（微生物学专业论文）盐生杜氏藻3磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其结构分析.pdf

盐生杜氏藻3 一磷酸甘油脱氢酶基因克隆 及其结构分析 微生物学专业 研究生李钢指导教师曹毅 盐生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 是极端耐盐的藻类，在植物耐盐研究中 是重要的模式生物。该藻通过甘油进行细胞膨压的调节。因此对甘油合成途 径上的关键酶3 磷酸甘油脱氢酶( g l y c e r o l 一3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，简称为 g p d h ) 的研究是至关重要的。本文通过s m a r t r u 技术构建了盐生杜氏藻的 全长e d n a 文库，测得该文库的平均滴度为1 2 1 0 6e f u m l ，可以代表藻体 细胞3 0 7 1 0 6m r n a 片段，重组率为1 0 0 。然后在对文库随机克隆进行 测序的同时，运用生物信息学手段寻找到3 磷酸甘油脱氢酶基因的序列表达 标签( e s t ) 序列，在这个基础上对3 磷酸甘油脱氢酶全长基因进行了克隆。 首先采取亚克隆，测序等手段获得了3 磷酸甘油脱氢酶基因的3 u t r 序列， 整个e s t 及其3 端序列总长度为1 6 0 9 b p ，包含3 磷酸甘油脱氢酶基因3 端 编码序列和3 u t r 序列，并发现其中含有一个o t 重复序列；其次通过r a c e 技术在e s t 的基础上进行基因5 端全长的扩增，整个5 端序列最长为 1 5 4 4 b p ，包括了3 磷酸甘油脱氢酶基因的5 端编码序列和5 u t r 序列：最 后对这条e d n a 进行了s o u t h e r n 杂交验证，杂交结果表明3 一磷酸甘油脱氢酶 基因在盐生杜氏藻基因组中含一个拷贝。同时通过分段p c r 的方法，对盐 生杜氏藻的基因组d n a 进行了部分扩增，获得了8 个3 磷酸甘油脱氢酶的 内含子。分析发现这些内含子的剪接边界与目前公认的内含子剪接边界相 同，同时发现内含子与外显子的g c 含量明显不同并且内含子中具有大量 g t 重复序列。 运用生物信息学手段对3 磷酸甘油脱氢酶基因核酸以及蛋白质序列做 出了分析，发现这个基因编码两种功能的结构域，磷酸化酶结构域和3 磷酸 甘油脱氢酶结构域。通过相似性搜索，结构域定位以及结构比较分析我们认 为磷酸化酶结构域很可能是催化3 - 磷酸甘油水解，而3 磷酸甘油脱氢酶结构 域是催化3 磷酸甘油合成的，为这个基因功能的鉴定提供了根据。 关键词盐生杜氏藻3 磷酸甘油脱氢酶e d n a 文库s o u t h e r n 杂交序列表 达标签内含子外显子结构域 c1o nin ga n dc h a r a c t e riz a t io i lo f gi y c e r oi 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( e c 1 1 1 8 ) g e n e j nd u n a i i e i l as a i n a m a j o r 聃j c r o b i o l o g y g r a d u a t e ds t u d e n tl ig a n gt u t o rc a oy i d u n a l i e l l as a l i n ai st h em o s te x t r e n l eh a l o t o l e r a ta l g ai nt h ew o r l d ，i ti sa g o o dm o d e lo r g a n i s mi nt h ep l a n th a l o t o l e r a n c er e s e a r c h t h ea l g ar e g u l a t e si t s i n s i d et u r g o rt oa d a p tt h eo u t s i d eo s m o t i cc h a n g eb ys y n t h e s i z i n gal a r g ea m o u n t o f g l y c e r 0 1 i ti si m p o r t a n t t os t u d yg l y c e r o l 3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，t h ek e y e n z y m eo ft h eg l y c e r o l m e t a b o l i s mt ok n o wh o wt h es p e c i e sc a l ls u s t a i nt h e h y p e r o s m o t i c sp r e s sb ya c c u m u l a t i n gs om u c hg l y c e r 0 1 h e r ew ec o n s t r u c t e da e d n al i b r a