（植物学专业论文）拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签氢芸甘 时间： 2 年月l 日 ， 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：j 反- 4 时间：一2 岬年占月f 明 导师签名：己h 产叠 时间：口7 年月，5 日 中国农业大学硕士学位论文 拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 m 中文摘要 表观遗传学控制和染色质重塑是目前生物学中最重要和前沿的研究领域之一表观遗传学是 指在不改变d n a 序列的情况下，在碱基序列外的各种修饰和与之相关的各种蛋白质或p , u a 的协同作 用下，调控基因的表达。以完成生命周期或适应环境变化，而且这套系统还能在世代之间传递。 染色质重塑的分子机制主要涉及d n a 的甲基化和组蛋白的甲基化，乙酰化、磷酸化、泛素化等化 学修饰以及组蛋白变种的替换等多种改变染色质构象的过程，这种分子机制决定了表观遗传学控 制具有稳定、可以遗传以及可逆等特点 组蛋白乙酰化是最早被发现的与转录有关的组蛋白修饰方式。组蛋白末端的乙酰化状态在组 蛋白乙酰基转移酶( h a t s ) 和组蛋白去乙酰基酶( 玎m c s ) 的作用下保持着动态平衡，并与染色质的 转录活性状态密切相关拟南芥基因组至少编码1 2 个h a t 和1 7 个h d a c 目前已知在拟南芥 基因组中皿猡作为组蛋白脱乙酰酶参与了拟南芥雄配子体发生的控制，且对拟南芥雄配子体的发 生控制具有帮量依赖性h d s - 1 显性失活突变体( d o m i n a n tn e g a t i v em u t a n t ) 楂株种子发育发生障 碍、雄配子体在后代中的传递效率降低，雄配子体的发生过程受到影响并最终导致花粉败育本 论文工作在已有的研究基础上，进一步研究h d 8 基因在拟南芥中调控雄配予发育的分子机制 以拟南芥h d 8 突变体为材科，通过正向遗传学的方法筛选出了h d 8 基因的抑制园子s u h d l ，并对 其进行遗传学分析通过观察发现，s u h d l h d 8 双重突变体对l u t 8 突变体的花粉败育性状具有明 显恢复，而对h d 8 突变体种子发育障碍性状没有明显恢复。表明s u h d i 确实是h d 8 的抑制因子， 但同时还有其它抑制因子的存在 关键词：表观遗传学组蛋白脱乙酰酶抑制因子遗传分析拟南芥 2 中国农业大学硕士学位论文 拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 a b s t r a c t e p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o n sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gc h r o m a t i nd y n a m i c sa n dg a n e e x p r e 幽n e p i g e n e t i cr e g u l a t i o ni sam a j o ra s p e c to fg e n ec o n t r o lb yw h i c hh e r i t a b l ec h a n g e si ng e n e e x p r e s s i o n o c c u rw i t h o u ta na l t e r a t i o ni nd n as e q u e n c e t h em o d i f i c a t i o ni n v o l v e sc o v a l e n t m o d i f i c a t i o n so c c u r r i n gd i r e c t l yo nd n a o ro nt h ec h f o m a t i n , a n dt h er e p l a c e m e n to f h i s t o r i cv a r i a n t si n t h ec o r eh i s t o n eo fn u c l e o s o m e t h et y p eo fd n am o d i f i c a t i o n si n c l u d e st h em e t h y l a t i o n ，a c e t y l a t i o n , p h o s p h o r y l a t i o na n du b i q u i t i n a t i o na n ds o0 1 1a tt h en t e r m i n a lo ft h eh i s t o n et a i l h i s t o r i ca c e t y l t r a n s f e r a s e s0 a t s ) a n dh i s t o n ed e a c e t y i a s c s ( h d a c s ) a r ee m e r g i n ga si m p o r t a n t c