（无线电物理专业论文）细菌视紫红质质子传输机制的固体核磁共振研究.pdf

s t u d i e so ft h e t r a n s f e ri nba c上r a n s i e rl n 髟a c s t a t en u c l e a r d 印a r t m e n t ： s p e c i a l i 够： b i o m 0 1 e c u l a rs s - n m r s u p e n ，i s o r ： p r o f e s s o rx i nz h a o a u t h o r ：w dz h a n m a y ，2 0 1 1 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文细菌视紫红质质子传输机制的固体核磁共 振研究，是在华东师范大学攻读硕左博士( 请勾选) 学位期间，在导师的指导 下进行的研究工作及取得的研究成集。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人 和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：日期：出j 年岁月名日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 细菌视紫红质质子传输机制的固体核磁共振研究系本人在华东师范大学 攻读学位期间在导师指导下完成的硕征博士( 请勾选) 学位论文，本论文的研 究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此 学位论文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论 文的印刷版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、 借阅；同意学校将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检 索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制 学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论车， 于年月曰解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 导师签名本人签名 支一0 “ “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过 的学位论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有 效) ，未经上述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为 公开学位论文，均适用上述授权) 。 新硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 佑、概f 缘规醺孙锣呈磊 主席 盒赢雏萌弓硫员 j 犯影彰幺 蔷戆蓐别旋磁 脚理匆 v 一 摘要 细菌视紫红质是嗜盐杆菌产生的由2 4 8 个氨基酸所组成的一个七跨膜蛋白， 其中位于g 螺旋上的赖氨酸2 1 6 与由视蛋白封装进入的小分子视黄醛结合形成 一个希夫碱。目前它被认为是接受光照能量并将其转换为化学能量的基本结构单 元。它能够驱动光循环的发生，从而由细菌视紫红质从胞内泵运一个质子到胞外。 形成一个质子梯度，被a t p 酶用来合成a t p 能量。对细菌视紫红质的研究一方 面能够对这个蛋白的功能发挥进行解释，另一方面，它作为一个七跨膜螺旋蛋白， 可以作为研究g 蛋白偶联受体( gp r o t e i nc o u p l e dr e c 印t o r s ，g p c r ) 的模型。 固体核磁共振技术在探究膜蛋白结构与功能方面具有十分强大的优势，能够 对大分子的动态行为进行监测和表征，目前是研究蛋白结构与功能的重要工具。 由于核磁共振方法只能检测那些自旋不为零的原子核，而天然丰度的碳、氮均是 自旋为零的核。因此需要对这些核进行同位素标记。本论文所采用的方法是在培 养基中添加选择性特异性标记的氨基酸，由细菌吸收并将其转化整合到细菌视紫 红质上，细菌视紫红质即得到标记。 我们对获得的甘氨酸、丙氨酸特异性标记的细菌视紫红质样品进行了核磁实 验，包括一维谱和二维谱。在对细菌视紫红质的交叉极化实验与双量子过滤实验 进行比较发现，双量子过滤实验能够消除细菌视紫红质中天然丰度的1 3 c 、1 5 n 的信号。这将对于将来进行多标记氨基酸核磁实验简化谱图提供途径和方法上的 可能。在二维谱上主要是进行了r f d r ( r a d i o f - e q u e n c yd 打v e nr e c o u p l i n g ) 实 验，这是一个同核零量子再偶合的实验。实验结果表明，能够依据甘氨酸没有p 碳这一特殊性将标记样品中的甘氨酸和丙氨酸的谱峰进行指认。 