（发育生物学专业论文）人类心脏发育候选基因hlbh的克隆与功能研究.pdf

摘要 心脏是脊椎动物器官发生过程中最早形成的器官之。心脏发育 是一个复杂的过程，它受系列基因的精确调控。鉴定在心脏发育过 程中起调控作糟的基因和分子途径，将促进人们扶分子水平认识心脏 发育和先天性心脏瘸发生的机制。在心血篱系统疾病的研究中已发 现，菜垡基因在对空上酶表达紊乱可导致先天毪心蕴瘸，而对部分心 盘簿系统病症舞发入群兹醣究恣涯鹗部分惹天影凌戆心薤瘸与遗传 因素有关。 通过人类胚胎心脏文露克隆到了一个重要的人类基因h l b i l oh l b h 的c d n a 长3 0 5 3 b p ，编码一个1 0 5 个氯基酸残基的蛋白。其蛋白壤在进化 上从斑马趣，小鼠到人类高度保守。n o r t h e r nb l o t 结果检测到了一个 3 i k b 的转录本，彪臃胚胎和成人时期薇心脏有强烈的表达。在 c o s 7 细胞中，与绿色荧光蛋白熬转染实验表昵该蛋自定位予胞核与 胞质之中：随詹将h l b h 与g a l 4 一d n a 结合区域形成融合蛋白后，与v p l 6 一起共转染，通过荧光素酶检测实验表绢，h l b h 是一个转录激活园子。 h l b h 蛋怠在c o s 7 细貔中避表达后，激活了s r e 和a p - i 的活性，这 些结果表骥h l b h 霹栽是一个转蒙激活嚣予遴遗漱涨信弩途径奔导缁 艟功能。分裂去掉k 寒蜷依羧予膦懿酸的丝筑夔苏氮黢滋酶链点鞫e 末羰e r k d 摸体艨的实验表明，纛端依赖予臆氨羧效丝氨酸苏氨羧 激酶位点和3 端e r k - d 模体在基因的转录激活中越了重要的作用。 i v 关键调：羹耍熬转秉调控因子；基因袭达：早絮心脏发育；囊继强 m a p k 信母途径：依赖于脯氮酸的丝氨酸潦氨酸激酶佼点，r r k d 模体： a b s t r a c t t h eh e a r ti so n eo ff i r s t o r g a n s t of o r m d u r i n g o r g a n o g e n e s i s i nt h ev e r t e b r a t e c a r d i o g e n e s i si s a v e r y c o m p l e xp r o c e s sa n di tr e q u i r e sp r e c i s er e g u l a t i o no fs e r i e s o fg e n e s ，t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h em o l e c u l a rp a t h w a y st h a t g u i d eh e a r tm o r p h o g e n e s i sw i l lp r o v i d eab a s i cu n d e r s t a n d i 矬g o fh o wh e a r ti sf o r m e da n do fh o wc o n g e n i t a th e a r td i s e a s e s ( c h d ) a r et a k e n p l a c e a s i t k n o w n ，m i s t a k e si ns p a t i o t e m p o r a l e x p r e s s i o n o fc r i t i c a l g e n e s r e s u l ti n c o n g e n i t a l c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s f u r t h e r m o r e s t u d i e so n h i g h r i s k p o p u l a t i o no fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s eh a v ea l s os u g g e s t e dt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n n o n c o n g e 摊量t 8 王c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s a n dg e n e tief a c t o r s 。 h e r ew er e p o r tt h ei d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f an o v e lh u m a ng e n e ，寿翻鹾f r o mah u m a ne m b r y o n i ch e a r te d n a v 1i b r a r y t h ec d n ao fh l b h is3 0 5 3b p ，e n c o d i n gap r o t e i no f1 0 5 a m i n oa c i d s t h ep r o t e i n i s h i g h l y c o n s e r v e di ne v o l u t i o n a c r o s sd i f f e r e n t s p e c i e sf r o mz e b r af i s h ，m o u s e ，t oh u m a n n o r t h e r nb l o t a n a l y s i s i n d i c a t e st h a ta3 。