o m p o n e n t so fp r o t e i nc o m p l e x e st h a ta f f e c t t h ed y n a m i c so fc h f o m a t i nf o l d i n gd u r i n gg e n c t r a n s c r i p t i o n a r a b i d o p s i st h a l i a n ag a n o m ee n c o d e sa tl e a s t1 2h a t sa n d1 7h d a c s i ti sp r o v e dh d 8 i sah i s t o n ed c a c e t y l a s c 吼had o m i n a n tn e g a t i v eh d 8m u t a n t , t h es e e dd e v e l o p m e n ti sa b n o r m a la n d p o l l e n sm a b o r t e d b a s e d0 1 1t h e s ec o n c l u s i o n s , w es c r e e n e dt h es u p p r e s s o ro fh d 8 g e n es u h d li n a r a b i d o p s i st h a l i a n ah d 8m u t a n tb yf o r w a r dg e n e t i c sm e t h o d b yg e n e t i c sa n a l y s i s , w ef o u n d n d z d - 1i s ar e c e s s i v e ，s i n g l eg e n em u t a 虹o n w h i c hi sc a p a b l et o 北s c u ct h ed e f e c t i v ep h e n o t y p c so f h d 8 + - m u t a n t b u tc o u l dn o tr e v e r tt h ee m b r y ol e t h a l i t yc a u s e db yh o m o z y g o n sh d 8 - 1m u t a n lb l o c k e df e r t i l i z a t i o n p r o c e s s e si nh , 8 + ，- m u t a n tj sr e c o v e r e db y s u u - 1m u t a f i o n1 0 0 0 k e yw o r d s ：e p i g e n e t i c s ，h i s t o n ed e a c e t y l a ，s u p p r e s s o r , g e n e t i c sa n a l y s i s , a r a b i d o p s i st h a l i a n a 3 中国农业大学硕士学位论文拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 第一章文献综述 1 1植物雄性有性生殖发育分子机理的研究进展 1 9 9 0 年y a n o f s k y 等成功地分离花器官发育控制基因a g a m o u s ，从此植物发育生物学的研究取 得了突破性的进展，花发育的分子生物学研究迅速成为植物发育生物学研究的新热点开花是有 花植物最主要的发育特点，这一过程由环境信号和内源信号共同决定 雄蕊是植物的雄性器官。由花丝和花药两部分组成。位于花被的内方或上方，在花托上呈 轮状或螺旋状捧列。数目因植物种类面晃，通常，原始的种类数目多丽不一定，较高等的种类数 目趋于减少并达到一定的数目一朵花中全部雄蕊总称雄蕊群在模式植物拟南芥中有六个雄蕊， 四长两短 1 1 1 花药的发育 模式植物拟南芥的花发育被分为1 2 个阶段( s m y t he f 口j 。1 9 9 0 ) 早期阶段包括分裂组织的 发生和生长以及在第三个阶段萼片原基的形成；雄蕊和花瓣的原基同时形成于第五阶段；细胞的 分裂和分化主要发生在第六到第九个阶段；在第七个阶段四个长雄蕊的发育超过两个短雄蕊并且 所有的雄蕊头部形成了花药；到了第八个阶段，四个长雄蕊的花药发育出四个圆裂片；第九个阶 段的时候雄性减数分裂开始，此时花瓣原基仍是小的、圆形的且花丝仍然在生长；接下来第十到 十二个阶段主要是花粉的发育随后花瓣开放，花药裂开。 由于花药的发育过程远比花丝发育过程复杂，根据形态学、细胞生物学和分子生物学又可以 将雄蕊的发育分为两个时期( k o l t u n o we ta 1 ，1 9 9 0 ；g o l d b e r ge ta 1 ，1 9 9 3 ) 。