎薹差孽i i ；盏j 誊薹苎蚕墓訇薹| 冀1 耋爿；l 黼重i 试l 毒 q ；吾壁誊；n 主；誊a ：| 羁| 善j 量囊i 蕾至莹主h 髫童鹜川j “l 写 2 0 循环 f i g 2l d p c r o fl i v e rc d n a m 1 ：九一h i n d i 工王m a r k e r ；m 2 ：d l 2 0 0 0m a r k e r ；l a n e 1 ：2 2 c y c l e s ；l a n e 2 ：2 0c y c i e s x 浙江大学硕士学位论文 第一部分前言 1 原羚属物种的生物学研究概况 原羚属( p m c 印r d ) 动物包括普氏原羚( 尸p r ，口b 胁) 、黄羊( p g “舰加s 口) 和减原羚( p p i c ，托四“砌蜘。分布于中国、蒙古、锡金和俄罗斯，其中普氏原羚为 我国特有种，目前仅栖息于青海湖地区( 蒋志刚等，2 0 0 3 ) 。原羚属隶属于牛科 羚羊亚科，其地理分布呈现明显的系统替代现象( 王宗炜等，1 9 6 3 ) 。黄羊是东 蒙草原的典型代表；普氏原羚是荒漠与高原过渡地带种类；而藏原羚则生活于青 藏高原的草甸。 1 1 生态学研究 对黄羊的生态学研究已有较多报道。张自学等( 1 9 9 5 ) 和金昆等( 1 9 9 7 ) 报 道了黄羊在中国和世界分布历史的变迁及其种群数量变化。孙静萍等( 1 9 9 6 ) 、 高中信等( 1 9 9 6 a ，1 9 9 6 b ) 和关中明等( 1 9 9 9 ) 详细报道了黄羊的集群行为、 社群行为、迁徙行为和黄羊对栖息生境的选择。高中信等( 1 9 9 5 ) 对黄羊的食性 作了研究。李俊生等( 2 0 0 0 a ) 评价了黄羊的主要饲料植物和食物营养质量，并 就呼伦贝尔草原地区黄羊肾脏重量和肾脏中心脂肪指数的变化进行了研究，初 步评价了不同年龄、不同性别组以及不同季节黄羊体况的差异( 李俊生等， 2 0 0 1 a ) 。赵肯堂( 1 9 8 2 ) 根据黄羊角年环外形特征、牙龄生长状况和磨损程度， 报道了黄羊年龄的鉴定方法。姜兆文等( 1 9 9 5 ) 利用最微鉴定的方法，对赵肯堂 ( 1 9 8 2 ) 的黄羊年龄鉴定方法作了校正。肖前柱等( 1 9 8 2 ) 和姜兆文等( 1 9 9 3 ) 根据两种不同的年龄鉴定方法，分别对黄羊种群结构、种群年龄结构、性比及种 群动态趋势作了预测，并编制了黄羊的静态生命表。 从1 9 9 4 年开始。蒋志刚等利用航片、g m 卫星照片、g i s 模型、生境适宜度模 型、种群生存力模型等系统地监测了青海湖地区普氏原羚种群动态。并就人类活 动、土地覆盖变化以及草地初级生产对普氏原羚种群生存力的影响：普氏原羚栖 息地选择、生境适宜度和活动规律；普氏原羚生境中的食物网；普氏原羚采食对 策及其与绵羊的食物竞争问题；狼捕食对普氏原羚生存的影响；草原围栏与普氏 原羚保护、草原生物多样性保护及普氏原羚社群行为和群体结构的时空动态等 等，进行了系统研究( 蒋志刚等，2 0 0 3 ) 。 6 浙江大学硕士学位论文 迄今，有关藏原羚的生态学研究报道较少，鲁庆彬( 2 0 0 3 ) 作了一简要的形 态特征和数量分布描述，张洪茂等( 2 0 0 2 ) 利用数量化理论作过川西北藏原羚夏 季生境选择的研究，认为藏原羚的最适摄食生境为隐蔽条件较好，离水源较近的 草甸草原。 1 2 生理生化及分子生物学研究 东北林业大学的学者对黄羊的胃肠消化道器官作了较为详尽的报道。李俊生 等( 2 0 0 1 b ) 研究了黄羊消化道内7 个部位f 瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、小肠、盲 l 肠和直肠) 食物粒径分布规律。马建章等( 2 0 0 1 ) 从5 l 副黄羊消化道形态结构特 征得出黄羊属于混饲者。邹琦等( 1 9 9 9 ) 通过石蜡切片法对成年健康黄羊胃肠进 行了组织形态学观察。李俊生等( 2 0 0 0 b ) 对5 1 头黄羊胃形态结构特征作了系统 研究。沈明华( 2 0 0 2 ) 对普氏原羚的1 0 项血液生理生化指标进行测定，发现普 氏原羚红细胞、红细胞压积、血红蛋白显著地高于低海拔地区的绵羊和山羊；但 其它大部分指标同黑羚羊、绵羊和山羊基本相近。 在基因水平上，此属物种的研究较少。g a t e s y ( 1 9 9 7 ) 通过形态学和r d n a 数据藏原羚作了属间系统发育关系探讨，k u 纽d s o v a ( 2 0 0 2 ) 通过1 2 sr r n a 和 1 6 sd 矾a 数据对黄羊作过属级间系统发育关系分析。g a t e s y 认为原羚属( 仅藏 原羚) 应归属于羚羊亚科羚羊族( a n 廿1 0 p i n i ) 。而k u e n e t s o v a 的结果与经典分类较 为相悖，认为原羚属( 仅黄羊) 与羚羊亚科岛羚族( n ，e o t r a g i m ) 犬羚属( 缸如q 凇) 亲缘关系最近，它们聚为单系群。l e i 等( 2 0 0 3 a ) 通过1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 数 据得出普氏原羚不是藏原羚的一个亚种，普氏原羚与黄羊的分类亲缘关系较与减 原羚的亲缘关系近；黄羊不能成为独立属。