关键词：细菌视紫红质质子传输机制固体核磁共振c p m a s 两维相关实验 化学位移偶极偶合 l i 曲t a b s o r b e db yt h ep i 鲫e n t“v e st h ep h o t o i s o m e r i z a t i o no ft l l er 如a 1 c _ h r o m o p h o r e 行o ma l l 胁l st o 13 - c i s ，w h i c h1 e a dt oav e c t o r i a l 仃a n s p o r to fap r o t o n a c r o s st h em e n l b r a n e n u c l e a rm a 萨“cr e s o n a i l c e ( n m r ) t e c h n i q u ec a no n l yd e t e c t 也o s en u c l e im a t t h e i rs p i nn u 瑚【b e ri sn o tz e m a n d 也es p i i lo fm o s em 勾o rn a t u r a la b u n d a n c e 肌c l e i ， s u c ha s1 3 c 1 5 ni sz e r o t h e r e f o r ew en e e dt o1 a b e lm o s en u c l e it od e t e c tt h e i rn m r s i g n a l i nm ye x p e r i m e i l t ，w ea d d c ds o m es p e c i a li s o t o p ela ：b e l e d 锄i n oa c i di n 廿1 e s y n t h 甜cm e d i a t h o s ea m i n oa c i dc 锄b ea b s o r b e db y 胁z d 6 口c 把一“ms 口矗，z n 刚7 ，z ，a n d b ei n t e g r a t e dm ot h eb a c t 甜o r h o d o p s i n w ea l s oo p t i m i z e dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n sa n d m ep 嘶f i c a t i o np r o c e d u r eo f b a c t e r i o r h o d o p s i n w eh a v em a d eb a c t 嘶o r h o d o p s i ns 锄p l e sc o n s i s to f1 3 c ，1 5 n1 a b e l e d9 1 y c i i la n d a 1 砒ea i l do t h e rn o n 1 a b e l e da m i n oa c i d w ec o n d u c t1 一d i m e n t i o n a la n d 2 d i m e n t i o n a ln m re x p e r i m e n t s w ec o m p a r e dt 1 1 ec p 锄dd o u b l eq u a n 衄nf i l t e r e d e ) 【p e r i m e n ta n d 缸dm a tm el a 仕e rc 觚f i l t e rt l l es i g i l a l s 舶mt l l o s e r a r en 删 a b u i l d a i l c en u c l e iw i 也s p i nl 2 1 1 1 i st e c h n i q u ec a l lb e 印p l i e dt ob a e r i o r h o d o p s i n s 锄p l e sw i mm o r e 锄i n oa c i d sm a th a v eb e e ni s o t o p el a b e l e d a n da l s 0 ，w ec o n d u c t 2 一d i m e n t i o n a lr f d re ) 【p e r i m e n t s i n c et l l e9 1 y c i l l eh a v en op c a r b o n ，w h i c hl e a dt 0 m ec o n s e q u e l l c em a tt h e r ei sn oc r o s sp e a kb e 铆e e nc a r b o n y lc a r b o na 1 1 dp c a r b o n t h i sc a nh e l pu st os p e c i 母也ep e a ka s s i g 衄e n t k e yw o r d ：b a c t i 嘶o r h o d o p s i n ，s o l i d - s t a t en m rp r o t o n 仃a n s f 打m e c h a