（微生物学专业论文）产γ氨基丁酸乳杆菌的筛选及其发酵条件优化研究.pdf

学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导 师指导下 进行的 研究工作 及取得的 研究成果。据我所知，除了文中 特别加以 标注和致谢的地方外，论文中不包含 其 他 人已 经 发 表 或 撰 写过的 研究 成 果， 也 不 包 含为 获 得 j醚蜚壁色或 其 他 教 育 机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同 工作的同志对本研究所做的 任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 (手 写 ): 4 .签 字 日 期 :0 7 年。 月 r8 日 学位论文版权使用授权书 本 学 位论 文作 者 完 全了 解 - 遏大堂 -有 关 保 留 、 使 用 学 位论 文的 规 定， 有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和 借阅。 本 人 授 权 直量去堂可以 将 学 位 论 文的 全 部 或 部 分内 容编 入 有 关 数 据 库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 ( 手 写 ) : 减 , 签 字 日 期 :。 7 年月 犷日 导师签少 矜 卿 艺签 字日 期 : 。/ 年 毛 月 / 6日 学 位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯 地址: 电话: 邮编 : 摘要 摘要 t - 氨基丁酸 ( a c i d , g a b a ) ， 又称氨酪 酸， 是一种非蛋白 质组 成的 天然氨基酸， 分布非常广泛， 在动物、植物和微生物中均有存在。 g a b a 是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功 能， 如降压、镇静、增强记忆、抗焦虑，尤其对更年期的失眠、压抑和自 身失 调疗效良 好。随着g a b a的生理功能不断研究和阐明，已 经发展成为一种新型 的功能性因子，正逐渐应用于医药、 食品等行业。本文主要进行了g a b a高产 菌种的选育及其发酵条件的优化，取得了较好进展，具体如下: 1 . 建立了高效液相色谱测定发酵液中g a b a的方法。 采用邻苯二甲醛作为 衍生 剂， 用反 相c i s 柱为分离柱， 在3 3 8 n m下进行检测。 结果发酵液中的g a b a 得到 很 好的 分离， g a b a在0 - 3 . 0 0 0 g / l 范围内 线性关系良 好， 其线性方程为y - 2 .2 2 0 3 x 一 0 . 0 4 2 8( 扩 0 .9 9 9 6 ) . 组间 样品测定相对误差为 一 2 . 8 2 ， 加样平均回收 率达到了9 7 . 1 8 % . 结果表明， 所建方法稳定， 重现性好， 可用于发酵液中g a b a 的定量分析。 2 . 从传统发酵食品中 分离筛选到一株产g a b a的乳酸菌株l 1 3 9 ， 经初步鉴 定为 乳 杆菌属 ( l a c t o b a c i l l u s s p . ) 。 实验结果 表明， 此乳 杆菌具有转化谷氨酸产 生g a b a的能力， 该 菌在初始条 件下摇瓶发酵7 2 h , g a b a产量为4 .3 5创 l , 底物转化率为7 8 .9 4 %。 3 ， 通过单次单因子实验法并利用 s a s软件中的二水平设计和响应面分析 法，对发酵生产g a b a的培养基进行了优化。以iu m 培养基作为基础培养基， 采用p l a c k e tt - b u r m a n ( p b ) 设 计对培 养基中 相关影响因 素的 效应进行评 价， 确定了 有显著效应的葡萄糖、碳氮比 及 m n s 0 4 h 2 0浓度， 而培养基中的其他因素对 g a b a产量的影响不显著.然后用b o x - b e h n k e n设计及响应面分析确定了主要 影响因 素的 最佳条 件. 结果表明 最适 培养基的 组成为: 葡萄 糖 2 5 .4 叭 、 酵母膏 6 .2 叭 、 大豆蛋白 膝 6 .2 g / l 、 吐 温8 0 2 m l / l 、 乙醇4 m l / l , m g s o 4 - 7 h 2 0 0 .2 g / l , m n s o 4 -h 2 0 0 .0 4 5 g / l , l - 谷氨酸 钠1 2 . 5 g/1. 。 在此基 础上考 察分析发酵 温度、 p h . 供氧及底物浓度等因素对l 1 3 9 产g a b a的影响， 获得的最佳底物起始浓度为 2 0 叭， 最适发酵条 件为: 发酵温度3 4 c ， 不 通气， p h 5 .0 0 实 验结果有良 好的重 现性，g a b a产量达 1 0 . 2 1 g / l ，底物转化率为9 2 .6 4 %. 摘要 4 . 以优化得到的发酵条件为基础，进行了5 l罐的小试发酵论证实验。研 究结果表明， 优化的摇瓶发酵条件可以 在小罐放大。 在5 l 罐上发酵8 0 h ， 底物 基本完全转化， g a b a产量达到9 .8 6 g i l ， 底物转化率为8 9 .4 6 % . 