另外，l e i 等( 2 0 0 3 b ) 分析了2 9 个采 自四个种群普氏原羚线粒体d n ad 1 0 0 p 控制区序列，测定了孤立普氏原羚种群间 遗传差异，探讨了酱氏原羚分子地理系统学，提出保护进化显著单元。 1 3 系统学研究 原羚属属级和属内各物种的分类进化地位历来争论较多( g r o v e s ，1 9 6 7 ) 。 s o k o l o v ( 1 9 5 3 ) 根据眶下凹窝退化过渡特征认为原羚属( p 加c 印m ) 虽然与羚 羊属( g 船p 抛) 有明显差异，但只是亚属差异，鹅喉羚( g j “6 删”“阳鲫为二者的中 间类型，原羚属应为羚羊属的亚属。绝大多数学者基于它们头骨、角形、毛色和 7 浙江大学碗士学位论文 齿系特征，认为原羚属物种为非典型羚羊，它们应作为独立属一原羚属，并认为 原羚属包含三个种即减原羚、普氏原羚和黄羊( 刘明玉等，2 0 0 0 ；s i m 口s o n ，1 9 4 5 ； g r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。但有人根据黄羊与普氏原羚及藏原羚之间的形 态差异较大，将黄羊列为黄羊属(尸加如陀娜)，将普氏原羚和藏原羚列为原羚属 ( p o c o c k ，1 9 1 8 ；刘明玉等，2 0 0 ! 蠹g e ? ；二t 鲤；i j 如掣勺晦暗罐凄舄强捌 滔涩懋莲滢噔壅 鲫酗? 董i i i 耋ji l l l ? ：螽l ! 二蠹篷相隼否醯| 霉一l i 塞i ! l l l 萎 上耋! ；主堂；i l | ll 孽一辱荆丑裂川型硼秫分拂序飘n 皱再蜂。姜 蕈i 翻l 垂| ；矿 藁荔川。t ：i l ；| 珥罐浸心瑶理增芝京警量螽明盼 ，鳃醴 批发商和零 售商也同样在选择制造商。“”除非厂家真的信誉卓著、又能给中间商留出足够的 利润空间，否则决不会期望到有良好资质的中间商主动上门要求代理其产品的。 所以，公司必须将服务和营销渠道功能分成一个个独立的元素，从而为目标顾客 提供正确的服务及营销渠道组合“”。厂商必须首先明白，且想办法让中间商明 白，双方的合作是愉快的和互利的，让即将成为渠道成员的中间商在加入之前就 知道“加入后到底可以获得哪些益处? ”：让已成为渠道成员的经销商切实感觉 到合作有利可图，而且身心愉悦，才会奠定中间商的忠诚。即： 提供品质优良、销路旺盛、利润丰厚的丰富的产品线，并从经销商的利益 出发，使之充分认识到经销公司产品的利益所在的重要性。 提供强有力的如广利益出发，使之充分认识到经销公司产品的利益所在的重要性。 提供强有力的如广告津贴、购物指南宣传资料、展示会等广告促销支持显x 浙江大学碗士学位论文 齿系特征，认为原羚属物种为非典型羚羊，它们应作为独立属一原羚属，并认为 原羚属包含三个种即减原羚、普氏原羚和黄羊( 刘明玉等，2 0 0 0 ；s i m 口s o n ，1 9 4 5 ； g r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。但有人根据黄羊与普氏原羚及藏原羚之间的形 态差异较大，将黄羊列为黄羊属( 尸加如陀娜) ，将普氏原羚和藏原羚列为原羚属 ( p o c o c k ，1 9 1 8 ；刘明玉等，2 0 0 0 ；g r o v e s ，2 0 0 0 ) ，且认为黄羊属是介于原羚 属和羚羊属的中间类型。a 1 1 e n ( 1 9 4 0 ) 、e 1 l e n n a l l 和m o r r i s o n s c o t t ( 1 9 5 1 ) 以 及k i e i s c h m i d t ( 1 9 6 1 ) 曾一度将普氏原羚划为是藏原羚的一个亚种。p o u s a r g u e s ( 引 白g r o v e s ，1 9 6 7 ) 则认为普氏原羚是藏原羚和鹅喉羚的杂交种。但g r o v e s ( 1 9 6 7 ) 对比研究了有关动物标本馆馆藏的普氏原羚标本的形态特征，确定普氏原羚为一 个独立的种。另外，根据普氏原羚与藏原羚在青藏高原同域分布，人们普遍认为 普氏原羚与减原羚的分类亲缘关系较普氏原羚与黄羊的亲缘关系近( 蒋志刚等， 2 0 0 3 ) 。 2 研究的目的和意义 根据原羚属属内各物种和羚羊亚科各属间形态分类地位的混乱，分子数据在 属级分类上的争议和属内背景资料的缺乏之现状。本文利用进化速度较快、序列 长度高度保守和易于同源比对的线粒体d n a ( m t d n a ) 细胞色素b ( c y t o c l l r o m e b ) 基因这一分子标记( i n v i n ，1 9 9 1 ；h a s s a l l i n ，1 9 9 9 ) ，对原羚属属内物种及羚 羊亚科各属之间发育关系进行研究。 期望通过本研究，阐明原羚属及羚羊亚科各属物种之间的系统发育关系，这 对于日后羚羊亚科分类地位确定，重建牛科羚羊亚科系统发育树具有重要的理论 意义。 