r yu s i n gs m a r t t mt e c h n i q u e t h er e c o m b i n a n to ft h el i b r a r yi s 1 0 0 t h e t i t e ro f t h i s l i b r a r y i s1 2 t o o c f u d m l w h i c hc a nr e p r e s e n t3 0 7 1 0 6 m r n a f r a g m e n t si nt h ea l g ac e l l al a r g es c a l ed n a s e q u e n c i n go f t h er a n d o m c l o n ei nt h el i b r a r yw a sp e r f o r m e d e s to f g l y c e r o l 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e g e n e w a s g a i n e d a n dt h e f u l l - k n g t h e d n ao f g l y c e r o l 一3 一p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s eg e n et h e nw a sa c h i e v e d f o l l o w i n gd e s c r i b e d f i r s tt h e 3 c o d i n gs e q u e n c e a n d3 u t r g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s eg e n e w a s s e q u e n c e da c c o r d i n gt os u b c l o n i n gt h ep g p d h - 3p l a s m i d t h et o t a ll e n g t ho f3 c o d i n gs e q u e n c e a n d3 u t r w a s 1 6 0 9 b p w h i c h i n c l u d e da g t - r e p e a t e d s e q u e n c e s e c o n d l ya c c o r d i n g t ot h ee s t s e q u e n c et h e5 f u l ll e n g t ho ft h i sg e n e w a sa m p l i f i e du s i n gr a c e t e c h n o l o g y t h e5 c o d i n gs e q u e n c ea n d5 u t rw a s 15 4 4 b p l o n g a tl a s tt h es o u t h e r na n a l y s i sw a sd o n et oi d e n t i f yt h ee d n a t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h eg l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s eg e n eo f t h i ss p e c i e s w a sa s i n g l ec o p yg e n e i nt h eg e n o m e t h e g e n e s t r u c t u r ew a s s i m p l ya n a y z e db yp c rm e t h o d t h ep a r t i a l s e q u e n c eo f t h i sg e n ew a sa m p l i f i e da n dr e s u l ts h o w e dt h a ti th a d8i n t r o n sa n d9 e x o n s t h es p l i c i n gs i t ew a sc o l l l n l o nt oo t h e r g e n eo f a i t h ee a k a r y o t e t h eg c c o n t e n to fi n t r o na n de x o nw a s g r e a t l yd i f f e r e n t a n dt h ei n t r o nh a dal o to fg t r e p e a t e ds e q u e n c e t h ed n aa n d p r o t e i ns e q u e n c e o ft h i s g e n e w a sa n a l y z e d u s i n gt h e b i o i n f o r m a t i c st o o l s t w of u n c t i o n a ld o m a i n sw e r ef