（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕ubrps27a基因克隆、表达及其功能的研究.pdf

摘要 泛肽一核糖体蛋白$ 2 7 a ( u b i q u i t i n - - r i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a ，u b r p s 2 7 a ) 是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白，n 端是泛肽，c 端是有c 2 c 2 型锌指结构域的 高度保守的核糖体蛋白。在真核细胞中表达时，被酶解成泛肽和核糖体蛋白。n 端的泛肽蛋白主要参与细胞内的蛋白质选择性降解过程：c 端的核糖体蛋白 $ 2 7 a 在翻译过程中不可缺少。已发现核糖体蛋白$ 2 7 a 在人结肠癌细胞中过表达， 是一个早期生长反应基因：在胰腺癌细胞和临近胰腺癌细胞的癌前病变组织中也 超常表达；在肝癌细胞罩也高表达；在胃癌细胞中，该基因的表达也远高于胃正 常黏膜t 皮细胞。总之，这个多功能核糖体蛋白在各种活性增殖细胞和瘤组织中 高度表达，在多种类型的肿瘤细胞中，该基因的过量表达是一个典型特征。 在对家蚕蛹c d n a 文库测序中，我们发现一个编码家蚕泛肽一核糖体蛋白 $ 2 7 a 基因的序列，我们对其进行生物信息学的分析并将其命名为b m u b r p s 2 7 a 。 为研究b m u b r p s 2 7 a 的功能，将该基因的o r f 插入到融合表达载体p e t 2 8 a ( + ) 的相应酶切位点，成功构建了原核表达质粒p e t - 2 s a ( + ) b m u b r p s 2 7 a ，并转化 感受态细胞e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 经i p t g 诱导表达后，将裂解菌体的上清和沉淀分 别进行s d s p a g e 检测，与阴性对照相比存2 3 2 8k d a 处有。一特异性条带，与预 期值一致。重组蛋白以可溶的形式表达，通过亲和层析纯化了重组蛋白并使用该 重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，效价为1 ：5 1 2 0 0 。利用多克隆抗体对 家蚕u b r p s 2 7 a 进行亚细胞定位，结果显示细胞核与细胞质中都有分布。同时还 进行了荧光定量p c r 分析不同组织、时期该基因的表达差异，定量内参选用 1 8 s r r n a ，结果表明在各组织中，脂肪体和肠中的表达量最低，丝腺中表达量最 高；在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中，蛹的表达量最高，卵和幼虫中表达最 较低。我们合成了b m u b r p s 2 7 a 的d s r n a 进行r n a i ，用脂质体转染家蚕卵巢 上皮细胞b m 5 后，发现了细胞的形态发牛了变化：细胞由圆形、椭圆形变成了 梭形，甚至出现类似神经细胞的突触结构。对这一变化的机制，我们还将继续刈 此研究。 关键词：家蚕；核糖体蛋白$ 2 7 a ；表达；细胞定位；荧光定量p c r ：r n a i v a b s t r a c t u b i q u i t i n - - r i b o s o m a lp r o t e i ns 2 7 a ( u b r p s 2 7 a ) i saf u s i o np r o t e i no fu b i q u i t i n a n dr i b o s o m a lp r o t e i n t h en t e r m i n a li su b i q u i t i na n dc t e r m i n ai sak i n do fh i g h c o n s e r v a t i v ep r o t e i no faz i n cf i n g e rd o m a i no ft h ec 2 一c 2t y p e w h e ni tw a s e x p r e s s e di ne u k a r y o t e s ，t h ei n t a c tu b i q u i t i nc a r b o x y le x t e n s i o np r o t e i n sw e r er a p i d l y p r o c e s s e dt of r e eu b i q u i t i nm o n o m e ra n dr i b o s o m a lp r o t e i ns 2 7 a ( r p s 2 7 a ) u b i q u i t i nd e g r a d a t e dp r o t e i n sp a r t i c u l a r l ya n ds e l e c t i v e l yi nc e l l r p s 2 7 ai s d i s p e n s a b l ef o rt r a n s l a t i o n i th a sb e e nf o u n dt h a tr p s 2 7 ag e n eo v e r e x p r e