（生物化学与分子生物学专业论文）多种水解酶的荧光分析新方法研究.pdf

厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人 在沦文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标 明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) 圈荔象 卯舌年f 月弘目 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有 权保留并向国家丰管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的 标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定a 本学位论文属于 1 、保密() ，在 年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名：闰荔寡 导师签名：勘揖 日期：沙易年f 月扫 日期：洲6 年( 月，( 妇 多种水解酶的荧光分析新方法研究 摘要 本文共分为四章，包括：酶的应用与常用的测定方法综述；以罗丹明为标记 物的蛋白酶荧光各向异性均相分析法：吖啶橙一纤维素复合物的制备及纤维素酶 的荧光分析；吖啶橙一淀粉复合物的制各和淀粉酶的荧光分析。 第一章为前言，介绍酶在医药、食品、工业、环境保护等方面的实际应用与 重要意义，评述了目前常用于检测酶的方法，并在此基础卜提出了本论文的研究 设想。 第二章主要研究以罗丹明为标汜物的荧光各向异性法均向测定蛋白酶的方 法。本章主要包括五个方面的内容：1 罗丹明一牛血清白蛋白复合物的制备；2 以罗丹明一牛血清白蛋白为底物在碱性条件下检测胰蛋白酶水解活力的研究；3 以罗丹明一牛血清白蛋白为底物在中性条件下检测菠萝蛋白酶活力的研究；4 以罗丹明一牛血清白蛋白为底物在酸性条件下检测胃蛋白酶活力的研究；5 实际 药品的测定。相比以往的检测方法，本研究技术灵敏度高，受p h 的影响小，拓 宽了荧光各向异性技术在酶学分析中的应用范刚。 第三章首次报道了以吖啶橙为探针的荧光光谱分析法测定纤维素酶的方法。 本章主要包括两个方面的内容：1 吖啶橙一纤维紊复合物的制备；2 以吖啶橙 一纤维素为底物检测纤维索酶活力的研究。本研究原理简单，易于操作，灵敏度 高( 可检测到纳克级的酶量) ，实用性强。 第四章主要研究以吖啶橙为探针检测淀粉酶的荧光光谱分析法。本章主要包 括两个方面的内容：1 吖啶橙一淀粉复合物的制备：2 以吖啶橙一淀粉为底物 检测淀粉酶活力的研究；3 实际样品的测定。本方法灵敏度高、线性范围宽、实 用性强。 关键词：荧光分析；酶；荧光探针 多种水解酶的荧光分析新方法研究 a b s t r a c t t h i sp a p e ri sc o n s i s t e do ff o u rc h a p t e r s ，i n c l u d i n gt h ef o l l o w i n ga s p e c t s ：r e v i e w o nt h ea p p l i c a t i o na n dt h ea n a l y s i sm e t h o d so fe n z y m e s ；t h ee s t a b l i s h m e n to fa h o m o g e n e o u sm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e a s e su s i n ga f l u o r e s c e n ts u b s t r a t e p r e p a r e db yt m r i ca n db s a ；t h ep r e p a r a t i o n o faa c r i d i n eo r a n g e c e l l u l o s e c o m p l e xa n di t sa p p l i c a t i o n i nt h ea a a l y s i so fc e l l u l a s e ；j h cp r e p a r a t i o no f a c r i d i n eo r a n g e - a m y l u mc o m p l e xa n di t sa p p l i c a t i o ni nt h ed e t e r m i n a t i o no fa m y l a s e c h a p t e r1 i st h ep r e f a c e ，i n t r o d u c i n gp r a c t i c a la p p l i c a t i o n so fe n z y m ei nv a r i o u s d o m a i n ss u c ha sm e d i c i n e ，f o o d ，i n d u s t r y , e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n ，e t ci nt h i s c h a p t e rw ec o m eu pw i t ht h er e s e a r c hp r o g r a mo ft h i sp a p e r ，o nt h eb a s i so fa n a l y s i s a n de v a l u a t i o no f s o m ee x i s t i n gm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f e n z y m e s ， c h a p t e r2d i s c u s s e st h eh o m o g e n e o u sa n a l y s i so fp r o t e a s e sb yf l u o r e s c e n c e a n i s o t r o p yt e c h n i q u e ，u s i n gr h o d a m i n ea st h ep r o b e t h i sc h a p t e ri sc o n s i s t e do ft h e f o l l o w i n gp a n s ：( 1 ) p r e p a r a t i o n o ft h e t m r i t c b s a ；( 2 ) r e s e a r c h o nt h e m e a s u m n l e n to ft r i p s i nw i t ht m r i t c b s aa st h es u b s t r a t ei na l k a l ie n v i r o m n e n t ； ( 3 ) r e s e a r c ho i lt h em e a s u r e m e n to f b r o m e l a i nw i t ht m r i t c b s a a st h es u b s t r a t ei n n e u t r a lm e d i u m ；( 4 ) r e s e a r c ho nt h em e a s u r e m e n to fp e p s i nw i t ht m r i t c b s aa s t h es u b s t r a t ei na c i d i cm e d i u m ；( 5 ) ad e m oe x a m p l ef o ri l l u s t r a t i o np u r p o s e c o m p a r e dt oo t h e rp r e v i o u sw o r k ，t h ep r e s e n tm e t h o di s m o r ei n d e p e n d e n to fp h a l s oi tw i d e n st h ea p p l i c a t i o n s c o p e o ff l u o r e s c e n t a n i s o t r o p yt e c h n o l o g y i n e n z y m o l o g ya n a l y s i sa r e a c h a p t e r3p r e s e n t st h em a i ni d e a sf o rt h em e a s u r e m e n t o fc e l l u l a s ew i t ha c r i d i n e o r a n g e a st h ef l u o r e s c e n t p r o b ef o r t h e f i r s tt i m e t h i s c h a p t e rc o m p r i s e s t h e f o l l o w i n gc o n t e n t s ：( 1 ) p r e p a r a t i o no ft h ec o m p l e xo fa c r i d i n eo r a n g ea n dc e l l u l o s e ； ( 2 ) r e s e a r c ho nt h em e a s u r e m e n to fc e l l u l a s ew i t ht h ec o m p l e xo fa c r i d i n eo r a n g e a n dc e l l u l o s ea st h es u b s t r a t e t h o u 【g ht h ep r i n c i p l eo ft h i sm e t h o di ss i m p l e ，b u ti t p r o v i d e sh i 曲s e n s i t i v i t y ( e n z y m ec a ne v e nb em e a s u r e d a tn a n o g r a ml e v e l ) a n d l l i g hp r a c t i c a b i l i