8 浙江大学硕上学位论文 第二部分材料与方法 1 材料 1 1 样品 自四川省和内蒙古采集到藏原羚( 户p f c 咖口姚f d ) 、斑羚( p m 口砌以p 如s c d “如f “s ) 、鬣羚( c ( p r f c d r ”括c r 如p “5 ) 和黄羊( p g “f m 加j d ) 样品1 3 份，其中， 藏原羚3 份、斑羚2 份、鬣羚5 份、黄羊3 份。采集地点、时间和样品类型见 表l 。 表l 样品信息一览 t 曲l el s u m m a r yi n 如m a t i o no nt h es a m p l e su s e dj nt h i ss t u d y 物种样品数采样地点样品类型观察资料采样时间 s p e c i e sn o o f s a m 口l e ss a m p m 喂s i t e t i s s u es a m p l eo b s e r v a t j o n s s a m p l i n gy e a r 藏原羚3四川木里皮肤野生 1 9 9 9 鬣羚 l 四川青川皮肤野生 1 9 9 9 4 四川木里皮肤野生 1 9 9 9 斑羚l四川木里皮肤野生1 9 9 9 l四川稻城皮肤野生1 9 9 9 黄羊3内蒙古满洲里肌肉野生1 9 9 4 1 2 试剂 t 如d n a 聚合酶、e xt 细d n a 聚合酶、琼脂糖凝胶d 1 q a 回收试剂盒、 p m d l 8 t 载体购自宝生物工程( 大连) 有限公司；其它常规试剂为进口分析纯， 购自上海生工生物工程公司：p c r 引物由上海生工生物工程公司合成；测序由 上海生工生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司完成。 1 3 主要的仪器设备 p t c 一2 0 0p c r 扩增仪( m jr e s e a r c h 公司) ；p e9 6 0 0p c r 扩增仪( p e 公司) ； 5 4 1 7 r 高速冷冻离心机( e p p e n d o r f ) ；5 8 l o r 高速冷冻离心机( e p p e n d o r f ) ：g e i d o c 2 0 0 0 凝胶成像系统( b i o - r a d ) ；b s2 0 0 s 电子天平( s a n o r i u s ) ；p o w e r p ：a c3 0 0 电泳仪( b i o r a d ) ；u l t r af r e e z e 超低温冰箱( h e t o ) ：s b d 5 0b i o 恒温水浴摇床 ( h e t o ) ：n l e n l l o i l l i x e rc o m f o n5 3 5 5 ( e p p e n d o ：v e n t i c e l l “l r 烘箱( m m m ) ； i n c u c e l ll “r 培养箱( m m m ) ：3 3 1 0 p h m e t e r ( j e n w a y ) ；s s 3 2 5 灭菌柜( t 0 m y ) ； d n a m i n i 真空干燥系统( h e t o ) ：s m 眦s 口e c3 0 0 0 紫外分光光度计( b i o r a d ) 。 2 方法 9 浙江大学坝士学位论文 2 1 d n a 提取 2 1 1 肌肉样品总d n a 的提取 ( 1 ) 取少量肌肉样品，液氮下碾碎，然后加入3 7 0 u l 的t n e 缓冲液( 0 1 m n a c l ：1 0 m mt r i s h c l ，p h7 5 ；1 m me d t a p h8 o ) ，1 0 0 u l 的1 0 s d s ，1 0 l 的l o m g m l 蛋白酶k ，2 0 斗l 的1 m o l l 的d t t ，混匀后放入5 6 。c 下消化 至透明。 ( 2 ) 4 0 0 0 r p m m i n 离心5 分钟，取上清。 e 3 ) 加入等体积的酚，在自动混匀器上混匀l o 分钟，i o o o o r p “m i n 离心1 0 分 钟，取上清。 ( 4 ) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，在自动混匀器上混匀l o 分钟，1 0 0 0 0 r p m h i n 离心1 0 分钟，取上清。 ( 5 ) 重复以上步骤。 ( 6 ) 加入氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，在自动混匀器上混匀1 0 分钟，1 0 0 0 0 r p 州m i n 离心l 0 分钟，取上清。 ( 7 ) 在上清中加入1 1 0 体积的3 mn a a c 和2 倍体积的冰无水乙醇，混匀后放 入一2 0 0 c 沉淀3 0 分钟。 ( 8 ) 1 20 0 0 r p i l l m i n 离心l o 分钟，弃无水乙醇，再用冷的7 0 乙醇洗涤沉淀。 ( 9 ) 真空干燥，加入1 0 0l l lt e 溶解沉淀。 ( 1 0 ) 紫外分光光度计测定浓度和纯度后，冻存于一2 0 0 c 备用。 