在第一个时期( p h a s e1 ) ， 细胞组织的分裂和分化导致了花粉囊形成四个圆裂片，里面包裹着许多小孢子母细胞在第二个 时期( p h a s e2 ) ，花丝迅速伸长，随着花药进一步增大小孢子发育成成熟花粉粒，随后花药组织 破裂，花粉放出 根据光学显微镜观察到的形态学和细胞学特征，拟南芥的花药发育进一步被分成1 4 个发育 阶段( s a n d e r s c ta 1 ，1 9 9 9 ) 第一阶段至第八阶段组成了雄蕊发育的第一个时期( p h a s e1 ) 而第九 阶段至第十四阶段组成了雄蕊发育的第二时期( p h a s e2 ) 在第一阶段，花分生组织的u 、l 2 和l 3 层细胞发生分裂导致花药原基的形成；第二到第五阶段，u 层细胞分裂扩大表面区域形成 表皮，与此同时l 3 层细胞进行分裂和分化形成了结缔组织和微管组织，平周和垂周的分裂形成 了内层细胞，特别是在第二阶段四簇孢原细胞在第二阶段由l 2 层细胞分裂而成，并且在第三阶 段分裂形成初生周缘层和造孢细胞，初生周缘层在表皮内侧包围着造孢细胞，随后初生周缘层分 裂形成次生周缘层；到了第四阶段外部次生周缘层继续分裂分化形成内表皮层和中间层，内部次 生周缘层通过分裂和发育形成绒毡层；在第五阶段，花药发育完成，形成四个圆裂片。每个裂片 从外到内有四层没有生殖能力的细胞：外壁、内壁、中间层和绒毡层，小孢子母细胞被这些细胞 层包围在中间；随后在第六阶段小孢子母细胞进行减数分裂，中间层降解，简述分裂细胞互相分 离并离开绒毡层形成腔室；第七阶段。经过减数分裂形成以四分体形式存在的小孢子；第八阶段， 4 中目农业大学硕+ 学位论文 拟南芥中组蛋白脱已酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 小孢子互捌分开并且胼胝体壁开始降解；第九阶段到第十二阶段，小孢子发育成成熟花粉，其中 第十阶段到第十二阶段绒毡层降解，花粉分裂形成三细胞花粉粒；第十三阶段，花药裂开；第十 四阶段花粉释放 1 z i g u r t1 ( m 童2 0 0 5 ) a n t h a c c n d i f f c x c n t i m i o n s h o w na t e t h cs t a g e s o f w i l d - t y p e a r a b i d o p s t s t h a i a n az m t b a d e v c l o p m c n t t h e n u m b e r s i n d i c 越es t a g c sb a r l 2 5 , u r n a n ds t a g c s l t 0 5 ，6a n d7 ，8 m d l 0 , s n d l 2a l ch 曩v c 埘叫捌b a r s a f 斗函咧搬诫；e t e p i d e r m “；阻e n d o t h e c i u m ；l i ，l 2 ，l 3 ，蛳1 ，2 ，3 ；地m i d d l e l m j c r , m s ，m i c r o s p o r o c y t ；m 吼m i c r o s p o r c , p o , p o l l g r a m , p p c ，p l i i a r y p 盯i c i a l c e l l ；辨，p r i m a y 叩讲0 号舶。咕c e l l ；s m , 冀p t 眦；s p c ，辩n d j 姆p 扪c i 矗ic e l l ；s t , s t o l l l i mt t a i 栅t 峨嘏m 缸t h c i m a g e s 咄l m v i d e d b y n 撕 1 1 2 控制花药发育的基因 5 中国农业大学碰十学位论文拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 i i 1 ，2 1 花器官发育的经典 阽模型 花器官发育的经典a b c 模型( c l a s s i c a l a b cm o d e l ) 假定花中有a b c 三类的基因活性存在( g n l e r l h e ie n , 2 0 0 1 ，l 耻na n dm e y e r o w i t z , 1 9 9 1 ；l o i r e , , a n na n dw e i g e l ，2 0 0 2 ) 。这二炎基踊作蹦方式为： a 类基因控制第1 、2 轮花器官的发育，其功能丧失会使第一轮的萼片变为心皮，第二轮的花瓣变 成雄蕊。b 类基因控制第2 、3 轮花器官的发育，其功能丧失会使第二轮花瓣变为萼片。第三轮的 雄蕊变为心皮c 类基困控制第3 、4 轮花器官的发育，其功能丧失会使第三轮的雄蕊变为花瓣， 第四轮的心皮变成萼片 为了解释调控花同源异型转变的三类基因，经典- a b c 模型还提出a 、c 两类基因彼此负控制， 也就是说c 类基因突变则a 类基因表达，反之亦然在拟南芥中a 类功能基因包括丘p 冒尉工一j 阻用， 脾；b 类功能基因包括肥，p 1 s t l l l 4 t a ( p i ) ，c 类功能基因含有a o a m o u s “研a p l a p 3 p i j t l 4 g 是m a d s 盒基因家族，而4 蛆是属于植物另一个独立的家族，拟南芥这3 类5 个基因中任何 一个基因的功能丧失或突变都会导致花器官性状的改变。a 类功能基因突变后( 如印f ，a p 2 突变 体) ，c 类功能基因( 如d g ) 就会在第1 ，2 轮花器官中异位表达而b 类功能基闪的表达不受影响， 这样在突变体中。