s s e di n h u m a nc o l o r e c t a lc a r c i n o m ai sa ne a r l yg r o w t hr e s p o n s eg e n e ，a n di t e x p r e s s e d s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t i a l l yi np a n c r e a t i ca d e n o c a r c i n o m aa n di nn o r m a la d j a c e n t t i s s u e a n di ta l s oe x p r e s s e dh i g h l yi nh e p a t o c e l l n l a rc a r c i n o m aa n dg a s t r i cc a n c e r i naw o r d ，t h i sm u l t i f u n c t i o n a lr i b o s o m a lp r o t e i ni se x p r e s s e da th i g hl e v e l si naw i d e v a r i e t y o f a c t i v e l yp r o l i f e r a t i n g c e l l sa n dt u m o rt i s s u e s i ti sar e p r e s e n t a t i v e c h a r a c t e r i s t i co f v a d o u st u m o rc e l l s a c c o r d i n gt ot h el a r g e s c a l es e q u e n c i n go fs i l k w o r mp u p a e ，au n i q u eb o m b y x m o r ie s tw a si d e n t i f i e dw h i c he n c o d e su b i q u i t i n - - r i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a w e n o m i n a t et h i sn o v e lg e n ea sb m u b r p s 2 7 a i no r d e rt or e s e a r c ht h ef u n c t i o no f b m u b r p s 2 7 a ，t h eo r fo ft h i sg e n ew a sc l o n e di n t ot h ep e t - 2 8 a ( + ) v e c t o r , a n d c o n s t r u c t e dt h ep r o c a r y o t i c e x p r e s s i o np l a s m i dp e t - 2 8 a ( + ) - b m u b r p s 2 7 a t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a f t e ri n d u c i n gw i t h i p t gt h ee c o l iw a sl y s i s e da n dt h e a n a l y s i s o fs d s - p a g es h o w e dt h a tt h e r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e dc o m p a r e dt oc o n t r 0 1 t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s s o l u b l ew h i c hp r o v i d eac o n v i n e n c ew a yf o ri s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h i sp r o t e i n ， a f t e rp u r i f i e dw i t hm e t a l - c h e l a t i n ga f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , i m m u n i z a t i o no fn e w z e a l a n dr a b b i tw i t hr e c o m b i n a n tp r o t e i ng e n e r a t e dh i g ht i t e rp o l y c l o n a la n t i b o d i e s r l ：5 1 2 0 0 ) t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ne x p e r i m e n tw i t hp o l y a n t i b o b yi n d i c a t e dt h a tt h e b m u b r p s 2 7 aw a sd i s t r