2 1 2 皮肤样品总d n a 的提取 ( 1 ) 用消毒后的镊子和剪刀反复刮皮肤表面，然后剪一小块放入1 5 m l 离心管 中，用t n e 缓冲液在振荡器上高速冲洗2 到3 次。 ( 2 ) 加入s o o u l t n e 缓冲液浸泡2 4 小时。 ( 3 ) 用消毒后的剪刀剪碎。 ( 4 ) 其它步骤与上同。 2 2 p c r 扩增 p c r 引物使用曹丽荣等( 2 0 0 3 ) 改进后的牛科物种c y t 山基因全序列特异 性引物，引物序列为：l 1 4 7 2 4 5 g a t a t g a a a a a c c a t c g t t g - 3 和h 1 5 9 1 5 5 c c t t c t c t g g t t t a c a a g a c 一3 1 0 浙江大学坝士学位论文 2 1 d n a 提取 2 1 1 肌肉样品总d n a 的提取 ( 1 ) 取少量肌肉样品，液氮下碾碎，然后加入3 7 0 u l 的t n e 缓冲液( 0 1 m n a c l ：1 0 m mt r i s h c l ，p h7 5 ；1 m me d t a p h8 o ) ，1 0 0 u l 的1 0 s d s ，1 0 l 的l o m g m l 蛋白酶k ，2 0 斗l 的1 m o l l 的d t t ，混匀后放入5 6 。c 下消化 至透明。 ( 2 ) 4 0 0 0 r p m m i n 离心5 分钟，取上清。 e 3 ) 加入等体积的酚，在自动混匀器上混匀l o 分钟，i o o o o r p “m i n 离心1 0 分 钟，取上清。 ( 4 ) 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，在自动混匀器上混匀l o 分钟，1 0 0 0 0 r p m h i n 离心1 0 分钟，取上清。 ( 5 ) 重复以上步骤。 ( 6 ) 加入氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，在自动混匀器上混匀1 0 分钟，1 0 0 0 0 r p 州m i n 离心l 0 分钟，取上清。 ( 7 ) 在上清中加入1 1 0 体积的3 mn a a c 和2 倍体积的冰无水乙醇，混匀后放 入一2 0 0 c 沉淀3 0 分钟。 ( 8 ) 1 20 0 0 r p i l l m i n 离心l o 分钟，弃无水乙醇，再用冷的7 0 乙醇洗涤沉淀。 ( 9 ) 真空干燥，加入1 0 0l l lt e 溶解沉淀。 ( 1 0 ) 紫外分光篓卜戮驯f a 到劁蟊戳i 韩囊謦；i i ；毳氆唾； i j 二j i 给更堑鬻曙謦妻囊至 限制渠道成员出售竞争对手的产品。 为渠道成员提供其目标市场的市场调查。 培养客户带头人使之成为渠道成员。 提供质量好、有稳定可观利润的产品。 访问顾客，反馈信息。 渠道建立之后，如何维护自己的渠道网络体系，巩固渠道关系，建设忠诚于 自己的网络体系成为企业渠道竞争的重要内容。然而，一个产品从面世到推出市 场的整个生命周期过程中，中间商的积极性也表现出不同的变化，要保持渠道的 稳定和高效，就必须不断激励中间商。要成功的激励渠道成员，就必须尽可能从 渠道关系中了解渠道成员的需求“，然而无论何种形式的激励，核心都是解决 中间商的长期及短期利益问题。这样看来，如果能够协助中间商尽快将产品送到 一 塑竖查鲎堡主兰竺堡苎 2 3 4 转化 a 分别取x g a l ( 5 0 m g m 1 ) 2 0 “i ，工p t g ( o 1 m ) 1 0 0 “i 涂布l b 平板( 含l o o 肚g n n l 氨苄青霉素) 。 b 在连接反应管中加入l o o “1 感受态细胞，轻旋混匀，冰浴3 0 分钟。 c 4 2 。c 热激9 0 秒。 d 将管迅速转移到冰上冷却2 分钟。 e 每管加入4 0 0 肛ls o c 培养基，3 7 。c2 0 0 r p 州m i n 振荡培养1 小时。 f 室温4 0 0 0 r p i l l ，h i n 离心5 分钟，吸弃4 0 0 u l 上清。 g 吸取余下的转化物，涂布上述平板。 h 3 7 。c 正向放置培养1 小时。 i 3 7 。c 倒置培养过夜。 2 3 5 筛选 选择白色菌落，挑至含a m p 的l b 液体培养基中，3 7 。c2 0 0 r p 耐诚n 振荡培 养4 小时。 2 3 6 鉴定 取上述菌液l 肚l 进行p c r 检测，反应条件如前所述。 2 4 测序 取鉴定正确的菌液，加入l o m ll b 液体培养基中，3 7 0 c2 0 0 r p 叫m i n 振荡培 养过夜。然后取1 m l 菌液，送交上海生工生物工程有限公司，用通用引物 ( m 1 3 十m 1 3 一) 进行双向测序。d n a 自动测序仪型号为a b ip l u s m3 7 7 9 6 。 2 5d n a 序列数据处理分析 搜寻g e n e b a i l k 上所有羚羊亚科物种c ”b 基因全序列，结合本次羚羊亚科 原羚属藏原羚和黄羊全部测序结果( 各3 个) ，对羚羊亚科原羚属属内物种及羚 羊亚科各属之间发育关系进行研究分析。