t y 8 多种水解酶的荧光分析新方法研究 c h a p t e r4f o c u s e so nt h em e a s u r e m e n to fa m y l a s eu s i n ga c r i d i n eo r a n g ea sa f l u o r e s c e n tp r o b e t h s ic h a p t e rc o m p r i s e st h ef o l l o w i n gc o n t e n t s ：( 1 ) p r e p a r a t i o no f t h ea c r i d i n eo r a n g e a m y l u mc o m p l e x ；( 2 ) r e s e a r c ho nt h em e a s u r e m e n to f a m y l a s e w i t ht h ea c r i d i n e o r a n g ec o m p l e xa st h es u b s t r a t e ；( 3 ) ad e m oe x a m p l ef o ri l l u s t r a t i o n p u r p o s e k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s ；e n z y m e s ；f l u o r e s c e n tp r o b e 9 多种水解酶的荧光分析瓤方法研究 第一章前言 1 酶的基本概念与发展史 酶是具有生物催化功能的生物大分子，按其化学组成，可以分为蛋白类 酶( p 酶) 和核酸类酶( r 酶) 两大类别。蛋白类酶主要由蛋自质组成，核酸 类酶主要由核糖核酸( r n a ) 组成。 早在几千年前，人类就已经不自觉地利用酶的催化作用来制造食品和治 疗疾病。据文献记载，我国在4 0 0 0 多年前就以经掌握了酿酒技术。在3 0 0 0 多年前就会制造饴糖、食酱等食品。然而，人们从1 9 世纪3 0 年代开始才真 正认识酶的存在和作用。1 0 0 多年米，人们对酶的认识经历了一个不断发展、 逐步深入的过程。1 8 3 3 年，p a y e n 和p e z s o z 发现淀粉酶，初步触及了酶的 些本质问题。1 9 0 2 年，h e n r i 提出中削产物学说，认为底物在转化为产物之 前，必须首先与酶形成中间复合物，然后再转变为产物，并重新释放出游离 的酶。1 9 1 3 年，m i c h a e l i s 和m e n t o n 根据中间产物学说，推导出酶催化反应 的基本动力学方程一米氏方程。1 9 2 6 年，s u n n e r 证实酶的化学本质是蛋白质。 1 9 8 3 年，a t m a n 等人发现核糖核酸酶p 的r n a 具有催化活性，由此引出“酶 是具有生物催化功能的生物大分子( 蛋白质或r n a ) ”的新概念。 2 水解酶催化作用的特点与应用 酶是生物催化剂，与非酶催化剂相比，具有专性强，催化效率高和作 用条件温和等显著特点。在一定条件下酶可以催化各种生化反应。所以酶在 医药、食品、轻工、化工、环保等领域1 1 泛应用。 2 1 酶在医药上的应用 蛋白酶可作为消炎剂，由于它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的 坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排 出并抑制肉芽的形成，因此具有很好的疗效，如木瓜蛋白酶“1 。此外，蛋白 酶还可用于多种疾病的诊断于治疗。靡蛋白酶可用来治疗白内障“1 1 。胃蛋 白酶可用于诊断胃溃疡，十二指肠溃疡，萎缩性胃炎以及胃癌等疾病的发生 。“。胰蛋白酶可用于预防出血性肠坏死，增加存活率，还可用于检测急性胰 腺炎等疾病。1 “。蛋白酶抑制剂广泛的应用于抵抗炎症、感染、病毒以及艾滋 0 多种水解酶的荧光分析新方法研究 病、肿瘤的治疗中”2 1 “。血清淀粉酶还可用于检测胰胆管异常以及呼吸衰竭 等疾病“”1 。纤维素酶可治疗消化不良，食欲不振等疾病，改善便秘，胃涨 的现象。”1 。 2 2 酶在食品方面的应用 纤维素酶在食品工业中应用广泛。2 “。在进行酒精发酵时添加纤维素酶 可显著提高酒精和白酒的出酒率和原料的利用率。将纤维素酶应用于啤酒工 业的麦芽生产中可增加麦粒溶解性，加快发芽，减少糖化液中单一葡萄糖含 量，改进过滤性能，有利于酒精蒸馏。纤维素酶还可用于进行大豆、茶叶加 工以及生产单细胞蛋白。蛋白酶对肌肉的肌动蛋白和胶原蛋白有很强的水解 作用，食品： 业上用它来处理肉类，可提高肉类的嫩度，使得口感更好；蛋 口 白酶对啤酒还具有良好的澄清效果，用蛋白酶处理啤酒，不仅能够提高啤酒 的澄清度、色度质量、蛋白质含量，而且能较长时间保持其澄清度效果及各 指标的稳定性。这是因为蛋白酶使酒样中的大分子蛋白质分解生成了可溶于 酒中且稳定的小分子多肽等物质，这有利于提高啤酒的品质和营养价值。蛋 白酶应用于乳制品中还能加速乳的凝固，促进乳凝块的产生“”“。