（植物学专业论文）两种模式蓝藻ccm的运转及其对过剩光能的耗散作用.pdf

摘要 蓝藻拥有几乎在所有光合生物中最有效的c 0 2 浓缩机制( c 0 2c o n c e n t r a t i n g m e c h 姐i 锄s c c m ) 来提高羧体内c 0 2 浓度以补偿其r u b i s c o 对c 0 2 亲和力自q 不足， 它可以将r u b i s c o 周围c 0 2 浓度提高到外界浓度的5 0 0 1 0 0 0 倍以上。迄今为止，在 蓝藻中至少已发现了五种无机碳转运子，但是关于不同转运子在蓝藻光合作用中所 起作用的相对大小，以及不同碳浓度下它们转运能力的变化方面的研究并不全面。 c c m 的运转需要光合供能，因此蓝藻c c m 的运转也许能够耗散过剩光能，避免光 合器官的光动力学破坏。这在食用蓝藻葛仙米中已得到证实，然而在其它蓝藻中尚 无这方面的报道。本文选择蓝藻c c m 研究模式种跏e c d c 。c c 螂s p 8 0 5 ( 即 跏e c d c c 船p c c7 9 4 2 ) 和跏e c i l 口驴出s p 8 9 8 ( 即跏e 如d 啪出p c c6 8 0 3 ) ， 从光合放氧、叶绿素荧光淬灭分析和叶绿素荧光上升动力学等角度，研究了它们的 无机碳转运和积累及其在减轻光抑制方面的作用。 通空气培养的$ n 幽口c d c c 螂s p 8 0 s 和跏p c d c 声出s p 8 9 8 具有多种c 0 2 和 h c 0 3 。转运系统，其中n a + 依赖h c 0 3 - 转运系统是其最重要的主动获取无机碳的方 式。当p h 为8 。0 胞外碳浓度为2 5 0 弘m o ll 1k h c 0 3 时，n a + 依赖h c 0 3 转运系统， c 0 2 转运系统和n a + 非依赖h c 0 3 。转运系统对跏e 曲d c d c c 昭s p 8 0 5 光合作用的贡献 份额分别为4 7 6 _ 5 8 9 、3 3 8 4 5 1 和大约7 3 ，而对劬e c j l d 劬n 缸s p 8 9 8 的贡 献份额分别为大约5 7 0 、2 6 s 4 3 4 和大约1 6 5 。高碳条件下。n a + 缺乏或e z ( e t h o x y z o l 锄i d e ) 对跏e 曲d c c 淞s p 8 0 5 光合放氧的抑制作用降低，跏e 曲o c 删妇 s p 8 9 8 无机碳转运在低碳条件下表现出对卜a + 的依赖性而高碳条件下对n a + 非依赖 性。这可能都是由c 0 2 自由扩散对总无机碳捕获的贡献增加或者c 0 2 泄漏降低所造 成的。强光照射后，加入1 0 0 肛m o l l - 1k h c 0 3 处理的跏 o c c 淞s p 8 0 5 样品的 光合放氧速率、p s 的活性和最大光化学效率均显著高于加入1 0 0 0 0 m o ll - 1 k h c 0 3 处理样品的值。在1 0 m 1 0 0 0 0 m o ll - 1k h c 0 3 范围内，随着胞外无机碳浓度 升高，强光引起的光抑制加剧，因此跏e c d c 伽s p 8 0 5 和跏枷d 邮出s p 8 9 8 的c 0 2 浓缩机制的运转可以耗散过剩激发能从而降低光破坏程度。此外，强光处理 过程中量肛p 曲d t 脚妇s p 8 9 8 的f v 瓜。和e t o 瓜c 值急剧下降，加有n a + 的样品的下降 幅度低于不加n a + 的样品；而强光处理使a b s 瓜c 和d i 拈c 的值显著升高，加有 n a + 的样品的上升幅度低于不加n a + 的样品。这进一步说明跏e 砒o c 如s p 8 9 8 的 n a + 依赖h c 0 3 。转运系统在减轻光抑制方面具有一定的作用。 关键词：劬e 曲d c d c c 淞s p 8 0 5 ；| 5 ：炉 o c ) 鼢s p 8 9 8 ：二氧化碳浓缩机制；光抑 制；叶绿素荧光；光合放氧 1 i t h ec o xc o n c e n t r a t i n gm e c h a n i s mi nc y a n o b a c t e r i ai st h em o s te f f i c i e n to fa l l p h o t o s y n t h e t i co r g a n i s m sa n di tc o u l de l e v a t ec 0 2 c o n c e n t r a t i o na r o u n dt h ea c t i v es i t eo f r i b u l o s e - i ，5 一b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ( r u b i s c o ) t oc o m p e n s a t ef o rt h el o w a f f i n i t yo fr u b i s c of o rc o x s of a r , t h e r ea r ea tl e a s t5d i s t