o u n di nt h ep r o t e i n ，o n ei s p h o s p h a t a s e l i k ed o m a i na n dt h e o t h e ri s g l y c e r o l 一3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e d o m a i n t h ef o r m e rd o m a i n m a y c a t a l o g t h e d e p h o s p h a t i o n o ft h e g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e a n dt h el a t e r p r e s u m a b l ys y n t h e s i z e t h e g l y c e r o l - 3 一p h o s p h a t ea c c o r d i n gt os i m i l a r i t ys e a r c h i n g ，d o m a i nl o c a l i z a t i o na n d s t r u c t u r ec o m p a r i s o n t h e s es h o u l dg i v ea ne v i d e n c ef o rt h ef u n c t i o n a lr e s e a r c h o f t 1 i sg e n e k e y w o r dd u n a l i e l l as a l i n a , g l y c e r o l 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，e d n a l i b r a r y ， s o u t h e r n b l o t t i n g ，e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g s ( e s t ) ，i n t r o n ，e x o n ， d o m a i n 4 日| j吾 盐生杜氏藻( d u n a t i e l l as a l j n a ) 是目前世界上最耐盐的真核光合生物， 主要生活在一些盐湖盐田以及海洋中。对该藻的耐盐( h a l o t o l e r a n c e ) 机理阐明 是目前盐胁迫功能基因组学( f u n a i o n a lg e n o m i c s ) 需要迫切解决的问题。研究 表明，该生物在高盐胁迫环境中可以将细胞叶绿体中储藏的淀粉迅速转化成 大量甘油，这个过程不仅涉及物质由叶绿体向胞质中运输过程，而且还涉及 甘油合成代谢途径的激活。甘油代谢的基本过程是淀粉经过水解成葡萄糖， 经1 ，6 一二磷酸果糖，转化为磷酸二羟基丙酮，接着生成3 磷酸甘油 ( g l y c e r 0 1 3 - p h o s p h a t e ) t 后脱去磷酸生成甘油。其中磷酸果糖激酶和3 磷酸甘 油脱氢酶( g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，简称为g p d h ) 是这个代谢途 径中的关键酶n ，j ，尤其是3 磷酸甘油脱氢酶在生成甘油中起到了关键酶的 作用。3 磷酸甘油脱氢酶是广泛存在于生物体内的代谢酶，它有多种类型分 别用酶学代号e c l 1 1 8 ，e c t 1 9 9 5 ，e c l 1 1 ，9 4 来表示，其中e c l 1 9 9 5 是 位于线粒体中磷酸甘油穿梭途径中以f a d 作为辅酶，而e c l 1 1 8 是在各个 生物中位于胞质参与甘油代谢的酶，对于e c l 1 1 9 4 的功能还不是很清楚。 盐生杜氏藻在高渗( h y p e r o s m o t i c ) 条件下要合成甘油调节胞内膨压 ( t u r g o rr e g u l a t i o n ) ，因此作为甘油合成途径中的关键酶，研究3 磷酸甘油 脱氢酶对盐生杜氏藻耐渗的机理研究具有重要意义。早在2 0 世纪8 0 年代就 有人分离并纯化了这个酶，但是后续研究发现在盐生杜氏藻中3 磷酸甘油脱 氢酶存在多种形式，一种是位于线粒体是参与磷酸甘油穿援途径的，还有三 种以n a d h 为辅酶的g p d h 同工酶，位于叶绿体的有两种，分别是调渗型 g p d h 以及甘油脂型g p d h ，另外一种是位于细胞质型g p d h 也可能参与细 胞甘油代谢。其中渗透调节型( o s m o r e g u i a t o r yt y p e ) 的活性受到渗透压的调 节，因此在该物种适应渗透压变化过程中起着重要作用【1 ，卯。虽然从2 0 世纪 7 0 年代就陆续有人对调渗型g p d h 基因以及与之相关的渗透压调控反应途 径开展了研究【3 7 9 1 3 1 ，并取得了很大的进展，但是至今没有人成功克隆到 这个酶的基因。本文成功地克隆了这个酶的基因，同时对这个基因做出了相 应分析。为盐生杜氏藻盐胁迫下的功能基因组学研究打下了坚实的基础。 