5 . 在5 l 小罐发酵的基础上， 进行了5 l 发酵罐补料分批发酵试验， 在1 0 0 r l m i n 搅拌不通气的条件下， 3 4 发酵4 0 h 后开始补料， 流加葡萄搪和lms g . 在发酵终 止1 2 0 h 时， g a b a浓度 达到3 2 叭， 底物转化率为7 2 . 5 9 % . 关键词: 丫 . 氨基丁酸; 乳杆菌; 发酵条件;响 应面法: 设计 ab s t r a c t ab s t r a c t 7 - a m i n o b u t y r i c a c i d ( g a b a ) i s a n o n - p r o t e i n a m i n o a c i d t h a t i s w i d e l y o c c u r e d i n n a t u r e . g a b a i s a m a j o r i n h i b i t o ry n e u r o t r a n s m i t t e r i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e r m . g a b a h a s v e ry i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s , s u c h a s n e u r o t r a n s m i s s i o n m e d i a t o r , d e p r e s s i o n o f h y p e r t e n s i o n , d i u r e t i c e ff e c t s , a n d t r a n q u i l i z e r e ff e c t s e t c . i t m a k e s g a b a a n i m p o r t a n t f u n c t i o n a l f a c t o r i n f o o d a n d m e d i c i n e . i n t h e p r e s e n t s t u d y , a s t r a i n o f l a c t o b a c i l l u s s p . t h a t p r o d u c e g a b a w a s s c r e e n e d , a n d i t s f e r m e n t a t i o n p r o c e s s w e r e s t u d i e d . t h e m a i n r e s u l t s w e r e a s f o l l o w s : 1 . a h p l c m e t h o d f o r a n a l y s i s g a b a i n t h e f e r m e n t i n g li q u o r w a s e s t a b l i s h e d . t h e g a 13 a w a s e x t r a c t e d f r o m f e r me n t e d b r o t h , a n d d e r i v a t i z e d t o o p a - g a b a w i t h o p a ; t h e l a t t e r w a s s u b s e q u e n t l y s e p a r a t e d w i t h c i s s e p a r a t i o n c o l u m n a n d d e t e c t e d w i t h u v a b s o r b a n c e d e t e c t o r a t 3 3 8 u r n . u n d e r t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d a b o v e , t h e h p l c s e p a r a t i o n g a v e a w e l l - r e s o l v e d a n d s y m m e t r i c a l o p a - g a b a p e a k . t h e r e t e n t i o n t im e s w a s 6 .6 3 m i n a n d r e p r o d u c i b l e . p e a k a r e a v a l u e s s h o w e d g o o d r e p r o d u c i b i li t y w i t h r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n ( r s d ) v a l u e s a t 1 . 