（水产养殖专业论文）嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白w的制备及免疫原性研究.pdf

- 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文， 是本人在导师的指导f ，独立进行研究j i ：作所取得的成果。除文中已经明确注 明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品及成果的内容。论文为本人亲a 撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 口期： q o 年易月 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 | 嘲纺 哆日 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或 借阅。本人授权上海海洋人学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 保密i，在郴年解密后适用本版权书。 指导教师签名： 日期矽l 年占即日 口 谝恬 一1 n ：-密j 、 保一、多，嘴参日篇 雠肿 位期学日 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 施志仪上海海洋大学教授主席 梁旭方暨南大学教授委员 中国水产科学研究 喻达辉研究员委员 院南海水产研究所 中科院南海海洋研 喻子牛研究员委员 究所 邹记兴华南农业大学教授委员 全迎春珠江水产研究所助理研究员秘书 答辩地点珠江水产研究所答辩日期 2 0 1 0 6 1 5 上海海洋人学硕上学位论文 嗜水气单胞菌鉴定、重组外膜蛋白w 的制备及免疫原性研究 摘要 草鱼( c t e n o p h o r y n g o d o ni d e l h t s ) 是我国淡水养殖的“四大家鱼之一，一直以来 是巾国人部分地区的主养品种，在我国农业经济中具有重要的意义。由于高密度 养殖以及水质环境的日益恶化，草鱼养殖过程病害的发生日趋严重，其中嗜水气 单胞菌所致的草鱼败血病是危害最大的细菌性疾病之一本研究采用传统理化鉴 定方法与分子生物学鉴定方法，对患病草鱼的嗜水气单胞菌分离株进行分类鉴定， 并进行其毒力基因的鉴定。同时研制重组嗜水气单胞菌的外膜蛋白w ，为草鱼败血 病基因工程业单位疫荫的制备提供理论依据。 1 草鱼噜水气单胞菌的分离与鉴定 本研究从患暴发性败血病的草鱼肝脏病灶处分离了2 株致病菌，分别命名为 w p 3 和z c l ，通过人工回归感染实验显示分离菌株能使草鱼致病死亡对分离菌株 进行形态观察、选择性培养基培养和理化特性分析，初步判定所分离的2 株菌均 为嗜水气单胞茼。进一步对菌株进行d n a 分子鉴定，结果显示2 株荫的1 6 sr r n a 基因、促旋酶亚单位蛋白( g r y b ) 基因均与g e n b a n k 上的嗜水气单胞菌相应的基因 具有高度的同源性。在根据已知序列构建的分予系统进化树中2 株菌均与嗜水气 单胞菌聚类。同时2 个菌株均可扩增到气溶素基因( a e r a ) 和丝氨酸蛋白酶基因 ( a h p a ) ，提示它们均町能为嗜水气单胞菌强毒株。 2 嗜水气单胞菌毒力因子基因的分析 选取w p 3 菌株，克隆该菌株的气溶素( a e r o l y s i n ，a e r a ) 基因和溶血素 ( h e m o l y s i n ，h l y a ) 基因，序列分析显示这二个基因只有4 6 7 的同源性。b l a s t 分析显示，h l y a 基凶与g e n b a n k 卜已登录的h l y a 序列具有较高的同源性，而a e r a 基冈与已髓录的a e r a 基冈以及一些h l y a 序列也具有较高的同源性。对与a e r a 基 因同i | j ；f 性较高的这些h l y a 序列进行结构域预测，发现它们均具有a p t 结构域和气 i v 上海海洋大学硕士学位论文 溶素结构域，说明它们实际上虑是a e r a 基因，只是命名上与h l y a 基冈混淆。用 o n a s t a r 软件预测a e r a 和h l y a 的抗原区，显示它们均具有很好的抗原性。用特异 性引物检测菌株的a e r a 基因和h l y a 基因，结果显示二株毒力株均有特异条带， 而无毒株则未扩增到特异条带，说明a e r a 和h l y a 有可能作为鉴定嗜水气单胞菌 毒力菌株的标记。 3 重组外膜蛋白w 的制备 以w p 3 菌株基凶组d n a 作为模板扩增外膜蛋白w 基凶( o m p w ) 。o m p w 基因全 长为8 6 5 b p ，其中开放式阅读框( o r f ) 为6 1 5 b p ，与标准株a t c c 7 9 6 6 的o m p w 基 因的同源性高达9 9 8 。使用蛋白结构分析软件对该o r f 框编码的蛋白高级结构进 行预测，发现其编码的蛋白质具有一个由8 个p 折叠组成的结构域。根据o r f 序列 设计引物进行扩增，将不含信号肽的o m p w 基因编码序列克隆到表达载体p q e 3 0 中，转化至大肠杆菌m i 5 ，经诱导可表达分子量大小为2 4 7 l 渤的带外膜蛋白与h i s 标签的融合蛋白h 毽w 。 