i l i s m ，c p m a s ，c h e m i c a ls h i r ，d i p o l a rr e c o u p l i n g 目录 第一章：细菌视紫红质结构、功能研究进展及生物固体核磁共振技术简介1 1 细菌视紫红质的简介1 2 细菌视紫红质的光循环1 3 细菌视紫红质研究的焦点问题一4 4 生物固体核磁共振技术1 1 4 1 自旋相互作用1 l 4 2 固体核磁共振的基本实验方法简介1 3 5 固体核磁共振技术对细菌视紫红质的研究现状1 7 6 本论文的研究内容1 9 第二章：细菌视紫红质样品的制备2 0 1 同位素标记蛋白质的方法和策略2 0 2 细菌视紫红质大规模培养的讨论2 2 3 蛋白胨培养基和合成培养基的选用2 3 4 细菌的培养及细菌视紫红质提取纯化：2 3 4 1 细菌视紫红质培养条件的优化2 3 4 2 细菌培养流程2 5 4 3 紫膜的收获与提纯2 5 4 4 样品的质量检测2 7 4 5 细菌视紫红质固体核磁共振样品的制备2 9 第三章：细菌视紫红质的固体核磁共振初步研究3 0 1 固体核磁共振技术研究蛋白结构及相互作用的基本思路3 1 2 一维固体核磁实验3 2 3 二维固体核磁共振研究3 7 4 讨论4 1 第四章：结论与展望4 6 附蜀匙4 9 参考文献5 4 致谢6 1 第一章：细菌视紫红质结构、功能研究进展及生物固体核磁 共振技术简介 细菌视紫红质的简介 细菌视紫红质( b a c t 嘶o r h o d o p s i i l ，b r ) 是一种由生长在高盐环境中的嗜盐古 细菌( h a l o b a c t 甜u ms a l i n a n 蛐) 产生的由2 4 8 个氨基酸组成的一个七跨膜螺旋 蛋白。它能够在接受光照条件下，将细胞内的质子泵出到细胞外的光致异构离子 泵蛋白，也即是一个光驱动质子泵，与质子通道有着很大的区别，因为质子泵有 方向性，往往可以逆质子梯度运输。细菌视紫红质的方向性就在于始终是将质子 从胞内泵到胞外。细菌视紫红质在结构上由7 个跨膜螺旋几乎平行排列在一起， 其中g 螺旋上的赖氨酸2 1 6 ( l y s 2 1 6 ) 与光致异构化合物视黄醛以共价键键合形 成一种希夫碱，目前它被认为是接受光照能量并将其转移为化学能量的结构单 元。 细菌视紫红质的光循环 当细菌视紫红质受光照后，在亚皮秒级时间尺度下，全反式视黄醛异构为 1 3 一顺视黄醛导致一系列的光循环事件，从k 态到l 态到m 态到n 态再到o 态， 然后返回到原始的光适应b r 。b r 的质子泵功能是由5 个基本步骤来完成的，位 于希夫碱上的质子传递到天冬氨酸8 5 ( a s p 8 5 ) ，这触发了包含有谷氨酸1 9 4 ( g l u l 9 4 ) 、谷氨酸2 0 4 ( g 1 u 2 0 4 ) 、及水分子网络的质子释放基团( j 7 ) 释放一个 质子到胞外，随后去质子化的希夫碱又从胞内的质子供体天冬氨酸9 6 ( a s p 9 6 ) 获得一个质子，失去质子的a s p 9 6 又从胞内面上获得一个质子；最后，获质子 的a s p 8 5 将其质子传递给质子释放基团完成这一光循环。( 如图1 1 所示) 从运 输的方向或者说次序上来讲，并不是由内而外的，而是有着它自己的一个顺序。 并且有很多的步骤是偶联的。 绘制，原始p d b 数据为l c 3 w ) o br n 7k ，、 nl ， m2 7 一 m1 m2 ， 图1 2 ，细菌视紫红质的光循环与中间态 2 在这一光循环中，每一个功能单元都对应着一个或几个中间态。从x 射线 晶体衍射结果来看，当b r 接受光照后即变为k 态，这一阶段变化主要体现在希 夫碱由全反式变为1 3 顺，且希夫碱氮原子与水分子4 0 2 之间的氢键断裂( 国；由 于希夫碱的扭曲延着多烯链的延伸，希夫碱氮原子又重新与水分子4 0 2 形成氢键 而达到l 态；随后这个氢键又断裂了，希夫碱去质子化，a s p 8 5 质子化，水分子 4 0 2 移开约1 埃的距离，而靠近a s p 8 5 和a s p 2 1 2 ，这即是m 1 态( 9 ) ；在k l m 1 态过程中，希夫碱氮原子一直都是朝向胞外面的( j d ，j ) ，在m 2 态，去质子化的 希夫碱氮原子转向约1 8 0 度而朝向胞内( 这即是人们通常所说的第一质子开关 ( t h ep r i m a r yr 印r o t o n a t i o ns w i t c h ) ) ，并且不再能观察到水分子4 0 2 ，这些发现表 明，希夫碱的去质子化的驱动力在于视黄醛扭曲的弛豫，由希夫碱氮原子与 a s p 8 5 之间的质子传递是通过水分子4 0 2 介导的。但是有报道表明，希夫碱n h 键在l 态已经朝向胞内，水分子4 0 2 在k l 态转变过程中迁移到胞内边( 2 ) ，这 也导致了解释质子从希夫碱到a s p 8 5 的转递机制变得冲突起来。 事实上，天冬氨酸8 5 ( a s p 8 5 ) 从第一个步骤发生之后到最后一个步骤发生 之前一直是处于质子化的。