7 7 2 5%. t h e c a l ib r a t i o n c u r v e f o r o p a - g a b a w a s c a l c u l a t e d b y l i n e a r l e a s t - s q u a r e s s q u a r e s r e g r e s s i o n . t h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n w a s y = 2 .2 2 0 3 x 一 0 .0 4 2 8 ( r 3 = 0 .9 9 9 6 ) w h e n t h e i n i t i a l g a b a c o n c e n t r a t i o n i n 血 r a n g e 03 .0 0 0 g / l . t h e r e s u l t i n d i c a t e d t h a t t h e m e t h o d d e s c r i b e d w a s s p e c i f i c a n d u s e f u l f o r t h e d e t e r m in a t i o n o f g a b a i n t h e f e r m e n t i n g l i q u o r . 2 . a g a b a - p r o d u c 吨 s t r a i n o f l a c t o b a c i l l u s s p . l 1 3 9 w a s i s o l a t e d a n d s c r e e n e d fr o m t h e t r a d i t i o n a l f e r m e n t e d f o o d . 4 . 3 5 g / l o f g a b a w i t h a s u b s t r a t e c o n v e r s i o n o f 7 8 .9 4 %w a s p r o d u c e d 衍t h e i n i t i a l s t r a i n l 1 3 9 a ft e r f e r m e n t a t io n f o r 7 2 h o u r s u n d e r t h e c o n d i t i o n s w i t h o u t b e i n g o p t i m i z e d . 3 . t h e c u l t u r e m e d i u m a n d c o n d it i o n s o f l 1 3 9 f o r g a b a p r o d u c t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d a n d o p t i m i z e d w i t h o n e - f a c t o r - a t - a - t u n e e x p e r i m e n ta l d e s i g n a n d r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y . t h e mr s - b a s e d f e r m e n t a t i o n m e d i u m f o r y - a m i n o b u t y r i c a c i d ( g a b a ) p r o d u c t i o n w a s o p t i m i z e d u s i n g s a s s o ft w a r e c o m b i n e d w i t h t h e p l a c k e tt - b u r m a n d e s i g n a n d r e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s m e t h o d . ab s tra c t f i r s t l y , p l a c k e tt - b u r m a n d e s i g n w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e i n fl u e n c e o f re l a t e d f a c t o r s . t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t g l u c o s e , c / n r a t i o a n d mn s o 4 -h 2 0 w e r e t h e m a i n a ff e c t in g f a c t o r s w h i l e t h e o t h e r a d d i t i v e s h a d n o s i g n i fi c a n t e ff e c t o n t h e g a b a p r o d u c t i o n . t h e n , t h e b o x - b e h n k e n d e s i g n a n d re s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s w e re u s e d t o d e t e r m i n e t h e o p t i m a l l e v e l s o f t h e m a i n f a c t o r s . t h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e o p t i m a l c o m p o n e n t s o f m e d i u m f o r g a b a p r o d u c t i o n w a s a s f o ll o w s : g l u c o s e , 2 5 .4 g / l ; y e a s t e x t ra c t , 6 .2 g / l ; p e p t o n e , 6 . 