4 重组蛋白免疫原性与保护作用评价 融合蛋白h i s w 经过镍柱纯化后，对草鱼进行免疫实验。受免草鱼血清经e 您a 分析显示呈现阳性反应，说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。采用实时荧光定 量p c r 方法分析诱导前后草鱼头肾组织i g m 基凶表达水平的变化，结果显示免疫组 l g m 的表达量均高于空白组，低浓度免疫组的表达量显著高于空白组的( p 5 0 ) 再经p a g e 时，其泳动速度明显减慢，这是因为含有丰富的1 3 折叠结构，在 自然情况下不形成对s d s 抵抗的寡聚体( o l i g o m e r ) ，加热时分子构象改变，导致 不对称性增加，故又称热修饰蛋白【2 8 】。 微孔蛋白，又称通道蛋白、基质蛋白。它不具有热修饰性，以非共价键与肽 聚糖紧密结合，可形成相对非特异性的通道或透道，具有通透特性。按其功能不 同分为3 类：第一类为普通外膜主要微孔蛋白( o m p c ，o m p f ，o m p w 等) ，可形 成亲水性孔道允许非特异性水溶性物质的被动扩散；该类蛋白允许水溶性物质 特别是阳离子溶剂的渗透，并能为聚磷酸所识别；第二类包括p h o e 、p e r i m 和 5 上海海洋大学硕士学位论文 m a h o p o r i n ，该类蛋白允许小分子水溶性物质渗入，能被麦芽糖和麦芽糖糊精所识 别；第三类微孔蛋白能摄取介质中含量较低的大分子物质，该类微孔蛋白与被运 输的底物有高度亲和力，本身也参加催化反应。微孔蛋白缺乏的突变株已被证实 可允许营养物质，抗菌素及抑制剂扩散入细胞。 脂蛋白为细菌外膜蛋白中含量最多的结构蛋白，由5 8 个氨基酸组成，分子量 约为7 2 k d a ，具有高度的叶螺旋结构，分子间可发生交联并形成寡聚体。脂蛋白可 通过3 个脂肪酸与细菌外膜疏水结合，不暴露在细胞表面，因此脂蛋白不具有噬菌 体与大肠菌素的受体功能。脂蛋白结构基因突变株虽能允许小分子量亲水性分子 通过外膜，但这种突变株细胞壁不稳定，外膜成份可以小泡形式释放出来。故脂 蛋白除作为一种结构蛋白外，不具稳定细菌外膜的功能。 此外还有些微量蛋白，在细胞中含量低却具有重要的生理功能。大部分参与 特异性扩散过程，与细胞生长密切相关。有些酶分布于外膜上，这些酶包括磷脂 酶a 及蛋白酶。 6 3 外膜蛋白的免疫原性 研究表明细菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以激发机体的体液免 疫，而且还可引起细胞免疫 2 9 , 3 0 ，而且外膜蛋白具有异种血清型的免疫交叉保护性， 是一种潜在的共同保护性抗原1 3 t - 3 3 。蒋蔚等表达纯化了外膜蛋白a ( o m p a ) 免疫 兔子所得血清与9 株不同血清型的嗜水气单胞菌在w e s t e mb l o t 反应中能起较强反 应【3 4 】，说明外膜蛋白有很好的免疫原性，并可能是嗜水气单胞菌的共同保护抗原 k h u s h i r a m a n i 等表达纯化了外膜蛋f 了o m p t s ，通过对印度鲤的免疫试验发现，所得 血清效价达到l ：1 2 0 0 0 ，说明外膜蛋白能对鱼体起到很强的免疫作用 3 5 1 。董传甫等 天然提取了嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白( m o ) 通过免疫鱼后的攻毒实验发 现，各免疫组免疫保护率都在8 0 以上，说明嗜水气单胞菌的外膜蛋白是重要的保 护性抗原p 6 】。m 等从嗜水气单胞菌j - l 菌株中克隆表达并纯化t o m p 3 8 ，通过免疫 兔子发现能产生很高效价的抗体，抗体能识别包括j 1 菌株在内的多株不同血清型 的嗜水气单胞菌 r r l 。m a i t i 等从鲮鱼病灶处分离了嗜水气单胞菌并从中首次克隆了 嗜水气单胞菌o m p w 基因，对其在气单胞菌属种的分布进行了研究，并且进行了 免疫试验，免疫的兔血清出有能与嗜水气单胞菌结合的高效抗体1 3 8 l 。 6 上海海洋人学硕上学位论文 7 嗜水气单胞菌的检测 嗜水气单胞菌的检测方法很多，包括传统方法与分子生物学方法，主要有生 化方法检测、选择性培养基检测、免疫学方法检测、p c r 检测法，核酸探针技术 等。 7 1 选择性培养基鉴别培养法 选择性培养基鉴别培养法是利用不同培养基成分和培养条件，抑制多数细菌 生长，只利于某一种或某一类细菌生长的检测方法。选择性培养基制作容易，使 用方便是常规的细菌诊断方法之一。目前用于分离水中及食品中的气单胞荫的选 择培养基种类较多1 3 9 l ，主要以培养细菌颜色变化加以区别【柏l ，这种方法简单实片j 但使用选择培养基时温度和时间要求较严格，培养时间较长，且只能用于初步判 断。常用有r s 培养基，s h o r t s 和r i m l e r 使用i t s 培养摹检测腐皮病病原a h , 3 7 培养 2 0 - 2 4 h 后，嗜水气单胞菌菌落呈黄色，其它菌落呈其他的颜色【4 1 4 2 】。 7 2 生化方法鉴定 生化鉴定包括生化鉴定管和细菌自动签定仪鉴定。