i b u t e db o t hi nn u c l c o l u sa n d c y t o p l a s m w ea l s ou t i l i z e d r e a lt i m ep c rt oa n a l y z et h ed i f f e r e n te x p r e s s i o np a t t e r n si nd i f f e r e n tt i s s u e sa n d v i d e v e l o p m e n tp h a s e s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eu b r p s 2 7 a w a sl o w e s te x p r e s s e di n f a tb o d ya n dg u t ，h i g h e s te x p r e s s e di ns i l kg l a n d ；hw a se x p r e s s e dh i g h l yi np u p a ， a n dl o w l yi nl a r v aa n do v a w ec o n s t r u c t e dt h ed s r n ao fb m u b r p s 2 7 aa n dd o r n a i t h es i l k w o r mo v a r yc e l lb i n 5w a s t r a n s f e c t e db yd s r n au s i n gl i p o s o m e t h e n w eo b s e r v e das u r p r i s i n gp h e n o m e n ao ft h ec e l l u l a rs h a p e h o w e v e r , w ed o n tk n o w t h ec a u s a t i o no fi tn o w ，s ow ew i l lc a r r yf u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：b o m b y xm o r i ；r i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a ；e x p r e s s i o n ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ；r e a lt i m ep c r ；r n a i v 浙江理1 = 大学硕士学位论文 缩略语 a m pa m p l c l l l i n b m u b r s 2 7 ab o m b y xm o r iu b i q u i t i n - r i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a b s a b o v i n es e r u ma l b u m i n c e p c a r b o x y le x t e n s i o np e p t l d e d a p i 4 - 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e e d t a e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t l ca c i d e l i s a e l i z y l l l el i n k e dm u n u n o s o r b e n ta s s a y e s t e x p r e s s e ds e q u e n c et a g k a n k a n a m y e i n i p t g i s o p r o p y l t h i o b - d - g a l a c t o s i d e l bl u r i a b e r t a n i n c b in a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yr e f o r m a t i o n o r f o p e nr e a d i n gf r a m e p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p i 4 - 6 - d i a m i d i n o 一2 - p h e n y l i n d o l e r pr i b o s o m a lp r o t e i n s r p s 2 7 ar i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a s d s - p a g e u b u b r s 2 7 a u p p s d s - p o l ya c r y l a r m d eg e le l e c t r o p h o r e s i s u b i q u i t i n u b i q m t i n - r i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a u b