2 g / l ; t w e e n 8 0 ,2 m 1 j l ; e t h o n a l , 4 m l j l ; m g s o 4 - 7 h 2 0 , 0 .2 g / l ; mn s o 4 -h 2 0 , 0 . 0 4 5 g / l ; l - m s q1 2 . 5 g 几 . b a s e d o n t h e a b o v e o p t i m u m c o n d i t i o n , t h e e ff e c t s o f t e m p e r a t u r e , p h , o x y g e n s u p p ly a n d t h e c o n c e n t r a t i o n s o f ms g w e r e i n v e s t i g a t e d . a s a re s u lt , t h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s o f m s q p h , t e m p e r a t u r e w a s 2 0 g / l , 5 . 0 , 3 4 r e s p e c t i v e l y . t h e y i e l d o f g a b a a ft e r o p t i m i z a t i o n r e a c h e d 1 0 .2 1 g / l t h a t w a s i n c r e a s e d b y 1 .3 5 - f o l d i n c o m p a r i s o n t o n o n - o p t i m i z a t i o n . t h e c o n v e r s i o n r a t e w a s 9 2 . 6 4 %. 4 . a c c o r d i n g t o t h e o p t i m a l c o n d i t i o n s , t h e b a t c h f e r m e n t a t i o n w a s c a r r i e d o u t i n 5 l f e r m e n t o r t o d e mo n s t r a t e t h e re s u l t o f o p t i m i z a t i o n . t h e s u b s t r a t e w a s mo 心 t r a n s f o r m e d t o g a b a a ft e r f e r m e n t a t i o n f o r 8 0 h o u r s ; 出. y i e l d o f g a b a w a s 9 . 8 6 叭 a n d t h e c o n v e r s i o n r a t e o f s u b s t r a t e w a s 8 9 .4 6 %. 5 . b a s e d o n t h e o p t i m a l c o n d i t i o n s , 比 e f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n w a s p e r f o r m e d w i 山 s t r a i n l 1 3 9 i n 5 l f e r me n t o r . wh e n t h e f e r m e n t a t i o n w a s c o n d u c t e d w i t h a g i t a t i o n a t 1 0 0 r / m i n a n d w i t h o u t a i r a d d i t i o n f o r n e a r l y 4 0 h o u r s , t h e g l u c o s e a n d l - ms g w e r e a d d e d i n t o t h e m e d i u m . t h e a d d it i o n o f g l u c o s e a n d l - ms g c o u l d re s u l t i n a c c u m u l a t i o n o f g a b a t o r e a c h a s h i g h a s 3 2叭 w i t h a s u b s t r a t e c o n v e r s i o n o f 7 2 . 