主要根据 0 ，抗原 指数 o ，表面可及性 l 时，形成袭位的可能性大，综合其结果确定为抗原区。通 过在线分析系统( h t t p ：w w w c b s d t u a k s c r v i c e s s i g n a n 口) 预测序列的信号肽，将成熟 肽氨基酸序列输入在线分析系统p f a mh m m s ( h t t p j p f a m m n g e r a c u k l s e a r c h ) 分析 a e r a 和h l y a 基因特有的结构域。 上海海洋大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1a e r a 和h l y a 基因的扩增与序列分析 以嗜水气单胞菌w p 3 菌株基因组为模板，引物p l 和p 2 、p 3 与p 4 进行扩增，获 得与预期相符的特异性条带( 图2 1 ) ，长度分别为1 3 9 2 b p 和2 1 2 2 b p 。扩增片段经克 隆与测序，显示获得a e r a 和h l y a 基因全长序列。 所克隆的a e r a 基因和h l y a 基因序列分别通过b l a s t 与g e n b a n k 上的序列进行比 较。与a e r a 基因同源性最高的前l o 个序列包括：3 个气溶素基因，d q l 8 6 6 1 l 、 e f 4 5 0 8 2 4 和m 1 6 4 9 5 ，同源性分别为9 6 4 ，9 2 1 和9 0 ；6 个溶血素基因， d q 4 0 8 2 6 3 、d q 3 0 2 1 2 3 、d q 3 0 2 1 2 2 、f j 3 8 0 9 9 8 、a f 5 3 9 4 6 7 、x 6 5 0 4 5 和e f 4 5 0 8 2 4 ， 同源性为9 4 - - 9 9 6 ；1 个细胞溶解性肠毒素基因，m 8 4 7 0 9 ，同源性为9 3 6 。 与h l y a 基因同源性最高的前1 0 个序列中有9 个为嗜水气单胞菌溶血素基因， a y 4 4 2 2 7 3 、u 8 1 5 5 5 、a f l 4 6 5 9 9 、a b 2 0 6 0 3 9 、a b 2 0 6 0 4 l 、e u 0 0 9 3 9 8 、a b 2 0 6 0 4 0 、 e f 6 81l ll 和d q18 9 9 9 4 ，同源性为9 4 7 0 - - 9 9 7 ；1 个a , s o l m o n i c i d o 溶血素基因， x 6 5 0 4 9 ，同源性为8 5 9 。本实验所克隆的气溶素基因和溶血素基凶问的l 一源性则 仅为4 6 7 在g e n b a n k 上的髓录号分别为g u 2 2 9 0 2 4 ，g u 2 2 9 0 2 5 。 mi2 3 0 0 0 b p _ 一 2 0 0 0 b 矿一 1 2 0 0 b p 一 图2 - l嗜水气单胞茵a e r a 基因和h l y a 基因的扩增 f i g 2 - ia m p l 踊l c a t i o no f a e r ag e n ea n dh l y ag e n ef r o mt h e a h y d r o p h i l o 注：m d n am a r k e r ：i a e r a 扩增片段：2 h l y a 扩增片段 n o t e ：m d n ai r k 盯u l ：1 a m p l i f i e df r a g m e n to f a 自 a ；2 a m p l i f i e df r a g m e n to f h l y a 上海海洋大学硕士学位论文 卜一 图2 - 2 根据zh y d r o p h i l a a e r a 和h l y a 序列建立的系统进化树 f i g 2p h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do ns e q u 朋c 懿o fa e r aa n dh l y ag e n e so f a h y 功 o p h i l n 注：“口，代表g m b m k 登录号n o t e ：“n ”i n d i c a t e dt h ea c c e s s i o nn i n g e n b a n k 3 2a e r a 和h l y a 的系统进化分析 根据a h y d r o p h i l aw p 3 的a e r a 和h l y a 基因序列构建系统进化树( 图2 2 ) 。在 此进化树中，a e r a 和h l y a 基因序列分成二个独立分支。h l y a 基因与g e n b a n k 巾的其 他h l y a 基因聚类，而在a e r a 基凶的分支中，除了有g e n b a n k 中登录的a e r a 基凶序列 外，还有多个h l y a 基因序列。 