另取本次羊亚科斑羚( 研。砌卯d 协 c 日“妇f “s ) 和鬣羚( c 印r f ，雕fc r 印w ) 测序结果( 各1 个) 及来自g c n e b a n k 的牛科其它亚科物种作为外群对照。共使有3 3 个物种，4 1 个个体，分析物种出 处详见表2 。同时根据牛亚科处于牛科系统分类的基础地位( g a t e s y ，1 9 9 7 ： m a t t h e e ，2 0 0 1 ；r e z a ，2 0 0 0 ) ，定义牛( 肋j 妇“阿) 夕 群为根( r o o t ) 。 用m e g a l j 郢软件( d n a s t a r i l l c ，】9 9 6 ) 对测定序列和从g e n e b a l l k 中下载的 2 一 塑竖查鲎堡主兰竺堡苎 2 3 4 转化 a 分别取x g a l ( 5 0 m g m 1 ) 2 0 “i ，工p t g ( o 1 m ) 1 0 0 “i 涂布l b 平板( 含l o o 肚g n n l 氨苄青霉素) 。 b 在连接反应管中加入l o o “1 感受态细胞，轻旋混匀，冰浴3 0 分钟。 c 4 2 。c 热激9 0 秒。 d 将管迅速转移到冰上冷却2 分钟。 e 每管加入4 0 0 肛ls o c 培养基，3 7 。c2 0 0 r p 州m i n 振荡培养1 小时。 f 室温4 0 0 0 r p i l l ，h i n 离心5 分钟，吸弃4 0 0 u l 上清。 g 吸取余下的转化物，涂布上述平板。 h 3 7 。c 正向放置培养1 小时。 i 3 7 。c 倒置培养过夜。 2 3 5 筛选 选择白色菌落，挑至含a m p 的l b 液体培养基中，3 7 。c2 0 0 r p 耐诚n 振荡培 养4 小时。 2 3 6 鉴定 取上述菌液l 肚l 进行p c r 检测，反应条件如前所述。 2 4 测序 取鉴定正确的菌液，加入l o m ll b 液体培养基中，3 7 0 c2 0 0 r p 叫m i n 振荡培 养过夜。然后取1 m l 菌液，送交上海生工生物工程有限公司，用通用引物 ( m 1 3 十m 1 3 一) 进行双向测序。d n a 自动测序仪型号为a b ip l u s m3 7 7 9 6 。 2 5d n a 序列数据处理分析 搜寻g e n e b a i l k 上所有羚羊亚科物种c ”b 基因全序列，结合本次羚羊亚科 原羚属藏原羚和黄羊全部测序结果( 各3 个) ，对羚羊亚科原羚属属内物种及羚 羊亚科各属之间发育关系进行研究分析。另取本次羊亚科斑羚( 研。砌卯d 协 c 日“妇f “s ) 和鬣羚( c 印r f ，雕；i j 纛弦邑孙嚣籀f 鬃 磊：笔名萎簦引i 誉涫溪 酗蛳甜雏万幽雏鞒劓酝娶蠢嚣稳辎。瑟疆简! l 乳相积! 喜；雅始“；稽并貅蘩誓 瞧装坐剥a。蓍掣瓢鞋旨掣茧芦剽舔谚灌哩嘎崞遵惰l墓薹ii委j!赛加羚 羊差异最小，差异值分别为1 2 3 4 和“7 5 ；黄羊、藏原羚分别与 岛羚及山羚相距最远，差异值分别为1 5 | 2 9 和1 4 9 3 。作为外群的牛和内群各 种之间序列差异值为1 5 6 4 1 9 6 5 ，平均1 7 3 9 ；与原羚属平均差异值为1 6 5 。详见表 3 。 浙江大学硕士学位论文 同源序列进行排序。用c l u s t a l x l 8 软件( t h o m p s o n ，1 9 9 7 ) 进行c y tb 基因全 序列的比对。用m e g a 2 1 ( k u m a r8 r 以，2 0 0 1 ) 软件计算不同序列间的碱基替代 数、变异位点、简约信息位点数、转换颠换百分比、转换颠换比率和k i m u r a ( 1 9 80 ) 两参数( 2 口a r 锄e t e r ) 距离。用d n a s t a r 软件计算两两序列的遗传相似度和序 列差异百分比。基因突变是否饱和采用转换颠换散点分析( b i m n g i ，2 0 0 1 ) 。使 用p a u p 4 o b 8 软件( s w o f r o r d ，1 9 9 8 ) 构建邻近( n j ) 树、开启式功能搜寻最简约 ( m p ) 树和t b r 法搜寻最大似然( m l ) 树。依据所获得转换颠换平均比率， m p 和m l 树采取加权( w e i 啦t i n g ) 系数( 吕宝忠等译，2 0 0 2 ) 。系统简约信息 分析使用步长( t r e ei e n 醇h ) ，一致性指数( c o n s i s t e n c yi n d e x ，c i ) 、保留指数 ( r e t e n t i o ni n d e x r i ) 、同型指数( h o m o p l a s yi n d e x ，h i ) 和重复衡量一致性指数 f r e s c a l e dc o n s i s t e n c yi n d e x ，r c i ) 评估。n j 和m p 系统树各分枝的置信度由l o o o 次自举( b o o t s t r a 口) 重复检测：m l 系统树分枝置信度由1 0 0 次自举重复检测。 