第一章盐生杜氏藻s m a r t t m 质粒c d n a 文库构建 1 材料与方法 1 1 材料 i 1 1 藻种 盐生杜氏藻( d u n a l i e l l a s a l i n a ) ，购于中国科学院武汉永生生物研究所。 1 1 2 菌种 电转化感受态大肠杆菌j m l 0 9 ，购自购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限 公司 1 1 3 酶制剂 s f ii 限制内切酶，购自购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限公司 1 1 4 试剂盒 r n e 鹊ym i n ik i t 植物总r n a 提取试剂盒，购自q i a o e n 公司 c r e a t o r t “s m a r t r mc d n a l i b r a r yc o n s t r u c t i o nk i t ，购自c l o n t e c h 公司 a d v a n t a g e 2p c r k i t ，c l o n t e c h 公司赠送 1 1 5 培养基 d sm e d i u m 盐生杜氏藻培养基 其它培养基参见附录 1 2方法 1 2 i 杜氏藻的培养 将原种按5 的接种量接入1 0 0 m l 的d s 培养基中，按光照1 6 小时黑 暗8 小时，2 5 培养。 1 2 2 杜氏藻总r n a 分离 当藻体细胞生长到6 1 0 5c e u s m l 的浓度时，收集细胞i o m l 细胞子 4 0 0 0 r p m ，4 离心5 分钟迅速将所有的细胞转移入一个预冷的r n a s e f r e e e p 管中。 按照q i a g e n 公司的r n e a s y m i n i 植物总r n a 提取试剂盒的操作说明书 6 提取。中途使用试剂盒操作说明书中提供的柱式降解d n a 法，去除d n a 污染，最终收集r n a 溶液4 0 此。 分别取o 5 此，1 1 t l ，2 此r n a 在含0 1 p g m l 溴乙锭的1 2 甲醛变性凝 胶中电泳3 0 分钟到1 5 小时，电压5 7 v c m 。 用a m e r s h a mp h a n n a e i a 公司的q u a n tp r or n a d n ac a l c u l a t o r 测定r n a 浓度以及纯度，测定a 2 6 0 a 2 9 0 以及a 2 6 0 a 2 3 0 的光吸收比值。 1 2 3l d p c r 法舍成s m a r 丁“c d n a 按照文库构建试剂盒加量，量取各个组分。进行e d n a 链的合成。取1 o g 总r n a ( 约3 p l ) 于0 2 m l 薄壁管中混匀以下成分： 藻总r n a3 吐 s m a r t i vo l i g o n u c l e o t i d e 1 t l c d s i l l 3 p c r 引物1 “l 加入少量矿物油封液面，稍微离心。于7 2 水浴2 m i n ，冰浴2 m i n ，加 入以下成分： 5 f i r s t s t r a n d 缓冲液2 吐 d t t ( 2 0 r a m )l 止。 d n t p 混合物( 1 0 m m )l 此 p o w e r s c f i p t t m 反转录酶1 止 用量取器轻吹打几下混匀，于4 2 c 水浴反转录1 5 小时后冰上终止反应。 反转录完成后以e d n a 为模板进行长程p c r ( 1 0 n gd i s t a n c e p c r ， l d p c r ) ，于冰上加入以下反应体系： f i r s t s t r a n dc d n a 2 p l 去离子水8 0 u l 1 0 a d v a n t a g e 2p c r 缓冲液 1 0 l l l 5 0 d n t p 混合物 2 0 l 5 p c r 引物2 u l c d s i i i 3 p c r 引物2 u l 5 0 a d v a n t a g e2 聚合酶混合物2 止 混匀并离心，加入少量矿物油，放入p c r 仪中按照预变性9 5 c ，3 0 s ， 扩增9 5 ，1 5 s ：6 8 。6 r a i n ；2 1 循环。 取4 皿l d p c r 产物于含溴乙锭的1 t 琼脂糖凝胶中电泳检测。 1 2 4c d n a 纯化以及分段化 将合格的c d n a 用蛋白酶k 于4 5 处理2 0 分钟，然后加入5 0 旺去离 子水，用等体积的酚：氯仿，氯仿：异戊醇各抽提一次，加入1 0 吐3 m 乙酸钠， 1 3 z l2 0 峙，肛l 糖原以及两倍体积乙醇沉淀。8 0 乙醇洗涤后加入7 9 皿去离 子水，然后用s f i i 酶切，体系如下： c d n a7 9 儿 1 0 x s f ii 缓冲液1 0 此 s f ii 限制内切酶1 0 止 1 0 0 b s al 儿 混匀加入少量矿物油于5 0 温育2 小时。将酶切反应液和2 乩1 二甲 苯青青混合。 