3 3a e r a 和h l y a 的抗原性预测 经d n a s t a r 软件预测，并综合亲水性、表面可及性以及抗原指数三项指标，预 测可形成抗原表位的氨基酸区域数为气溶素有2 7 个，溶血素有2 2 个( 表2 - 2 ，图2 3 ) 上海海洋大学硕士学位论文 o j a n t i g e n k i n d e x s u r f a p r o b e b i , t y t a n t i g e n i c i n d e x * - s u r f 扯e p r o b a b i l i t y 图2 3 气溶素( a 盯a ) 基因和溶血素( h l y a ) 基因的亲水性表面可及性和抗原性预测 f i g 2 - 3 p r e d i c t i o no f h y d r o p h i l i c k y ，s u r f a c ep r o b a b i i j t ye n da n t i g e n i c i t yo f a e r ag e n ea n dh l y a g e n e 注：上图：气溶素( a u a ) 基因；下图：溶血素( h l y a ) 基因 n o t e ：u p ：a e r o l y s i n ( a e r a g m d o w n l - d i ! j o b , s m ( h b a ) p e 表2 - 2d n a s t a r 预测抗原表位 t a b l e2 - 2p r e d i c t i o no f e p i t o p e sb yd n a s t a rs o f t w a r e 相关参数 r e l a t e dp a r a m e t e r s 预测域( a a ) p r e d i c t k l gr e g i o n a l ( a a ) a e r a 抗原区综合分析 2 0 2 2 。3 8 - 5 l ，8 0 - 8 6 ，l l1 - 1 1 6 ，1 5 0 1 5 3 1 4 8 - 1 5 3 ，1 5 7 - 1 6 3 a n t i g e n i cr e g i o n a io f a e r a1 7 1 7 1 1 8 1 - 1 8 2 ，1 9 5 - 1 9 7 ，2 0 0 - - 2 0 2 ，2 0 4 - 2 1 3 2 2 3 - 2 3 1 2 3 4 - 2 5 2 , 2 5 5 - 2 6 3 。2 8 1 - 2 8 3 。2 8 6 - - - 2 8 8 。2 9 0 2 9 4 3 0 1 - 2 0 5 3 2 3 - 3 2 5 3 2 8 - 3 2 9 , 3 4 7 3 5 6 ，3 6 4 3 8 l ，3 9 7 - 3 9 8 ，4 0 2 - 4 0 3 ，4 2 2 - 4 2 4 ，4 4 3 - 4 4 9 h l y a 抗原区综合分析 1 8 - 2 0 ，9 4 9 6 ，l l 弘1 2 0 ，1 3 4 - 1 3 9 。2 2 6 - 2 2 8 ，2 3 7 - 2 3 9 ，2 4 7 - 2 4 9 t a n t i g e n i cr e g i o n a l o f2 6 8 - 2 7 0 2 8 5 - 2 8 6 , 2 8 8 - 2 9 l ，3 0 7 - 3 1 2 ，3 4 2 - 3 4 3 。3 6 7 - 3 7 1 3 9 4 - 3 9 9 , h l y a 4 0 2 - 4 0 3 4 1 3 - 4 16 4 4 4 - 4 4 6 ，4 7 4 - - 4 8 1 4 9 0 - 4 9 8 5 2 0 - 5 2 4 5 3 9 - 5 4 7 , 5 8 7 - 5 9 4 3 4a e r a 和h l y a 的结构域分析 通过在线分析系统p f a m h m m s 进行分析( 图2 - 4 ) ，w p 3 菌株a e r a 基凶的前 3 l 上海海洋人学硕上学位论文 8 1 0 6a a 为气溶素的a p t 结构域( a e r o l y s i n p e r t u s s i st o x i nd o m a i n ) ，1 1 9 4 9 1a a 区 域为气溶素结构域；w p 3 菌株h l y a 基因的前7 1 9 6a a 为溶血毒素n 端( h e m o l y t i c t o x i nnt e r m i n a i ) ；2 2 2 - 4 8 4 a a 区域属于白细胞素溶血素家族结构域 ( l c u k o c i di n h e m o i y s i nt o x i nf a m i l y ) 。 分析与w p 3 菌株a c r a 基因同源性高的前五个序列：o q1 8 6 6 1 i ( a ha e r o l y s i n ) 、 d q 3 0 2 1 2 3 ( a hi 笸m o l y s i n ) 、d q 3 0 2 1 2 2 ( a nh e m o l y s i n ) 、d q 4 0 8 2 6 3 ( a hh e m o l y s in ) 、 a f 5 3 9 4 6 7 ( a hh e m o l y s i n ) ，结构域预测发现它们也都具有a p t 结构域以及气济素 结构域，说明它们实际上应是a e r a 基因，只是命名上与h l y a 基因混淆。 