天冬氨酸8 5 ( a s p 8 5 ) 从阴离子状态到质子化的状态 与另一个基团的状态是偶联的( j j ，_ f 3 ) ，这个基团被认为是释放质子到胞外的质子 释放基团。也即是说从m 1 到m 2 态和m 2 到m 2 态是偶联的。在p h5 到p h 9 之间两个基团都可以质子化但不能两者同时质子化( _ 7 们，这即是他们的偶联属 性。这个属性促使天冬氨酸8 5 的质子化导致另一个基团的分解释放一个质子到 胞外，在这个模型中，当天冬氨酸是阴离子的时候，质子释放基团的p k a 值是9 到1 0 ，但是当天冬氨酸8 5 ( a s p 8 5 ) 质子化后这个基团的p k a 值变为5 到5 5 ( j 5 ) 。 在m 2 态到n 态的过程中主要的事件是朝向胞内的希夫碱从供体天冬氨酸 9 6 ( a s p 9 6 ) 获得一个质子而重新质子化，目前这一过程是最难被人接受的，因 为在这一过程中存在着两个基本障碍，一是在这个长程( 天冬氨酸9 6 到希夫碱 的距离约为1 1 l m ，到胞内面上的距离约为0 6 i m ) 质子传递过程中，周围环境 都是疏水区域，缺乏质子传输途径；二是天冬氨酸9 6 的原始p k a 值很高( 1 1 ) ， 不易失去质子( j 6 ) 。这两个障碍都是由水分子的进入来克服的，在希夫碱氮原子 被去质子化之后，在这一区域，一串键合水分子即开始形成并增长( 夕，j7 - j 。 3 失去质子的天冬氨酸9 6 ( a s p 9 6 ) 将从胞内表面上捕获一个质子，在野生型 的光循环中，天冬氨酸9 6 的重新质子化与视黄醛的重新异构化为全反式是互相 偶联，同时发生的。这一过程后即产生了o 态。 光循环的最后一步即是空缺了质子的质子释放基团被天冬氨酸8 5 重新质子 化，这是一个强烈的释能反应。这个反应的驱动力在于，天冬氨酸8 5 的低p k a 值( 约2 5 ) 和质子释放基团的高p k a 值( 约9 ) 的重新建立，而这是由胞外区 的区域构象的恢复所造成的( j 9 2 j ) 。 3 细菌视紫红质研究的焦点问题 3 1 希夫碱氮氢键的朝向 由视黄醛与位于g 螺旋上的赖氨酸2 1 6 形成的希夫碱，不仅仅是吸收光能 的结构单元，在光循环中也扮演着重要的功能与结构作用。在质子传输过程中， 希夫碱上的氮氢键不断起了质子供体的作用，还由于其氮氢键周期性的由朝向胞 外面转向朝向胞内面，而被人们认为起着质子开关的作用。 从一系列的x 射线衍射结果来看( j j ) ，希夫碱氮氢键在k - l m 1 过程中， 是连续处于朝向胞外面，在k 态下它失去了与水分子4 0 2 形成的氢键，在l 态， 由于希夫碱的扭曲沿着多烯链的延伸，希夫碱氮原子又重新与水分子4 0 2 形成氢 键，到了m l 态，这个形成的氮氢键又丢失了，因为这个氮氢键断裂，希夫碱去 质子化，水分子朝向天冬氨酸8 5 和天冬氨酸2 1 2 方向移开大约o 1 m 的距离。 到了m 2 态，去质子化的希夫碱氮原子则转了大约1 8 0 度角，而朝向胞内面，水 分子也不再被观察到。 从k o u y 锄a 的报道来看( j 2 ) ，希夫碱氮氢键的约1 8 0 度转向与亮氨酸9 3 ( l e u 9 3 ) 残基的较大转动相偶联，并且观察到希夫碱氮氢键已经在l 态朝向胞 内面，水分子4 0 2 在转变过程中，从它处于近乎五角形的氢键网格( 2 2 ) 中被拖到 胞内面上。而占据由亮氨酸因旋转而腾开的位置。从其它的衍射结果看这个水分 子4 0 2 在l m 态的转变过程中进一步的朝胞内面移动。l u y 锄a 认为水分子4 0 2 与希夫碱的分开，降低了希夫碱的p k a 值，而使得希夫碱向天冬氨酸8 5 的传递 成为可能。据此可得出结论认为从k 态到l 态的转变过程中水分子的单向转移 4 是一个关键事件，它保证了质子由胞内向胞外的传递方向性。 3 2 希夫碱与天冬氨酸8 5 间的质子传递 人们已经证实，希夫碱与天冬氨酸间的质子传递是发生在l 态到m 态的转 变过程中，但是对l 态m 态观察到的不同结果( 刀) ，使得人们对于解释这个质 子传递的机制变得冲突起来，但是无论哪种解释，都认为水分子4 0 2 起着十分重 要的作用，因为它从希夫碱那里接受一个氢键，同时它又分别贡献一个氢键给处 于对称位置的天冬氨酸8 5 ( a s p 8 5 ) 和天冬氨酸2 1 2 ( a s p 2 1 2 ) 。 目前比较流行的解释有三种( j j ，2 2 ，2 旬。第一种认为，水分子是作为一种媒 介，它将希夫碱与天冬氨酸桥接起来，从而介导了质子从希夫碱到天冬氨酸8 5 的传递。第二种解释认为，水分子4 0 2 并没有参与迸希夫碱与天冬氨酸8 5 之间 的质子传递，由于处于对称位置的天冬氨酸2 1 2 与水分子的氢键的加强，水分子 4 0 2 被拉扯过来，从而使天冬氨酸8 5 更靠近希夫碱，从希夫碱到天冬氨酸8 5 之 间的直接质子传递便成为了可能。第三种则认为，在这一阶段，所谓的质子传输 事实上是一个氢氧根离子的传输，这种解释认为，水分子4 0 2 被解离为一个氢离 图l 一3 ，细菌视紫红质a s p 8 5 a s p 2 1 2 附件的关键残基、水分子及质子传递 的三个假说。