1k bt r a n s c r i p t s p e c i f i cf o rh l b h i sm o s ta b u n d a n t l ye x p r e s s e di ne m b r y o n i ca n d a d u l th e a r t 。i nc o s 一7c e l l s ，h l b hp r o t e i n i sl o c a l i z e dt o n u c l e u sa n dc y t o p l a s m h l b f fi sat r a n s c r i p t i o na c t i v a t o rw h e n f u s e dt og a l 一4d n a b i n d i n gd o m a i na n de o t r a n s f e c t e d 鬻lt hv p 1 6 0 v e r e x p r e s s i o n o fh l b hi nc o s 一7c e ll sa c t i v a t e st h e t r a n s c r i p t i o n a i a c t i v i t i e so fs r ea n da p 一1 t h e s er e s u l t s s u g g e s t t h a th l b h p r o t e i nm a y a c ta sa t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o ri n m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e s i g n a l i n g p a t h w a y t om e d i a t ec e l l u l a rf u n c t i o n s d e l e t i o na n a l y s i s i n d i c a t e st h a tt h en t e r m i n a lc o n t a i n i n gp r o li n e d e p e n d e n t s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s eg r o u pa n dt h ec t e r m i n a lc o n t a i n i n g e r kd - d o m a i nm o t i f a r e r e q u i r e d f o r t r a n s c r i p t i o n a l a c ti v a ti o n 。 k e yw o r d s ：n o v e lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；g e n ee x p r e s s i o n ； e a r l y h e a r td e v e l o p m e n t ：h l b h ：融蕊s i g n a l i n gp a t h w a y ： p r o li n e - d e p e n d e n ts e r i n e t h r e o n i n e k i n a s eg r o u p ，e r kd - d o m a i n m o t i f 缭写词 a a a m p a p - l b p b s a c n c o s - ? c r e d e p c 醐毫麓 d a p i e b e c o l i e d t a e g f p e r k e s t f e s 英文全称 娩i n oa c i d k = 赴p i c i l l i n 英文缩写谲蔼襄 a ：t i v a ti o np r o t e i n1 b a s ep a i r s 巾译名 黛基酸 繁卞青鞯素 激活蛋臼一l 碱基对 牛血清自蛋自 c o m p l e m e n t a r yd n a互补脱氧核糖核酸 c 丫一1 o r i g e n ，s v 4 0细胞系 c k 鹾p r e s p o n s ee l e m e n t b i e t h y p y r o c 丧r b o n a t e d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m c a m p 应答元件 焦碳酸二乙精 4 3 ，6 0 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e4 0 ，6 0 - - 筑墓一2 苯 e t