照巫亟亟巫巫亟圈一 8 1 0 6 l l 1 1 一4 9 1 a a 垂亟函，”逐亟亟匦亟圃， 1 - 19 6 t - 2 2 2 4 8 4 a , 图2 - 4a e r a 基因和h l y a 基因的p f a mh m m s 结构域分析 f i g 2 - 4 p f a mh m ms e a r c ho f s t r u c t u r ed o m a k l so f a e r o l y s i na n dh e m o l y s i ng e n e s 注：上图为a e r a 基因下图为h l y a 基因 n o t e ：u p ：a e r o l y s i n ( a e r a ) 8 m e ；d o w n ：h e m o l y s i n ( h l y a ) 8 e r i e 3 5a e r a 与h l y a 基因毒力相关性分析 以a e r a 基因特异性扩增引物p 5 与p 6 ，h l y a 基因扩增引物p 2 和p 3 ，分别扩增w p 3 和z c l 菌株以及嗜水气单胞菌无毒株n t w p 3 和z c l 菌株均有2 0 9 b p 的a e r a 的特异性 条带和2 1 2 2 b p 的h l y a 条带，而n t 菌株则无a e r a 的特异性条带和h l y a 条带( 图2 5 ) ， 说u f j a e r a 矛l l h l y an - i 作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。 上海海洋人学硕上学能论文 图2 5 三株嗜水气单胞茵a e r a 基因片段和h l y a 全基因的扩增 f i g 2 - 5a m p l i f i c a t i o no f a e r ag e n ef r a g m e n ta n dh l y ag e n ef o rt h es t r a i n sw p 3 ，7 ela n dn t 注：m d n a m a r k e r ；, i - 3 w p 3 。z c i 和n t 菌株h j y a 扩增产物：4 - 6 w p 3 ，z g l 和n t 茵株a e r a 片段扩增产物 n o t e ：m d n am a r k e r , ! - 3 p c r p r o d u c t so f h l yo f w p 3 ，z g l a n dn t ；4 - - 6 p r o d u c t so f a e r ao f w p 3 ，盈l a n dn t 4 讨论 嗜水气单胞菌分泌的胞外产物有多种，其中气溶素( a e r o l y s i n ) 、溶血素 ( h e m o l y s i n ) 和蛋白酶是嗜水气单胞菌的重要致病因子，与致病性相关呻2 1 1 。气 溶素和溶血素属于溶血性毒素( h e m o l i t i ct o x i c ) l s 4 l 。其毒力作用与结构特征有关。 气溶素的a t p 结构域能促进气溶素与靶细胞表面特异性受体的结合，并使气溶素转 化成为插入的状态，导致产生细胞膜通道、细胞渗透压升高，最终细胞裂解；气 溶素结构域则是气溶素、其它相关的溶血素毒素及杀白细胞毒素( l e u k o c i d i ns ) 亚单位通道形成的部分 1 6 , s s l 。溶血素还具有水溶性跨膜毒素的特征结构溶血毒 素n 端( h e m o l y t i ct o x i nnt e r m i n a i ) ，可与三段p 折叠的溶血素结构域组成一个“门 娜 闩”瞰钉l 。 本实验克隆到的草鱼嗜水气单胞菌分离株w p 3 菌株的h l y a 基冈序列与 g e n b a n k 上的相应序列具有较高同源性( 9 4 7 0 旷9 9 7 ) 。但与w p 3 菌株a e r a 摹因高 同源性的序列中除了有a e r o l y s i n 基因( 同源性为9 0 0 0 9 6 4 ) 外，还有h e m o l y s i n 基因 ( i 一源性为9 4 0 旷9 9 6 ) 。在系统进化树中，这些序列混合聚类于a e r a 基凶分支中。 对a e r a 基因以及与之同源性较高的这些h l y a 序列结构域进行预测，发现它们均具 有气溶素典型的a p t 和气溶素结构域。缺少h l y a 的溶血素n 端结构域。序列与结构 域的相似性说明这些与a e r a 基因聚类的h l y a 基因实际卜应足a e r a 基因，只足命名卜 与h l y a 基因混淆。 3 3 上海海洋人学硕上学位论文 蛋白质的亲水性、表面可及性、柔韧性等在抗原的形成方面发挥着重要的作 用，用d n a s t a r 软件预测a e r a 和h l y a 的抗原性，显示它们分别有2 8 个和2 2 个 氨基酸区域指标达到抗原区的标准，说明两个基囚均具有很好的抗原性。 嗜水气单胞菌有致病菌株和非致病菌株之分，而嗜水气单胞菌的致病性与胞 外产物密切相关 1 7 ! s 3 4 。编码气溶素和溶血素的基因常被用于鉴别嗜水气单胞菌 的毒力菌株【黯，别。但嗜水气单胞菌的致病性菌株是否与这二个毒力基凶相关不同 的研究者有着不同的结论。