i n c tm o d e so fa c t i v ec i u p t a k ei nc y a n o b a c t e r i a ，h o w e v e r , t h ep h y s i o l o g i c a ld a t aa v a i l a b l e o nt h er e l a t i v e c o n t r i b u t i o no ft h e s ec iu p t a k es y s t e m st ot h ep h o t o s y n t h e s i sa n dt h e i ro p e r a t i o nu n d e r l o wo rh i g he x t e r n a lc ic o n c e n t r a t i o n sa r er a t h e rf r a g m e n t a r y t h eo p e r a t i o no fc c m r e q u i r e sl i g h te n e r g y i th a sb e e ns u g g e s t e dt h a tt h eo p e r a t i o no fc c mc o u l dd i m i n i s h p h o t o d y n a m i cd a m a g eb yd i s s i p a t i n ge x c e s s | i g h te n e r g y , w h i c hh a sr e c e n t l yb e e n e s t a b h s h e di nt h ee d i b l ec y a n o b a c t e r i u mg e x i a n - m i ( n o s t o c ) h o w e v e r , u od a t ai s a v a i l a b l ef o ro t h e rc y a n o b a e t e r i a ls p e c i e s i ti si m p o r t a n tt oe s t a b l i s hw h e t h e rt h i si sa u n i q u em e c h a n i s mo fg e - x i a n m io raw i d e s p r e a dm e c h a n i s mf o rm o s to fo t h e r c y a n o b a c t e r i a t h u s ，ic h o o s et h em o d e lo r g a n i s m s n e c h o c o c c u ss p 8 0 5 ( a l s ok n o w n 猫s y n e c h o c o c c u sp c c7 9 4 2 ) a n ds y n e c h o c y s t i ss p 8 9 8 ( a l s ok n o w na ss y n e c h o c y s t i s p c c 6 8 0 3 ) t oi n v e s t i g a t eo ni n o r g a n i cc a r b o nt r a n s p o r t sa n di t sa c c u m u l a t i o nw i t h i nt h e c e l la n dt h e i rr o l e si na l l e v i a t i n gp h o t o i n h i b i t o nb yt h em e a n so fp h o t o s y n t h e t i co x y g e n e v o l u t i o n ，c h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga n a l y s i sa n df l u o r e s c e n c er i s ek i n e t i c s m u l t i p l et r a n s p o r t e r sf o rc 0 2o rh c o x 。o p e r a t e di na i r - g r o w ns y n e c h o c o c c u ss p 8 0 5a n d 母片e c h d 掣出s p 8 9 8 , a n dn a + - d e p e n d e n th c o f t r a n s p o r tw a st h e i rp r i m a r y m o d eo fa c t i v ec iu p t a k e a t2 5 0 # m o ll 1k h c 0 3a n dp h8 0 n a + 一d e p e n d e n th c 0 3 t r a n s p o r t ，c o x - u p t a k es y s t e m sa n dn a + - i n d e p e