（发育生物学专业论文）amphicks1、shh在动物胚胎发育和器官形成中的表达模式研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盘五日期：2 2 q 5 ，2 1 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许沦 文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：堑矗 导师签名： 山东大学硕士学位论文 英文缩写 a p b c i p b s a d e p c d i g d m f d m s 0 e d t a e g t a h m o p s n b t p b s p c r p v p r p m s d s s s c u 符号说明 英文全名 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y - p h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i g o x i g e n i n d i m e t h y lf o r m a m i d d i m e t h y ls u l f o x i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d e e t h y l e n eg l y c o l b i s ( 2 - a m i n o e t h y l e t h e r ) 一t e t r a a c e t i ca c i d h o u r 3 - n m o r p h o l i n o 】p r o p a n e s u l f o n i ca c i d n i t r ob l u et e t r a z o l i u m p h o s p h a t a t e b u f f e r e d s a l i n e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e i j n i t 中文 碱性磷酸酶 5 溴4 氯一3 吲哚磷酸盐 牛血清白蛋白 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲基甲酰胺 二甲基亚砜 乙二胺四乙酸 乙二醇双( 2 - 氨基乙基) 四乙 酸 小时 3 ( n 一吗啡啉) 丙磺酸 硝基四氮唑盐 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙烯吡咯烷酮 每分钟转数 十二烷基苯磺酸钠 标准柠檬酸盐溶液 酶活单位 山东大学硕士学位论文 a m p h i c k s l ，s h h 在动物胚胎发育及器官 形成中的表达模式研究 摘要 第一部分：c d c 2 8 激酶调节亚单位( c d e 2 8k i n a s er e g u l a t o r ys u b u n i t s ，c k s ) 是一些细胞周期调节必需的小蛋白质，分子量9 1 8 k d a ，构成c k s 家族。自从 1 9 8 6 年在芽殖酵母中发现c k s l 基因至今，在酵母、线虫、非洲爪蟾及人等生 物中研究揭示，c k s l 在细胞周期中对于c d k 功能和细胞分裂以及c d k 抑制 因子p 2 7 的泛素蛋白水解具有重要作用，是一类重要的细胞周期调控因子，并 可能与人类某些癌症的发生有关。但目前关于c 鼢基因在文昌鱼中的研究还没 有报道。头索动物文昌鱼是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物，是研究脊 椎动物的起源与进化和基因进化的理想模型。对文昌鱼中c k s l 的同源基因进行 研究必将为我们了解该基因的起源和进化、文昌鱼的发育机制以及人类癌症的 发生机理提供新的线索。通过对文昌鱼神经胚e d n a 文库进行测序，首次获得 了编码文昌鱼a m p h i c k s l 样蛋白基因的e d n a 序列，并将该序列命名为 a m p h i c k s l ( c d c2 8p r o t e i n k i n a s e l i k e p r o t e i ng e n e ，g e n e b a c k a c c e s sn o a a k 9 1 2 9 5 ) 。通过与多种脊椎动物和无脊椎动物进行同源性比较，结果显示 c k s l 与人或家鼠的同源性为7 7 ，非洲爪蟾的为7 3 4 ，果蝇的为7 7 ，帽贝 的为7 5 ，线虫的为4 7 9 ，酵母的为3 1 1 表明青岛文昌鱼a m p h i c k s l 基因 在进化上具有较高保守性。同时说明，在进化上介于脊椎动物和无脊椎动物之 间的文昌鱼，由a m p h i c k s l 基因所编码的a m p h i c k s l 样蛋白更接近于脊椎动物 c k s l 蛋白。s o u t h e r nb l o t t i n g 分析表明，a m p h i c k s l 基因在文昌鱼基因组中只 有一个转录本，为单拷贝基因。