左图为细菌视紫红质a s p 8 5 a s p 2 1 2 与关键水分子形成的网络。 右图为从希夫碱传递质子到a s p 8 5 的三个假说( 此图引自参考文献( 2 习) 。 子和一个氢氧根离子，氢离子被留在天冬氨酸8 5 处，而氢氧根离子则到达希夫 碱处，与其上的氢离子又结合形成一个新的水分子。至此这一过程即完成了希夫 碱到天冬氨酸8 5 的质子传递( 如图1 3 所示) 。这个氢氧根离子模型还能很好的 5 解释d 8 5 t 突变体会变成一个由胞外将氯离子转运到胞内的氯离子泵( 2 回，就如 同h a l o r h o d o p s i n 一样。虽然这个模型看起来解释的很好：但是却并不具有说服 力，水分子4 0 2 很难被解离为氢离子和氢氧根离子，水分子4 0 2 周围的偶极是否 足以能够将其极化到被解离的程度。且将细菌视紫红质与h a l o r h o d o p s i n 的比较 也受到怀疑( 2 7 ) 。 3 3 什么是质子释放来源 每经过一个光循环，细菌视紫红质都会释放一个质子到胞外，这个质子的来 源地一直是人们争论的话题( j 7 ) ，目前比较认可的来源地为位于胞外区的含有离 域化质子的水网络。质子释放的机理在于存在着一个由谷氨酸1 9 4 ( g l u l 9 4 ) 和 谷氨酸2 0 4 ( g 1 u 2 0 4 ) 维系的一个水簇复合体h 5 0 2 + ( d 。释放的质子是由两个所 谓的“z u n d e l ”水分子( 回维系的，而这两个分子又是由谷氨酸1 9 4 和谷氨酸2 0 4 维 系的。( 如图1 4 所示) 图1 4 ，细菌视紫红质质子释放位点的构成( 此图引自参考文献( 习) 精氨酸8 2 ( 趣8 2 ) 在质子释放中起着十分重要的作用，因为这个位点的任 何突变都将使质子释放功能的丧失。精氨酸8 2 与酪氨酸5 7 ( y 5 7 ) 协同将希夫 碱与质子释放区域隔离开。当天冬氨酸8 5 质子化后，使得带正电的精氨酸8 2 残基下移而朝向胞外区，这又进一步的导致了两个水分子的水合受到破坏( j7 ) ， 而趋向于形成一个h 3 0 + ，这个结构是极不稳定的，因此而解离，释放一个质子 到胞外。 3 4 质子传输与质子释放的偶联 从希夫碱到天冬氨酸8 5 的质子传输后，几乎同时一个质子被释放到胞外， 6 这表明从希夫碱到天冬氨酸8 5 的质子传输与质子释放到胞外是偶联的，而这个 偶联机制就在于精氨酸8 2 的侧链的来回穿梭( 2 回。精氨酸的胍基通过静电相互 作用与希夫碱区域的天冬氨酸阴离子联系起来，通过氢键与水分子4 0 6 联系起 来，当质子传输到天冬氨酸后，位于希夫碱区域的五角形氢键网络崩解，带正电 的精氨酸8 2 ( 魍8 2 ) 侧链移开这一区域，而朝向谷氨酸1 9 4 谷氨酸2 0 4 。这又 导致谷氨酸对谷氨酸1 9 4 谷氨酸2 0 4 区域的水簇网络崩解，释放一个质子到胞 外。这样，希夫碱到天冬氨酸8 5 的质子传输与质子释放基团到胞外的质子释放 偶联起来。 3 5 天冬氨酸9 6 到希夫碱的质子传输壁磊 希夫碱去质子化后，含有孤对电子的希夫碱氮原子从朝向胞外转向到朝向胞 内，随后从天冬氨酸9 6 ( a s p 9 6 ) 处获得一个质子。在这个过程中存在着两个显 著的障碍或壁磊，一个是在这个长程( 约1 1 m n ) 质子传递过程中，周围环境都 是疏水性区域，缺乏质子传输途径；二是此时的天冬氨酸9 6 ( a s p 9 6 ) 具有较高 的p k a 值( 1 1 ) ，不易失去质子( ，6 ) 。而这两个障碍都是水分子的进入来克服的。 c u 硎捆嘶n 们s 扛1 测 图1 5 ，希夫碱重新质子化的壁磊与胞内区水分子网络的形成模拟图( 此图引自 参考文献( 2 9 ) ) 。 事实上，在希夫碱去质子化后，在天冬氨酸9 6 ( a s p 9 6 ) 处，一串水分子簇 7 伍黔酚。陵黢豁豢秽嚣艮。犷。錾嚣k。黪霞葭。馘 即开始形成并生长( 9 ，j 7 j 8 ) 。它的原因表现为f 螺旋和g 螺旋的开裂形成可以 让水分子进入的洞穴。在m 2 态，希夫碱去质子化后氮原子转向而朝向胞内，天 冬氨酸9 6 ( a s p 9 6 ) 与苏氨酸4 6 ( t h r 4 6 ) 之间的氢键由水分子5 0 4 所代替( 如 图1 6 所示) ，将二者以氢键形式联系起来( j ) ，并且，水分子5 0 4 还与部分延伸 到希夫碱区域的水分子5 0 3 、水分子5 0 2 联系起来。据此推测，在这个状态下， 天冬氨酸9 6 的高p k a 值被降低到约7 5 ( 3 d 3 j ) ，这个值是可以观测到的。而此 时希夫碱的p i o 值约为8 ( 3 2 ) 。质子供体天冬氨酸9 6 与质子受体希夫碱氮原子存 在着一个平衡，直到由四个水分子组成的分子单链的出现推动这个平衡朝希夫碱 氮原子质子化的方向发展。 图1 6 ，天冬氨酸9 6 附近的关键残基以及苏氨酸4 6 氢键的变化。( 此图引自参考 文献( j j ) ) 在天冬氨酸9 6 随后重新质子化后的n 态，可以观察到这四个水分子单链( 水 分子5 0 3 一水分子5 0 2 一水分子5 0 6 一水分子5 0 5 ) 。