n d e n th c 0 3 t r a n s p o r tc o u l dc o n t r i b u t e 4 7 6 5 8 9 ，3 3 8 - 4 5 1 a n da b o u t7 3 t op h o t o s y n t h e s i so fs y n e c h o c o c c u ss p 8 0 5 r e s p e c t i v e l y ，a n da b o u t5 7 0 ，2 6 5 4 3 4 a n da b o u t1 6 5 t os y n e c h o c y s a ss d 8 9 8 1 1 l ei n h i b i t i o no f o x y g e ne v o l u t i o no f s y n e c h o c o c c u s s p 8 0 5b yl a c ko f n a + a n da d d i t i o n o fe z ( e t h o x y z o l a m i d e ) w a sr e d u c e da t h i g h e rk h c 0 3c o n c e n t r a t i o n a n dt h e i n h i b i t i o no fn a + l a c ko np h o t o s y n t h e s i so fs y n e c h o c y s t i ss p 8 9 8c o u l db er e l i e v e dw h e n s a m p l e sw e r ea d d e dw i t h1 0 0 0 0 z m o ll 1k h c 0 3 t h e s ea r ep r o b a b l yd u et ot h e i n c r e a s e dc o n t r i b u t i o no fc o xd i f f u s i o nt ot o t a li n o r g a n i cc a r b o na c q u i s i t i o no rt h e r e d u c e dc o x l e a k a g e t h ep h o t o s y n t h e t i c o x y g e n e v o l u t i o na n dm a x i m a l i l l 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：瓠簧敏 日期：2 耐年r 月妒日 学位铪文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：斌蹙被 日期：2 t ) d 6 年r 月；d 日 导师签名：廓食i 处 日期：籼占年月? o 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圃童诠塞握窑厦溢屋! 旦主生；旦= 生；旦三玺筮查! 作者签名：钗薏数 日期：2 卯6 年f 月；d 日 导师签名：廓像粒 日期：2 耐年r 月? 。日 第一章蓝藻的二氧化碳浓缩机制 蓝藻在地球上的分布极为广泛，从炎热的赤道地区到千年冰封的极地，无论在 江河湖海、沟渠塘堰等各种水体中，还是在潮湿的土表、树干、树叶、岩石甚至沙 漠上，都有生长。蓝藻在地球上生存了大约3 5 亿年( s c l l o p f ，2 0 0 0 ) 。在漫长的自然 进化过程中，大气中的c 0 2 浓度下降0 2 浓度上升( b a d g e r 姐d ，2 0 0 3 ；g i o 毗媚o ， “a f ，2 0 0 5 ；b a d g c r ，甜口f ，2 0 0 6 ) 。蓝藻的核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶，力玎氧酶( r l | b p c a r b o x y l 鹤e ，o x y g e n 硒e ，r u b i s c 0 ) 对c 0 2 的亲和力较低，但是蓝藻细胞光合作用对 c 0 2 的亲和力很高。这主要是因为蓝藻拥有几乎在所有光合生物中最有效的c 0 2 浓 缩机制( c c m ) 来提高羧体内c 0 2 浓度以补偿其r u b j s c o 对c 0 2 亲和力的不足， c c m 可以将r u b i s c o 周围c 0 2 浓度提高到外界的5 0 0 1 0 0 0 倍以上( e s p i e 蛆dc a l l v i n ， 1 9 8 7 ；m i u c rd 口f ，1 9 9 0 ) 。因此即使外界的无机碳浓度很低，蓝藻依然可以正常地进 行光合作用。蓝藻的c 0 2 浓缩机制包括无机碳的跨膜转运，在细胞质内以h c 0 3 的形式积累，以及以h c 0 3 的形式扩散进入羧体并在碳酸酐酶( c a ) 催化下脱水形 成c 0 2 的整个过程。