依据分歧时间的计算公式d = 2 t ( l i 甜d ，1 9 8 1 ) ，以牛科动物已校正的c y t6 分子钟，细胞色素6 全序列平均进化速度为2 唰百万年( b i r u n g i ，2 0 0 1 ；硒k l ( a w a ， 1 9 9 7 ：m a n h e e 吖烈，1 9 9 9 ) 计算分歧时间。 浙江= 学硕士学位论文 第三部分结果和讨论 得到牛科4 个物种1 3 个个体细胞色素6 基因的全序列，c i u s t a l x l 8 软件排 序比对具体分布位置见图一。 1 细胞色素6 基因碱基序列组成、变异位点及序列差异 经对位排列后，4 1 个个体c y t b 基因序列中，共有1 1 4 0 个碱基位点。其中 有5 6 8 个核酸变异位点，4 3 5 个简约信息位点。a 、t 、c 、g 碱基平均含量为3 1 4 、2 6 6 、2 8 7 、1 3 3 ，密码子第三位点g 碱基含量为6 1 ；原羚属黄羊 和藏原羚6 条基因序列中，a 、t 、c 、g 碱基平均含量为3 1 ，5 、2 7 3 、2 8 o 、1 3 2 ，密码子第三位点g 碱基含量为5 o 。原羚属种内和种间及相关物 种基因序列差异百分比显示出：原羚属种内和种间均有较高的遗传相似性，黄羊 种内序列差异值为1 2 6 1 9 l ，平均为1 5 1 ；藏原羚种内序列差异值为o 1 8 o 9 ，平均为o 6 ；属内二者种间序列差异平均值为3 7 8 。原羚属种间 序列差异平均值( 3 7 8 ) 与犬羚属种间序列差异平均值( 2 2 8 ) 较近；同比 而言，羚羊亚科羚羊属、小岩羚属属内种间序列差异值较大分别为9 3 5 、8 8 4 。原羚属与羚羊亚科其它属级序列差异百分比显示出：原羚属与赛加羚羊属、 跳羚属同源相似性较高，序列差异平均值分别为1 2 0 6 、1 3 1 4 ；与岛羚属同 源相似性最小，差异值为1 4 9 3 。羚羊亚科内属间相互比对差异平均值为1 1 0 9 1 7 3 8 ，印度羚属与羚羊属差异最小为1 1 0 9 ；犬羚属与岛羚属差异最大 为1 7 3 8 。原羚属黄羊和藏原羚与羚羊亚科其它属物种对比发现：黄羊和减原 羚与赛加羚羊差异最小，差异值分别为1 2 3 4 和“7 5 ；黄羊、藏原羚分别与 岛羚及山羚相距最远，差异值分别为1 5 | 2 9 和1 4 9 3 。作为外群的牛和内群各 种之间序列差异值为1 5 6 4 1 9 6 5 ，平均1 7 3 9 ；与原羚属平均差异值为1 6 5 。详见表3 。 2 细胞色素6 基因序列核酸变异方式 4 1 个个体，3 3 个物种间核苷酸碱基的变异存在很大的差异：平均替换数为 1 5 1 个，在密码子的第三位点中存在9 5 个变异，占总变异位点的6 2 9 1 ：t 一 一c 、a 一一g 的转换数分别为8 7 个和3 0 个，a 一一c 、a 一一t 、t 一一g 和 1 4 浙江大学硕士学位论文 c 一一g 的颠换数分别为2 0 、1 0 、2 和2 个。原羚属黄羊和藏原羚平均替换数为 4 3 个，在密码子的第三位点中存在2 9 个变异，占总变异位点的6 7 4 ；t 一一c 、 a 一一g 的转换数分别为2 8 个和1 4 个，a 一一c 、a 一一t 、t 一一g 和c 一一 g 的颠换数分别为l 、0 、o 和0 个。黄羊和藏原羚种内平均替换数分别为1 7 和 7 个，在密码子的第三位点中存在1 5 和6 个，分别占总变异位点的8 8 2 和8 5 7 ，且均为转换。表3 显示出：黄羊和藏原羚种内转换与颠换比值( t s t v ) 近乎为 无穷大( 分别为1 7 o 和7 o ) ，二者种间t s t v 为4 3 ( 4 3 1 ) 。原羚属与羚羊亚科 其它属间转换颠换比值( t s 厂r v ) 在2 ，7 6 1 1 3 7 ：l 之间( 1 0 6 1 4 lt s ，1 2 4 3 t v ) 。 羚羊亚科属间转换颠换比值在2 5 1 1 4 ：l 之间( 1 0 3 1 6 5t s ，1 2 5 3 t v ) 。原羚 属物种与外群牛转换颠换比值为2 ，9 2 ：1 ( 1 4 0 t s ，4 8 t v ) 。 3 细胞色素6 基因转换颠换散点饱和性分析 取羚羊亚科及外群牛作散点饱和性分析，羚羊亚科属内、属间，羚羊亚科与 外群的序列差异及转换( t s ) 、颠换( t v ) 数散点饱和图见图2 ( a 、b 、c ) 。结果发现： 原羚属及羚羊亚科属内、属间随着序列差异比提高，其碱基替换数均伴有线性提 高，但羚羊亚科各属内、属间突变均未达到饱和。在羚羊亚科与外群的饱和分析 比较中，所有颠换位点和转换位点中仅有第三转换位点f t s 3 ) 存在有饱和现象， 但羚羊亚科与外群突变仍未完全达到饱和临界。 