将淀粉酶 应用于面包的烘焙中可以改善面团特性，提高发酵性能，从而获得柔软性， 稳定性更好的面团；还可赋予面包心良好的质地，防止面包老化，延长面包 货架寿命。淀粉常被用于制造冷食品中，由于淀粉容易老化，因此食品常 会出现生淀粉味，当加入淀粉酶后，使得淀粉水解成糊精，解决淀粉老化的 问题，消除生淀粉昧，而且还可适度增加淀粉用量，使得成本降低。3 “。 2 3 酶在工业上的应用 酶广泛用于制浆工业。5 。“1 ， a c o b s 等人研究了纤维素酶预处理硫酸盐法 制浆。结果发现，酶处理后，纸浆卡伯值降低1 0 ，漂白时c 1 0 2 消耗减少 约9 k g t 浆，纸浆强度性能与未经酶处理的相当，但粘度下降。王高升等人 “2 1 采用3 种纤维素酶对非接触印刷废纸进行脱墨，结果表明，纤维素酶能促进 油墨从纤维素上分离，改善非接触印刷废纸脱墨效果。经过脱墨后的纸张不 但白度高、残留油墨量少、虑水性能好，而且具有优良的结合性能。酶在轻 工业和化学工业方面有多种用途“3 。例，用酶进行原料处理，用酶生产各种轻 工、化工产品，用酶增强产品的使用效果：如在纺织工业中，为了增强纤维 多种水解酶的荧光分析新方法研究 的强度和光滑性，便于纺织，需要先行上浆，将淀粉用a 一淀粉酶处理一段 时间，使黏度达到一定的程度就可以用作上浆的浆料，纺织品在漂白、印染 之前，还需要将附着在其上的淀粉浆料等除去，利用a 一淀粉酶使淀粉浆料 水解，就可以使浆料退尽，这称之为退浆。又如，有些纤维原料的表面附着 一些短小纤维，用这种纤维制成的纺织制品外观质量受到一定的影响。采用 纤维素酶处理，使表面的短小纤维水解除去，可以使纤维表面柔和、光滑、 有光泽，显著提高制品的质量。再如，天然蚕丝的主要成分是不溶于水的有 光泽的丝蛋白。丝蛋白表面有一层丝胶包裹着，在绞丝过程中必需进行脱胶 处理，采用蛋白酶可在比较温和的条件下催化丝蛋白水解，进行生丝脱胶， 从而使生丝的质量显著提高。 2 4 酶在环境保护方面的应用 人类的生产和生活与自然密切相关，地球环境由于受到各方面的影响正 在不断的恶化，已经成为举世瞩目的重大问题。如何保护环境和改善环境质 量是人类面临的重大课题。而酶在环保方面的应用已日益受到关注，呈现出 良好的发展前景，主要应用于环境监测方面，废水处理方面，以及可生物降 解材料开发方面。最近j l f f 年农药豹滥用造成了严重的环境污染，为了监测 农药的的污染，人们研究了多干叶t 方法，其中采用胆碱酯酶监测有机磷农药的 污染就是一种具有良好前景的检测方法。”_ 。“。有机磷农药是胆碱酯酶的一种 抑制剂，可以通过检测胆碱酯酶的活性变化来判定是否受到有机磷农药的污 染。以己基对硫磷为例，胆碱酯酶活性受到抑制的过程如下： 尸g 溉，o c 凰。c a 簿菇一时簸一。一8 繁 在处理工业废时，可以根据l , a k 废水所含的物质采用不同的酶进行处理。如 可利用酪氨酸酶从工业废水中除去酚类等物质“”，酪氨酸酶可以催化氧化单 酚化合物一邻苯二酚类化合物一酿类化合物，后者在水溶液中不稳定，经过 一系列酶催化和化学催化反应，自身聚合或与其它物质( 有机胺类化合物等) 聚合反应形成不浴于水的大分子物质而沉淀，因此酩氨酸酶不仅除去酚类物 多种水解酶的荧光分析新方法研究 质，还能去除其它多种有机物，如有机胺、有机氛化合物等。 3 常用的水解酶检测方法 3 1 常用的蛋白酶检测方法 3 1 1 荧光法和分光光度法 荧光法和分光光度法常用来检测以血红蛋白、荧光标记蛋白、发光染料 标记的酪蛋白、胶原蛋白、明胶为底物的蛋白酶活性”j 。先用蛋白酶水解 底物，而后将所牛成的产物与底物分离，测其产物在上清的尖光强度或吸光 度。所测得的荧光强度与吸光度与所加入的酶的活性成i e 比。一般而言，荧 光法灵敏度较分光光度法高。这两种方法的主要缺点是：需在定的时间问 隔内取样，底物消耗量大：且产物与底物需完全分离，操作步骤多。 3 1 。2s d s 凝胶电泳法 s d sp a g e 电泳常被用来检测各种蛋白酶5 。其基本原理为：聚丙烯酰 氨凝胶中加入s d s 和蛋白酶底物，s d s 可使蛋白酶发生可逆变性。电泳完毕， 用t r i t o nx - - 1 0 0 恢复凝胶中蛋白酶的活性，凝胶板置于蛋白酶反应缓冲液中 进行酶解，而后用考马斯亮蓝染色，最后脱色，紫外灯照射下，底物被酶解 的部分会呈现亮带。带的亮度与蛋白酶的活性成正比。该方法，可以同时检 测同一底物的酶，灵敏度也很高，但是时间耗费较长( 约2 0 h ) ，而且每次胶 的脱色程度不一样。重复性差。 3 1 3 放射性检测法 放射法是根据放射性标记的底物，经酶解后会产生放射性的产物的原理， 来进行测量。”6 0 1 。所生成的放射性的产物的含量与酶的浓度成正比，由于底 物与产物均含有放射性，所以在测量之前必须加以分离。这种方法可以检测 到纳克级的酶量，灵敏度高，但是耗时长，有时需长达2 4 小时才能获得满意 的结果。此外，由于放射性同位素成本高、半衰期短、对人危害大、反应废 物难以处理、反应程序复杂等原因使该法的应用受到了限制。 3 1 4 生物发光法与化学发光法 生物发光法”主要是用基因重组的方式，得到一种含蛋白酶酶切位点的 荧光蛋白。