其中，相当一部分c 0 2 被r u b i s c 0 固定，余下的c 0 2 在向外扩 散过程中被依赖于光能的c 0 2 主动转运系统部分回收( k a p l 觚纽dr c i i 血o l d ，1 9 9 9 ； p 矗c c ，e f 口f ，2 0 0 2 ) 。 1 二氧化碳浓缩机制的组成部分 蓝藻c c m 包括两类主要的功能元件：一类是羧体，c 0 2 在其内被浓缩；另一 类是无机碳转运子，它将a ( i n o 唱a i l i cc a r b o n ，主要指c 0 2 和h c 0 3 ) 转运到细胞 内并以h c o ，的形式在胞质内积累。 1 1 箍体( c a r b o x y s 姗e ) 羧体存在于所有蓝藻中，此外在一些化能自养菌中也发现了与其同源的多面小 体( ( 舭n o ne f 口f ，2 0 0 1 ) 。羧体是一种蛋白小体其内含有碳酸酐酶，在蓝藻c c m 中 起关键作用。此外，细胞中绝大部分r u b i s c o 位于羧体内。根据r u b i s c o 与羧体结 合方式的不同可以将羧体分为两类，后来系统发生学分析表明这两类羧体的基因也 不同，含有1 a 型i 沁b i s c o 和含有1 b 型r u b i s c o 的羧体分别为q 一型羧体和b 一型羧 体。相应地，蓝藻也可分为a 一型和b 一型( b a d g e r 甜口f ，2 0 0 2 ) 。无机碳在胞内以 h c 0 3 。的形式积累后扩散进入羧体，在羧体内由碳酸酐酶催化生成c 0 2 ，从而使羧 硕士学位论文 m a s t e r s 丁h e s j s 体内c 0 2 浓度升高，但是如何解决c 0 2 泄漏的问题仍有待进一步研究。有人认为羧 体鞘可以限制c 0 2 从羧体中扩散出来。如果羧体鞘是c 0 2 泄漏屏障，那么它对气体 的传导力应该相对较低，而对离子的传导力应该相对较高。然而，羧体鞘是由蛋白 质组成的，人们迄今尚未发现蛋白质膜具有这种特性。也有人认为c 0 2 主动转运系 统在回收泄漏的c 0 2 中充当重要的角色，从而使羧体中的c 0 2 泄漏降到最低程度 ( p r i c e 甜口t 2 0 0 2 ) 。 1 2 羧体内碳酸酐酶( c a r b 0 坷s o m a l 铋r b o n i ca n h ”腑s 船) 羧体内碳酸酐酶作为蓝藻c c m 的一个重要组分，催化由细胞质扩散进入羧体 的h c 0 3 生成c 0 2 ，从而对提高r u b i s c o 羧化位点的c 0 2 浓度具有十分重要的意义。 蓝藻中至少有四种碳酸酐酶，其中有三种与羧体相关( s m n h 扯df e r 啦2 0 0 0 ；b a d g c r 甜口j ，2 0 0 6 ) 。但是迄今为止，羧体内c a 也仅在一些8 型蓝藻中的b 型羧体内得到 证实( f u k u z a w a 甜娃，1 9 9 2 ；p f i c c 甜口，1 9 9 2 ；y u 甜口f ，1 9 9 2 ；b a d g c ra n dp r i c e ，2 0 0 3 ； b a d g c r e f 口f ，2 0 0 6 ) 。除了在跏e 西d c d c 删s 中发现了b 型c a 外，在其它所有已测 序的a 型蓝藻中还没有发现羧体内碳酸酐酶的同源体( b 一( a ) ( b a 姑廿d 口f ，2 0 0 2 ； b a d g c ra n d p r i 2 0 0 3 ；b a d g c re f 口f ，2 0 0 6 。虽然b 型蓝藻中的c c ：m m 蛋白可能含 有具y c a 活性位点的氨基末端，但是还没有确切证据表明羧体内存在y c a ( l n d w 蟾引口l ，2 0 0 0 ；b a d g c r a n d p r i c c ，2 0 0 3 ；b a d g c f 甜口f ，2 0 0 6 ) 。 1 3 无机碳转运系统( t h ei o r g a i c 恤r b 哪h 曩n s p o r ts ”t e m ) 目前，在蓝藻中至少发现五种无机碳转运子( 图1 ) ，其中包括三种h c 0 ，转运 子和两种c 0 2 转运子：( 1 ) b c t l ，一种诱导型高亲和力的b h + 非依赖型h c 0 3 转运 子，由凹弘t 口c d 操纵子编码( q m a t a 甜4 f ，1 9 9 9 ) ；( 2 ) s b 峨，一种诱导型高度亲和 力的n a + 依赖型h c 0 3 + 转运子由曲纠基因编码，在无机碳转运中起重要作用f s l l i b a t a 甜口f ，2 0 0 2 ) ；( 3 ) b j c a ，最近新发现的种n a + 依赖型h c 0 3 转运子，对h c 0 3 。亲 和力较低但转运速率很高( p r i c e 甜耐，2 ：( 4 ) 组成型c 0 2 转运系统n d h 1 4 ，由 n d l l d 4 n 曲f 4 c u p b ( q i p p 组成( s h i b a t a 甜口f ，2 0 0 1 ；m a e d a 甜4 f ，2 0 0 2 ；p r j c e 甜口f ， 2 0 0 2 ) ；( 5 ) 低c 0 2 诱导型c 0 2 转运系统n d h 1 3 ，由n d h d 3 n d h f 3 c u p a ( c h p y ) 组成( s h i b a t a 甜4 f ，2 0 0 1 ；m a e d a “口f ，2 0 0 2 ) 。