通过n o r t h e mb l o t t i n g 和原位杂交实验研究了 a m p h i c k s l 基因在文昌鱼早期胚胎及幼体发育过程中的表达图式。该基因首先 在卵裂期细胞中表达，囊胚期表达水平下调，原肠期在中、内胚层表达，从神 经胚期到幼体时期在发育中的脊索、口、咽鳃区、消化道及尾等器官中表达。 结果表明，a m p h i c k s l 基因在发育早期是母源性的，可能与卵裂期细胞的分裂 2 山东大学硕士学位论文 有关。原肠胚期以后，该基因开始以合子基因的形式表达，先后参与了中、内 胚层的分化，脊索的形成以及口、咽鳃区、消化道、尾等器官的发育过程，是 一种重要的发育调控因子。本文首次克隆文昌鱼a m p h i c k s l 基因，并研究了该 基因在文昌鱼胚胎发育中的时、空表达图式，为了解a m p h i c k s l 基因在文昌鱼 中的功能和文昌鱼发育机制提供了新的证据。 关键词：文昌鱼，a m p h i c k s t ，保守，发育调控 第二部分：s o n i ch e d g e h o g ( s h h ) 是果蝇体节极性基因h e d g e h o g 在脊椎动 物中的同源基因之一，它所编码的分泌性糖蛋白分子作为一种成形素 ( m 0 r p h o g e n ) ，在多种器官的发育与形成中起着重要作用，是与生长发育密切 相关的信号传导因子。本文以海兰白种鸡为实验动物，用原位杂交的方法研究 了s h h 基因在鸡中枢免疫器官胸腺和法氏囊的早期发育中的表达图式，探讨s h h 基因在这些器官发育中的作用。在早期鸡胸腺发育中，s h h 基因分别在8 天一 1 4 天鸡胚整个胸腺的上皮性网状细胞中表达，其中1 2 天鸡胚胸腺上皮索表达 强烈，1 4 天鸡胚胸腺皮质部上皮性网状细胞中的表达强于髓质部；1 4 d 以后， s h h 基因主要在胸腺表皮及近表皮的皮质有微弱表达。结果表明，s h h 基因参与 胸腺上皮细胞的发育，诱导胸腺的形成，可能与上皮细胞诱导的淋巴细胞的形 成和发育有关。在法氏囊的研究中发现，s h h 基因在9 天上皮性法氏囊的上皮 细胞中表达：在1 4 天法氏囊滤泡的网状上皮中强烈表达。结果提示，跏 基因 与法氏囊滤泡上皮细胞的发育和形成有关。通过鸡胚的研究，首次阐明了s 砌 基因在中枢免疫器官胸腺和法氏囊早期发育中的作用为s h h 信号分子的功能 研究提供了新的证据。同时也为了解h e d g e h o g 基因家族的功能和进化提供了 依据。 关键词：s h h ，胸腺，法氏囊，上皮细胞，发育 山东大学硕士学位论文 e x p r e s sio np a t t e r nr e s e a r c ho fa m p hi c k si 。s h h lna nim a l e m b r y od e v e l o p m e n ta n do r g a nf r o m a t10 n a b s t r a c t f i r s tp a r t ：t h ec k s ( c d ck i n a s es u b u n i t ) f a m i l yi sc o m p o s e do fs m a l lp r o t e i n s ( 9 18 k d a ) t h a tp e r f o r me s s e n t i a lf u n c t i o ni nt h ec e l lc y c l e s i n c ec k s lh a sb e e n f o u n di nb u d d i n gy e a s ti n19 8 6 ，t h er e s e a r c hi ny e a s t ，c e l e g a n s ，a f r i c a nc l o w e d f r o ga n dh u m a n s h o w e dt h a tc k s lw a sn e c e s s a r yt oc d k a c t i v i t ya n dc e l ld i v i s i o n i tc o u l df a c i l i t a t et h eu b i q u i t i n m e d i a t e dp r o t e o l y s i so ft h ec d ki n h i b i t o rp 2 7v i a i n t e r a c t i o nw i t ht h es c f s k p 2u b i q u i t i nl i g a s e t h e r e f o r e ，c k s lw a sa ni m p o r t a n t r e g u l a t o r y f a c t o ri nc e l l c y c l e ，e v e nr e l a t i n g t oc a n c e r h o w e v e r , t h e i rp r e c i s e f u n c t i o n sh a v er e m a i n e dp