希夫碱也处于质子化，但仍 然是1 3 顺。此时，在b r 态下即可观察到的水分子5 0 2 仍然与g 螺旋上的赖氨 酸2 1 6 肽键氧形成氢键，但是被拉动到一个易于与水分子5 0 3 和水分子5 0 6 形成 氢键的位置( 如图1 7 所示) 。这将沿着水分子氢键的延伸而将天冬氨酸9 6 与希 夫碱含有孤对电子的氮原子联系起来，以适于质子的传输( j j ) 。 8 3 6 天冬氨酸9 6 的重新质子化与视黄醛的弛豫 在野生型b r 光循环中，天冬氨酸9 6 的重新质子化与视黄醛的热力学弛豫 而异构化是同时发生，这之后即产生出o 态；因此第二个n 态，n 态( 天冬氨 酸9 6 被重新质子化) 往往不能被观察到。这是因为视黄醛的异构化与天冬氨酸 9 6 的质子化状态存在着一个偶联机制，之所以这样认为是因为，n 态的存在时 间不仅被视黄醛附近的残基突变所影响，而且还被天冬氨酸9 6 附近的残基突变 所影响( 3 j ) 。 图1 7 ，胞内区水分子网络的形成。( 此图引自参考文献( j 8 ) ) 表观上看这两者相隔离约1 1 n m ，这两者的偶联途径在于存在着上面提及的 由氢键联系起来的水分子单链( 水分子5 0 3 一水分子5 0 2 一水分子5 0 6 一水分子 5 0 5 ) 。水分子5 0 5 与希夫碱形成的氢键是要求希夫碱氮原子朝向胞内的，当希夫 9 碱氮原子转向回到原来的朝向胞内状态时，这个由氢键维系的单链水分子将崩 解，当水分子离开天冬氨酸9 6 的区域，这将导致增加天冬氨酸的质子亲和性。 从而从胞内面上获得一个质子。捕获的途径仍然不是很清楚。但是这个机制的重 要性在于，它使得天冬氨酸9 6 的质子供体不是刚刚质子化的希夫碱。换句话说， 天冬氨酸9 6 的质子化不是上一步反应的逆反应。 虽然捕获的途径仍然不是很清楚，但是人们推测，在n n 态，这个区域另 外一个水分子链的积累和形成，为天冬氨酸的重新质子化形成了质子传递途径 ( 3 3 ) 。 3 7 有关通道与开关 细菌视紫红质是一个质子泵而区别于一个离子通道，关键在于人们认为在 b r 里头存在着一个质子开关的功能机制，也即是说它保证了质子只能从胞内泵 出到胞外而不能从胞外流进胞内。 细菌视紫红质质子开关的身份和开关机制一直以来是人们不断探究和追寻 的问题。人们认识到希夫碱氮原子在去质子化后将转向约1 8 0 度而朝向胞内面， 它保证使质子只能从希夫碱传递到天冬氨酸，而不能将质子从天冬氨酸传递到希 夫碱，在这里起到了开关作用。据此人们将视紫红质的功能简化为由两个“半离 子通道”和一个“质子开关”组成的质子泵蛋白。这一概念的提出对细菌视紫红质 功能的认识具有十分重要的的作用，一方面，它将通道蛋白与泵蛋白在定义上加 以区别，另一方面，它将希夫碱到胞内区的这一段质子传输与质子从希夫碱最终 传递释放到胞外等同起来视为“半通道”，这强调了，虽然在希天碱到胞内区这一 段是疏水区域，它仍然可能因水分子的进入而形成能够传递质子的通道。 人们逐渐意识到两个“半离子通道”加一个“质子开关”模型能够很好的解释 很多现象，但是它本身存在着缺陷，两个所谓的“半离子通道”并不能作为发挥质 子传输功能的单元，“质子开关”也不简单的仅仅是由希夫碱氮原子所能决定。其 它许多的事件都在某种程度上保证了质子传递的方向性( j7 ) ，例如：( 1 ) 在m 2 到m 2 态，由精氨酸的来回穿梭引起的质子的释放将进一步的促使天冬氨酸8 5 的p k a 值升高，进而使希夫碱与天冬氨酸8 5 之间的质子传输平衡朝希夫碱去质 子化的方向进行；( 2 ) 由色氨酸1 8 2 的倾斜和赖氨酸2 1 6 的扭曲所引发的胞内面 1 0 大尺度结构变化，使天冬氨酸9 6 的p k a 值降低，并且提供了由水分子瞬时进入 而形成的质子传输途径，它也保证了质子是从胞内传向胞外。( 3 ) 尽管在m 2 到n 态天冬氨酸9 6 到希夫碱之间的质子传递存在着一个平衡，但是在n 到n 态天冬氨酸9 6 的供体却是来自于胞内面上，而不是希夫碱。表明需要将希夫碱 与天冬氨酸9 6 之间的联系断开，这可看作另外一个可以视为“质子开关”的机制。 ( 4 ) 在光循环的最后一个步骤，细菌视紫红质从o 态恢复到光适应b r 态，这 一变化中能量需要为1 0 m o l ，它保证了不同的中间态之间的平衡大很大的程 度上得到推移以重新建立光适应态b r 。也即是说细菌视紫红质是作为一个整体 来发挥作用将质子单向的从胞内传递到胞外，而不允许质子从细胞外流进细胞 内。 生物固体核磁共振技术 所有自旋量子数不为零的原子核都有磁矩，当把这样的原子核置于外磁场中 时，原子核的磁矩呈现量子化的分布。在外磁场的作用下，原子核的简并能级发 生塞曼分裂( z e e m a ns p l i t t i n g ) ，能级差为肛。当对原子核施加频率为缈的射频 场，并且满足壳缈= 丝时，核磁矩发生能级之间的跃迁。这一现象即称为核磁共 振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a i l c e ，n m r ) 。