蓝藻无机碳转运能力随着外界环境的 变化特别是无机碳浓度的变化而变化。生长在较高无机碳浓度条件下的蓝藻细胞对 c i 的亲和力较低，胞内积累碳的能力较弱；而低碳培养的蓝藻细胞对c i 的亲和力 很高，在这种条件下蓝藻可以从接近碳枯竭的基质中摄取无机碳进行光合作用。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s l - 3 1b c t l 型h 1 0 0 3 转运系统 b c t l 型高亲和力h c 0 3 转运系统属于a b c ( a 1 tb i n d i l l gc a s s e t t e ) 型转运予家 族，也就是通常所说的转运胁e s ，该家族成员通常由加卫提供能量( 硪g g m s ， 2 0 0 1 ) 。虽然在其它六种蓝藻中也发现类似b a h 的结构，但到目前为止其生理特 征只在跏帕彻盯p c c7 9 4 2 中得到确切研究。b c t l 是由c 晔4 b c d 操纵子编 码的由四个亚基组成的复合体，在碳限制或高光强胁迫条件下被诱导表达( o m a t a a n do g a w a ，1 9 8 6 ；0 m a l a 甜口j ，1 9 9 9 ；m c g i 衄甜4 j ，2 0 0 3 ；w 砌g c re f 口z ，2 0 0 3 ； m c g i 皿甜吐，2 0 0 4 ；w 缸g 甜口z ，2 0 0 4 ；) 。 h g 山他lf i v ec iu p t a k cm e c h a i l i 锄si nc y a n o b a c t e r i a t h r e eb i c a r b o n a t ct r a n s p o n e r s ， b c t l ，b i c a 越ds b 氓1 0 c a t e do nt l l ep l a s m 枷e m b r a n ea n dt w oc 0 2u p t a k cs y s t 啪s ， n d h 1 3 锄dn d h - 1 4 ，o nt l l et l l y l a k o i d s 图1 蓝藻中的五种无机碳转运系统。三种位于质膜上的h c 0 3 转运系统( b c t l b i c a 和s b 姨) ，和两种位于类囊体膜上的c 0 2 转运系统( n d h 1 3 和n d h 1 4 ) ，引 自b a d g e r 甜口f ( 2 0 0 6 ) 。 1 3 2s b 瞧型h c 0 3 转运系统 s b 姨型h c 0 3 转运子最初是在$ ”e c o q 幅豳p c c6 8 0 3 中被证实的，它是一种 3 n a + 依赖型的h c 0 3 转运子，大约需要1 m mn a + 才能使h c 0 3 。转运能力达到最大值 的一半( s h i b a t ae t 口z ，2 0 0 2 ) 。关于蓝藻h c 0 3 转运对n a + 的依赖性有三种解释t ( 1 ) h c 0 3 转运过程中通过n a + ，时反向运输系统的转运维持胞内p h 值恒定；( 2 ) 原初 n a + 泵的转运产生u n a + 从而驱动n a c 0 3 同向转运子将h c 0 3 转运至腮内；( 3 ) n 矿和h c 0 3 转运子相结合，调节其对h c 0 3 - 的亲和力。研究表明n 叫在 跏e c o 谚叭，p c c6 8 0 3 的无机碳转运中起到重要作用，它可能是一个原初外向n a + 泵，为s b 认型h c 0 3 转运子所必需( s h i b a t a 甜口，2 0 0 2 ) 。碳限制条件下s b 暖的丰 度急剧上升。 1 3 3b i c a 型h c 0 3 转运子 b i c a 型转运子是最近刚被发现的一种 h + 依赖性h c 0 3 精运子，与s b 哺无明 显相似序列( p i i c c 甜口z ，2 0 0 4 ) 。b j c a 是在海岸蓝藻跏b c o c c 淞p c c7 0 0 2 中被 发现的，非常有意思的是虽然它对底物的亲和力相对较低( 大约3 8 | im ) 但却可以 维持较高的光合速率。b i c a 转运子的活性达到最大速率一半时大约需要1 7m m n a + ，达到饱和速率时约需要2 0m mn a + ( 眦ee f 口z ，2 0 0 4 ) 。此外在跏e c 肋c c 船 w h8 1 0 2 和跏e 幽d 斜甜括p c c6 8 0 3 中也发现了这种转运子。跏e c j l d c c 淞p c c 7 0 0 2 中的b i c a 在碳限制条件下被高效地诱导表达，在高c 0 2 环境中只有较低水平 的表达。在$ h e c j l 口。愠出p c c6 8 0 3 中b i c a 基因可能是组成性表达，而在 跏e 如口c 口c c 淞w h8 1 0 2 中此方面的研究还不是很清楚。 