i q u i t i n - p r o t e a s o m ep a t h w a y 氨苄青霉素 家蚕泛肽核糖体蛋白$ 2 7 a 牛血清白蛋白 c 一末端延伸肽 4 , 6 联咪一2 一苯基吲哚 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 表达序列标签 卡那霉素 异丙基硫代b - d 一半乳糖苷 液体培养基 美国国立生物技术信息中心 开放阅读框 聚合酶链式反应 4 , 6 联咪- 2 苯基吲哚 核糖体蛋白 核糖体蛋白$ 2 7 a 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 泛肽 泛肽核糖体蛋白$ 2 7 a 泛肽蛋白酶体途径 5 - b r o m o - 4 - e h l o r o - 3 一m d o l y l b - d g a l a c t o s i d e 5 - 溴- 4 一氯一3 吲哚- 1 3 - d 一半乳糖苷 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所旱交的学位论文，是本人存导师 的指导f ，独立进行研究l ：作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任伺其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。沦文为本人亲自撰 写，我刈所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：2 ，7 年弓月 啡戋夏 z 弓r 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电予版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后使用本版权书。 不保密口 。 学位论文作者签名： 切士囊坟 日期：碲弓月z ，日 指导教师签名 日期： 致谢 一转眼，我的硕士研究生生涯即将落幕，回首两年半的求学经历，几多感慨几 多欢笑。几年晕，很多老师和朋友在各方面给予了我大力的支持和帮助，值此论 文完成之际，谨向他们表示最诚挚的谢意。 首先，本论文是在导师张耀洲教授的悉心指导下完成的。本论文从设计、试 验方案实施到论文撰写，结果的分析与讨论，撰写中的修改，都凝结着导师的心 血。先生渊博的学识、开拓性的思维、严谨的治学态度、循循善诱、寓教于乐的 教学方式和生动风趣的个性都使学生终生难忘，值此论文完成之际，弟子满怀感 激。谨向恩师致以最深的谢意和敬意! 本论文的工作是在浙江理工大学生物化学研究所完成的，张老师一手缔造了 朝气蓬勃的生化所，在这里我们感受着严谨的科研态度，浓厚的学术氛围。感谢生 化所这个大家庭给予我学业和生活上的关心和支持；特别感谢吕正兵老师、陈健 老师、聂作明老师、王丹老师对实验的建议与指导；感谢盛清老师、王江老师、 张文平老师的热心帮助；感谢已经毕业的张文波博士等各位师兄师姐的帮助；感 谢王雪冬、何玉琴等工作人员；感谢亲爱的各位同窗，和你们的友谊是我永远有 价值的回忆，感谢刘玉生、孔令印、徐江涛、陈剑清、郑青亮、钱家伟、倪忠、 王学健、舒特俊、周若冰、冯姗等各位同窗对我生活上的帮助和支持；大家的帮 助使我顺利完成了论文，在此表示衷心感谢。 感谢我最亲爱的父母和我的女友，因为你们的期待，使我时时不敢懈怠谢谢 你们! 最后，谨向参加本论文评阅和答辩委员会的全体专家致以最诚挚的敬意! 叶嘉良 2 0 0 7 年1 月于浙江理工大学 杭州下沙 浙江理工大学硕士学位论文 第一章泛肽核糖体蛋白$ 2 7 a 的研究进展 1 泛肽核糖体蛋白$ 2 7 a 的结构特征 泛肽一核糖体蛋i ! t $ 2 7 a ( u b i q u i t i n - - r i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a ，u b r p s 2 7 a ) 是一个融合蛋白，其n 端是泛肽，c 端是一段核糖体蛋白，两端结构域在不同物 种中高度保守。n 端的泛肽蛋白主要参与细胞内蛋白质选择性降解过程；c 端为 核糖体蛋i 刍$ 2 7 a ( r i b o s o m a l p r o t e i n $ 2 7 a ，r p s 2 7 a ) 。u b r p s 2 7 a 结构如图1 1 所 示： 图1 1u b r s 2 7 a 的结构示意图 n 端是泛肽，c 端是核糖体蛋白s 2 7 a f i g1 1 t h es t r u c t u r eo f u b r p s 2 7 a t h en - t e r m i n a li su b i q u i t i na n dc - t e r n u n ai sr i b o s o m a lp r o t e i n $ 2 7 a 在细胞中，泛肽的常见功能是参与细胞中蛋白质的选择性降解，而核糖体蛋 白的常见功能是组装配成核糖体，主导细胞中蛋白质的合成。u b r p s 2 7 a 把泛肽 和核糖体蛋白这一对功能上似有矛盾的基因整合在了一起。 2 泛肽系统的生物学意义 2 1 泛肽及泛肽蛋白酶体途径 泛肽( u b i q u i t i n ，u b ) 是一种由7 6 个氨基酸残基组成、高度保守的小分子 可溶性多肽。