有些发现致病性分离株均有a e r a , 大部分有h l y 基冈 刚：有的则发现致病性分离株至少扩增到a e r a 或h l y a 基因的一种，而非致病性 分离株中未扩增到a e r a 或h l y a 基因【9 1 1 ；有些则发现h l y a 基因的存在与致病力 无关，而a c r a 基因的存在则与毒株的毒力相关，r - - 个基因均呈阳性的菌株可能 是强毒株【9 2 】。本实验在强毒株与弱毒株中均扩增到a e r a 和h i y 基因，而非毒力株 则均未扩增到，说明a e r a 基因和h l y a 基因的分布与菌株的毒力相关。但关于有 毒与无毒株此二个基因的分布、以及基因与毒力大小的相关关系仍需更多的菌株 检测加以确证。 上海海洋人学硕上学位论文 第三章嗜水气单胞菌外膜蛋白w 基因的表达及其免疫原 性分析 l 前言 外膜蛋白( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ，o m p ) 是革兰氏阴性菌外膜的主要结构， 在细菌的物质运输、形态维持和有关物质合成方面起着重要的作用。研究表明细 菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以激发机体的体液免疫，而且还可引 起细胞免疫1 9 3 3 0 l ，而且外膜蛋白具有异种血清型的免疫交叉保护性，是一种潜在的 共同保护性抗原1 3 1 - 3 3 。已报道的嗜水气单胞菌主要的外膜蛋白有外膜蚩白 a ( o m p a ) 、微孔蛋白( p o r i m ) 、脂蛋白( l i p o p r o t e i n ) 等。外膜蛋白a 又称热修 饰蛋白，含有丰富的p 折叠结构，在维持细胞膜结构上具有重要作用；微孔蛋白则 不具热修饰性，但可形成相对非特异性的通道，具有通透特性，又称通道蛋白； 脂蛋白为细菌外膜蛋白中含量最为申富的结构蛋白，该基凶突变的菌株可允许亲 水性小分子通过外膜，但突变株的细胞壁小稳定，且小具备有作为噬菌体受体、 大肠杆菌素受体的功能f 2 7 l 。外膜蛋白w ( o m p w ) 为一类微孔蛋白，属于小外膜 蛋白家族( f a m i l yo f s m a i io u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ) 1 9 4 1 ，由2 0 0 - 2 3 0 个氨基酸组成， 有研究人员预测该蛋白是一个由8 个b 折叠组成的一个桶状通道结构，能够协助疏 水性分子通过细菌外膜p s i 。o m p w 广泛存在于革兰氏阴性荫，如弧荫v 殇r i os p p ， 大肠杆菌e s c h e r i c h i nc o l , 沙门氏菌s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ，气单胞菌a r o m o n a ss p p 等【3 町。关于弧菌的o m p w 已有较多的研究，o m p w 基凶存在于所有已知的弧菌中 具有很好的免疫原性且较为保守，推断其具有交叉免疫保护作用脚t 明关于嗜水气 单胞菌o m p w 的研究较少，m a i t i 等( 2 0 0 9 ) 首次克隆了嗜水气单胞黼的o m p w 基 因，并证实o m p w 分布于大部分气单胞菌中且序列相埘保守，并认为该基因可用 于气单胞菌的鉴定p 叼。 本研究克隆了强毒株w p 3 的o m p w 基因，进行序列分析与高级结构预测， 并进行了原核表达、重组蛋白的免疫效果、保护作用评价，为基因工程亚单位疫 荫的研制奠定了基础。 上海海洋大学硕上学位论文 2 材料和方法 2 1 供试菌株、宿主菌和质粒载体 嗜水气单胞菌强毒株w p 3 菌株，大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l d h 5 a 和m 15 宿主菌 由本实验室保藏；克隆用质粒载体是p d m 一1 8 tv e c t o rs y s t e m ，表达用质粒为p q e 3 0 ， 购自t a k a r a 公司。 2 2 酶和试剂 2 2 1 酶和主要试剂 质粒d n a 提取试剂盒( e z n ap i a s m i dm i n i p r e pk i t ) 和胶回收试剂盒 ( e z n ag e l e x t r a c t i o nk i t ) 为o m e g a 公司产品；t r i m lr e a g e n t 、n o v a g e nh i sb i n d 蛋白纯化试剂盒，购自i n v i l r o g e n 公司：r c v e r t r aa c e 0 【 k i t 试剂盒购t o y o b o ： e x t a qd n ap o l y m e r a s e 购自上海生工生物技术有限公司；p o w e rs y b rg r e e n m a s t e rm i x 购白a p p l i e db i o s y s t c m 公司；限制性内切酶购白t a r a 公司：p c r 产物 清洁盒( p c rc l e a nu pk i t ) 购自v - g e n e 公司；t 4d n a 连接酶为华美生物工程公 司产品；i p t g ( 异丙基硫代半乳糖苷) ，t e m e d ，t r i s ，s d s ，e d t a r n a s ef r e e d n a s ei 购自p r o r m g a 公司；硝酸纤维素膜，鼠抗h i s 单抗，辣根过氧化物酶标记的 羊抗鼠抗体，d a b 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗草鱼血清 为本实验制备与保存；琼脂糖、d n a 分予m a r k e r 、蛋白分子m a r k e r ，弗氏不完全 佐剂( f r c u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t ，f i a ) s i g m af - 5 5 0 6 购自，“州威佳生物有限公司。 