o o r l yu n d e r s t o o ds of a r t h e r ei sr i o r e p o r to nc k s li n a m p h i o x u s a m p h i o x u s ，c e p h a l o c h o r d a t a ，w a sa ni n v e r t e b r a t et h a tt h en e a r e s tt o v e r t e b r a t e i tw a sa ni d e a lm o d e la n i m a lt h a ts t u d i e dt h e o r i g i na n de v o l u t i o no f v e r t e b r a t ea n dg e n e o u rr e s e a r c ht oc k s li na m p h i o x u sw i l lp r o v i d en e wc l e w sf o r u n d e r s t a n d i n gt h eo r i g i n a n de v o l u t i o no fc k s l ，d e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s mo f a m p h i o x u sa n dt h ep a t h o l o g yo fc a n c e r ：b ys e q u e n c i n gt h eq i n g d a oa m p h i o x u s e d n a l i b m r y ，w eo b t a i n e dt h ec k s lh o m o l o g u ee d n as e q u e n c ef o rt h ef i r s tt i m e ， n a m e d a m p h i c k s l ( c d c 2 8p r o t e i nk i n a s e l i k ep r o t e i ng e n e ，g e n e b a c ka c c e s sn o a a k 9 1 2 9 5 ) w ea n a l y z e di t s f r a m ea n dc o m p a r e di tw i t l lo t h e ra n i m a l sc k si p r o t e i n t h ei d e n t i t y w i t hh u m a n ，h o u s em o u s e ，a 衔c a nc l o w e df r o g ，f r u i t f l y , c o m m o n l i m p e t ，c e l e g a n s ，y e a s tw a s7 7 ，7 7 ，7 3 4 ，7 弼，7 5 ，4 7 9 ，3 1 i r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta m p h i c k s g e n ew a sc o n s e r v e di ne v o l u t i o n a n d a m p h i c k s l l i k ep r o t e i nw a s c l o s e rt os o m ev e r t e b r a t e sc k s l s o u t h e r n b l o t t i n g a n a l y s i ss u g g e s t e dt h a t t h e r ew a so n l yo n ea m p h i c k s lt r a n s c r i p ti n a m p h i o x u s g e n o m ea n da m p h i c k s lw a s as i n g l ec o p yg e n e f u r t h e r m o r e ，w er e s e a r c h e di n t o t h ee x p r e s s i o no f a m p h i c k s li na m p h i o x u se m b r y ob yn o r t h e r nb l o t t i n ga n dw h o l e 4 山来大学硕士学位论文 m o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n a m p h i c k s lw a sf i r s te x p r e s s e di no o c y t ea to o g e n e s i s s t a g e t h ee x p r e s s i o nb e g a n t od o w n - r e g u l a t ea tb l a s t u l as t a g e a tt h eg a s t r u l as t a g e ， t h ee x p r e s s i o n 、怫d