5 9% a f t e r f e r me n t a ti o n f o r 1 2 0 h o u r s . k e y w o r d s : y - a m i n o b u t y r i c a c i d ( g a b a ) ; l a c t o b a c i l l u s s p . ; f e r m e n t a ti o n p r o c e s s ; d e s i g n ; b o x - b e h n k e n d e s i g n ; u 第一章 文献综述 第一章 文献综述 1 . 1前言 y - 氨基丁酸( y - a m i n o b u t y r i c a c i d , g a b a ) 也 称 氨酪 酸， 是一 种非 蛋白 质组 成的天然氨基酸， 广泛存在于自 然界。 g a b a是目 前研究较为深入的 一种重要 的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。 1 9 9 4 年， t a k a y o l 1等 在 研 究 用 水 浸泡的 米 胚 芽 的 氨 基 酸 分 布时 ， 发 现 经 过 发 酵处 理的 米胚芽中g a b a的 积累 量很高， 达到2 0 0 - 3 0 0 m g / 1 0 0 g . 1 9 9 6 年， 富 含g a b a的米胚芽制品在日 本实现了商业化. 神经生理及神经医学的研究表明， g a b a是一种重要的活性物质。在人脑中，虽然g a b a可由 脑部的谷氨酸在专 一性 较强的 谷氨酸脱梭酶作 用下 转化而成2 .， 但是随 着年龄的 增长和精神 压力的 加大，g a b a的转化和积累比 较困难，而通过日 常饮食补充可有效改善这种状 况。最近，日 本科学家利用米胚芽等原料开发制造的富含 g a b a的功能食品配 料，已 经 广泛地 应用于饮料、 果酱、 糕点、 饼干、 调味 料 等制品中 3 1 . 另外还有 报道，应用生物技术制造的高浓度 g a b a饮料以及利用乳酸菌等制作的富含 g a b a的食品配料， 可以 直接作为抗高血压 改善脑机能及肝功能的功能 食品14 1 在我国，有关g a b a食品的研究报道较少，相关产品有待进一步开发。 1 . 2 g a b a的生理功能 1 . 2 . 1杭焦虑 g a b a能结合到抗焦虑的脑受体并使之激活， 然后与另外一些物质协同作 用，阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢，从而根本上镇静神经，起到抗焦 虑的作用 气 1 . 2 . 2降低血压 高血压是现代社会老年人常见的疾病，严重者可引 起心肌梗塞 、中风和血 第一章 文献综述 管硬化， 危及生命。g a b a作为中 枢神经系统内最重要的抑制性氨基酸递质， 具有突触后抑制作用，g a b a 能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩 张， 从而 达到降 低血压的目 的。 h a y a k a w a等6 1 以 乳 酸菌发酵脱脂乳 获得的富 g a b a乳制品，饲喂自 发性高血压和正常鼠，结果富g a b a乳制品具有显著的 降血压作用，进一步研究发现该乳制品并没有抗血压肤存在，其降 血压的功能 性成分是g a b a . 据报道，中 草药 黄蔑等中 药的 有效降 血压成分也为g a b a n e 1 . 2 . 3促进睡眠 g a b a可以降 低神经元活性，使细胞超极化，防止神经细胞过热。同时， g a b a能提高葡萄糖磷酸酷酶活性， 激活脑内葡萄搪的代谢，促进乙酞胆碱合 成，使脑细胞活动旺盛，促进脑组织新陈代谢和恢复细胞功能，改善神经机能。 合成神经元分布于脑千、间脑的核团内 和投射神经元内。能产生丘脑一 皮层纺锤 波的丘脑网状核内神经元含有 g a b a ， 从而在丘脑皮层投射中起抑制作用。位 于下丘脑和前脑基部的g a b a神经元向 前脑皮层投射， 可能与在前脑纪录到的 睡眠细胞有关v 。 孙兵等19 对 g a b a对猫睡眠时 相的影响进行了 研究，发现 g a b 人使猫的慢波睡眠ii 期和快动眼睡眠期延长。 o k a d a等1 1 0 1 人也 报道了富 含 g a b a的米胚芽具有促进睡眠的作用。摄入g a b a可以提高葡萄糖磷脂酶的活 性，从而促进动物大脑的能量代谢，活化脑血流， 增加氧供给量，最终恢复脑 细 胞 功 能 ， 改 善 神 经 机能 p l l 1 . 2 . 4治疗蠢痛 癫痛病的 发 作和中 枢神经递质之间 有密切的 联系 2 1 . g a b a是脑内 重要的 抑制性递质， 对中 枢神经表现了 普遍和强烈的抑制作用。研究表明，精神病与 g a b a的缺乏有一定相关性。 试验显示， 实验性 惊厥动物的脑组织中g a b a含 量明显减少，1 9 9 7 年，大雄诚太郎发现帕金森病人脊髓的g a b a的浓度降低， 癫痈病 患 者脊 髓 液中g a b a的 浓度也 低 于正 常水 平. s u t c h 13 等 人 研究 发 现在 遗 传缺陷型癫痈鼠的丘脑中g a b a摄入较正常鼠少，主要是由于摄入亲和性较低 造成。 现在已经合成了许多g a b a衍生物作为治疗癫痛的药物。虽然g a b a几 乎不能通过正常的血脑屏障，但在血脑屏障发生紊乱时( 如皮层的某些癫痛病 第一章 文献综述 则g a b a可以通过，这也许是g a b a对某些癫痛有效的原因. 