准备1 6 个e p 管对c h r o m a s p i n - 4 0 0 柱进行滴速性能实验，用1 0 0 0 肛l 量取器将柱胶重悬，然后移去出口的帽子，让桂内缓冲液自然滴出，柱胶自 然沉降。不断重复此过程直至流速在4 0 s 6 0 s 每滴，约4 0 吐滴。然后加入 7 0 0 l 的柱缓冲液，当缓冲液不滴时，小心平稳地加入酶切混合液，等酶切 液被柱子吸收后，加入1 0 g l 止，柱缓冲液，待滴完后，将e p 管口置于柱子出 口下，再加入6 0 0 此柱缓冲液，按每滴( 约3 5 止) 一管收集滴出液，共1 6 管。 每管各取3 此予1 1 的琼脂糖凝胶中1 5 0 v 电泳1 0 分钟，混合含有d n a 片段的前3 4 管d n a 溶液用乙酸钠、糖原以及乙醇沉淀，洗涤。用7 儿 去离子水溶解。 1 2 5 原始文库的形成 将2 5 此c d n a 与1 此载体p d n r - l i b 混合，加入连接液其它成分。于 1 6 。c 连接过夜。用本章1 2 4 的方法沉淀d n a ，加入5 旺去离子水，待转化。 以1 此c o n t r o l 质粒p u c l 9 ( 0 0 1 n g g l ) 转化电转化感受态大肠杆菌 j m l 0 9 ，使用b i o - r a d 公司c 1 a l ep u l s e r l i s y s t e m ，以2 5 u f ，2 0 0q ，1 5 k v 电击，最终得的2 m l 转化液，取5 曲涂布于平板，计算平板菌落数以及转 化效率。将3 m 1 0 9 细胞5 0 此与5 p l 文库连接液混匀，加入o 1 c m 电击杯中， 于冰上冷却1 0 2 0 分钟。g e n ep u l s e r i is y s t e m ，以2 5 心，2 0 0q ，1 5 k v 电击。然后立即加入l m ls o c ，于3 7 。c ，2 2 0 r p m 复苏1 小时。 取l 此原始文库涂布于含3 0 i _ t g m l 氯霉素l b 平板中3 7 培养过夜。 1 2 6 文库滴度测定 将文库按1 ：1 0 3 ( a ) 和1 ：1 0 6 ( b ) 比例稀释。各取l 此稀释液各加入5 0 此 l b 全部涂布在平板上。室温朝上放置15 2 0 分钟，于3 7 c 倒置培养过夜。 1 2 7 文库质量鉴定初步鉴定 利用p c r 方法对文库随机克隆的插入片段进行菌落p c r 。按照如下体系： 去离子水1 7 3 儿 1 0 p c r 缓冲液 2 5 t t l m g c l 2 2 儿 d n t p2 儿 m 1 3r e v e r s e 引物 1 0 p m o l 约o 5 吐 m 1 3f o r w a r d 引物 l o p m o l 约o 5 u l t a q d n a 聚合酶 l 单位 预变性9 5 c 3 0 s e c ：9 5 ，3 0 s e e ，7 2 ( 2 ，2 m i n ，2 5 循环；7 2 ( 2 ，5 m i n ，l 循 环。取8 儿子1 o 琼脂糖凝胶中电泳。 2 结果与分析 2 1 总r n a 提取 本次试验从6 1 0 6 新鲜藻体细胞中提取了约1 2 t t g 的总r n a ，r n a 浓度 是0 3 i t g t x l ，a 2 6 0 a 2 8 0 比值约为2 0 ，a 2 6 0 ，a 2 3 0 比值约为2 5 。详见表i i 。 表1 1r n a 样品制备比较 壁曼垒! 型垒：驾 ! ! 坐翌! 蓬壅垒型些2 d n a s ei 未消化2 5 0 9 1 7 3 1 0 2 d n a s ei 消化2 0 3 1 2 5 0 7 0 3 经过试剂盒的备择方案来除去d n a ，比较结构如表i 1 。图1 1 是经过 柱式消化后的，电泳上看主带1 8 sr r n a 与2 8 sr r n a 亮度比值约1 ：1 5 ，而 且没有弥散，此外还有一些小r n a 的条带也比较明显，说明r n a 质量完好。 123m 12 3 4m 图11 盐生杜氏藻总r n a 变性电泳 l a n l 3 ：杜氏藻总r n a ；m ：m a r k e r 图1 2l d p c r 电泳结果 j a n l “： p c r 反应样品电泳： m ：m a r k e r 2 2c d n a 的检测与收集 c d n a 是通过长程p c r 的方式等比例扩增的，扩增后的c d n a 在0 1 4 k b 之间呈现弥散状态同时在弥散的的泳道上有一些明亮的条带，如图12 。 m1234 ，67891 01 i 1 2 1 31 4 l2 3 4m5 678 9 圈1 3 分段e d n a 电泳结果 l a n l 1 4 ：1 1 4 管e d n a 分段样品： m ：m a r k e r 0 图1 4p e r 检测文库插入片度 l a n l 一9 ：随机克隆1 9 号；m ：m a r k e r 通过c h r o m as p i n 4 0 0c o l u m n 分段化后的d n a 产物主要分布在6 到1 4 号管中，从图1 1 3 中可以看出c d n a 主要集中在6 到1 0 号管中，l l 号 到1 4 号管主要是引物，接头等短片段，所以将6 1 0 管中的c d n a 收集沉 淀。 