h i d i u r f lb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i 基吲喙 演化乙键 大肠耔蘩 e t h y l e n ed i a m l n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺娴乙酸 e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e l a t e dk i n a s e 胞外信号激酶 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g g e d表达序列标签 f e t a lc a l fs e r u m 胎午血清 g p c r h i p t g k a n k b k d a 姒p k 姒p k k m a p k k k m l n m e m t n n c b i o d o n a o n p g o r f p b s p c r g - p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r h a u r i s 3 p r o p y l t h i o p d g a l a c t o s i d e k a n y c i n k if o b a s e p a i r k i f o d a l t o n g 一蛋白耦连受体 小时 异丙基硫代一p d 一半乳 糖昔 卡那霉素 千碱基对 千道尔顿 m i t o g e n a c ti v a t e dp r o t e i nk i n a s 丝裂素活化蛋白激酶 m a p kk i n a s e m a p k kk i n & s e m i n u t e 姒p k 激酶 m a p k k 激酶 分钟 m e r c a p t o e t h a n o l巯基乙醇 m u l t i p l et i s s u e sn o r t h e r nm e m b r a n e 多组n o r t h e r 膜 n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n 国立 生物技术信息中心 o p t5 c a ld e n s i t ya t6 0 0n m6 0 0 n m 吸光度 o e o x y r i b o n u c l e i c o p e nr e a d i n gf r a m e 脱氧核糖核酸 口半乳糖苷一邻硝基苯酚 开放阅读框 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 i i p o l y v i n y p y r r o l id o n e聚乙烯蹴咯烷酮 p a g e p o l a c r y l a m i n eg e le l e c t r o p h o r e 8 i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 r a c e r n a r n a s e r t - p c r s c a n s i t e s r e s r f s d s t r i s s r e s r f r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d sc d n a 末端快速扩增 r i b o n u e l e i ca c i d r i b o n u c l e a s e 核糖核酸 核糖核酸酶 r v e r s et r a n s c r i p t i o n p l y m e r a s eh a i nr e a c t i o n s e r u mr e s p o n s ee l e m e n t s e r u mr e s p o n s ef a c t o r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 反转录聚合酶链式反应 蛋白矮结稳扫攒 血清廒答元件( 盘渍艨答匿子( 十二烷基磺酸钢 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i nm e t h a n e三羟擎基氮基甲烧 c f o ss e r u mr e s p o n s ee l e m e n tc f o s 斑清反应元件 s e r u mr e s p o n s ef a c t o r i i i 斑清反应因子 湖南师范大学硕：l 二研究生毕业论文 第一章前言 以人类基因组为大背景研究疾病状态和发病过程中基因型变 化规律将是揭示基因组功能奥秘的最佳突破途径，可由此率先建立 “疾病基因组学”的理论和技术体系，并使“功能基因组学”在实质上 得到具体体现和理论的升华。其优势在于可更加明确地揭示：人类 所有疾病或踺康状态都是与基因直接或间接相关，每种疾病都有其 相应的致病基因或易感基因存在，疾病发生过程则是相关基因与内 外环境相互作用的结果。