e t e c t e di nt h em e s o b l a s ta n de n d o b l a s to f a m p h i o x u se m b r y o f r o mt h en e u r u l a s t a g e t o7 2 hl a r v a , t h e e x p r e s s i o n w a sm a i n l yd e t e c t e di n d e v e l o p m e n t a ln o t o c h o r d ，o r e ，p h a r y n x ，g u ta n dt a i l b u d t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a t a m p h i c k 3 1w a sam a t e m a g e n ea n dp a r t i c i p a t e d i nt h ec e l ld i v i s i o n d u r i n g o o g e n e s i ss t a g e a f t e rg a s t r u l as t a g e ，t h i sg e n eb e g a nt oe x p r e s si nt h ef o r m so f z y g o t i cg e n e a n d p a r t i c i p a t e d i nd i f f e r e n t i a t i o no fm e s o b l a s ta n d e n d o b l a s t , f o r m a t i o no fn o t o c h o r da n dd e v e l o p m e n to fs e v e r a lo r g a n si n c l u d i n go r e ，p h a r y n x ， g u ta n dt a i l b u d i ts e r v e da sad e v e l o p m e n t a lr e g u l a t o r yg e n ed u r i n gt h i sp r o c e s s h e r e 、f o rt h ef i r s tt i m e ，w ec l o n e dt h ea m p h i c k s lg e n ei na m p h i o x u sa n dr e s e a r c h e d i n t oi t sf u n c t i o ni nd e v e l o p m e n t a l a m p h i o x u se m b r y o s t h e s ed a t aw i l lp r o v i d en e w e v i d e n c e sf o r d e e p e r l yu n d e r s t a n d i n g t h ec k s lf u n c t i o na n d m a s t e r i n g t h e d e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s m o f a m p h i o x a s k e y w o r d s ：a m p h i o x u s ，a m p h i c 勉 ，c o n s e r v a t i o n ，d e v e l o p m e n t s e c o n d p a r t ：t h e s e c r e t e d g l y c o p r o t e i n s o n i c h e d g e h o g ( s h h ) ，a v e r t e b r a t e h o m o l o g u eo ft h ed r o s o p h i l as e g m e n tp o l a r i t yg e n eh e d g e h o gp r o d u c t p l a y s i m p o r t a n tr o l e si np a t t e r n i n gt i s s u e so f t h ev e r t e b r a t ee m b r y oi n c l u d i n gt h ec e n t r a l n e r v o u ss y s t e m s h hw a sa n i m p o r t a n ts i g n a lt r a n s d u c t i o nf a c t o rr e l a t i n gt ot h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t u s i n gt h eh a i l a n b a ic h i c k sa se x p e r i m e n tm a t e r i a l ，w e s t u d i e dt h e e x p r e s s i o