2 3 文库的鉴定 以l “lc o n t r o l 质粒p u c l 9 ( 0 0 1 n g 此) 转化j m l 0 9 ，电击时间4 。2 m s ，取 5 止涂布于平板得到2 1 个菌落，转化频率计算：2 1 5 x 2 0 0 0 x o 0 1 1 0 3 = 8 1 0 8 个菌落l a g p u c l 9 ，说明这个感受态细胞可以做为文库转化的细胞。 文库连接液电转化时间4 1 m s ，取1 1 t l 转化液涂布于平板，得到9 0 0 l1 0 0 个菌落平板。文库滴度测定如表1 2 。表格数据按照以下公式计算： c o l o n y # 原液1 0 3 = c f u m l ， c o l o n y # a 1 0 3 1 0 3 = c f u 1 1 1 l 一 c o l o n y # b 1 0 3 1 0 3 x 1 0 3 = c f u m l 。1 表1 2 文库滴度计算结果 文库滴度平均为1 2 x1 0 6 ，按照公式n = 衄1 p ) a n ( 1 - l n ) ，可以计算这个 文库所代表的藻体细胞m r n a 的片段数。n 为文库克隆总数，p 为m r n a 出现在文库中的比例，一般为9 9 的m r n a ，1 n 为出现单拷贝m r n a 的 m r n a 总数。这样经过计算，l n = 3 0 7 x1 0 一，说明这个文库可以代表藻体 细胞3 0 7 1 0 。m r n a 片段。 通过p c r 的方法对随机挑取的6 0 个克隆子进行p c r ，以检测重组率， 重组率为1 0 0 。圈1 4 为l 9 号p c r 检铡结果。经过统计6 0 个克隆子发 现平均片段插入长度为1 s k b ，5 0 0 b p l k b 的片段占文库克隆子3 3 3 ， l k b 2 k b 的片段约5 1 7 ，2 k b 3 k b 的片段占1 3 3 ，大于3 k b 的片段占 1 7 。 3 讨论 3 1 总r n a 的提取 高质量的r n a 是决定文库质量的关键因素。但是r n a 提取是分子生物 学中难度比较大的一项实验。主要原因是r n a s e 污染，r n a s e 的具有耐受高 温，不易变性，活性不易被抑制等特点，因此很难除去。污染主要包括内源 和外源两种，内源污染主要是由细胞内的一些r n a s e ，因此这个是不可避免 的，是系统误差：外源污染是指外界环境中的，主要是仪器、容器、溶液以 及空气中的r n a s e ，这些是可以尽量避免的，所以是偶然误差。 在实验中为防止外源r n a s e 的污染，我们采用了0 1 d e p c 水溶液对所 有枪头，容器和溶液进行3 7 处理，然后再高温除菌，容器和枪头再于烘箱 中烘烤2 小时，这样处理过的耗材实验的重复性好；同时选择了相对隔离的 空间超净间，经过紫外除菌3 0 分钟这样的环境相对要稳定，有利于 实验的重复。除此之外，在提取过程中穿着洁净的工作服，佩戴口罩手套， 并勤换手套也是很重要的。在材料的准备上。我们采用了合成培养基无菌培 养，虽然高盐环境中基本没有其它生物可以存活，但是这样制备的培养基成 分明确而且相对比较纯净。 为抑制内源r n a s e 污染，我们首先选用比较嫩的藻体细胞，比如对数生 长中期的细胞这样的细胞代谢活跃，自溶的少故释放出来的r n a s e 以及 细胞内部r n a s e 少：其次整个提取过程在低温下快速完成的( 约3 0 分钟) 例如在收集细胞时采用4 c 离心，冰浴盛放细胞尽量保持细胞的完整性， 防止其在裂解细胞前过多破裂；最后在细胞裂解后操作迅速也可以防止r n a 的过多降解。 在除去d n a 污染的方案中，选择柱式降解有两个优点，第一柱式降解 时r n a 是吸附在柱子上的，因此r n a 比较稳定：第二柱式降解后可以通过 以后的步骤除去d n a s e ，以防止酶的污染。从实验结果中可以看出这样的 r n a 质量是很好的。 从电泳结果图1 1 中可以看出来杜氏藻的总r n a 条带比较多，不过主要 是1 8 s 和2 8 s 的条带。另外还有5 s 的条带，以及些小r n a 的条带。在此 前没有人对杜氏藻的总r n a 电泳进行过分祈，但是n c b i 上面已经有了盐 生杜氏藻的2 8 s r d n a ( g i 一1 6 7 9 8 8 ，2 5 k b ) l 拘序列从大小上看这个实验结果与 这两条序列是一致的。 3 2 文库构建 全长e d n a 文库构建的两个重要参数就是文库代表性和文库的e d n a 全 长性，文库的代表性主要是由文库滴度的来衡量的，在这个实验中为确保高 滴度文库采取了以下几个方面的措施： 1 s m a r ”叫支术和l d p c r 相结合，将c d n a 通过s m a r t r m 技术在 反转录时两端加上接头，然后以接头为引物经过l d p c r 等比扩增，保证了 e d n a 在量增加时丰度保持不变。这样也避免了以往文库构建是繁琐的酶学 操作导致的e d n a 得率低的问题。 