将荧光蛋白n 末端生物素化，然后固定在亲合素包被的9 6 孔板上， 加入蛋白酶水解后，发光蛋白释放到溶液中，9 6 孔板上剩余的生物荧光信号 多种水解酶的荧光分析新方法研究 减弱，荧光信号减弱的程度与蛋白酶的活性有关。此方法检测时间较短，可 在5 分钟内完成。但是生物发光法的灵敏度明显不如化学发光法”“。此法所用 的荧光底物需采用基因工程技术制各，因而应用面有限。 e d w a r d s 等人1 9 9 5 年报道的化学发光法“，在测定速度及检测限上有优 势，但因需加入过氧化氢和起催化作用的钴离子，而使检测过程变长。 3 1 5 酶联法 g u t i e r r e z “。等人设计了一个多肽，其中包含一生物素化的n 末端，蛋门 酶哺切化_ i 利一c 术端抗原表位。通过n 末端生物素将其固定在用亲合素包被 的微量滴定板上，加入蛋白酶反应后，去除释放的c 末端，剩余的多肽底物与 加入的抗c 末端单抗结合，这些复合物将被此后加入的h r p d i l g 的第二抗体i g g o 所识别。通过h r p 酶促t m b 显色，可定量分析样品中蛋白酶的活力。酶促反应 显色后所产生的颜色变化间接和加入的目的蛋白酶活性有关。指示酶的加入 扩大了反应信号，增加了反应的灵敏度，而且此方法适合自动化、高通量检 测。g a n “等人用此方法检测了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶等的活性以及 它们的抑制剂含量。 此种方法都需要蛋白酶水解后分解产物与底物，应此必须中止反应。用 a n s 作为标记物虽能够连续的检测酶解反应，但在较高背景干扰下，很难测得 荧光的轻微下降。而且，一些酶并不作用于a n s 结合于蛋白的位点。 3 1 6 自猝灭荧光法 自猝灭荧光法“6 、6 7 3 是在蛋白底物上标记大量的荧光染料，使其荧光大部 分被猝灭。蛋白酶水解后，荧光基团在水溶液中分散，使体系荧光强度e 升。 荧光强度的增强幅度与蛋白酶的活性成正比。此法操作简便，但是在标记蛋 白日寸很难获得荧光的充分猝灭，而且受背景荧光的干扰较大，灵敏度和检测 范围都因此而受到影响。 3 1 7 荧光共振能量转移 l a t t 等人合成了一段多肽连接荧光供体和受体，多肽中含有蛋白酶的 酶切位点，维持这样的近距离可以发生由荧光供体向受体的能量转移，直接 的表现就是供体产生的荧光强度比它单独存在时要低得多，当蛋白酶水解多 肽后，荧光供体和受体分散到溶液中，其浓度不足以使它们的距离达到发生 多种水解酶的荧光分析新方法研究 共振能量传递的范围内，供体荧光恢复，其增强的幅度与加入的蛋白酶的含 量成正比。此法易于操作，可实现均相、实时分析；但需进行多肽合成，及 荧光双标记，因而费用高。而且底物也非天然的，难以作为通用的蛋白酶检 测法。 3 2 纤维素酶测定技术 3 2 1 椭圆偏光法 。 椭偏光谱“”学是一种利用线偏振光经样品反射后转变为椭圆偏振光这 性质以获得样品的光学常数的光谱测量方法。它区别于一般的反射投射光谱 的最主要特点在于不直接测算光强，而是从相位空间寻找材料的光学信息， 这一特点使这种测量具有极高的灵敏度。j o n n y 等人利用椭圆偏光法检测纤 a 维素酶作用于纤维素薄膜的过程，无需分离底物与产物，可以做到实时测定 ”“。然而，这种方法在具有较大背景噪声的红外波段难于实现。 3 2 2 分光光度法 t h o m a sk “”等将纤维素用r e m a z o lb r i l l i a nb l u e 或e t h y l e n e d i a m i n e 等染料染色，作为酶解的底物。当水解反应达到平衡后，测其产物的吸光度 值。吸光度值与所加入的酶量成正比。该方法的不足就在于：灵敏度不高， 需分离底物与产物，若分离不完全还将干扰测定结果，底物用量也很大。 3 2 3 荧光光度法 w i l l i a mh e l b e r t ”1 等人用氨基化荧光素( a m i n o f l u o r e s c e i n ) 共价标记 纤维素分予作为底物，检测纤维素酶的活力。待纤维素酶水解纤维素达到平 衡后，测定体系的荧光强度值。此方法灵敏度欠佳，标记过程比较复杂，测 定过程受背景荧光干扰较大。 3 2 4 液相色谱法 j o z s e fm e d v e ”曾利用液相色谱法检测纤维素酶( 主要是葡聚糖内切酶 和葡聚糖外切酶) 水解纤维素的反应体系，以确定参与反应的纤维素酶量与 酶活力。液相色谱仪中带有一个阴离子交换套色版，当反应体系进入仪器内 后，漂浮在溶液中的未参与反应的纤维素酶将被套色版所吸附，由已知加入 的酶量与所测得的酶量可计算出参与反应的酶量。通过测定所生成的产物从 而确定酶的活力。此方法可测到纳克级的酶量。但操作繁琐，耗费较高，较 多种水解酶的荧光分析新方法研究 难应用于实际中。 3 3 淀粉酶的检测方法 3 3 1 凝胶扩散法与凝胶电泳法 m a s o jp 7 4 报道的测定d 淀粉酶活性的凝胶扩散法是在直径约为l o o m 的培养皿中灌入沸腾的琼脂糖、淀粉混合物作为底物，冷却成胶后，均匀打 孔，在孔中加入淀粉酶，进行酶解反应，待反应平衡后，取出凝胶进行染色、 淋洗，由于淀粉酶孔周围的淀粉已被其分解，应而在染色后，凝胶j ：出现一 个未能染色的圆，无色圆的直径与酶的含量成正比。