改善肝肾功能 临床医学认为， g a b a能抑制谷氨酸的 脱狡反应，能与a - 酮戊二酸反应生 成 谷氨酸，使血氨有效降 低， 还能促使更多的谷氨酸与氨结合生成尿酸排出体 外， 解除氨毒， 增进肝机能;给老鼠 喂食富含g a b a的 米胚芽实验，发现大鼠 肾 脏基底膜细胞 坏 死减少， 尿素 态氨降低， 说明g a b a具 有活肾 功能 1 4 1 1 .2 . 6 g a b a的其它功能 除上述功能之外，g a b a还有许多其他生理功能，如调节激素的分泌，参 与 哺 乳动 物心 血 管 功 能 体 调 节， 抑 制 心率 失 常， 改 善 脂 质 代 谢 ， 防 止 动 脉 硬 化( 1热 此外，g a b a还可促进酒精代谢，增强食品风味，在饲料行业也将具有广泛的 应用 前景( 1 6 1 ; 医 学 上， g a b a对 脑血管障 碍引 起的 偏瘫、 儿 童智力发 育迟缓、 记忆障碍等有很好的 疗效，同时也用于治疗尿毒症、 c o中毒的 药物中。 1 . 3 g a b a的制备方法及进展 1 . 3 . 1化学制备法 g a b a 的制备方法有化学合成法和生物合成法。 化学合成法以 邻苯二甲酞 亚 氨钾和7 - 氛丁 氛在强 烈条件下反 应， 产物与 浓硫酸作 用后水解获 得， 化学合 成法制备 g a b a由 于在生产工艺中使用了一些腐蚀性较强的溶剂，成本高，反 应条 件 剧烈， 安全 性 差 ， 可引 起 环 境污 染(t 几 1 . 3 . 2生物合成法 生物合成法是一种安全、 低成本的方法。 在早期的研究中， 发酵法生产g a b a 以大肠杆菌为生产菌，发酵培养基为数皮水解液、玉米浆、蛋白 陈、 矿物质等。 在发酵过程中，利用大肠杆菌脱梭酶的作用，将l - 谷氨酸转化为g a b a ，再分 第一章 文献综述 离纯化得 g a b a制品，大肠杆菌具有很高的谷氨酸脱狡酶的活性，利用这一特 性， 有人利 用固 定 化大肠杆菌细胞生产 g a b a ， 并达到较高的 转化率 【 7 0 1 。目 前 已有采用固定化酶和固定化细胞生产g a b a的技术。但若要用于食品开发，大 肠杆菌无疑存在安全卫生方面的隐患。根据最新的研究报道，一些高安全的微 生 物， 如乳 酸菌 d 8 1酵 母菌 19 1 、曲 霉 菌2 0 1 等 也 有 脱 梭酶 活性， 可以 进 行。 a b a 生产，同时又有自 身安全的优势。生物合成的g a 13 a制品能用作高档功能性保 健食品的 配料， 用米胚芽为原料的 制备工艺 如下f2 l 1 . 米胚芽提取物*添加碳源、氮源等配制培养基一接种微生物 ( 酵母菌或乳 酸菌) ，发酵*过滤一干燥- - a b a成品。 乳酸菌 是一 类 普 遍认为 安全的 细菌( g e n e r a ll y r e g a r d e d as s a f e , g r a s ) ， 具 有多种生理活性，广泛用于食品和医药，如作为益生菌调节肠道菌群，抑制腐 败菌的 繁 殖， 增强 人 体免 疫力和 抵 抗力， 降 血 脂 血 压 等2 2 1 。 因 此， 产g a 13 a的 乳酸菌或其生产的g a b a可以直接应用于食品和医药。目前，已有许多研究报 道乳酸菌 产g a b a的例子， 1 9 9 7 年， u e n o 2 3 1从k i m u c h i 中 分离出 产。 a b a的 短 乳 杆菌( l a c t o b a c il l u s b r e v is ) , 2 0 0 2 年， y o k o y a m a 12 4 1从酒 精发 酵液中 也 分 离了 出了 产。 a b a的 短乳杆菌，1 9 9 8 年， n o m m a 2 5 1 等从发酵乳中 发现产g a b a的 乳酸乳 球菌 ( l a c t o c o c c u s l a c t i s ) , 2 0 0 5 年， k o m a ts u z a k i 12 6 1 等从 传统发 酵鱼中 分 离了 具有高g a d 活性的 类干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e i ) o 筛选出 不同 种 类、具有高产g a b a能力的乳酸菌菌株对于食品工业具有重要的意义，因为不 同个体的乳酸菌具有特殊的发酵特性，例如产酸及发酵风味等。而发酵食品的 质量则取决于它的口 感与风味，这些都依赖于乳酸菌的发酵特性，因而乳酸菌 的特性是发酵食品生产的重要因素。 许建军等人在国内 首次报道了产g a b a的乳酸菌株s y f s 1 .0 0 9 ， 发酵液中 g a b a 含 量 提 高 到2 0 0 m g / 1 0 0 m l 以 上 12 7 1 . 刘 清 等 2 8 1对 一 株 可 产 谷 氨酸 脱 梭 酶 的 乳酸菌菌株进行了 试验， 3 3 c 进行发酵培养 3 d 后， 发酵液中g a b a含量达到 3 1 0 m g / 1 0 0 m l ， 比 优 化 前 提 高t 约4 倍。 s a d a j i 等 。 ， 发 现， 短 乳 杆 菌i f o - 1 2 0 0 5 ( l a c t o b a c i l l u s b r e v i s i f o - 1 2 0 0 5 )几乎能将酒糟中的游离谷氨酸全部转化为 g a b a 。这些研究说明，利用乳酸菌制备g a b a是完全可行的。 