2 利用c h r o m as p i n - 4 0 0c o l u m n 将e d n a 与接头引物等小分子d n a 分离保证了文库的有效滴度。因为小分子的d n a 在连接时的动力学特性要 高于大分子d n a ，因此在存在小分子d n a 时大片段的连接效率就会很低， 从而阻碍了e d n a 片段与载体连接，降低了文库的有效滴度。本实验通过大 小d n a 片段在柱子经历得时间不一样分段收集e d n a 大片段与杂质小片段 以达分离效果，如图1 3 。 3 高效转化是保证文库高滴度的另一个重要因氯实验中采用电转化方 法确保了转化效率。以往实验的氯化钙法转化率只有1 0 5 1 0 6 个菌落l a g p u c l 8 ，而分子克隆实验指南上的高效转化法也只能达到1 0 7 个菌落l a g p u c l 8 ，这种转化率在构建文库时往往文库的滴度只能在1 0 5 个克隆的水平 上，因此电转化是一个比较好的方法。电转化条件是影响转化成功与否的限 制因素，实验中我们通过参考文献 i l l ，不断实验，发现使用b i o r a d 公司 g e n e p u l s e r l is y s t e m ，以2 5 妒，2 0 0 q ，1 ，5 k v 电击较为合适，电击时间一 般在3 9 4 2 m s ，转化率在8 x1 0 8 个菌落岖p u c l 9 。 根据计算这个文库可以代表杜氏藻细胞中3 0 7 1 0 6m r n a 片段，也就 是说细胞中3 0 7 l 伊条m r n a 才出现一次的低丰度m r n a 都可以从这个 文库中筛选出来。当然这个数据只是个理论值，当文库中的重组率比较低 或者插入片段中短片段的比例过高时，文库的有效滴度都会降低，文库的代 表性还会下降，这些数据并没有精确测定，所以这个代表性数据只是参考值。 文库构建的第二个重要参数是e d n a 的全长性。好的c d n a 文库不仅要 有高滴度作为保证，而且要使e d n a 的长度接近全长，克隆基因才有意义。 要保证全长c d n a 主要是在反转录反应中获得近全长的c d n a 第一链。一般 的反转录酶在反转录时超过i 2 k b 时其活性就开始降低，导致反转录不完 全。本实验使用p o w e r s c r i p t t m 反转录酶可以保证2 k b 以上的片段均可以反 转录成功。通过l d p c r 可以看出来c d n a 主要集中在l 4 k b 之间，呈弥 散状，其中一些明亮条带主要是对应于一些高丰度的m r n a 。其次连接反应 也是保证全长文库的重要因素，由于c d n a 中存在短片段，长短片段的连接 效率不一致，因此长片段连接子的含量就可能减少，从实验结果来看， l d - p c r 产物长度集中在l 4 k b ，而在文库鉴定中6 0 个克隆子的的插入片 段主要集中在5 0 0 2 k b 之间，说明连接时一些大片段产生了丢失。这种差 异可以通过增加连接反应时间和优化反应体系来缩小，甚至可以按c d n a 大 小分段迸行连接，当然这些还要通过实验优化。 第二章盐生杜氏藻3 一磷酸甘油脱氢酶基因克隆 1 材料与方法 i 1 实验材料 1 1 i 菌种大肠杆菌d h 5a ，由本实验室保存。 i 1 2 载体 p m d i s - - tv e c t o r ( d 5 0 4 ) ，购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限公司 1 1 3 酶制荆 h i n d h i ，s a ci ，x h oi ，购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限公司 1 1 4 试剂盒 r n e a s y m i n ik i t 植物总r n a 提取试剂盒，购自q i a g e n 公司 s m a r t t mr a c e 试剂盒，购自c t o n t e c h 公司 e x t a q e m p c r k i t ，购自宝( t a k a r a ) 生物工程有限公司 小量胶回收试剂盒，购自华舜生物工程有限公司。 1 2 实验方法 1 2 1e s t 的获得 通过随机挑取克隆对文库的大规模测序，获得一系列e s t ，然后对这些 e s t 进行生物信息学分析。首先对e s t 序列之间进行叠连，将属于同一条 m r n a 上的e s t 归类形成u n i e s t 。其次将这些k i n i e s t 在g e n b a n k 上进 行相似性搜索，搜索按照核酸序列相似性到氨基酸序列相似性，最后到弱相 似性的顺序进行，从而寻找3 磷酸甘油脱氢酶基因的e s t 。 将与b l a s t n 击中的核酸相似性大于7 5 ，击中长度超过2 0 0 b p 的序列 归为核酸相似序列，并以击中的序列注释暂时作为该序列的注释，其余提交 b l a s t x 。 将与b l a s t x 击中的氨基酸相似性大于3 0 ，击中长度超过5 0 氨基酸 的e s t 可能编码的序列归为氨基酸强相似序列，并以击中的序列注释暂时作 为该序列的注释。 