次方法较为灵敏，但所 采用的凝胶厚薄、染色、淋洗等操作均不易掌握。培养皿越大，厚薄均匀度 越难控制，而且每个培养皿测定的样品数量极为有限，培养皿之间也可能会 。 出现较大差异，因此难以用于大批样品的分析和不同时问测定结果之间的相 互比较。s k a d e n ”报道的凝胶电泳测定。一淀粉酶活性需要电泳槽设备，要 控制电泳电压和电流，染色脱色方法也较为复杂。 3 3 2 近红外分光法 m b l a n c o “”等人曾用近红外分光技术检测淀粉酶水解淀粉的过程，以测 定酶的活力。并根据他将所合成的混合糖水解率的最小二次方作为标准模式 制定标准曲线，用来分析淀粉被淀粉酶水解的过程。浚法可以做到实时测定， 但标准曲线的制作比较麻烦，而且准确度并不高。 4 论文设想 酶对我们的生产生活有着不可估量的作用，因此对它的研究也变得尤为 重要，本研究利用荧光光度计的特征，通过对底物进行荧光标记，测定酶水 解的活力，并做到定性与定量。旨在研究测定酶活的快速、简便、灵敏、稳 定的技术。 拟采用四甲基异硫氰酸罗丹明( t m r i t c ) 标记牛血清白蛋白( b s a ) ，由 于罗丹明所带的异硫氰酸基是高活泼性的氨基反应性基团，很容易与蛋白质 上的伯氨基发生共价偶联反应，从而使t m r i t c 与蛋白质牢固结合，制得 t m r i t c b s a 共价偶联物。根据荧光各向异性原理，游离的t m r i t c ( 小分子) 由于有着较大的运动自由度，而具有较小的荧光各向异性，当其与蛋白质( 大 分子) 结合后，其分子运动受到限制而导致荧光各向异性明显增加。如在 6 多种水解酶的荧光分析新方法研究 t m r l t cb s a 偶联物中加入蛋白酶，由于蛋白质被降解成较小分子量的多肽片 断，t m r i t c 的运动又得到相当大程度的恢复，其荧光各向异性又变小。变小 程度与加入的酶量相关，据此可建立溶液中蛋白酶的直接( 均相) 测定法。 如在体系中加入蛋白酶抑制剂，则酶的活性受到抑制，则上述荧光各向异性 变小的趋势减缓，依此现象又可建立测定或研究蛋白酶抑制剂的方法。 还拟用吖啶橙标记纤维素与可溶性淀粉分子，当纤维素与淀粉溶于水中 时，旷电离使其带有众多负电荷，而吖啶橙带有正电荷，当吖啶橙标记纤维 素时，由于纤维素与淀粉分子的负电荷被结合上的吖啶橙所中和，分子之间 的静电斥力减小，彼此聚集产生沉淀，从溶液中析出，以此作为反应的底物。 当加入纤维素酶与淀粉酶后，底物被降解，所结合的吖啶橙分散到上清溶液 中，直接表现为，上清溶液荧光强度的增加，增加的程度与加入的酶量成正 比。据此，可建立测定纤维素酶与淀粉酶的荧光分析法。 17 多种水解酶的荧光分析新方法研究 5 参考文献 1 f a nf s ，p a u l t o p i c a lp a p a y a j 2 b a r r a q u e rj m ，g e i s e t as e ta 1 t h et r e a t m e n to fp a e d i a t r i cb u r n su s i n g b u r n s ，1 9 9 9 ，2 5 ：6 3 6 6 3 9 t o t a l el i n s e u e x t r a k t i o nn a c ha u s l o s u n gd e rz o u u l ad u r c h u c h y m o t r y p s i n j k 1i n ，m b l a u g e n h k ，1 9 5 8 ，1 3 3 ：6 0 9 a n ds md r a n c e ：t h eu s eo fd c h y m o t r y p s i ni nc a t a r a c t aa r c h ie so fo p h t h a i 1 9 6 0 6 3 ：9 1 0 4 t t r u b y ，k ，d i ee x p r e s s i o nd e rk a t , a r a k tn a e hz o n u l o l y s e j k l i n m b l a u g e n h k ，1 9 5 9 ，1 3 ：5 2 7 5 l l u r i ec a t a r a c te x t r a c t i o nb ye x p r e s s i o n j b r i t jo p h t h a l 1 9 6 1 ，4 5 1 3 3 ， 6 r i c h m 、dae i l l i s ，c a t a r a c te x t r a c t i o nw i t ht h em o d i f i e ds m i t h s t e c h n i q u e j ，a m e t j o p h t h a l ，1 9 6 1 ，5 1 ：2 6 7 k a i i n o v a k i iv p ，g a m a i u n o v av b ，s h u m a k o va p ，e ta i r a d i o i n u n o a s s a yo fs e r u m p