应用生物技术制造的高浓度 g a b a饮料以及利用乳酸菌等制作的富含 g a b a的食品配料， 均可直接作为或用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功 能食品，已 有利用产g a b a的乳酸菌制作具有抗高 血压作用的奶酪的报道2 5 第一章 文献综述 产g a b a的乳酸菌食药两用，应用领域广。 1 . 4 g a b a的应用前景 我国 人民 在长期的实践中建立发展了 传统中医学，成为一大宝库。中医使 用的多种天然产物具有食用和药用的双重功能，从而提出了 “ 药食同源”的概 念和理论。日本人基于这一理论提出了功能食品的概念。g a b a也可属于这一 类物质，因此富含g a b a的食品一定具有广阔的应用前景。治疗高血压的药物 较多，但不少药物具有一定的副作用，患者连续服用后会出现四肢无力，昏昏 欲睡，记忆力骤降，食欲不振以及老年痴呆等不良 现象。为此，寻找和开发纯 天然药物已成为当今研发工作的发展趋势。 在食品 领域已 开发研制成功的有: y - 氨基丁 酸茶、 桑茶(3 0 1 及米 胚芽制品 等。 g a b a作为活性因子，具有降血压、抗抑郁、 增强脑功能和记忆，以及利 尿、强肝、健肾等生理活性，在功能性食品的开发中有很大潜力。已有报道指 出，茶和大米胚芽通过自 然的发酵过程可以富集 g a b a 。除此之外，豆制品、 西红柿、小球藻等天然食品素材通过加工可以富 集 g a b a 。目 前，日 本多家公 司和研究所都在从事这方面的开发工作。虽然g a b a在自 然界的分布很广泛， 但将其开发作为保健食品功能因子还需大量的工作。 在食品中应用 g a b a ，绝 不是对药用g a b a的简单添加， 而是要从制备这个源头开始，利用天然物质及 采用生物技术方法，生产出可安全用于食品并可被视为天然添加剂的食用 gaga. 目 前国内己有一些研究人员开始对 g a b a 的制备及应用进行研究，相信 g a b a这种新颖的功能食品因子将会在我国得到很快的发展。 1 .5 g a d特性及其克隆表达 谷氨酸脱狡酶( g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e , g a d ) 是 乳酸 菌生 产g a b a的 关键 酶， 在动植物及微生物体内 都能检测到， 分布非常广泛。 g a d的辅酶是5 一 磷酸 毗哆醛( p y r o d o x a l - 5 - p h o s p h a t e . p l p ) ， 故也被称为p l p 依 赖型脱v酶。 第一章 文献综述 1 . 5 . 1微生物 g a d 已 经报道了e s c h e r i c h i a c o h 3 1 1 , l a c t o b a c i l l u s b r e v is i 13 l , l a c t o c o c c u s l a c t i s r 5 1 , n e u r o sp o r a c r a s s a 3 2 1等 微 生 物 细 胞 中 都 有g a d的 存 在。 细 菌中e . c o l t 的g a d 研究 得 较为 深入。 1 9 7 0 年， s t r a u s b a u c h 等 3 3 1报道， 从e . c o l i 分 离 纯 化的g a d 由6 个相同的亚基构成， 每个亚基分子量为5 3 k d a ，并结合一分子磷酸毗哆醛。 1 9 7 2 年 ， f o n d a 3 4 1报 道了 该 酶 的 最 适p h 为4 .0 4 .5 . f o n d a 发 现 在 培 养 基中 添加谷氨酸可诱导g a d酶的 生 成， 产量可 达1 0 m g t l . 近些年来人 们对乳酸菌g a d的 关注也 越来越高. 1 9 9 7 年， n o 等 1 s ) 报 道 l a c t o c o c c u s l a c t i s 来源的g a d是一种成熟的单体形式，其相对分子量约为 5 4 k d a . l a c t o b a c i l l u s b r e v is i f 0 1 2 0 0 5 的g a d分子有两个亚基， 亚基相对分子 质 量 约 为6 0 k d a 2 3 1 . 2 0 0 5 年， k o m a ts u za k i 等 2 6 1 人 首 次 在l a c t o b a c il l u s p a r a c a s e i 中 发现高活力的g a d ， 但其酶学 特性还有待进一步研究。国内， 许建军3 5 1 等人 对l a c t o c o c c u s l a c t i s 的g a d进行了分离纯化， 在加入l - 谷氨酸后， 表现出了很 强的 底物专一性， 最适p h为4 . 7 . p h 6 .0 以 上时失活.l . l a c t is g a d的热稳定 性良 好， 在3 0 - 7 0 ， p h 4 . 1 处 理1 0 m in 仍能 维 持9 0 % 以 上的 活 力。 u c m3 6 1 指出， 细菌中g a d的存在与细胞生长的耐酸机制有关， 脱梭作用不可逆地消耗 了扩， 从而对维持细胞的 生理p h有利。 其 它 微 生 物 来 源的。 a d 也 有 报 导 . 