np a t t e r n o fs h hi n t h y m u s a n db u r s ao ff a b r i c i u sf o r u n d e r s t a n d i n gt h er o l eo fs h hi no r g a nd e v e l o p m e n t d u r i n gt h ed e v e l o p m e n to f t h y m u s ，s h hw a se x p r e s s e di nt h ee p i t h e l i a r e t i c u l a rc e l l so fw h o l et h v m a so nt h e 8 m - 1 2 山d a y a n do n1 2 t l ld a y ，s h hw a sa l s oe x p r e s s e di nt h ee p i t h e l i a lc o r d ，w h i c h w i l lf o r mi n t e r v a lo ft h y m u sl o b u l e si nt h ef u t u r e o n 1 4 。d a y ，e x p r e s s i o nw a s d e t e c t e di nt h ew h o l e t h y m u s b u t t h ee x p r e s s i o ni nt h y m i cc o r t e xw 越s t r o n g e rt h a n i nt h y m i cm e d u l l a - a r e r1 4 山d a y ，t h ee x p r e s s i o ni nt h y m u sb e g a nt od e c l i n ea n d w a sm a i n l yd e t e c t e di ne p i d e r m i so f t h y m u sa n dt h y m i cc o r t e xn e a rt h ee p i d e r m i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts h h p a r t i c i p a t e di nt h ed e v e l o p m e n t o f e p i t h e l i a lc e l l si nt h e 山东大学硕士学位论文 t h y m u sa n dw e r ep r e s u m a b l yr e l a t e dt ot h ef o r m a t i o no fl y m p h o c ”e st h a ti n d u c e d b ye p i t h e l i a lc e l l s d u r i n gt h ed e v e l o p m e n to f b u r s a o f f a b r i c i u s ，s h hw a se x p r e s s e d i nt h ee p i t h e l i a lc e l l so nt h e9 出d a y o nt h e1 4 “d a y ，s h hw a ss t r o n g l ye x p r e s s e di n t h ee p i t h e l i a lr e t i c u l a rc e l l so ff o l l i c l ee p i t h e l i u m t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts h hw a s r e l a t e dt ot h ef o r m a t i o na n d d e v e l o p m e n t o ff o l l i c l e e p i t h e l i u m o u r w o r k d e m o n s t r a t e dt h er o l eo f s h hi nt h ed e v e l o p m e n t o f t h y m u sa n d b u r s ao ff a b r i c i u s i t w i l lb eb e n e f i tt od i s c u s st h ef u n c t i o no fs h ha n du n d e r s t a n dt h ed e v e l o p m e n ta n d e v o l u t i o no f h e d g e h o g f a m i l y ， k e yw o r d s ：s h h ，t h y m u s ，b u r s ao ff a b r i c i u s ，e p i t h e l i a lc e l l ，d e v e l o p m e n t 6 前言 综述一文昌鱼发育机制与脊椎动物进化研究进展 头索动物( c e p h a l o c h o r d a t a ) 文h 鱼( a m p h i o x u s ) 被认为是现存的与脊椎 动物最接近的无脊椎动物，从形态学和发育生物学角度，它与脊椎动物有许多 共同点，具有脊索、背神经管、肌节、鳃裂、神经肠管等，是研究动物进化和 动物胚胎发育的典型材料。 