u b 广泛存在于各种真核生物中，不同真核生物来源的u b 有类似的 结构和功能，是细胞内含量最丰富的蛋白质之一。 蛋白质合成和选择性降解是生命过程进行精确时空调控的中心环节之一。生 物体内存在着两类蛋白质降解过程：一种是不需要能量的，例如发生在消化道中 的降解，这一过程只需要蛋白质降解酶参与；另一种则需要能量，是一种高效率、 指向性很强的降解过程。泛肽一蛋白酶体途径( u b i q u i t i n - - p r o t e a s o m ep a t h w a y ， u a a ) 是目| ；i 已知最重要的、高度选择性的蛋白质降解途径，存在于细胞质和细 胞核内，其作用依赖于a t p 。 u i p 由u b 、泛肽活化酶( u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e ，e 1 ) 、泛肽结合酶 i 浙江理_ 丁= 大学硕上学位论文 ( u b i q u i t i n e o n j u n g a t i n ge n z y m e ，e 2 ) 、泛肽连接酶( u b i q u i t i nl i g a s e ，e 3 ) 、多泛肽延 伸因子( m u l t i u b i q u i t i nc h a i ne l o n g a t i o nf a c t o r ，e 4 ) 、去泛肽化酶( d e u b i q u i t i n a t i n g e n z y m e s ，d u b s ) 、蛋白酶体( p r o t e a s o m e ) 及靶蛋白等几部分组成。在e 1 、e 2 和e 3 三种酶作用下实现泛肽活化、底物识别、和靶蛋白绑定，这一过程不断重复，靶 蛋白上就被绑定了一批泛肽分子。被绑定的泛肽分子达到一定数量后，附着上泛 肽的靶蛋白会被运送到细胞内圆柱形的细胞器一蛋白酶体中被降解【l 】。蛋白酶体 是u p p 系统的一个中心结构，由超过3 0 种不同的亚基组成【2 1 。经过它的处理，蛋 白质就被切成由7 至9 个氨基酸组成的短链，这一步骤如图1 2 所示： 图1 2 泛肽蛋白酶体途径 泛肽蛋白酶途径需要3 种酶和蛋白酶体的协同作用：泛肽活化酶e l ，泛肽结合酶e 2 ，泛肽 连接酶e 3 ( 图片引自m i t0 c w a f t e rw h i l t ，u n i v e r s i t a ts t u t t g a r t ) f i g1 2u b i q u i t i n - - p r o t e a s o m ep a t h w a y t h i ss y s t e mr e l i e so nt h r e ee n z y m e sa n dp m t e a s o m e ：u b i q u i t i na c t i v a t i n g ( e 1 ) e n z y m e s u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g ( e 2 ) e n z y m e s ，a n ds u b s t r a t er e c o g n i t i o np r o t e i n s ( e 3 ) e n z y m e s ( i m a g eb ym i t0 c w a f t e rw h i l t ，u n i v e r s i t a ts t u t t g a r t ) 尽管u b 途径早在2 0 世纪7 0 年代中期就已被发现和研究，但它作为体内的重 要细胞调控体系，直到最近才被深入研究。由于不断有新的l i b 系统酶家族成员 和l i b 新功能被鉴定，这个领域的进展十分迅速。 u p p 通过调节功能蛋白质的周转( t u r no v e r ) 或降解不正常蛋白，来调控多种 代谢过程，介导多种细胞功能。除了能介导蛋白降解，l i b 还有一些“非常规” 功能例如d n a 修复【4 】、转录调控【5 1 、跨膜运输【6 】、细胞信号转导1 7 , 8 、u v 修复【9 j 、 浙江理工大学硕十学位论文 受体内吞、发炎、和免疫反应。这些功能中很多都依赖泛肽连接酶e 3 。和蛋白的 磷酸化作用相似，蛋白的泛肽化是个可逆过程，泛肽也可以被d u b s 从底物上移 除下来。因此，区分e 3 与d u b s 的底物有助于我们了解细胞内的一些复杂生物学 功能1 1 0 1 。泛肽化不仅仅导致蛋白降解，还能作为蛋白的一种修饰导致一些其他功 能。泛肽的可逆修饰涉及到细胞的多种信号转导途径1 1 】。 2 2 泛肽相关蛋白的生物学意义 泛肽相关蛋白是真核生物中一个重要家族。在目前发现的1 0 0 多个家族成员 中，大多数成员主要参与泛肽介导的蛋白水解途径，如e 1 、e 2 、e 3 、f a 和d u b s 等，该家族成员的共同特征是具有一个或多个在进化中高度保守的泛肽结合功能 域( u b i q u i t i nb i n d i n gd o m a i n s ，u b d s ) 。u b d s 是能与u b 非共价结合的结构域，在 不同物种间高度保守，靶蛋白通过u b d s 与u b 结合。已经被鉴定的1 1 个u b d s 家 族中，有六个家族被发现尽管它们的序列相差巨大，但它们的三维结构非常相似。 