因此，尽可能多地克隆人类发育相关基因 并研究其功能，从中筛选出疾病相关基因，开发基因药物，对于预 防及治疗先天性疾病将有巨大的价值。 心脏的正常发育要求相应的基因的进行精细的时空调控 卜5 。相反他们的的异常表达会导致心脏病的发生甚至引起死亡 6 8 。心脏病严重的威胁着人类的健康和生命，近几年，心脏病的 死亡人数已经居于疾病死亡总人数的前三位。据估计，先天性心脏 病在正常人：群中的发病率大约是0 6 - 1 2 ，因此，我国可能有一一千 万人患有先天性心脏病。研究表明，遗传性心脏病是由于控制人体 心脏发育的基因产生突变或者特异基因在时间( 发育阶段) 和空间 ( 组织特异性) 上的表达调控失误而引起的。从分子水平上系统的研 究控制心脏发育的基因及其相互调控作用，鉴定疾病基因，对于探 讨心脏疾病机制，进行产前诊断和利用基因治疗手段来治疗遗传性 心脏病，具有非常重要的理论的实际意义。 心脏分子发育学和分子生物学的研究进展显示，在脊椎动物和 湖南师范大学硕士研究生毕业论文 人类心脏的正常发育过程中，细胞通过包括m a p k 在内的多种信号 途径，激活或抑制细胞内众多的转录因子，最终精确控制数量庞大 的基因j e 确表达，通过大量的、在时间上和空间上极为精确的一系 酬分子攀件，捂导心脏斋阶段的形态发釜 9 - t o 。尽管入们对心脏 发育酶分子秽毛涮麓谈识己取得了突破性进展，德仍春大量的分子攀 俘不为人所翔。已有静磷究显示，诲多转袋调控因子以及m a p k 信 号途径的摆关因子涉及到心魅的形态发生= 以及心脏豹生理、痰理过 程 1 卜1 2 ，因此克隆薪的人类心脏发育相关调控基阂、鉴定其功 能，将肖助予揭示人体心脏发鬻的过程及分子调控机制，也有助予 提高人们对心脏痫包括先天性心脏瘸的分子病因学的理解，具有遵 要的理论和实践意义。 本研究利用分子生物学和生物倍息学的方法，从人类胚胎心脏 文库中克隆得到了1 个新基因由肠弑并对其进行了初玲的功能研究。 潮精师范_ 人举硕士研究生毕业论文 2 1 材料 第二章材料与方法 2 1 1 酶类和试剂盒 t a gd n a 聚合酶，鹣美公嗣； e x t a gd n a 聚合酶，t a k a r a 公运： d n a 片段缝耽试剂鑫v e r + 2 0 ，t a k a r a 公司； a m v 反转录酶，上海生工 限制性内切酶，p r o m e g a 公司秘t a k a r a 公司； 去碱性磷酸酶( c i a p ) ，t a k a r a 公司； 随机引物标记试剂盒，t a k a r a 公司； r a p i d ：m r n a t mp u r i f i c a t i o nk i t ，a m r e s c o 公司； c d n as y n s i sk i t st a k a r a 公司： c d n ap c rl i b r a r yk i t s ，t a k a r a 公司； s m a r tr a c e c d n aa m p i i f i c a t i o nk i t ，c l o n t e c h 公诼： l i g a t i 9 nk i t2 0 试裁盒，t a k a r a 公司； u n i q 1 3 柱式d n a 胶圈收缝纯试裁盒，上海生工： u n i q 一2 3 0 覆靛大量撼提试翔盒，上海生工； d n a 回收试剂鑫，上海生工 l i p o f e z t 扭i i n ep l u s 憎r e a g e n t 试剂盘，l i f et e c h n o l o g i e s ： t r i z o l 试剂，p r o m e g a 公司； d n ab 1 j n t i n gk i t ，t a k a r a 公司： 湖南师范人学硕士研究生毕业论文 2 1 2 菌株、细胞系和质粒 大肠杆菌点：c 0 1 1d h 5q 、c o s 一7 细胞系本实验室保存； p m d l 8 - t 克隆载体购自上海生工公司； p e g f p n l 表达载体，c l o n t e c h 公司： p c m v t a 9 2 表达载体，s t r a t a g e n e 公司： p c x f f b d 表达载体，美国s t r a t a g e n e 公司： p c m v l a z ，壶本院张链教授实验室构建、枣赠： p l 8 g 5 一l u c ，由支| l 臻壤教授从美阑带爨； p s r e l u c 秘p a p 1 一l u c 质粒，美图s t r a t a g e n e 公司； 2 。1 3 人类多缀织膜麓u l t i p l et i s s u en o r t h e r nb l o t s 成人缀织m r n a 貘，c t o n t e c h 公司； 艇骆缝织总r n a 骥，零实骏室制餐。 2 。l 。