自从1 9 9 2 年h o l l a n dr w h 等 1 1 克隆了第一个佛罗里达文昌鱼 ( b r a n c h i o s t o m a f l o r i d a e ) a m p h i h o x 3 基因，并研究了它在文昌鱼胚胎发育过程 中的表达图式之后，目前报道的文昌鱼基因已有近1 0 0 个，包括脊椎动物转录 因子、生长因子、信号分子、结构基因和酶的同源基因。利用分子生物学手段， 通过对这些脊椎动物和文昌鱼等分类地位接近的一些无脊椎动物的同源基因进 行比较基因组研究和发育调控基因系统发生( p h y l o g e n y ) 的研究，并结合比较 解剖学研究，揭示了基因组、基因和发育过程在进化中的变化情况，为脊椎动 物中的基因倍增现象提供了确凿的证据，同时也对于阐明脊椎动物进化提供了 重要的实验依据。 一、基因倍增与功能进化理论 a t k i n 和o h n o 等测定文昌鱼( b r a n c h i o s t o m al a n c e o l a m m ) 基因组的大小约 为0 6p g ( 5 8 0m b ) ，大于尾索动物( 如海鞘c i o n a 基因组大小约为0 2p g ) 2 1 o 现存最古老的脊椎动物之一，七鳃鳗( 1 a m p e r y s ) ，基因组大小为1 4p g ，大约是 文昌鱼基因组的2 倍f 3 ) ，h o l l a n dr w h 等 4 】认为七鳃鳗可能代表了进化早期刚 形成的脊椎动物的基因组大小。而目前脊椎动物基因组大小主要分布在1 4 2 8 p g 。将逐渐增大的基因组与逐渐增加的发育过程和身体图式的复杂性联系起来， o l m o 降6 1 提出一个假说，认为在进化过程中，基因倍增( g e n ed u p l i c a t i o n ) 对 新的更复杂的发育机制的出现具有重要作用。基因倍增或整个基因组的倍增( 多 倍化) ，产生出了多余的基因，它们承受的自然选择压力较低，可以积累大量的 突变，直至具有新的功能，导致新的结构和发育机制的出现。这一观点已为发 育调控基因的研究所证实。 山东大学硕士学位论文 s o x i 2 3 是一类转录因子，神经胚中期，文昌鱼4 m 砸渤x 弘独基因的表达 仅限定于形成神经管的背部区域，这种表达图式保持了原始功能 7 1 ：而在脊椎 动物和果蝇中，它们的同源基因除在中枢神经系统表达外，还在脊椎动物特有 的组织鳃上基板( e p i b r a n c h i a lp l a c o d e s ) 中表达【8 l ，说明在脊椎动物中随着基因 倍增该类基因已经开始了新功能的进化。 文昌鱼的版基因主要在神经管中表达 9 1 。哺乳动物的m s x l 和m s x 2 在由神 经嵴( n e u r a lc r e s t ) 来源的头部间充质细胞中表达，包括发育中的鳃弓、腭、 牙齿和眼睛等，其表达区大部分位于脊椎动物特有的组纠旧。m s x l 基因敲除的 小鼠出现多处头面部发育缺陷】，m s x 2 基因的一个点突变被认为与人的头骨发 育异常颅缝早闭症有关。h o l l a n de w h 等推测【4 l ，在哺乳动物中由m s x 3 保持其原始的功能( 与文昌鱼中相似) ，m s x l 和m s x 2 则在进化中由于结构改 变或获得了新的调控因子，而适于在不同的区域表达，承担新的功能并参与全 新结构的形成。 文昌鱼a m p h i m n x 基因主要表达在发育的神经管区域，形成不规则点状条 斑，与运动神经元的背部间隔分布相似，它也在背部内胚层和晚期中胚层中表 达。脊椎动物中克隆到两种同源基因，m n x l 参与运动神经元的分化，m n x 2 贝1 在s h h 诱导的运动神经分化信号通路中充当m n x l 基因的上游调节予。因此d a v i d e k 等【i 习认为，m n x 2 基因功能是基因倍增后新功能积累的结果。 h e d g e h o g 基因也是如此。在果蝇和其它无脊椎动物中仅发现了一个 h e d g e h o g ( h h ) 基因，在文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a f l o r i d a e i l ”，b r a n c h i o s t o m a b e l c h e d ) 中也仅发现了一个h 1 1 基因，主要在脊索和发育中的神经管基板( f l o o r p l a t e ) 中 表达。而在脊椎动物中则具有多个h h 同源基因，包括s o n i c 肭( s h h ) 、l n d i a n h h ( 1 h h ) 、d e s e r th h ( d h h ) 等【1 4 】。其中鼢 在脊椎动物神经管、体节和肢的发育中 起着关键作用，它很可能介导了脊索的诱导作用。