1 3 4 依赖于n d h 1 的c 0 2 转运 早期研究表明，n d h 1 脱氢酶复合体可能通过循环电子传递产生a 口而在蓝 藻c 0 2 转运中起作用( 0 9 a w a ，1 9 9 2 ) 。后来在劬 d c 弦如p c c6 8 0 3 中发现有两 种功能各异的n d h 1 复合体。n d l l d l 小d h d 2 型n d h - 1 复合体介导从p h 到 p q ( p i a s t o q u j n o n c ) 的电子传递，这是围绕p s i 循环电子传递的必要组成部分。而 n d h d 3 小d i l d 4 型n d h - 1 复合体对这种电子传递的贡献相对较小( o g a w aa i l d 勋p l a i l ，2 0 0 3 ) 。n o n l i e m 杂交显示咒砒d 2 和n 幽n ，在低c 0 2 浓度下被诱导表达， 而 d d j 和，l 砌d 4 则组成型表达( 0 1 l l ( a w a 甜以，1 9 9 8 ) 。n d h f 3 f 4 蛋白和 n d h d 3 小d h d 4 蛋白被认为是两类与催化c 0 2 主动转运相关的n d h 1 复合体的组成 成分。另外两个蛋白c h p x 和c h p y ( s h i b a t a 及其同事称之为c u p a 和c u p b ，而 p r i c e 及其同事则称之为c h p x 和c h p y ) 也是与c 0 2 捕获相关的n d h 1 复合体组 成成分。研究表明，l 幽f j 愉幽d - 玑印y 基因编码高c 0 2 亲和力n d h 1 3 复合体，而由 ，l 幽尉加砌d 纠c 蛔z 基因编码的则是对底物亲和力较低的n d h 1 4 复合体( m a e d a 酣 4 f ，2 0 0 2 ；s h i b a t a 甜耐，2 0 0 1 ) 。近期蛋白质组学研究表明n d h 1 4 复合体存在于类囊 体膜上，从而使之与光合电子传递链直接相关( 研汰a w ae fn f ，2 0 0 1 ) 。关于这种 n d h 1 3 ，4 型c 0 2 转运复合体( n d h 1 型c 0 2 转运复合体) 如何起作用有一个模型，就 是c h p x 和c h p y 可能具有类似于碳酸酐酶的功能，在光照条件下催化细胞质内c 0 2 到h c 0 3 的转化从而在c 0 2 的主动转运中起作用( p i i c ee f 口1 ，2 0 0 2 ) 。 2 碳限制对二氧化碳浓缩机制的调节 早期研究表明，蓝藻二氧化碳浓缩机制的活性与其生长环境中碳限制的程度密 切相关( 勋p l 柚甜口z ，1 9 8 0 ) 。模式蓝藻如点妒枷c c 淞p c c7 9 4 2 和跏b c 声出 p c c6 8 0 3 ，如果生活在低碳条件下( 2 蛐，p h 8 o ) 则对a 的亲和力降低( 1 ( 0 j 2 0 0um ) ( m c g i n ne f 口f ，2 0 0 3 ；w b o d g e r 鲋口z ，2 0 0 3 ) 。近期研究表明，这种对底物亲 和力的变化几乎都与各种高或中等程度亲和力的h c 0 3 ( b c r l ，s b 峨，b i c a ) 转 运予以及高c 0 2 亲和力的n d h 1 3 复合体的诱导有关( m c g i 皿d 口f ，2 0 0 3 ；w o o d g 盯 甜口f ，2 0 0 3 ；m c g i 衄鲥4 f ，2 0 0 4 ) 。也有研究表明，低碳条件下产生更多小的羧体 ( m c k a y 甜以，1 9 9 3 ) 。 碳限制条件下可诱导产生多种转运予的蓝藻，在对同一种无机碳转运上表现出 利用成对的在动力学上互补的无机碳转运系统。如，在曲件e c o c o c c 淞p c c7 0 0 2 中 有两种h 3 精运子，b i c a 转运子对底物的亲和力较低( 大约3 8 l im ) 但是转运 速率较高；相反，s b 认转运系统对底物的亲和力较高( 约2 i lm ) 但是转运速率较 低。在稳态光合作用条件下，这两种转运系统对底物的亲和力约6 5um 并且转运 速率也较高( p d c ee f 以，2 0 0 4 ) 。像这神采用高转运速率，低亲和力转运系统和低转 运速率，高亲和力转运系统的策略在蓝藻中是否为普遍规律，以及这种策略能否使无 机碳转运更有效仍有待进一步研究。 3 无机碳转运的能量需求 蓝藻可以主动转运无机碳使胞内碳浓度高于胞外5 0 0 1 0 0 0 倍，这一过程显然需 要光合作用提供能量。然而，光反应中心以及电子传递的不同部分在这一过程中的 具体作用还不是很清楚。研究表明，依赖于n d h 1 的循环电子传递主要驱动c 0 2 转运( o g a w a ，1 9 9 3 ) 。利用特异性的电子传递抑制剂与电子受体研究发现 $ ”e 幽d c d c c “su t e x6 2 5 的c 0 2 转运依赖于循环电子传递，而h c 0 3 一转运依赖于线 性电子传递( l ia j l dc a n v j n ，1 9 9 8 ) 。