u b d s 对细胞的多种功能非常重要，泛肽化蛋白与u b d s 构成了细胞内复杂的信号 网络 1 2 , 1 3 】。u b d s 功能域的高度保守及泛肽相关蛋白家族在组织的广泛表达说明 这类基因功能的重要性。在已知的泛肽相关蛋白家族中，e 3 家族的功能最为引人 注目。在人细胞里，预计有超过1 0 种的e 1 ，超过1 0 0 种的e 2 ，超过l o o o q 的e 3 。 甚至推测e 3 会和蛋白激酶( k i n a s e s ) 的总数一样多，它调控了各种细胞生命过程。 u b 系统调节的多样性主要取决于e 3 ，它特异性地识别靶蛋白，引导着泛肽途径 1 4 , 1 5 。 最近对e 3 家族成员功能的发现非常多，例如：被命名为a r f b p l 的e 3 ，能与 肿瘤抑止因子p 5 3 、抗凋亡因子m c l 1 两种底物相互作用1 1 6 , 1 7 。p 5 3 和m c l 1 在细 胞存活与否方面常常扮演着相反的作用，因为能控制决定细胞存活或凋亡的关键 因子p 5 3 和m c l 1 ，a r f b p l 成了细胞命运的重要决定者，成了一种新的癌症治疗 的靶点。 e 3 家族的h e c t h 9 通过特殊位点的泛肽化，激活或抑制转录调节蛋( 5 1 m y c 的功 能，对其进行调控，h e c t h 9 在多种人肿瘤细胞中过表达，推测对肿瘤细胞增殖必 不可少【1 8 】；e 3 家族的n p 9 5 在肿瘤细胞增殖中扮演角色，在很多化疗中，使n p 9 5 沉默，使肿瘤细胞对化疗变得敏感【1 9 l ；s k p 2 ( e 3 家族) 在肿瘤抑制中起作用【2 0 】； 最新发现，对e 3 的研究也许可以用来控制衰老过程中的一些步骤，u b 途径在衰老 过程中也起作用【2 1 翊；e 3 的功能还有：h u l 5 ( e 3 家族) 被鉴定是蛋白酶体的一个组 浙江理工大学硕十学位论文 成部分，h u l 5 在去泛肽化酶的配合下，能使泛肽链的长度在蛋白酶体上被改变”l ； e 3 还被发现能激活蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec p k c ) ，e 3 和蛋白激酶c 在信号转 导过程中互相作用对方犯”。 很多癌基因或抑癌基因的编码产物是泛肽连接酶e 3 的成分，通过调控蛋白翻 译的起始，或与一些癌基因、抑癌基因起作用，上调或下调某些抑癌基因、转录 因子和细胞周期因子等的表达，从而参与恶性肿瘤的发生和发展。它的发现被认 为是细胞周期、细胞恶性转化研究的转折点，泛肽介导的降解途径也因此被认为 可以作为肿瘤治疗的靶点1 2 5 之引。 3 核糖体蛋白与肿瘤发生的关系 此外，越来越多的证掘表明，许多种r p 除组成核糖体、参与蛋白质生物合 成之外，还具有其他的功能。如参与复制、转录加工、修复、自体翻译、细胞凋 亡调控、以及正常细胞的恶性转化及发育调控等等，对其原因目前尚未完全知晓 【2 9 州。人们推测这些蛋白在编入核糖体之前就预存并保留了其核糖体外的功能 【3 1 】，研究r p 的核糖体外功能作用有重要的意义。 在许多肿瘤细胞中，发现蛋白质合成率和几个翻译成分的表达常常显著增 加，这指示核糖体功能和翻译控制在肿瘤发展中有潜在的重要性 2 9 , 3 0 1 。 肿瘤细胞由于有快速生长、增殖和进一步恶性转化的需要，必须拥有高水平 合成蛋白质的能力。而核糖体扮演了蛋白合成机器的角色，因此在一些肿瘤细胞 中往往可以看见超表达r p 的身影。目前已有很多研究报道在肿瘤细胞中，一些 r p 参于肿瘤细胞增殖的调控，并与其恶性转化和进展有关 3 1 , 3 2 。 对于肿瘤细胞中r p 基因的表达，人们已经进行了大量的研究工作。发现肿 瘤细胞中，很多r p 的m r n a 表达水平异常。在胃癌组织中，r p l l 5 的表达水平比 非肿瘤组织增加了4 7 倍【3 3 】，结肠癌细胞中r p 表达选择性增高的有r p l 5 、r p l 7 a 、 r p l l 8 、r p s 3 、r p s 8 、r p s 6 、r p s l 2 、r p s l 3 、r p s 2 8 f 3 4 1 、r p s l l 、r p s l 7 1 3 5 1 ； 肝癌中有r p p l 、r p p 2 、r p s l 0 、r p l 3 5 、r p l 5 、r p l 3 9 、r p l 9 、r p l 6 、r p s 3a 、 和r p s l 7 、r p l 3 6 a t 3 6 j 7 1 、r p s 8 、r p l l 2 ，r p l 2 3 a 、r p l 2 7 和r p l 3 0 1 3 8 】；卵巢癌r p s l 8 、 r p l 3 和r p l 8 3 9 】；胰腺癌r p l 3 8 h o l ；宫颈癌t l a r p s l 2 4 j ；肺癌中r p l 9 t 4 2 l ；前列 腺癌中r p l l 9 t 4 i 。 除此之外，虽然大多数发现显示很多r p 与肿瘤正相关，但也有报道发现， r p 在肿瘤中表达降低、缺失或突变】。