s h h 在艇胎中的异位表达可诱 导神经基板和生骨节标记基因的异位活化怕】。文昌鱼砌基因的表达与脊椎动 物的s h h 相似，可能代表着砌基因的原始功能。d h h 和t h h 贝l j 在不同的区域承担 了全新的功能，分别参与了精巢和软骨等的发育。 另外还有很多基因功能具有这种特点e n g r a i l e d i 】、p a x l p a x 9 博1 和 跏口讲旧1 、d l l1 2 1 2 0 1 等基因。 8 山东大学硕士学位论文 随着研究的深入，通过对文昌鱼和脊椎动物发育调控基因的功能比较研究， 人们又发现了新的事实，倍增基因在未进化之前就已经具有类似于进化后的功 能，新功能的获得只不过是功能细分化( s u b f u n c t i o n a l i s a t i o n ) 的结果。因此， l9 9 9 年a l l a nf o r c e 等【2 l 】提出另个假说，d d c ( d u p l i c a t i o n - - d e g e n e r a t i o n - - c o m p l e m e n t a t i o n m o d e l ) 模型，认为( 1 ) 调节成分中的退化( d e g e n e r a t i o n ) 突 变能够增加而不是减少倍增基因进化的几率，( 2 ) 倍增基因进化的通常机制是 旧功能的分割而不是新功能的进化。正是功能细分化使倍增基因得到大量保留 | 2 h 。发育调控基因w w 膳基因家族的进化功能证实了这一观点。 ， w n t 8 基因1 2 2 】家族在文昌鱼中是单拷贝基因，称为a m p h i w n t 8 ，系统进化分 析表明该基因的倍增发生在脊椎动物w n t 8 和w n t s b 产生分化之前。文昌鱼 a m p h i w n t 8 基因在前脑、后肠及肌节产生的近轴中胚层中表达。脊椎动物中存 在w n t 8 b 和w n t 8 两个同源基因。w n 馏6 是特异性神经组织起源的基因，主要在前 脑中表达；w n t 8 $ u 多处表达，尤其在体节早期发生处。这表明它们与文昌鱼 a m p h i w n t 8 基因具有类似的表达区域，文昌鱼4 唧俯胁培和脊椎动物w n t 8 同 源基因在早期胚胎背腹轴分化中有相似的功能，后者是前者功能的细分化。 还有一些基因在功能细分化( s u b n c t i n a l i s a f i o n ) 后又出现新功能化 ( n e o f u n c t i o n a l i s a t i o n ) ，如p i t x 基因家族。文昌鱼b b p t x 基因1 2 3 j 最初在原肠 胚中期胚孔的背部边缘表达，继而表达仅限制在原始肠管( g u t ) 的左前背 ( a n t e r o d o r s a l ) 和发育的左侧体节腔系统中。最后在e l 前凹陷( p r e o r a l p i t ) ，棒 状腺体( c l u b s h a p e dg l a n d ) 、1 2 ( o r a ) 以及尾部中胚层等左侧发育器官中表达。 人【2 4 1 、爪蟾【2 列等脊椎动物也具有相应的表达区，但它们又有自己特有的表达 部位，如胃神经( s t o m o d e u m ) 等。说明脊椎动物p i t x 2 相关基因的表达保留着 原始的特征，它们与头索动物的p 妇基因有着共同的起源，但是在进化过程 中，脊椎动物又获得了新的表达部位。 二、文昌鱼对脊椎动物进化的依据 g a n s 和n o r t h c u t t 指出，脊椎动物和原索动物的最大区别与头部有关，脊椎 动物具有精致的脑，集中的外部感觉器官和分节的肌肉化的咽，而且有骨骼支 持。因此他们认为脊椎动物的进化与头部的获得有关，脑部的延伸的区域化 ( e x t e n s i v er e g i o n a l i s a t i o no ft h eb r a i n ) 、神经嵴( n e u r a lc r e s t ) 和外胚层基板 9 山东大学硕士学位论文 ( e c t o d e r m a lp l a c o d e s ) 的出现以及咽部的精细化都可以证明这种观点。在过去 的几年里，通过对原索动物的研究发现，脊椎动物的这些独有特征其实在早期 脊索动物的进化中就已经明显存在。可以通过对现存原索动物如尾索类海鞘和 头索类文昌鱼的同源基因进行功能表达分析，来证明这种重要的进化转变的分 子学基础，这对于我们进一步了解脊椎动物基因组的进化也很有帮助。以下将 分别对文昌鱼和脊椎动物的神经系统、外胚层基板、神经嵴和咽等四种器官进 行发育进化比较，揭示文昌鱼对脊椎动物进化的作用。 1 、神经系统 脊椎动物和原索动物的明显区别之一在于它存在复杂的神经系统。一些发 育早期在神经管中表达的转录因子表明，脊椎动物的中枢神经系统沿着前后轴 分区。通过对这些基因进行分类分析得出，文昌鱼近乎简单的神经系统区域与 脊椎动物脑部的相应分区具有同源性。在脊椎动物中，o t x 基因【2 6 】的表达区域 集中在神经索的前端，覆盖了预期的前脑和中脑的后端，觑一2 7 1 基因则在后脑 脊索区之上表达。