目前核磁共振已发展出液体核磁共振 ( l i q u i d s t a t e n m r ) 、固体核磁共振( s o l i d s t a t e n m rs s - n m r ) 、磁共振成像 ( m a g i l 甜cr e s o n a n c ei m a g i n g ，m r j ) 三个比较成熟的方向。 自从固体核磁共振的先驱a l e x a u l d e rp i n e s 发现了金刚烷和苯的交叉极化现 象以来p ，固体核磁共振以飞快的速度在发展着，它被用来研究各种固态物质 的结构和动态信息，在催化剂、玻璃、多聚物、蛋白质等很多领域有广泛的应用。 固体核磁共振的成功得益于各种研究核间距、各向异性、扭转角、原子取向、自 旋扩散、分子动态行为以及交换过程等一些技术的长足进展。 4 1 自旋相互作用 通常来讲，固体里的自旋相互作用主要包括两在部分，一是外部的，如：核 自旋与静磁场的相互作用，核自旋与外加射频场的相互作用，另外就是内部相互 作用，主要包括化学位移相互作用( 通常约为1 0 k h z ) 、间接的j 偶合相互作用 ( 通常约为1 0 0 h z ) 、直接的偶极偶合相互作用( 通常约为o 1 5 0 1 ( h z ) 。 与射频场的相互作用 当有脉冲激发时，自旋与射频场发生相互作用，也即是人们通常所谓的 “z e e m a n ，相互作用。其中与自旋进动方向一致的一部分与自旋有共振作用，而与 之相反的一部分则没有共振作用，这一部分将被扔弃掉。通常它的作用效果是将 纵向磁失矢量扳倒9 0 度在x y 平面上，或者其它角度。其中扳转的速率就叫做意 章动频率。章动频率可以表示为： 协b 一 其中，表示对应原子核的磁旋比，表示射频场的强度。 化学位移 自旋核感受到的磁场强度与实际施加的磁场略有差异，这是因为，不仅仅原 子核感受到外加磁场，原子核周围的电子也感受到了外加磁场，由于电子的运动 产生感生磁场，这个磁场也会加在原子核上。由于原子核所处的化学环境不同， 电子云密度也不相同，原子核因此所感受到的磁场强度也不相同，因而谱峰出现 的位置也不相同，这就叫做化学位移。 直接偶极偶合 由于每个自旋核都是磁性的，它会产生一个磁场作用在其它的核上，这种作 用是相互的，它通常叫做通过空间的偶极偶合相互作用，或是叫做直接偶极偶极 相互作用。 j 偶合 当2 0 世纪5 0 年代人们发现即使在相当完美的各向同性的物质当中，仍然含 偶极偶合相互作用。这即是后来人们现在所说的j 偶合相互作用，它是由于键合 的电子在自旋核之间的运动所产生的。对于j 偶合来说，只有两个自旋核之间存 在着化学键的时候，这个j 偶合才存在。 不像化学位移，j 偶合不随着外加磁场强度的改变而改变。j 偶合是有正负 的，当j 偶合是正的时候，作用在目旋极化i 司向的两核之i 司会便能量增强，而作 用在自旋极化反向的两核之间会使能量减小。当j 偶合是负的时候作用相反。 在大多数情况下，具有相同符号的磁旋比的核之间，j 偶合是正的；具有不 同符号的磁旋比的核之间，j 偶合是负的。下图是蛋白肽链各原子之间的j 偶合 常数( 3 5 ) ： 1 3 c y i 3 s 墩 1 3 q ph p q 产h p 1 3 s 1 3 5 1 3 c 伍丝1 3 c ，坠n 型3 c0 【型3 c i j l l 爪陋兰z 磊 h 伐h n h 图1 9 ，蛋白质肽链中各原子间的j 偶合常数。( 此图引自参考文献( 3 9 ) ) 4 2 固体核磁共振的基本实验方法简介 在固体核磁共振中，最基本的实验方法有：魔角旋转，高功去偶，和交叉极 化。在这些基础上，人们发展了二维谱技术。 魔角旋转 当两个自旋核之间的连线矢量与主磁场之间形成一个角度0 = 5 4 7 4 。的时候 那么这两个自旋核之间的偶极偶合相互作用的就变为零，这对化学位移来说同样 如此。魔角旋转能够平均掉化学位移各向异性( c s a ) ，同核偶极偶合，异核偶 极偶合，电四极矩相互作用，它们都会随着魔角旋转的速度的提高而平均的越充 分。魔角旋转的优点在于能平均一些相互作用，使得分辨率和灵敏度得到提高 ( 3 6 - 37 ) 。 对于一个静态的粉末，一个给定了晶格朝向的分子，它的c s a 是固定的，而 当样品处于旋转的时候，由于晶格的朝向发生了随时间的改变，晶格的化学位移 13 各向异性值是时间依赖的。如图所示：当样品轴倾斜到与主磁场形成5 4 7 4 0 角的 时候，通过一个旋转周期，每个个晶格感觉到被平均了的有效的化学位移。也即 是感觉到的是各向同性的化学位移。因此m a s 可以看作是能够通过立体对称来 削除掉化学位移各向异性的一个方法( 3 彳p ) 。 z x 图1 1 0 ，魔角旋转的模式图。 高功率异核去偶 当观察像1 3 c 这样的稀核的时候，如果在其周围存在着像氢这样的富核的时候， 即使用m a s 平均掉部分相互作用，往往因为异核偶极偶合的相互作用而使得到 的谱图变得很宽。但是，人们发现了另外一种办法使谱峰变窄的办法，这就是在 富核上施加以射频辐照，即高功去偶。高功去偶是去掉异核偶极偶合偶合相互作 用的最简单的办法。