1 9 9 1 年， h a o 3 2 1 分 离 纯 化了n e u r o s p o r a c r a s s a c o n i d i a的g a d , 测得其相对分子量仅为3 3 k d a , 酶学特性与e c o l i g a d 较为 相 似。 g a r c i ( 1 9 9 5 ) 从s t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 纯化得到g a d ， 相对分子 量为5 4 k d a , 酶学特性与哺乳动物的相似，并与人g a d 6 5 的序列有一定同源 性3 7 1 1 . 5 . 2植物g a d g a d在植物中的分布也很广泛。从南瓜、 马铃薯、 矮牵牛花， 以 及林生山 熬豆13 1 中 都己 分离出g a d . 禾本 科植物的g a d活性可作为 种子活力和幼苗 长势的 标准。可见， 植物中g a d活性与种子发育、 成熟和衰老有关。1 9 9 7 年， 范军 14 2 1 等人 从小麦中 分离得到了g a d ， 它由6 个相同 亚基组成， 每个亚基分子 量为5 0 k d a ， 与大肠杆菌的g a d结构很相似。 1 9 9 3 年， b a u m等4 0 1 对矮牵牛花 第一幸 文献综述 g a d研究时发现，其c 一 末端部分结合有一个长约2 1 个氨基酸的特殊区域，能 与钙调蛋白 结合，由于它的存在，当细胞中c a z + 达到一定浓度时，g a d即被迅 速 ( d 、 于3 0 s ) 激 活。 1 9 9 7 年， j o h n s o n等 4 3 】对牛 豆g a d进 行了 分 离 纯 化， 经 s d s - p a g e 分析，显示出两条带， 分子量分别为5 4 k d a 和5 1 k d a 。根据已 有的 报导 ， 植 物g a d 都 是由 多 个 分 子 量 相同 的 亚 基 组 成， 如 南 瓜 ( 5 8 k d a ) ， 马 铃 薯 3 s . 9 1 ( 4 5 .5 k d a ) 等 。 然 而 ， s n e d d e n 5 9 1 指 出 ， 即 便 是 在 苯甲 基 磺 酞 氟( p h e n y b n e th y l s u l f o n y l f l u o ri d e . p m s f ) 存 在的 情 况 下， 在 分 离 纯 化。 a d 时 也 可能 发 生 部 分 水解，小 亚基( 5 1 k d a ) 很可能 是大亚基 ( 5 4 k d a ) 蛋白 质水解的 产物。 j o h n s o n随 后 对纯 化过 程中 发 生 蛋白 质降 解的 小 亚 基 进行了c 扩 + 测试， 发 现其 对c a z 十 的 激活 作用并不敏感， 说明其活性复合物中 缺少钙调蛋白， 进而得出被降解的部分是 与钙调蛋白 结合的 c 一 末端特殊序列4 3 1 。除了 牛豆、矮牵牛花之外， 从拟南芥 ( a r a b i d o p s i s ) 、 蚕豆( f a v a b e a n ) 、 番茄中 得到的g a d也 在c 一 末端部分显示有 钙 调 蛋白 结 合 区 域 3 6 1 早 在1 9 7 5 年 ， i n a t o r a i 和s la u g h t e r 4 4 1就 发 现大 麦 胚 乳 的g a d有 两 种 形 式， 相对分子量分别为2 5 6 k d a 和 1 2 0 k d a ，后者活性较低， 但在o c贮藏后会自 发 地转变成2 5 6 k d a 的形式。 大麦根中g a d的相对分子量为3 1 0 k d a e 1 9 8 5 年， n a r a y a n 和n a i r 从马铃薯块茎中分离得到g a d ， 经p a g e 测其相对分子量为9 1 k d a ， 而通过s d s - p a g e测得为4 3 k d a ， 证明马铃薯g a d为二聚体。 1 9 9 0 年， m a t s u m o t o 等 对 南 瓜g a d 进行分离 纯 化研究， 发 现 此酶 在p h 5 .8 条 件 下 通过凝 胶过滤， 其相对分子量为3 4 0 k d a ，再经s d s - p a g e 分离， 得到了纯化酶， 其相 对分子量为5 8 k d a ，最适p h为5 .8 . 1 . 5 . 3哺乳动物g a d 哺乳 动物g a d主 要存在于脑神经元中. 1 9 7 3 年， w u 等4 5 1 首次 从鼠 脑中 纯 化到了鼠 脑g a d ， 其分子量为8 5 k d a ，亚基分子量为4 4 k d a ，最适p h为7 .0 . 此后，又从人脑、 牛脑、猪脑等多种哺乳动物的脑中纯化到了g a d 。除了 动物 种类不同的 影响， 对同 一个 体， 其体内 亦存在多 种形式的g a d . 1 9 8 3 年， s p i n k 等 14 6 1 从 猪 脑 中 纯化 到u , p , 7 三 种 形 式的g a d . 1 9 8 7 年 ， s p i n k 等 发 现鼠 脑中 存在四种g a d 。 近期有报导指出， 脊椎动物含有两个不同的g a d基因， 分别产 生g a d 6 7 和g a d 6 5 两种酶。 在人体内， 两基因分别位于2 号和1 0 号染色体上。 第一