4 其他试剂 标准d n a 分子鳖m a r k e r ( 1 0 0 0 b p ，3 0 0 0 b p ，1 0 0 0 0 b pg e n e r u l e r “) ，上海罴美； i p t g 和x - g a l ，t a k a r a 公司： r n a s e a ，上海生工： 琼脂糖( a g a ra ) 、胰蛋岛胨( t r y t o n e ) 和酵母摁取物( y e a s t e x t r a c t ) ，加系大b b i 公丽； 往一3 2 p d c t p ，j 艺索难辉公司； d e m e 缀魏培养基，胰酶，g i b c ob r l ； 童 ，湖南娜莲犬学碳l ? 科究生毕韭论文 氨苄青霉素和链襟索，b b i ： g 4 1 8 ，c 1 0 n t e c h ： 胎牛啦清，杭州醐攀青公司： d a p i ，s i g m a 公司； 琼脂糖粉，上海y i t o 公司； e b 染液，s y b r 染料，深圳市达科生物技术有限公司。 2 2 盘簧实验仪器 p c r 仪型号为s p r t 0 0 1 ，t h e r m o h y b a i d 公司； 高速冷冻离心机，s i g m a 公司； 墩型枣，飙，f r e s c o 公司； 移液器，e p p e n d o r f 公司： 凝胶戏像分辑系统，蠢港肯羹公司； 恒温描床，江苏太仓仪器设备公司； s w c j l f 型超净螽，苏州净化设备公司； u v 一2 8 0 2 型紫外可熙分光光度计，上海u n i c o 公司； d 7 3 8 2 - 3 3 纯水仪，b a r n s t e a d 公司： 恒温水溺循环嚣，江苏博医康公司； c o ：细胞培养箱，f o r m a 公司； 皇耪安全桓，f o r m a 公司； e - 4 0 0 荧光倒置显微镜，日本n i k o n 公司。 d d 一2 0 2 0 荧毙测爨仪，美基t u r n e rb i o s u s t e m s 公司。 一湖南师范太学硕”f ：研究生毕业论文 2 。3 生犍信息学分析的主要软件慧数据库 b l a s t 程序廷l ! 坠；z 里螋：曼! 垒i ：望! 婆：銎i 垫：g q ! 么垒! 垒! 用于核酸 殛白质序列匹配奄找； 虹l ! 乜；z ：! 幽：n 垫i ：d ! 婴：n i 垒：蛀q ! z g q 用于开放阅读框( o r f ) 分：沂； 吐卫上z x 曼型：跫! b i ：q 1 里：骢i 蔓：g q x g ! 骢q 盟用于染色体定位 分析； u c s c 援星垒i 釜；z z g 竺塑q 艘：垡篓曼：壁羹婪焉予染色体定位分析和确 定内禽子矫显子交雾； t t p ： a 嘲v , e x p a s y , c h t o o l s p r o t p a r a m , h t m l 一爝予分析蛋白 质理化特 生； p r o sit e 分析蛋白质基序h t t p ：w w v , e x p a s y , c h p r o s it e 一； p s o r t 分析亚细胞定位 垫羔主巳；z 乜苎q ! ：翌i b 坠：垦曼：。j q ! q 兰翌星：b 堡! ： j e l l y f i s hl 。4 下载自虹! 芭；以鳅：坠i 鲤i 旦：照鲤用于d n a 序 列、开放阅读框分析： p r i m e rp r e m i e r 5 0 软件用于酶切靛点的分析和p c r 引物设计： b i o e d i t 软件用予序列编辑，寻我特征序列等； p d r a 甏3 2 软徉溪予绘剿震粒线澎和环形圈潜； d n a s t a r 软锋藤予d n a 岸裂、嫠鑫麓健矮及迸纯关系分孛厅； m i c r o s o f te x c e l 用于数据处理及佟图分析。 + 湖南师范犬常硕士研究生毕妊论叟 2 4 方法 2 。4 t 组织总r n a 的抽掇 按照t r i z o l 试粼盒( p r o m e g a ) 操侔程序提取葸r n a 。其钵步 骤如f ： 1 ) 撼液氮冻存酌缝织教到泳冻的碾钵孛碾摩组织，萁闻不敝麴 入液氮，盔至碾瘀溅粉束状； ( 2 ) 将样鑫转移至已经麓入t r i z o l 试裁( i m l l o o m g 鳃缎酌均 浆管中，置于冰上；在组织匀袋混碎机上进行匀浆，匀浆液较透明 圭圭毫鬏粒，将匀浆波转入毅豹1 + 5 m l 离心簿，褒鬻主敖置5 m i n ； ( 3 ) 将离心管于4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，然后将上清移至粥 塞- 0 警；热入氯薅( o 2 m l i m lt r i z 0 1 ) ，蘸紧离心管盏，振荡1 5 s ， 在泳上放爱5 m i n ； ( 4 ) 离心管予4 ，1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，上清移鬻男离心管， 拥久0 5 倍t r i z o l 体积戆异鬻醇，室瀑放嚣t o m i n ； ( 5 ) 离心管予4 x 2 ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，弃上清，沉淀瑙7 5 乙醇浚涤沉淀，塞溢熙予，翔d e p c 楚嚣的毅蒸隶溶麓； ( 8 ) 玻2 彗l 紫钤霹冕分巍光度计测定r n a 浓度裂缝度，其余- 8 0 攥存套蹋， 2 。4 2 。