4 细胞色素6 基因全序列分子系统树构建 基于4 1 条3 3 个牛科物种全序列( 5 6 8 个核酸变异位点，4 3 5 个简约信息位 点) 获取最大简约m p 树( 开启搜寻) 和卜j 树，4 倍加权的m p 树和n j 树( 根据 t s t v 接近于4 ，采用4 倍加权，自举引导值l o o o 次) ，最大似然( m l ) 树( t b r ( t r e e _ b i s e c t i o n r e c o l l n e c t i o n ) 法搜寻，1 0 0 次自举重复检测) ：m p 树和n j 树基本 相似，发现3 棵m p 树( 步长( 1 c n g t h ) _ 2 5 0 7 ，c i = o 3 0 7 ，王u = o 4 9 9 ，h i = 0 6 9 3 ，r c i = o 1 5 3 ，树略) 。4 倍加权m p 树( 步长= 9 3 5 0 ，c i - o 2 8 0 ，r j = o 4 2 9 ，h i = o 7 2 0 r c i = o 1 2 0 ) 和n j 树见图3 ，图4 ：4 倍加权m l 树见图5 。除羚羊亚科藏羚属系 统支持略有不同外，m l 树相似于m p 和n j 树。结果显示：原羚属属内黄羊和 藏原羚及犬羚属内物种单系发生( m o l o p h y l y ) ：原羚属与赛加羚羊属、犬羚属及 跳羚属等并系发生( p a r a p h y l y ) ，原羚属隶属于羚羊亚科；在3 种树羚羊亚科组 浙江大学硕士学位论文 成属间基本上没有单系起源，而多为并系起源。 5 讨论 5 1 黄羊与藏原羚系统发育关系 随着分歧时间增加，其物种亲缘关系变远，同源基因序列差异值会增加，颠 换变化也随之增加( i r 晰n ，1 9 9 1 ) 。黄羊与藏原羚细胞色素b 基因序列遗传差异值 3 7 8 ，颠换数目近乎为0 ，充分显示黄羊和藏原羚有着较之其他牛科物种更近 的亲缘关系。根据牛科狷羚亚科角马属( c d ”n o 出口8 饱s ) ( m 甜h e e ，1 9 9 9 ) 、小苇 羚亚科水羚属( 勋6 “5 ) ( b i n m g i ，2 0 0 1 ) 和犬羚属属内物种遗传差异较小时，与 同亚科属外物种的遗传差异就较大的现象( 属内遗传差异值为2 0 5 、o 3 、 2 2 8 ；属外物种遗传差异值分别为1 1 5 3 1 9 2 l 、7 7 1 4 7 、1 2 3 1 7 8 9 ) 。利用黄羊和藏原羚与同亚科其它物种序列遗传差异值( 属内3 7 8 遗传 差异值，属外物种遗传差异值1 2 0 6 1 4 9 3 ) 现象及结合分子系统树高举信支 持黄羊和藏原羚同系发生，原羚属与羚羊亚科其它相近属并系发生( 图3 、图4 和图5 ) 现象。我们赞成把黄羊和藏原羚列为同一属不同种，此属为独立属( 原 羚属p 阳c 印r 口) 观点( s i m p s o n ，1 9 4 5 ；( r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。 所有牛科4 1 个个体不同的物种间转换的差异与颠换差异呈现正相关，种间 转换颠换比值最低为2 4 ，所有数值均大于转换颠换比的临界值2 o ( k n i g h t ，1 9 9 3 ) ，表现出高的转换偏奇( b i a s ) ，这与牛科、马羚亚科小羚羊 ( b e t t i n e ，2 0 0 1 ) 和食肉耳犬科( m a s u d a e ta 1 ，1 9 9 4 ) 的研究结果基本一致。随着 进化时问的增加，颠换的积累，哺乳动物的m t d n a 转换偏奇会下降，转换颠换 比值( t s t v ) 趋向于稳定临界，饱和性会增加( h e d g e s ，1 9 9 1 ；z h 趴g ，1 9 9 3 ) 。通过本 研究中黄羊与藏原羚的转换颠换比值( 4 3 1 ) 。羚羊亚科属闽种间转换与颠换比 值( t s t v ) 在2 5 1 1 4 ，羚羊亚科与外群转换颠换值( 2 4 3 5 ) 及饱和散点图线 性化( 图2a 、b 、c ) 。说明牛科各物种间c y t b 基因序列的突变未达到饱和状态， 尤其是黄羊与藏原羚之间c y t b 基因序列的突变远未饱和，随着进化时间推移， 它们的遗传差异的增加，转换可能趋向于饱和。根据黄羊和藏原羚转换远未饱和 现象，我们选择牛科动物已校正的细胞色素b 基因全序列每百万年2 的进化分 子钟( b i r u n 西，2 0 0 1 ) ，推测黄羊和藏原羚的分歧时间大约在1 2 百万年。 5 2 原羚属系统发育关系 1 6 浙江大学硕士学位论文 成属间基本上没有单系起源，而多为并系起源。 5 讨论 5 1 黄羊与藏原羚系统发育关系 随着分歧时间增加，其物种亲缘关系变远，同源基因序列差异值会增加，颠 换变化也随之增加( i r 晰n ，1 9 9 1 ) 。黄羊与藏原羚细胞色素b 基因序列遗传差异值 3 7 8 ，颠换数目近乎为0 ，充分显示黄羊和藏原羚有着较之其他牛科物种更近 的亲缘关系。根据牛科狷羚亚科角马属( c d ”n o 出口8 饱s ) ( m 甜h e e ，1 9 9 9 ) 、小苇 羚亚科水羚属( 勋6 “5 ) ( b i n m g i ，2 0 0 1 ) 和犬羚属属内物种遗传差异较小时，与 同亚科属外物种的遗传差异就较大的现象( 属耋州驸妫至砷 i | ! 。；囊i l ；蕈 1 。i l 囊；拍被酥磁称翰瓣笛委骧并不蔓? d i 荔j ；菱：蓥。! ? 摹一；j ：；矍，| 萋：p | ! i ! 。蓉垴黔葱建 。