进一步的研究表明，低c 0 2 诱导型c 0 2 转运系 统可能由p s i 活性支撑，而p s i 活性依赖于p s i i 向p s i 的电子传递；组成型c 0 2 转运系统部分依赖予p s l 循环电子传递( m a e d a 口口z ，2 0 0 2 ；o g a w aa n dk a p l a l l ， 2 0 0 3 ) 。循环电子传递和线性电子传递都可引起跨类囊体膜p ，l ii i + 是形成 a 口的必需条件。而a 皿可以为a b c 型h c 。3 转运子提供能量，也可被用来产生 l ln a + ，从而推动s b 暖或b i c a 型h c 0 3 - 转运子的运转( o g a w a 龃d 勋l p l 锄，2 0 0 3 ； p d c ee f4 z ，2 0 0 4 ) 。研究表明，在c 0 2 主动转运中ul r 是推动c 0 2 向h c 0 3 _ 转化 的直接能源( i c h 锄o v 甜口f ，2 0 0 1 ) 。 4 蓝藻的无机碳跨膜转运研究方法 l ( a p l a n 等运用硅氧烷液体离心技术进行的开创性研究第一次直接地证实蓝藻 能在胞内累积a ，他们发现照光后多变鱼腥藻臼m 6 4 删阳r 如6 池0 细胞可在胞内累 积高于胞外5 0 0 倍的c i 。目前，硅氧烷液体离心技术仍是最直接的证明蓝藻细胞累 积a 的方法，采用红外气体分析、质谱分析以及叶绿素荧光淬灭分析也可得到很 好的结果( 邱保胜和高坤山，2 0 0 1 ) 。c 0 2 固定不是胞内c i 库形成的前提，黑暗、 解偶联剂、高浓度d c m u 和a 口a s c 抑制剂等均能有效抑制蓝藻细胞在胞内累积 c i ( m i u e r e r 口f ，1 9 9 0 ) 4 1 测定胞内累积无机碳的方法 4 1 1 硅氧烷液体离心技术 这项技术用于迅速从反应液中分离细胞。藻细胞温育在缓冲液内，其下为一层 硅氧烷液体，接下来是碱性淬灭溶液。在光下以1 4 c 标记的溶解性无机碳( d i “c ) 温 育细胞，然后通过离心使细胞经硅氧烷液体层进入碱性淬灭溶液而迅逮终止c i 吸 收。这种溶液尔后用于分析有机组分中酸稳定的“c 和已在胞内积累但尚未被代谢 的酸不稳定“c 。 4 1 2 质谱检测 采用装备有气透膜系统的质谱仪测定胞外c 0 2 浓度，分析细胞对c i 的积累。 实验材料温育在与质谱仪相连的气透膜封闭小池中，用金属网支撑的二甲基硅氧烷 橡胶膜将质谱仪的入口毛细管与细胞悬液分开，只有氧气和二氧化碳等气体能渗透 膜进入质谱仪。由于质谱测定的是c 0 2 浓度，因而须在反应液里加入碳酸酐酶以确 保c 0 2 信号与总a 浓度成比例。i ，在光下向被抑制了c a l v i n 循环的细胞悬液中加 入c a ，通过检测反应液中二氧化碳减少估测库大小；i l ，c j 以库形式存在于胞内， 关掉光源后检测从细胞中泄漏出的二氧化碳以估计库大小。 4 1 3 荧光淬灭检测 m i l l c r 等最早注意到c i 积累与p s l i 光化学淬灭间有密切联系。胞内c i 积累引 起叶绿素a 荧光相对于c 0 2 补偿点时发生淬灭，在无c 0 2 固定条件下荧光淬灭程度 与胞内a 浓度密切相关。尽管c 0 2 固定本身也起到淬灭荧光的作用，但有c 0 2 固 定时，胞内c i 库大小与荧光淬灭程度间仍密切相关。因此，运用脉冲调制荧光仪， 同步测定光合放氧或c 0 2 转运，即可监测a 库状况。尽管荧光淬灭技术仅对a 库 形成的初始速率或c i 库大小提供间接的定性估计，但它具有应用方便、无损伤和 快速的特性。 4 2 蓝藻细胞利用h c 0 3 _ 的证据 一般可以通过以下几种方法证明h c 0 3 转运的存在( 邱保胜和高坤山，2 0 0 1 ) ： 4 2 1 比较不同p h 条件下的光合速率 当外界a 璁浓度一定时，在碱性和酸性条件下分别测定藻细胞的光合速率，如 果光合速率在碱性条件下明显高于酸性条件下的速率，则可认为h c 0 3 通过了细胞 膜为光合作用提供了碳源。 4 2 2 比较h c 0 3 脱水和二氧化碳固定速率 m i u e r 和c 0 l m 翘( 1 9 8 0 ) 首先确切地表明蓝藻可以主动转运h c o f 。c i 在水环 境中以h 2 c 0 3 、c 0 2 、h c 0 3 和c o 产的形式存在( 其中h 2 0 0 3 的相对含量很低，可 以忽略不计) ，几种形态的a 之间存在动态平衡。当反应液中没有c a ( h c 0 3 脱水 反应的催化剂) 时，h o d 3 脱水产生c 0 2 的速率很低，此时蓝藻的光合作用将会受 c 0 2 供给的限制。在这种情况下。如果光合速率高于h c 0 3 。脱水产生c 0 2 的速率， 即可证实这种蓝藻中存在h c 0 3 的主动运输。 4 2 3 比较h c 0 3 和d i c 的积累速率 向反应液中加入一定量的h c 0 3 _ ，监测蓝藻细胞在胞内累积d i “c 的时间进程。 