通常用到的序列有c w 、t p p m 、s p i n a l 6 4 ( 4 j 一彳2 ) 等 交叉极化 由于在固体核磁共振里头，存在着很强的氢的同核偶极偶合，往往无法得到较窄 的氢谱，因此大多数的实验观察其1 3 c 、1 5 n 这样的核，观察这些核的缺点在于， 它们往往是稀核，低的信号强度和长的弛豫时间( 3 z 私一4 习。这些缺点可以通过 像氢这样的富核短的弛豫时间来克服。 今天人们通过叫做交叉极化( c r o s sp o l 撕z a t i o n ，c p ) 的办法来使氢这样的富 核的高极化转移到像碳这样的稀核上( 4 乒彳7 ) 。交叉极化的实验是通过当使两个核 发生“接触”的时候，高极化的核的磁化矢量会有向低极化的核转移的倾向，如同 1 4 高温物体会向低温物体转移热量一样。 要使得两个核发生“热接触”需要满足h 锄n a n h a h n 匹配条件，当两个核的 章动频率一样的时候，偶极“接触”即被建立，它们在能量上的不同由射频脉冲提 供，通过这个偶极“接触”，磁化矢量的转移就会在这两个核之间发生。在双旋转 座标系里头，对于i 核和s 核的s p i n u p 和s p i n d o 、釉两个能级之间的空间是一 样的。( 如图1 1 1 所示) 交叉极化 实验室坐标系 双旋转坐标系 一“2 - 1 2 彩， 竺 王“2 一一生一：一 p 咱q l ， 一1 2 图1 1 1 ，交叉极化的原理模式图 多维核磁共振和多脉冲去偶 运用于有机体系和生物体系的固体核磁共振技术大多数用来检测像1 3 c 、1 5 n 这样的稀核。其中一个原因就是它们的偶极偶合可以忽略掉，这是因为两个这样 的自旋核靠近的机会比较小。另外由于它们的低磁旋比，即使是直接键合的原子， 同核偶合也非常小( 4 国。而且m a s 通常可以将它们消除掉。相比之下，氢的同 核偶极偶合则比较强，通常可以达到1 0 0 k h z ，加之氢的丰度几乎达到l o o ， m a s 对谱峰变窄的作用比较小。一个比较有效的获得高分辨氢谱的办法是通过 多维核磁共振技术来间接的检测到信号( 彳夕- 5 口) ，这些方法包括同核去偶( 5 ，一j 2 ) ， 去偶超级循环( 5 3 5 回，基于哈密顿量修饰的多量子波谱方法( 5 9 - 卯) ，h e t c o r e 15 异核相关( 卯等技术。与液体里h s q c 、h m q c 利用j 偶合来转移磁化矢量 不同的是，固体里的h e t c o r 实验是利用偶极偶合来形成相关的，因此它可以 使键合的、非键合的原子相关起来。 通过比较不同混合时间下的h e t c o r 实验波谱，可以得到分子的局部结构 和取向信息。 i s 1 1 0 m o n u ( i ea r d e ：o u p i i n g l d e c o u p i i n g c p 图1 1 2 ，h e t c o i 迮异核相关脉冲序列模式图 重新引入被平均化掉的哈密顿量 在前面的章节里，我们讨论了如何利用像m a s 和高功去偶的办法来去除或 者说是平均掉像化学位移、偶极偶合等项目的哈密顿量，使获得高分辨的谱图。 但是，由偶极偶合，化学位移各向异性的信号反映了原子核的周围环境信息，而 这些信息被魔角旋转和去偶等方法平均化掉了。固体核磁共振的学者通过 r e d o r 等异核重偶合方法( 酊一6 回，d r a m a 等同核重偶合方法( 6 7 - 6 酌将这些信 息又重新再引入被平均化掉的哈密顿量，从而在谱图中重新获得它们的信息。 异核相关谱 在前面，我们讲了氢碳的h e t c o r 实验，这是基于用c p 来转移磁化矢量的办 法，然而当转移低磁旋比的像碳、氮这样的核的时候，c p 就会变得没有效果， 即使是h a n m a l l h a h 条件匹配的很好。一个更为有效的办法是利用类似于 i 也d o r 的重偶合技术来在碳和氮之间交换磁化矢量( 6 9 7 j ) 。( 如图所示) 碳核 首先通过c p 从质子获得极化，之后通过r e d o r 序列将碳氮重偶合，随后，氮 演化一段时间f ，( 间接维) ，然后，第二个i 迮d o r 将磁化矢量又传回到碳核来 检测。 1 6 通过 下的 同核 在固 不： 进行 碳的 图1 1 4 ，同核再偶合相关脉冲序列模式图 5 固体核磁共振技术对细菌视紫红质的研究现状 目前，利用固体核磁共振技术研究细菌视紫红质的结构与功能主要有两个小 组。一个是g 五伍n 领衔的小组，另一个是s a i t o 领衔的小组。现就他们的研究工 作和现状作一简介。 在细菌视紫红质的功能上伽伍n 小组的研究兴趣主要集中在视黄醛的结构 变化，这个视黄醛与赖氨酸2 1 6 键合形成的希夫碱，以及希夫碱周围的平衡离 子( 7 2 ) 。在对小分子视黄醛的研究上，主要是测定各原子的化学位移各向异性。 描绘视黄醛的扭曲程度( 刀) ，以及细菌视紫红质吸收光照能量是如何转移储存到 1 7 视黄醛的扭曲当中( 硼，另外在对希夫碱释放质子的过程中，还对希夫碱结合的 平衡离子进行了研究，此外还对赖氨酸2 1 6 、酪氨酸1 8 5 的动态行为进行了研究 ( 乃7 6 ) 。总的来讲，他们的研究更注意的是固体核磁共振技术在膜蛋白体系 细菌视紫红质上的应用