e p s i n o g e nii nc h r o n i cg a s t r i t i sa n ds t o m a c hc a n c e r j ，v o p ro n k o l ，2 0 0 0 ，4 6 1 5 3 - 1 5 5 8 k i t a h a r af ，k o b a y a s h ik ，s a t ot ，e ta 1 a c c u r a c yo fs c r e e n i n gf o rg a s t r i c c a n c e ru s i n gs e r u mp e p s i n o g e nc o n c e n t r a t i o n s j g u t ，1 9 9 9 ，4 4 ：6 9 3 6 9 7 9 m o n t g o m e r ya ，b o r g s t r o ma ，h a g l u n du p a n c r e a t i cp r o t e a s e sa n di n t e s t i n a l m u c o s a li n j u r y a f t e ri s c h e m i aa n d r e p e r f u s i o n i nt h e p i g i g a s t r o e t e r o l o g y ，1 9 9 2 ，1 0 2 ( 1 ) ：2 1 6 2 2 j s a i n i o vk e m p p a i n e n ep u o l a k k a i n e n p h e a p i a i n e n r k i v i l a a k s oes c h a u r m a nk o s t e m a nu i u r i n et r p s i n o g e n 2a sm a r k e ro fs c u t e p a n c r e a t i t i s j c 1 i nc h e m 1 9 9 6 ，4 2 - 6 8 5 6 9 0 1 1 k e r n p p a i n e ne a ，h e d s t r o mj i ，p u o l a k k a i n e n p a ，s a i n i ov s 。h a a p i a i n e n r k p e r h o n i e m iv ，o s m a ns ，k i v i l a a k s o ，e o ，s t e n m a nu h ，r e p i dm e a s u r e m e n to fu r i n a r y t r y p s i n o g e n2 a s s c r e e n i n g t e s tf o ra c u t ep a n c r e a t i t i s j ne n g l j m e d ，1 9 9 7 ，3 3 6 ：1 7 8 81 7 9 3 1 2 凌贤龙胰蛋白酶与胰腺疾病 j 国外医学消化疾病分册，1 9 9 2 ，1 2 ( 3 ) 1 8 多种水解酶的荧光分析新方法研究 1 3 9 1 3 2 0 0 0 1 4 1 4 2 徐萍人巨细胞病毒蛋白酶及其抑制剂的研究进展 j ，国外医学药学分册 2 7 ( 6 ) ：3 3 0 3 3 1 h e a mm e d l a n ds t r y p s i ni n h i b i t o ra c t i v i t e so ff i b r o b l a s t si n c r e a s e w j t ha g eo fd o r n o ra n da r eu n a l t e r e di nf a m i l i a a l z h e i m e r sd i e a s e j e x p i 9 9 4 2 9 ( 6 ) ：6 1 l 一6 1 5 1 5 李丽琴，郑晓军，车乐贵蛋白酶体抑制剂药理活陛的研究进展 l t 国外医 学筠学分册，2 0 0 1 ，2 8 ( 3 ) ：t 3 2 1 3 6 1 6 g u e h u dm ，m o r e r ac ，r o d r i g u e zme ta l p a n c r e a t i c o b i l i a r yu n i o ni nc h i l d r e na n da d o l e s c e n t s j g a s t r o i n t e s te n d o s c o 1 9 9 9 5 0 ( 2 ) ：1 8 9 1 9 3 p a n c r e a t i c o b i l i a r y 4 5 5 4 i t a k u r a j ， e ta 1 r e c e n ta d v a n c e s jn jh e p a t o b i1i a r yp a n c r e a ts u r g ，2 0 0 2 ，9 ( 1 ) 1 8 a t s u m i y sn ，t a n a k am ，1 w a im ，e ta i e l e v a t e da m y