在这两个区域之间有p a x 2 , 王8 基因【2 8 】在后中脑、峡部 ( i s t h m u s ) 及后脑前部表达。而文昌鱼的单拷贝o t x 基因均在神经管的后末端 表达 2 9 - 3 0 1 ，h o x 基因表达位点在神经系统的尾部区域川。文昌鱼的h o x 基因、 o t x 基因并不相邻，而是被j p “只谬基因表达区隔开。以上说明，脑被分成三 个区域是脊索动物的共有特征。 但脊椎动物脑更加复杂，在发育过程中，这种早期的分区又进一步被分成 更小的单元，形成了脊椎动物所特有的特征。这些特征虽然在文昌鱼中不存在， 但它们却可能有共同的起源。脊椎动物前脑被细分为间脑( d i e n c e p h a l o n ) 和终 脑( t e l e n c e p h a l o n ) ，文昌鱼神经系统的前端与间脑同源，并不与终脑同源【3 2 l 。脊 椎动物的后脑也被进一步细分，产生了许多重复单位，称为菱脑节 ( r h o m b o m e r e s ) ；虽然在文昌鱼中没有形态上的表现，但是文昌鱼i s l e t 基因在 神经管区有一个重复表达区域，与脊椎动物的后脑相似3 3 i 。这个基因在发育的 六簇神经元中表达，他们紧接体节边界排列，预示了后脑分节的可能形式。h o x 基因的表达研究也说明了文昌鱼后脑区域中的一定程度的分节。a m p h i h o x l ， a m p h i h o x 3 ，a m p h i h o x 4 基因也都有一些被由前到后的两体节间隔所分开的前 端边界。文昌鱼后脑中的这些基因的表达水平并不统一，在某种程度上他们表 o 山东大学硕士学位论文 现出一种单一的分节周期性f 3 ”。虽然脊椎动物中与后脑分节有关的其它基因的 同源物( o r t h o l o g u e s ) 在文昌鱼也被发现，但是他们在文昌鱼中并不以相同的 方式表达 3 4 1 。因此，即使与脊椎动物后脑同源的文昌鱼的神经管区域的确有一 些分节组织区的迹象，但它也缺少脊椎动物的精确的组织分区。 2 、外胚层基板 基板是外胚层集中的增厚过程，存在于脊椎动物胚胎的头部，它形成了许 多特殊感觉器官的成分，如嗅觉上皮细胞，嗅觉受体神经元，内耳及其相关的 活动中心，侧线系( 1 a t e r a ll i n es y s t e m ) 和传递味觉的感受神经元1 3 “。现有的证 据表明，嗅觉和耳部基板并不是脊椎动物所特有的，在原索动物中存在它们的 同源物。文昌鱼中有许多定位的上皮感觉细胞，它们与脊椎动物的感觉细胞表 现出相似性【3 “。发育的早期，文昌鱼m s x 基因的表达标志着喙外胚层的形成， 对应于脊椎动物相关基因m s x l 的表达p ”。但有一点值得注意的是，虽然文昌 鱼有咽囊( p h a r y n g e a lp o u c h e s ) ，但它却没有脊椎动物中产生味觉神经元的鳃上 基板，这说明基板并不是与伴随脊椎动物的出现而一起进化的，而且脊椎动物 头部特异感觉器官的积累比以前认为的进化对阃更靠前，经历了更长的时空进 化。 3 、神经嵴( n e u r a lc r e s t ) 神经嵴( n e u r a lc r e s t ) 是脊椎动物所具有的关键特征，因此阐明这种组织 结构的进化也成为一直以来的研究热点。在脊椎动物发育过程中。神经嵴起源 于神经板和表皮连接处的细胞。在神经管形成时，神经嵴细胞和毗连细胞脱离， 向身体各部分预定地点迁移，形成面部神经节、周围神经系统、鳃弓间充质、 色素细胞、l 肾嗜铬细胞，以及面颅部骨骼和软骨。近年来，随着脊椎动物中一 些参与神经嵴进化的重要分子的发现，这一问题也变得更加容易解决。很明显 脊椎动物中神经嵴的遗传机制在脊索动物中很早就存在。神经嵴细胞产生于神 经底板的边缘，是胚胎外胚层和神经原始细胞相互作用产生的【3 引，由外胚层表 达的丑，印4 和b ，印7 基因介导【3 9 】。一旦神经嵴细胞被特异化，它们就表达许多基 因，包括埘奴，s l u g s n a i l 4 r a l 7 d l x 基因家族，以表明它们在背部神经管的外表面的 位置【4 0 - 4 3 1 。在文昌鱼胚胎中，已经发现单拷贝的b m p 2 4 基因在非神经系统外胚 层中表达m 1 ，m s x ，& 惦仇口f z 的同源基因在侧神经地板处表达【9 “5 1 ，d l x 基因在 山东大学硕士学位论文 神经底板边缘的外胚层中表达【“。因此，脊椎动物中参与神经嵴细胞形成的基 因在原索动物胚胎中也存在，而且预示了它们在脊椎动物中的表达方式。这些 结果强烈的证明了神经嵴由背部神经管细胞进化而来，而且两者被一种共同的 发育机制联系在起。同时也表明了神经嵴并不是脊椎动物所特有的。 4 、咽 咽分节是脊索动物门的特征，但是脊椎动物和原索动物的主要区别在于前 者的咽弓( p h a r y n g e a la r c h e s ) 已肌肉化，而且具有神经嵴延伸的骨骼支持。脊 推动物的研究表明，神经嵴在赋予咽弓特性和区域化分节中起一定的作用【”1 。 近来对文昌鱼基因表达模式的分析也说明神经嵴对咽部区域化起作用。文昌鱼 中的咽囊出现胁基因的区域化表达模式，这是脊椎动物囊袋结构