天类艇貔蛰虢e d n a 文痒熬耪建 ( 1 ) 用组织总r n a 抽掇法从2 0 厨入类腻胎的心脏缀织中提取的 总r n a 5 0 0 雌，用r a p i dm r n a t mp u r i f i c a t i o nk i t ( a m r e s c o ) 分离 瑚l 鸯撵越天学蛹士垮 究生毕韭论文 纯化m r n a ； ( 2 ) 以此m r n a 为摸援，按照c d n as y n s i sk i t s 萃秘c d n ap c r l i b r a r yk it s ( t a k a r a ) 操作程序反转录得到第一条c d n a 链； ( 3 ) 在此基础上合成第二条c d n a 链并使葵平滑化，经酚氯仿拙 提，连接，c d n a 扩增，获得人类胚胎心脏c d n a 文库。 2 4 3 基霞的壳隆 2 4 3 1 巢式p c r ( n e s tp c r ) 扩增开放阅读框 ( 1 ) 雩| 物设幸| ：逶过p r i m e rp r e m i e r5 。0 糕序设针对瓤基因e s t s 序列的一对引物p o u t l 和p o u t 2 ，为增加产物的特异 生，再加一对 一f 游弓| 耪p i n 3 翻p i n 4 。 ( 2 ) 第轮p c r 体系： 双蒸纯净水 1 0 b u f f e r d n t p ( 1 0 氆辩) 上游弓l 物p o u t l ( 1 0l jm ) 下游引物p o u t 2 ( 1 0 um ) 模板( 胚胎心脏p g rc d n a 文蓐) e x 。t a q 总体积： 王6 。2pi 2 5ul ( 3 ) 第二轮p c r 反，陂体系： 双蒸缝净承i 8 。2 耩l 1 l l l u 肛 u l u 曩 5 3 3 0 2 # 。 o 2 l l l 0 2 ，湖南师范人学硕1 ：研究生毕业论文 1 0 b u f f e r d n t p ( j o 出1 ) 下游引物p i n 3 ( 1 0 um ) 卜_ 游弓f 物p i n 4 ( 1 0um ) 1 ：1 0 稀释的第一轮p c r 产耪 e x t a q 总体羧 2 5u1 2 5ul 1 3ul 1 3pl l 韭l 0 。2 弘l 2 5 王i 王 2 4 3 。2p c r 产物嬲d n a 片段梭测 p c r 产物跑琼脂糖凝胶逛泳后，爝d n a 片段纯化试剂盒 u n i q 一1 0 ( h n b i o g e n 公司) 纯化厝，连接捕入p m d l 8 一t 载体；连接子 转化进入d 卜一5n 大肠杆菌君，涂布于含氨苄青霉素的平板培养基 3 7 培养1 ( 、小时。随机挑取单克隆菌落，提取质粒，用酶切检测 获得阳性克隆，迸步测序霜，序歹用b l a s t 程序分析，筛查出新 的d n a 片段。 2 4 3 3p c r 体系： 双蒸缝簿求 1 0 x b u f f e r d n t p ( 1 0 感) 上游引物p l s ( 1 0 p m ) 下游引物p l a ( 1 0 u m ) 1 6 。2 譬重 2 。5 羹l 2 。5 # 王 l 。3 扯1 1 。3nl 模板( 胚胎心脏p c rc d n a 文库)l “l e x 。t a q 9 0 。2 l il 湖南师范_ _ k 学硕士研究生毕业论空 总体积： 2 5n1 2 4 3 4r a c e p c r 采用快速扩增c d n a 末端( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ， r a c e ) 技术。 ( 1 ) r a c e 法扩璞采赠c l o n t e c h 公司的s m a r t “r a c e c d n a a m p l i f i c a t i o nk i t 中介绍憨方法，按说爨操佟合成r a c e r e a d y c d n a ：2 0 周人类驱胎的心脏组织总礤n a 5 0 n g 、5 o n s e t 物i g l ( 5 - r a c e r e a d yc d n a 力h i 越的s m a r ti ia 引物) 、力h d d h 。0 至终 体积5 此。 在p c r 仪7 0 。c ，2m i n ，冰上冷却2m i n ，简单离心后加入：5 f i r s t s t r a n db u f f e r2g l 、d t t1g l 、d n t pm i x1 g l 、p o w e r s c r i p t r e v e r s et r a n s e r i p t a s e1 此，p c r 仪4 2 。c ，1 。5h ，t r i c i n e e d t a b u f f e r 稀释夏应产物至1 0 0p l ，p c r 仪7 2 6 c ，7m i n 。以5 r a c e r e a d y c d n a 为模板，醴试剂盒掇供的遘餍弓l 秘为上游弓| 物，合成的 5 r a c e 萼i 物为下游弓l 兹，p e r 扩增r a c e 的5 末端。程开放阏读框 序列设司+ 2 条用予s r a c e 扩增静骞聚援蔫酸弓| 物为g s p ， 5 n g s p ) 。