l a s eisr e l a t e dt ot t l e d e v e l o p m e n to fr e s p i r a t o r yf a i l u r e i no r g a n o p h o s p h a t ep o is o r t i n g j h a me x p t o xi c o l ，1 9 9 6 1 5 ( 3 ) ：2 5 0 2 5 3 1 9 g o k e ly g u l a l pb ，a c i k a l i na ，e ta lp a r o t i t i sd u et oo r g a n o p h o s p h a t e i n t o x i c a t i o n j jt o x i c o lc 1 i nt o x i c o l ，2 0 0 2 ，4 0 ( 5 ) ：5 6 3 5 6 5 2 0 w e n k ，c ，k o l l i k e r ，r ，m e s s e k o n e r ，r w h o l em a i z ep k a n t si nd i e t sf o r g r o w i n gp i g s ： e f f e c to ft h r e ed i f f e r e n t e n z y m e s o nt h e u t i l i z a t i o n a i n ：w e n k ，c ，b o e s s i n g e r ，m ，e n z y m e s i n n u t r i t i o n c ，k a r t a u s e u t t i n g e n ，t h u r g a u ，s w i t z e r l a n d ，t 9 9 3 ，1 6 5 1 6 9 f e e d a n l m 8 1 2 1 g r a h a m ，h ，f a d e l ，j g ，n e w m a n ，c w e t a 1 e f f e c to f p e l l e t i n g a n d g l u c a n a s es u p p l e m e n t a t i o no nt h ei l e a la n df e c a ld i g e s t i b i l i t yo f a b a r l e y b a s e dd i e ti nt h ep i g j j o u r n a lo fa n i m a ls c i e n c e ，1 9 8 9 ，6 7 ，1 2 9 3 1 2 9 8 2 2 r a h i n o v i c hml ，m e l i n i k m s ，b o l o b o n a av ，c e l l u l a s e sf r o m m i c r o o r g a n i s m s j p r i mb i o k h i mm i k r o b i o l ，2 0 0 2 ，3 8 ( 4 ) ：3 5 5 3 7 3 【2 3 2 4 b a ny w 。e ta 1 f o o dt e c h n o l j 1 9 7 1 ( 2 ) ：3 2 3 5 l e e ，y lt f a nb i o t e c h n o l o g ya n db i o e n g i n e e r i n g j 1 9 8 2 ， 2 4 ( 1 1 ) 9 多种水解酶的荧光分析新方法研究 2 3 8 3 2 4 0 6 2 5 g r a s s i nc ，f a u q u e m b e r g u ep f r u i tj u i c e s m ，e db yg o d f r e yt ，w e s ts i n d u s t r i a le n z y m o l o g y 2 n de d u k ：m a c m i1 a n ，1 9 9 6 ，2 2 6 2 3 4 2 6 s s u z a n en i e ls e n ，e ta 1 a g r i c j ，f o o dt h e m ，1 9 9 8 ，3 6 ：8 9 6 9 0 2 2 7 yb l e e ，d j s e h n e r ta n dc ra s h m o r et e n d e rjz a t i o no fm e a tw ic h g i n g e rr h i z o m ep r o t e a s e j ，j o u r n a lo f f o o ds c i ，1 9 8 6 ，5 i ( 6 ) ：1 5 5 8 1 5 5 9 2 8 e ht h o m p s o n ，id0 ie g e rp h i z o m ea 1 0 ws o u r c e o fp r o t e o y t i ce u z y l l l e j ，j o u r n a lo f f o o d8 c i ，1 9 7 3 ，3 8 ( 4 ) ：6 5 2 6 5 5 2 9 c h u n g h e ek