其它试剂为国产分析纯试剂。 2 2 2 克隆用试剂与培养基 t a e 电泳缓冲液，d n a ：样缓冲液，l b 培养基，a m pl b 固体培养基，配置 方法见第一章。 2 2 3s d s p a g e 所用试剂 ( 0 5 x s d s p a g e 电泳缓冲液( r u n n i n gb u f f e r ) ( il ) ： g l y c i m t r 瓷 s d s 7 2 9 1 5 9 5 9 上海海洋人学硕上学位论文 ( 2 ) 2xs d s p a g e 上样缓冲液( g e ll o a d i n gb u f f e r ) ( 1 0 m 1 ) 4 下保存： 0 5 m o l lt i r s - h c i ( p h 6 8 ) g l y c e r o l 2 0 ( w v ) s d s d d h 2 0 0 1 ( w v ) b r o m p h e n o lb l u e 2 b - m e r c a p t o e t h a n o i 2 0 m l 2 0 m l 2 0 m l 2 5 m l 0 5 m l 1 0 m l ( 3 ) 1 8 s d s p a g e 分离胶( s e p a r a t i n gg e l ) ( i o r a l ) ： d d h 2 0 3 0 a c r b i s ( w v ) i 5 mt r i s - h c u p h 8 8 ) l o s d s 1 0 a p t e m d 1 2 m l 6 m l 2 6 m l l o o 皿 1 0 0 “l 4 儿 ( 4 ) 5 s d s p a g e 浓缩胶( s t a c k i n gg e l ) ( 5 m l ) ： d d h 2 0 0 5 mt r i s - h c l ( p h 6 8 ) l o s d s 1 0 a p t e m d 3 0 a c r b i s 2 7 7 m l 1 2 5 m l 5 0 皿 5 0 皿 5 止 8 3 0 p l ( 5 ) 2 5 考马斯亮蓝r - 2 5 0 染色液( ! o o m l ) ： 甲醇 d d h 2 冰乙酸 考马斯亮兰r - 2 5 0 4 5 m l 4 5 m l 1 0 m l 0 2 5 9 ( 6 ) 脱色液( 1 0 0 m l ) ： 3 7 ， 上海海洋人学硕上学位论文 甲醇 冰乙酸 d d h 2 2 5 m l 5 m l 7 0 m l ( 7 ) 磷酸盐缓冲液( p b s ，il ) - n a c l k c i k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 8 9 0 2 9 0 2 4 9 0 4 4 9 上述成分预溶于6 0 0 m ld h 2 0 ，用盐酸调p h 至7 4 后，再用d h 2 0 定容至l l 。 2 2 4 蛋白纯化所用试剂： ( 1 ) 洗涤液一：5 0m mt r i s ( p h 8 0 ) ，5m me d t a ； ( 2 ) 洗涤液- - ：5 0m mt r i s ( p h 8 0 ) ，5m me d t a ，2m 脲； ( 3 ) 变性液：0 1mt r i s ( p h 8 o ) ，1 0m m 瑚厂r ，8m 脲； ( 4 ) 复性液：o 1mi r i s ( p h 8 0 ) ，5m me d t a ，5m mc y s t e i n e 。 ( 5 ) n o v a g e nh i sb i n d 蛋白纯化试剂盒试剂： 2 2 5w e s t e r nb l o t 所用试剂 ( 1 ) 转膜缓冲液：7 0 0 m l 去离子水中溶解u 。氨酸2 9 9 ，t r i s b a s e 5 8 9 ，s d s0 3 7 9 调p h 值至8 3 ，定容到8 0 0 m l 后加入2 0 0 m l 甲醇。 上海海洋人学硕上学位论文 ( 2 ) t b s , n a c l8 9 ，k c l0 2 9 ，t r i s b a s e3 0 9 ，溶于8 0 0 m l 去离子水中，加入6 nh c ! 调至 p h 7 4 定容10 0 0 m l ( 3 ) t b s t ：在t b s 中加入0 0 5 吐温2 0 。 ( 4 ) 封闭液：5 9 牛奶溶1 0 0m lt b s t 溶液中。 