在结肠癌中，有1 0 个r p ( r p s a 、r p s 8 、 4 浙江理工人学硕士学位论文 r p s l 2 、r p s l 8 、r p s 2 4 、r p l l 3 a 、r p l l 8 、r p l 2 8 、r p l 3 2 和r p l 3 5 a ) 减少【3 5 】： 在头颈部鳞状细胞癌中r p s l 9 减少【4 5 j 。此外，还有一些肿瘤中存在多种核糖体蛋 白的突变】。 还有研究发现r p l 5 、r p l l l 和r p l 2 3 f l e 抑止癌基因m d m 2 的e 3 泛肽连接酶功 能，间接促进 p 5 3 的功能，抑止了癌的发展4 7 1 。在d n a 损伤时，发现r p l 2 6 过 表达提高p 5 3 蛋白的翻译，导致细胞周期g 1 期的停滞，促进了细胞凋亡，避免了 癌化4 8 1 。 总之，有很多核糖体蛋白的作用不仅体现在组成核糖体，在核糖体外也起作 用。很多研究结果表明核糖体蛋白可参与肿瘤细胞的增殖、分化调控和耐药性等 生物学行为，这方面的研究不仅将有助于深入了解核糖体蛋白在肿瘤发生、发展 中的作用和肿瘤的发病机制，还可能导致发现具有临床意义的肿瘤特异性诊断标 志物和肿瘤治疗新靶点，可能对肿瘤的预防和治疗具有重要意义。 4 核糖体蛋白s 2 7 a 4 1 核糖体蛋白$ 2 7 a 的结构特点 r p s 2 7 a 属泛肽c e p 家族【4 9 1 ，其n 端为一个完整的7 6 个氨基酸残基的u b ，c 端 包含一个保守的结构域，该结构域形成一个锌指结构，对c e p 的分析认为在u b 的c 端有一段延伸的5 2 个或7 6 8 1 个氨基酸残基的肽段，在人，鼠，酵母，盘基网 柄菌( d i c t y o s t e l i u m ) 中有保守性较高的结构域5 0 j 。已经确定c e p 大多是核糖 体蛋白，5 2 个残基的c e p 是核糖体大亚基的一种蛋白，7 6 8 1 残基的c e p 是核糖 体小亚基的组成成分之一。c e p 基因家族主要在细胞快速生长时表达【5 2 1 。但除了 核糖体之外，也曾在某些物种中观测到c e p 是肌动蛋白的例子f 5 3 1 。 去泛肽化酶加工移除融合蛋白的u b 部分后，c e p 会整合进入核糖体中。这 些核糖体蛋白与u b 共翻译成融合蛋白，很少以非融合形式翻译。在酵母细胞中 分别表达l i b 融合c e p 年i 除去u b 的c e p ，发现i ；i 者的表达效率远远高于后者1 5 。 因此认为u b 在核糖体生物合成过程中充当一种分子伴侣，在c e p 进入核糖体之 前，有保护和稳定这些核糖体蛋白的作用【”】。在核糖体形成时，c e p 会暂时性整 合进初生核糖体f 4 9 1 。 尽管彼此并不同源，但c e p 都是高度保守且包含半胱氨酸和组氨酸组成的锌 指结构，c e p 8 0 中有3 0 的氨基酸残基是赖氨酸和精氨酸。用抗体验证了c e p 8 0 在真核细胞中定位在核糖体，存在于细胞质中。对鼠的4 0 s 亚基免疫杂交鉴定证 s 浙江理工大学硕士学位论文 明c e p 8 0 是r p s 2 7 a 【卯1 。 构建重组表达载体将人的u b r p s 2 7 a 基因在原核和真核细胞中分别表达，发 现在真核细胞表达时会成为独立的l i b 单体和独立的c e p ，但在原核中却并非如 此，不存在前翻译和共翻译的步骤过程【5 4 】。 4 2 核糖体蛋白s 2 7 a 在肿瘤组织中高度表达 以前认为r p s 2 7 a 和转录因子、d n a 损伤应激蛋白一样，是起d n a 绑定作用 的一个核糖体蛋白，通过c 2 c 2 型的锌指结构域结合在d n a 上。在另一个由转化 生长因子b 诱导的实验中，同样的基因也被发现了并被命名为m p s 1 ，也即 r p s 2 7 a 。在人的多种类型肿瘤细胞中，m p s 一1 ( r p s 2 7 a ) 蛋白是一个典型特征。 此外，m p s 一1 蛋白释放到细胞外液中，可以作为一个血浆中的肿瘤标记物【5 6 1 。 j m w o n g 等【57 】在研究结肠癌时发现：r p s 2 7 a 基因在人结肠癌细胞中过表达， 是一个早期生长反应基因。n o r t h e r nb l o t 分析发现瘤组织中r p s 2 7 a 的m r n a 水平 要远高于临近的正常粘膜组织中的水平。对这个基因进行失控转录分析，显示它 的感应机制的动力学与原癌基因c - j u n 或c f o s 几乎完全一样。 k a t h e r i n el 等【5 8 】在研究胰腺癌时发现，在胰腺癌细胞中，有些基因会异常活 跃的表达。其中，有4 0 的在癌细胞中异常活跃表达的基因在临近胰腺癌细胞的 癌前病变组织中也超常表达，这其中就包含r p s 2 7 a 。癌前病变作为癌发生的中 间状态，与正常癌组织相比已存在有基因水平的表达异常，而一些肿瘤相关基因 的表达水平介于正常组织和癌组织之间，因此可以从分子水平揭示和区分这一病 理改变。癌前病变组织中的一些基因的表达异常警示了癌的临近，通过对基因水 平的监测有可能预示肿瘤的发生，并将这些相关基因作为肿瘤标志物为临床诊断 提供依据。 g a n g e rdr 等【5 9 】在研究肝癌标志物时，通过免疫组化方法检查了r p s 2 7 a 基 因在慢性肝炎、肝硬化、肝癌细胞中的表达，结果发现：在慢性肝炎时，肝细胞 的r p s 2 7 a 染色很浅；与之相比，肝硬化细胞里，发现r p s 2 7 a 染色很深；在分化 程度很高的肝癌细胞里，r p s 2 7 a 特另t j 密集。