将与b l a s t x 击中的氨基酸相似性小于3 0 ( 不限长度) 的e s t 可能 编码的序列归为氨基酸弱相似序列，并以击中的序列注释暂时作为该序列的 注释。 1 2 23 一磷酸甘油脱氢酶基因e s t 引物设计 根据e s t 序列使用v e c t o rn t i8 0 软件和p r i m e rp 鞑；m i e r 5 0 进行设 计引物，引物长度以2 5 b p 为宜，回文序列长度不超过6 b p 。重复序列不超过 4 b p ，茎环结构长度不超过3 b p 。t m 值在5 0 0 6 5 0 ，g c 含量在4 0 6 0 之间。扩增长度在4 0 0 b p 5 0 0 b p 之间。 1 2 33 一磷酸甘油脱氢酶基因e s t 扩增 按第章1 2 2 的方法提取藻总r n a 。 将藻总r n a 于7 0 c 水浴变性2 m i n ，立即于冰上5 r a i n ，然后使用p r o m e g a 公司的反转录体系如下： g o l db u f f e r7 4 u l d n t p1 0 m m o l l0 1 5 血 o l i g o ( d t ) t 5 1 2 u l r r n a s i np d b o n u c l e a s ei n h i b i t o r0 7 5 此 a m v r t ( 2 0 - 2 5 u ) 0 5 u l 加入2 0 乩藻总r n a ，于3 7 c 反转录4 0 r a i n ，完成后放置在9 54 c 水浴中 5 m i n 终止反应。取2 5 乩作为模板，按照如下体系进行梯度p c r 扩增。 去离子水3 l 此 1 0 p c r 缓冲液5 吐 m g c l 24 9 l d n t p4 止 e s tr e v e r s e 弓| 物 3 0 p m o l 约1 5 “l e s tf o r w a r d 引物 3 0 p m o l 约1 5 吐 t a qd n a 聚合酶5 u l m o 5 此 取8 p l 于1 o 琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外分析仪下观察。 将大量p c r 产物在1 o 琼脂糖凝胶中按5 v c m 电场强度进行电泳。当 片段充分分离开以后，用医用手术刀片将电泳条带切下，分别装在e p 管中， 称重按照胶回收试剂盒操作说明回收片段。回收完毕后，取4 吐于1 0 琼 脂糖凝胶中电泳检测。 使用p m d l 8 tv e c t o r 将p c r 片段1 a 克隆，通过蓝白斑筛选重组子， 验证后交寄测序。 1 2 4 3 一磷酸甘油脱氢酶基因c d n a 3 端序列酶切分析 从大规模测序的克隆子中寻找3 磷酸甘油脱氢酶基因e s t 的克隆子 p g p d h - 3 并测序，获得部分序列e s t 序列，但是由于大量重复序列，因 此导致测序终止。因此使用v e c t o r n t i8 0 软件对载体以及e s t 序列进行限 制内切酶位点分析。 挑取克隆子p g p d h - 3 单菌落，接子装有l o m l 的含5 0 i t g m l 的液体l b 1 6 培养基的三角瓶中，3 t c 过夜培养，第二日收集菌体，按分子克隆实验指 南中碱裂解法提取质粒，并电泳检测。 使用s a ci 和h i n d 进行双酶切，按照如下加量加入试剂： 去离子水1 6 t x l 1 0 b u f f e rm3 此 s a c i o 5 止一 h i n d l l l0 5 吐 加入质粒p g p d h 31 0 1 _ l l 于3 7 c 酶切2 h 后，转入8 0 c 水浴l o 分钟失活。 使用s a ci 和x h oi 进行双酶切，按照如下加量加入试剂： 去离子水1 6 乩 1 0 b u f f e r m3 吐 s a c10 5 u l x h oio 5 乩 加入质粒p g p d h - 31 0 1 a l 于3 t c 酶切2 h 后，转入8 0 c 水浴1 0 分钟失活。 将两次酶切液取1 0 p l 于1 o 琼脂糖凝胶中进行电泳，并在紫外分析仪 下观察。 1 2 5 克隆子p g p d h - 3 酶切片段亚克隆 将大量质粒p g p d h 3 做s a ci 和h i n d 双酶切，在1 o 琼脂糖凝胶中 按5 v c m 电场强度进行电泳。当片段充分分离开以后，用医用手术刀片将不 同电泳条带切下，分别装在不同的e p 管中，称重按照胶回收试剂盒操作说 明回收片段。回收完毕厢，取4 吐于1 o 琼脂糖凝胶中电泳检测。 将含p u c l 8 的大肠杆菌单菌落接于1 0 m l 含5 0 p g m l 的液体l b 培养基 中次日提取质粒。同时用s a ci 和h i n d i i i 双酶切胶回收制备亚克隆载体。 按以下体系进行连接反应： 去离子水7 1 a l 1 0 x l i g a s e b u f f e r2 儿 酶切后的p u c l 8 ( 2 5 n g i x l ) 2 儿 胶回收片段1 2 k b ( 1 5n e d p l )8 皿 t 4d n a l i g a s