2 2 6e l i s a 所用试剂 ( 1 ) 包被缓冲液：o 1 m o l ln a 2 c 0 3 ，0 i m o l ln a h c 0 3 ，用n a o h 凋p h9 6 。 ( 2 ) 封闭液：5 脱脂奶粉。 ( 3 ) 清洗缓冲液，p b s ( p h 7 4 ) + 0 0 5 吐温2 0 ： ( 4 ) 稀释缓 ( 5 ) 底物缓 ( 6 ) 终止液：2 m o l lh 2 s 0 4 。 2 3 引物设计与合成 根据g e n b a n k 上已登录的嗜水气单胞i ；基因组全序列( n c0 0 8 5 7 0 ) 1 9 s ，利用 p r i m e r 5 0 设计引物p l 、p 2 扩增o m p a 基因的全序列。再根据已扩增卅的o m p w 基因 全序列，设计引物p 3 ( 带有b o m h i 位点) ，p 4 ( 带有励硼i i i 位点) 扩增成熟肽序列 引物由上海生工生物技术有限公司合成( 引物序列见表3 1 ) 。 2 4o m p w 基因的克隆与序列分析 以w p 3 菌株的基因组d n a 为模板( 第一章已提取基因组d n a ) ，以p l 和p 2 为引 物进行p c r 扩增。p c r 反应体系为：d d h 2 01 4 6 5 t t l ，1 0 e x7 a 7b u f f e r 2 1 - i l ， d n t p 0 4 t t l ，上游引物0 4 t t l ，l - 游引物0 4 1 t l ，模板2 t t l ，e x 彻d n a 聚合酶0 1 5 t t l 。 上海海洋大学硕士学位论文 反应条件为：9 5 预变性3 m i n 后，进入循环，9 4 。c 变性i m i n ，5 5 退火4 5 s ，7 2 延伸1 m i n ，共3 3 个循环，最后一个循环结束时7 2 延伸5 m i n ，4 保存。用1 琼 脂糖凝胶电泳检测p c r 产物。切下目的条带，胶回收试剂盒回收。回收产物用 p m d l 8 tv e c t o r 连接并转化大肠杆菌d h 5 a 菌株感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素 的l b 平板上，3 7 c 培养1 2 1 6 h 。挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素a m p 的l b 液体 培养基中，3 7 、2 0 0 r m i n 振荡过夜，取2 此菌液为模板进行p c r 鉴定，阳性克隆 送上海生工生物技术有限公司测序，具体方法见第一章。质粒命名为p m d - 1 8 t - o m p w 。 利用软件 v e c t o r n l 6 0 及生物信息网站n c b i ( h t t p ：w w w n c b l n l m n i h g o v ) e x p a s y ( w 、】v v t e x p a s y o r g ) 、s i g n a i p 3 o s e r v e r ( h t t p ：、 ，w w c b s d t u d k s e v i e e s s i g n a l p ) 、d n a s t a r 进行序列分析，包括o m p w 基因全长序列拼 接、核什酸序列巾o r f 框的确定、编码氨基酸序列推导、信号肽预测、抗原性预 测。氨基酸序列提交3 m j l g s a w 服务器( h t t p ：b m m c a n c e r r e s e a r c h u k o r g - 3 d j i g s a w ) ， 转换成p d b 文本后应用s w i s s - p d b v i e w e r 软件j f l l r a s m o l 软件，分析蛋白高级结构。 表3 - lo m p w 扩增与表达、q r t - p c r 检测i g m 基因表达所用的引物 1 h 3 - 1p r i m e r sf o rc b n i n ga n de x p r e s s i o no fo m p wg e ma n dq r t - p c ro f i g m 沌：卜划线为酶切位点 n o t e ：u n d e r l i n e dn u c l e o t i d e sa r er e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i n gs i t e s 上海海洋人学硕上学位论文 2 5 重组质粒p q e 3 0 w 的构建 2 5 1 目的基因的扩增 提取p m d - 1 8 t - o m p w 质粒。以该质粒作为模板，以分别带酶切位点及聊h i 、 励脚i i i 的p 3 、p 4 为引物进行p c r 扩增。反应条件同上。用1 琼脂糖凝胶电泳检测 p c 胪物。切下目的条带，胶回收试剂盒回收，方法同上。 2 5 2p q e 3 0 和目的基因的双酶切 所得p c 贼化产物用限制性内切酶b o m h l 、h i n d l i i 进行双酶切，酶切时间为6 h 酶切结束后用p c rc l e a nu p 试剂盒纯化酶切产物，p q m o 也用同样的酶切方法进行 双酶切和纯化。3 7 水浴酶切3h