这些结果揭示r p s 2 7 a 可能涉及到肝 硬化和肝癌的形成。他们的其他研究，也发现了r p s 2 7 a 在各种活性增殖细胞和 瘤组织中高度表达。 蛋白激酶c k 2 ，或称酪蛋白激酶2 或i i ( c a s e i n k i n a s e 2 0 r i i ) ，是一种真核 细胞中普遍存在的信使非依赖性丝苏氨酸蛋白激酶。在d n a 复制与转录、r n a 6 浙江理工大学硕上学位论文 加工与翻译、细胞代谢和运动、信号的转导与加工、癌基因与抗癌基因活性的调 节、促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡等方面起重要作用。许多研究表明，在多种 白血病和实体肿瘤细胞中活性比相应的正常组织中高2 8 倍。且c k 2 活性的变化 与肿瘤的生长情况相关，在某种情况下c k 2 可引起细胞转化。h u a n gg o n g - h u a 等6 0 】在用酵母双杂交系统筛选与c k 2 相关的蛋白质时，筛选出一种与人蛋白激酶 c k 2 a 。相互作用的蛋白一r p s 2 7 a 。基于蛋白激酶c k 2 和肿瘤的密切关系，推测 r p s 2 7 a 和肿瘤有密切的关系。 w a n gy u n - w e i 等1 6 1 】采用逆转录聚合酶链反应( r t - p c r ) 和w e s t e r n 印迹，检 测胃癌组织及其相应正常黏膜组织中r p s 2 7 a 的表达情况。发现r p s 2 7 a 的m r n a 在胃癌组织中表达高于胃正常黏膜上皮细胞，表明胃癌抗原相关基因u b r s 2 7 a 可能在胃癌的恶性转变中发挥一定的作用。 多项研究结果显示r p s 2 7 a 在癌细胞较之正常细胞中过度表达。这些数据显 示蛋白翻译机制受癌细胞产生和转移的高度影响，且r p s 2 7 a 也许能作为一个很 重要的生物标记。 5 研究展望 生物体的生命活动是复杂的，一些简单的蛋白质或许扮演着多种复杂角色， 例如r p 、u 8 等。 u p p 被发现了2 0 多年，但其作为细胞周期调控方面的研究还刚刚开始。该途 径与许多包括癌症在内的疾病的发生有密切关系，是调节多种细胞生物学过程的 重要机制，对u p p 与细胞周期关系的研究，将有助于理解异常细胞增殖和肿瘤生 长的分子机理；有利于癌症的早期发现、新药研发及相关疾病的治疗。 很多r p 在组成核糖体的“常规”功能之外，在核糖体外也有丰富的功能， 尤其是它与肿瘤的密切关系更是引人注目，r p 在癌细胞中的增加是一个独立的 现象，不同于细胞分裂时普遍的r p 合成增加。而r p 的下调或突变办见于肿瘤中， 更非适应癌细胞生长所致。因此，r p 在肿瘤的发生、发展、转移和肿瘤抑制中 可能发挥重要的作用。对它的进一步研究，可能导致发现具有临床意义的肿瘤特 异性诊断标志物和肿瘤治疗新靶点。对进行癌症的早期诊治，对阻止由癌前病变 向癌的转化均具有重要的意义。 作为一种多功能r p ，与非癌组织相比，r p s 2 7 a 在多种活性增殖细胞和瘤组 织中表达量显著增加，在细胞快速生长时过表达。因此，和许多其它与肿瘤关系 7 浙江理工大学硕十学位论文 密切的r p 一样，r p s 2 7 a 也许可以作为恶性转化细胞或将要癌变组织的一个标记 物。 浙江理工人学硕上学位论文 第二章实验方案设计 1 实验目的和意义 本研究从家蚕蛹e d n a 文库中发现了一个融合蛋白：泛肽一核糖体蛋白 s 2 7 a 基因序列，命名为b m u b r p s 2 7 a 基因。尚未有报道在家蚕中研究过该基因。 本实验构建了重组原核表达质粒p e t - 2 8 a ( + ) 一b m u b r p s 2 7 a ，并在大肠杆菌中表 达目的蛋白，纯化后作为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，为进一步研究该基 因提供了条件。 用制备的多克隆抗体进行b m u b r p s 2 7 a 的亚细胞定位；并提取家蚕不同时 期及不同组织的总r n a ，进行荧光定量p c r 分析该基因在家蚕各组织及不同发 育时期的表达差异。根据文献已知r p s 2 7 a 在快速增殖的细胞中含量很高，通过 荧光定量p c r 可以验证b m u b r p s 2 7 a 在家蚕中细胞相对增殖迅速的组织和发育 时期高表达。 为了进一步研究b m u b r p s 2 7 a 的功能，合成了b m u b r p s 2 7 a 的d s r n a ， 转染家蚕卵巢细胞b m 5 ，细胞产生了形态上的变化，此前还未见报道过干扰 u b r p s 2 7 a 有能使细胞形态变化的现象，这个现象有待于下一步继续研究。 2 研究内容 b m u b r p s 2 7 a 的生物信息学分柝 构建含有目的基因的重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) 一b m u b r p s 2 7 a 重组表达载体在大肠杆菌中的表达 表达产物的纯化 多克隆抗体的制备与效价测定 将多克隆抗体进行亚细胞定位 提取家蚕不同时期及不同组织的总r n a ，荧光定量p c r 分析各组织，各 时期的m r n a 表达量 合成b m u b r