通孀弓| 物混合物( u p m ) 有鼹嵇序刿，长序判羹： 5 e t a a t a e g a c t e a c ta t a g g g c a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t 一3 ( 0 4 g m o l l ) ：短序列为： 5 一c t a a t a c g a ct c a c t a t a g g g c 3 ( 2 岬。l 。l ) 。5 r a c e p c r 德环参数见厝文列表。将第1 次的产物稀释 后作为模板用5 n g s p 引物与巢式引物n u p ( 序列为 5 a a g c a g t g g ta a c a a c g c a g a g t 一3 ，i 0i h u n o l l ) 进行第2 次扩增， 1 0 * 湖南蝾范走掌硬 ：诤 究生毕业论文 条件见后文列表。 巍3 - 1 克隆越艄蘩| 焉的引物及冀相应的程穿。 ! ! 墅! ! 塑壁! !、! ! 曼塞堡竺! 塞= ：_ p o l f t l享：g 矗g f g t g t c e 宣c e t 媳e e 嚣轰e r p o u l 聋5 - a g g g 0 矗g g c c 矗g 点l 嚣g g 五g c f 3 5 ：g g g a c 蝣c 矗g g g a c c g r r r n 湛 o 5 g g c c 矗6 崖1 矗g # 矗g e l 蕞轰茹c c 嫦- 3 1 5 l c c t c g a g c t r c 戌r i 嗣n 雕艄r 矗1 蕞1 1 t c c e 3 摹g 矗矗g c i t c t g 冀e t f 鼓蚪焉1 薯c f 凇誊掣 5 - c 芯a a c g g t c c a a c e t ! c 毒嚣r 5 - c g g g c a g t g a a t e g g c a a a 3 5 ；c c c 毽轧糕戡c t r c 瓿吼鼍娃娃畿澈e c - 3 5 - c i t c a g g a a c a g a t g c t g g g t c g 点c t g a - 3 + 5 ：c c c g a a t r c t i c 矗茁g r c t 东漱整阿c 3 5 l g g 矗是g e 徽c 譬r 翱紫飘广l f 玎岱掣 导i c c 蕈c 繇# 椰啾i t c 鹫娃鬟隐誉娃e g 掣 $ k c c t g t c 锨e a c c a g c a g c c 剥a a a a t c ， 9 4 驾，3 缸 $ 朝0 ，孙；强 ，2 。2 l 娃蚺搬一 9 4 c ，3 嘶； 靳，3 缸； 秘* 1 2 c , 2 m l r j r c 3 1 k ；“ 辩掌墨瓣端 辩t 7 2 c ，l m b k l t k 。拇 5 1 c 。融； 3 瓠 7 2 c ，l m b 抽卜 l l ，鞠 姆，轴； 摊“ 张。| _ 鲰# 辩，” 辨，辆 靼- 7 掣c 。l m 妇一 l 托，3 如p 。 辣，麓l ； 秘” ，2 。罄 。“。“_ _ m _ 9 一“_ 。w “m ”。_ * m _ _ _ _ _ - - _ w w “w _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ w _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ “_ w _ h 一 2 ) 第一轮r a c e p c r 体系： 鞭蒸纯净水 1 0 b u f f e r d n t p ( 1 0 m m ) 上游亏l 耪l j 穰1 0 醛蜒) 下游弓l 物5 g s p ( 1 0 彗赫) 5 一r a c e - r e a d yc d n a e xa t a q 1 5 3 壮l 2 。5 # l 2 5 嚣l 2 。5 _ i 王王 l 塾l 圭譬羔 0 2n1 眦脒 燃黼 熊黻 靴弛 糌挖 雌辩 湖溺师范火学硕：l 二研究生毕业论文 总体积： 2 5u1 ( 3 ) 篇二轮r a c e - p c r 反应体系： 双蒸纯净水 1 6 2 pl l o b u f f e r2 5 赫l d n t p ( 1 0 摘)2 5 瓣l 巢式p c r 弓 鞭j n u p ( 1 0 社鹾) l 。3 弘l 巢式p c r 弓i 物5 n g s p ( 1 0 塾麓) l 。3 壮l l ：1 0 0 稀释的第一辘p c r 产物 l 姐l e x t a q 0 2 l il 总体积 2 5ul 2 4 3 5 舶r 拆片片段的p c r 方法获取 h l b h 的o r f 只有3 1 8 b p ，我们在其o r f 内没有找到合适的酶切位 点来分汗两个功能区域。所以我们采用p c r 的方法来扩增，其其体 操作是：首先利用o r f 的5 端弓f 物p l ，设计弓 物p 唾，在隧的s 端加上酶锈像点白j i ，经标准p c r 扩增获得片段s 2 。然怎利用o r f 斡3 端i ；| 物p 2 ，设计号l 携p 3 ，在p 3 静5 端鸯瑟土酶甥位点e c o r i ， 经糠准p c r 扩增获褥冀段s 3 。