，使多数消费者 进入了一个持币观望的状态，有效的遏制了长虹掀起价格战策略的实现。 选择产品的认知质量组合模式，提高客户可认知的价值。 对于市场领导者，开辟新的渠道推出阻击品牌，保护主体市场( 康拜恩的 推出) 。 ( 3 ) 渠道乱价行为的解决 建立规范的价格体系。制定统一开单价、统一批发价、统一零售挂牌价并 严格执行和监督。安排导购员每天监督监控零售商的统一零售挂牌价的实施，业 务员监督批发商批发价的执行情况，一旦发现违反价格情况，立即纠正。 处理好客情关系。 维护渠道的价格梯度。 协调不同渠道的价格差异关系。 掌握各网点的经营动态。 响应厂家的价格调整政策。 科龙、华宝容声、康拜恩分渠道、分品牌、分型号操作。 折扣、促销、返利等激励政策保持相对一致。 5 3 科龙电器渠道的沟通管理 在渠道中进行沟通管理，有利于增强经销商对公司及其品牌的信心和忠诚 度，达到增强网络维护和渠道质量的目的。首先要建立行之有效的沟通机制，公 司总部与 浙江大学硕士学位论文 成属间基本上没有单系起源，而多为并系起源。 5 讨论 5 1 黄羊与藏原羚系统发育关系 随着分歧时间增加，其物种亲缘关系变远，同源基因序列差异值会增加，颠 换变化也随之增加( i r w i n ，1 9 9 1 ) 。黄羊与藏原羚细胞色素b 基因序列遗传差异值 3 7 8 ，颠换数目近乎为0 ，充分显示黄羊和藏原羚有着较之其他牛科物种更近 的亲缘关系。根据牛科狷羚亚科角马属( c o n n o c h a e 饱s ) ( m a t t h e e ，1 9 9 9 ) 、小苇 羚亚科水羚属( k o b u s ) ( b i r u n g i ，2 0 0 1 ) 和犬羚属属内物种遗传差异较小时，与 同亚科属外物种的遗传差异就较大的现象( 属内遗传差异值为2 0 5 、o 3 、 2 2 8 ；属外物种遗传差异值分别为1 1 5 3 1 9 2 l 、7 7 1 4 7 、1 2 3 1 7 8 9 ) 。利用黄羊和藏原羚与同亚科其它物种序列遗传差异值( 属内3 7 8 遗传 差异值，属外物种遗传差异值1 2 0 6 - - 1 4 9 3 ) 现象及结合分子系统树高举信支 持黄羊和藏原羚同系发生，原羚属与羚羊亚科其它相近属并系发生( 图3 、图4 和图5 ) 现象。我们赞成把黄羊和藏原羚列为同一属不同种，此属为独立属( 原 羚属p r o c a p r a ) 观点( s i m p s o n ，1 9 4 5 ；g r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。 所有牛科4 1 个个体不同的物种间转换的差异与颠换差异呈现正相关，种间 转换颠换比值最低为2 4 ，所有数值均大于转换颠换比的临界值2 0 ( k n i g h t ，1 9 9 3 ) ，表现出高的转换偏奇( b i a s ) ，这与牛科、马羚亚科小羚羊 ( b e t t i n e ，2 0 0 1 ) 和食肉耳犬科( m a s u d ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 的研究结果基本一致。随着 进化时问的增加，颠换的积累，哺乳动物的m t d n a 转换偏奇会下降，转换颠换 比值( t s t v ) 趋向于稳定临界，饱和性会增力g ( h e d g e s ，1 9 9 1 ；z h a n g ，1 9 9 3 ) 。通过本 研究中黄羊与藏原羚的转换颠换比值( 4 3 1 ) 。羚羊亚科属闽种间转换与颠换比 值( t s t v ) 在2 5 1 1 4 ，羚羊亚科与外群转换颠换值( 2 4 3 5 ) 及饱和散点图线 性化( 图2a 、b 、c ) 。说明牛科各物种间c y t b 基因序列的突变未达到饱和状态， 尤其是黄羊与藏原羚之间c y t b 基因序列的突变远未饱和，随着进化时间推移， 它们的遗传差异的增加，转换可能趋向于饱和。根据黄羊和藏原羚转换远未饱和 现象，我们选择牛科动物已校正的细胞色素b 基因全序列每百万年2 的进化分 子钟( b i r u n g i ，2 0 0 1 ) ，推测黄羊和藏原羚的分歧时间大约在1 2 百万年。 5 2 原羚属系统发育关系 1 6 浙江大学硕士学位论文 仅管同比原羚属与羚羊亚科赛加羚羊属、犬羚属及跳羚属物种基因序列具有 较高的同源相似性，但它们的序列差异均大于1 2 ；此外进化系统树也不举信 支持原羚属与赛加羚羊属、犬羚属聚为单系。所以我们的结果既不支持 k u z n e t s o v a ( 2 0 0 2 ) 从1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 认为原羚属与犬羚属具有单系姐 妹群关系的假设；也不支持原羚属与羚羊属亲缘关系更近( t i k h o n o v ，1 9 9 5 ) ， 原羚属与赛加羚羊属亲缘关系较近( g r o v e s ，2 0 0 0 ) 的观点；而仅赞成原羚属归 属于羚羊亚科( g a t e s y ，1 9 9 7 ) 的观点。原羚属与赛加羚羊属、犬羚属及跳羚属 等是并系发生，起源于共同祖先、互为羚羊亚