结果表明，胞内d 1 1 4 c 积累的初始速率高于反应液中h c 0 3 僦水生成c 0 2 的速率， 这为蓝藻细胞主动吸收h c 0 3 提供了令人信服的证据。 4 2 4 叶绿素a 荧光淬灭 叶绿素荧光淬灭的初始速率与h c 0 3 转运的初始速率紧密相关，这可能是由于 h c 0 3 转运的初始速率影响胞内c i 库形成的初始速率，因而可采用这项技术分析蓝 藻细胞中的h c o f 转运。 4 2 5 通过突变株进行研究 缺失c 0 2 转运系统的突变株，在碱性条件下如果能够像野生型一样正常生长， 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 则可以证明h c 0 3 转运系统的存在。 4 3 测定蓝藻细胞转运c 0 2 的方法 4 3 1 硅氧烷液体离心技术 向细胞悬浮液中加入经1 4 c 标记的酸化a 溶液，1 0 s 后通过离心，细胞经硅氧 烷液体层进入碱性淬灭溶液，从而迅速终止c i 吸收。在这1 0 s 之内，细胞悬浮液中 的a 大多以c 0 2 形式存在。到第一次取样时，胞内a 浓度可达到最大值的9 0 。 当加入h 1 4 c 0 3 域加入1 4 c 0 2 和c a 时，最终胞内a 浓度与单独加入1 4 c 0 2 的虽然 比较接近，但细胞内c i 的积累速率大幅度降低。这一实验结果表明，光照条件下 蓝藻细胞可转运c 0 2 。硅氧烷液体离心技术适于鉴别c 0 2 转运系统的存在与否，但 由于其时间分辨率较低，所以分析c 0 2 转运的初始速率较为困难。 4 3 2 检测照光条件下胞外二氧化碳浓度的变化 4 3 3 芡光淬灭 叶绿素荧光淬灭的初始速率与c 0 2 转运的初始速率相关，因而可利用该方法分 析蓝藻细胞对c 0 2 的吸收情况。 4 3 4 通过突变株进行研究 筛选h c 0 3 _ 缺失突变株对c 0 2 转运进行研究。 5 展望 在过去十多年中，对组成蓝藻c 0 2 浓缩机制的各种基因和蛋白的研究及这些蛋 白在c c m 中的功能主要集中在两个方面：( 1 ) 与细胞内羧体的形成有关，在羧体 内c 0 2 浓度升高以满足r 曲i s c o 的需要；( 2 ) 构成至少五种c i 转运子。蓝藻的羧体 和碳酸酐酶都表现出多样性，至少两种羧体( a 型和b 型) 和四类碳酸酐酶( n ， b ，y 和e 型) 。关于不同种蓝藻羧体内碳酸酐酶的基因鉴定及其作用机理还有待 深入研究。 到目前为止我们对蓝藻c 0 2 浓缩机制的了解大多基于在实验室中对三种模式 种的研究，$ n 曲。叩凼p c c6 8 0 3 ，$ ，l b c 矗口c d c c 淞p c c7 9 4 2 和劬e 幽d c d c c 淞p c c 7 0 0 4 。对于野外条件下是否存在c c m ，以及其它藻种内羧体和无机碳转运子的精 细结构和功能仍有待进一步研究。各种环境因子，如光强变化、营养元素尤其是 c 0 2 浓度变化对蓝藻c c m 的调节机理研究也有待继续进行。迄今为止，至少1 8 种 蓝藻的基因组被测序，这使我们可以通过同源性分析来研究与之相对应的野生环境 中蓝藻种类的c c m 。 8 第二章毋丹e 如d c d c c 以ss p 舳5 的h c 0 3 和c 0 2 转运对 光合作用的贡献及其在减轻光抑制方面的作用 l 前言 蓝藻r u b i s c o 对c 0 2 的亲和力较低，但是蓝藻细胞光合作用对c 0 2 的亲和力很 高。这主要是因为蓝藻拥有几乎在所有光合生物中最有效的二氧化碳浓缩机制( a d 2 n c e n a t i i l gm e c h a l l i s 瑚，c c m ) ，c c m 可以提高羧体内c 0 2 浓度而补偿r u b j s c 0 对 c 0 2 亲和力的不足，它可以将r u b i s c 0 周围c 0 2 浓度提高到外界浓度的5 0 0 - 1 0 0 0 倍 以上。因此即使外界的a 浓度很低，蓝藻依然可以正常地进行光合作用。蓝藻的 c c m 包括无机碳的跨膜转运，在细胞质内以h c 0 3 的形式积累，以及以h c 0 3 。的形 式扩散进入羧体并在碳酸酐酶( c a ) 催化下脱水形成c 0 2 的整个过程。其中相当 一部分c 0 2 被r u b i s c o 固定，少部分在向外扩散过程中又被依赖于光能的c 0 2 转运 途径部分回收。如第一章所述，在蓝藻中至少有五种无机碳转运系统，b c t l 型h c o f 转运子、s b 认型h c 0 3 - 转运子、b i c a 型h c 0 3 - 转运子、n i ) h 1 4 型c 0 2 转运系统和 n d h 1 3 型c 0 2 转运系统。 光合作用的进行离不开光能，但是光照又不可避免地会对光合机构造成危害。 大量研究表明，光合机构的光破坏主要发生在p s ( a 姐电1 9 9 4 ；l d n g 柚d h u m p m e s ，1 9 9 4 ；k e ，2 0 0 1 ；c h o wa l l da r 0 ，2 0 0 5 ) 。p s i i 是一个包埋于类囊体膜的水 质醌氧化还原酶，