按黧方法2 。3 。6 。1 分别将s 2 ，s 3 连接 刘p c m v - b d 琰粒 如图l 一1 3 ) 。 2 ，4 。3 。6p c r 产物的纯纯回收 按u n i q - i o 柱式d n a 胶回收纯化试剂盒( 上海生工) 说明书进 行p c r 产物的纯化回收。 ( 1 ) 制备一块1 的琼脂糖凝胶，点样后电泳分离； 湖南师范凡学硕 硝究生毕业论文 ( 2 ) 紫外灯下切下特异性d n a 条带放入i 5 m l 离心管中，称熏； ( 3 ) 加入3 个凝胶重攮的b i n d i n gb u f f e r ，放入6 5 c 水浴融胶 2 0 m i n ，此问震荡混合，使胶块充分融化； ( 4 ) 以上溶液转入u n i q 一1 0 柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃废液； ( 5 ) 将5 0 0 驻l 的w a s h i n gs o l u t i o n 加入u n i o t 0 柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，奔凌液，重复一次； ( 6 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ； ( 7 ) 将u n i q - i o 桂置予新的离心管上，在u n i q - t o 柱中加入2 5 弘l e l u ti o nb u f f e r ( 6 5 水浴) ，静置5 m i n ： ( 8 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，洗脱d n a ； 2 4 3 7f c r 产物与t 载体的连接 ( 1 ) 用紫外分光光度计测定p c r 产物浓度，按以下公式计算连接 所需p c r 产物的壁：插入片断量( n g ) = 载体量( n g ) x 插入片 断大小( k b ) 】载体大小( k b ) ) x ( 插入片断载体) 的摩尔眈率 插入片凝载体的摩尔冼率一般秀3 ：1 或l ：l 。操作中我们采 翻3 ：1 豹跑率进行。 ( 2 ) 连接爱应按t a k a r a 公司l i g a t i o nk i t2 0 试裁鑫说鞠搠入 t 载体和p c r 纯化产物，再期等体积的遴接溶渡i 。1 6 。c 恒温水漆 缀环器中连接过夜。 2 4 3 8 转化( 热休克法) ( 1 ) 将1 - ) 0n1 的感受态细胞( d 娃一5a ，由本实验室制备) 冰上化 冻，加入l o “l 的连接子，置冰上2 0 - 3 0 m i n ： ，湖南师范大学硕：确酣究生毕业论义 ( 2 ) 4 2 。c 热休克4 5 9 0 s ； ( 3 ) 迅速冰上冷却3 - 5 m i n ； ( 4 ) 加入l m l 无抗生索的潍液体培养基，3 7 。c 摇床( 1 8 0 r p m ) l h ： ( 5 ) 3 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，去7 0 0 瓣l 主清； ( 6 混匀剿下蕊液，取出1 5 0 瑟l 涂毒子毫3 7 。c 预热含攘痰挽生 素的l bt p t g x g a l 琼脂培养基乎板上； ( 7 ) 正置乎扳子3 7 。c 培养籀中3 0 m i n 后，倒置平板继续培养1 2 h 可出现菠落。 2 4 3 ，9 日性克隆的筛选与鉴定 ( 1 ) 小量制备质粒b n a 用扩增开放阅读矿引物中弓l 入的限制性内 切酶进行酶切，酶切反应体系：内切酶0 。5u1 ，r n a s e0 。5p1 ， 1 0 xb u f f e r1pl ，质粒d n al 耻l ，超纯水7pl 。混匀后予3 7 酶切4 h ； ( 2 ) 点榉进行琼脂耱凝狡曝泳稔鲞，筛选连入豹黼馕竟隆； 2 ， 3 + l 测滓 隈牲宠隆送上海博受公司测序。 2 ，4 。4 。质粒的割备 2 4 4 1 质粒的小量制备 ( 1 ) 随机挑选单个白色转化菌落予含相应抗生素的l b 液体培养 基( 5 0ug m 1 ) 中，3 7 ( 2 摇床小规模扩增培养1 5h 左右； 镧南拜箍走掌颟 ：辩究垒毕照避空 ( 2 ) 保种后取翁液1 5 m l 入微量离心管，4 2 26 0 0 0 r p m 离心2 m i n ， 奔| 二清； ( 3 ) 2 n1 0 0 “l 醚预冷的s o l u t i o ni ( 5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l l t r i s ，c l ( p h 8 。0 ) ，l o m m o l l 戮a ，剃烈振荡，重耨悬浮缨藤； ( 4 ) 翔2 0 0 l | l 耨聚制酶s o l u t i o ni i ，( 0 2 m o l l n a o t t ，l 篱s d s ) 轻缓混合颡燮混合5 一豫次，冰土5 m i m ( s ) 拥1 5 0 # 1 激颈冷魏s o l u t i o nl | l ( 1 4 7 + 2 9 数。，5 7 5 m l 冰 醋酸，拥求至5 0 0m 1