第l 轮花器官只有c 类功能基因作用，发育为心皮，第2 轮花器官由于c ，b 类功 能基因的表达而发育为雄蕊，第3 、4 轮花器官中的基因表达模式不变，仍然发育成雄蕊和心皮， 最后形成的花具有雄蕊和心皮结构；若b 类功能基因活性丧失( 如a p 3 ，突变体) ，则在第2 ，3 车台 花器官中只有a 、c 类功能基因表达而分别发育成花萼和心皮，同时第1 、4 轮花器官的发育不受 影响，分别发育形成花萼和心皮。由此形成的花只有花萼和心皮结构；若c 类功能基因活性丧失 ( 如蜡突变体) ，则在第3 、4 轮器官中有a 功能基因的异位表达，第3 轮花器官由于b 、a 功能基因 作用而发育成花瓣，第4 轮花器官由于a 功能基因异位表达而发育成花萼，从而形成由花萼和花瓣 组成的花：当3 种功能基因全部突变或者a 、c 类功能基因突变而导致第1 、4 轮中没有花器官类别 基因表达时，花器官应该转化成营养叶。 11 2 2 花药细胞分化的分子遗传学分析 在早期的分子生物学研究中液相杂交( s o l u t i o nh y l x i d i z a d o n ) 实验结果表明，在烟草第六阶 段的花药中大约有2 5x1 旷个基周表达；在这些基因中大约有l ox1 旷个基因被推测特异表达 在花药中近些年相似的研究表明大约3 5x1 矿个基因特异表达在拟南芥花药中伍m l a yj c , o o l d b e r gr n , 1 9 8 0 k a m a l a y d o ，g o l d b e r gr b ，1 9 8 4 ) 。在拟南芥的遗传学研究中，大量雄性不育或 雄性败育的突变体被鉴定出来s a n d e r se ta 1 ( 1 9 9 9 】对t - d n a 插入突变和e m s 诱变的拟南芥植株 进行了丈规模的筛选得到了大约9 0 0 抹花粉囊发育缺陷的突变体，并将这些突变体归为九类：早 期花药缺陷、无花粉、花粉发育缺陷、花粉功能缺陷或雄性不育、雄蕊长度异常、不开裂或晚开 裂，花药模式异常、花的育性提高或降低这说明在正常的花药发育过程中可能有上千个基因在 表达，其中有许多是正常的花药或花耪发育所必需的除此之外在玉米中也发现了许多雄性败 育的突变体( c h a u b a lr ，2 0 0 0 ) s p o r o c t t e l e $ s ( s p l ) n o z z l e 口v z 刁基因编码一个具有某些转录因子特征的核蛋白该基 因对花药细胞的早期分裂和分化有重要作用，表明该基因可能是在造孢细胞中而不是孢子体细胞 6 中国农业大学硕士学位论文 拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 i 中发生作用在印肋口突变体的花药中，孢子体细胞发育正常，但是在随后的细胞分化过程中不 能形成小孢子母细胞和花粉壁细胞近来的研究表明g 基因促j 拄s p l n z z 的表达和孢子发生在 一种蛋白合成抑制剂的存在下，a g 基因激活之后s p l 的m 砌峨水平上的活性被激活，说e 聃g 基因 可能是s 兕直接的调节因子( 1 t oe ta l ，2 0 0 4 ) 。 在发现s 兕z z 基因之后，有许多导致花药细胞层分化缺陷的突变体被发现，特别是翻l c e 姆 m a l es p o r o c t t e s i ( e m s l ) ，e x t r as p o r o g e n o u sc e l l s ( e x s ) 基因和t a p e t u m d e t e r m i n a n t l ( t p d l ) 基因( c a n a l e sda 1 ，2 0 0 2 ；z h a og ta t ，2 0 0 2 ；y a n g 甜a l ，2 0 0 3 ) 。e m s l e g s 编码一个富含亮氨酸重复序列的受体激酶，它定位于细胞膜上，而t p d l 编码一个1 7 6 + 氨基酸的 小肽，带有一个假定的分泌性信号肽序列。e m m f x s 和劬妇突变体具有相似的表型：产生大量的 小抱子母细胞，而缺少绒毡层细胞，表明这两个基因参与控制花药中体细胞和生殖细胞的命运。 这两个突变体在表型上的一致性说明它们在同一条发育途径中起作用。 m b j 突变体是最早见于文献报道的拟南芥雄性不育突变体。m a l e , s t e r i l i t y l ( m s l ) 基因的 克隆及序列分析表明，该基因具有p h d - f i n g e r 结构域( p h d - f i n g e rm o t i f ) 在许多生物体中都发现 具有p h d - f m g e f 结构域的蛋白m n g ，2 0 0 3 ) ，尽管他们的作用不同，但都参与转录调节作用。因此 推测 t 盯基因在花药发育过程中起转录调节作用( w i l s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 a b o r t e d m i c r o s p o r e s ( a g s ) 基因编码一个m y c 类的转录因子在a m s 突变体中，小孢子 和绒毡层在减数分裂后就开始降解，因而没有成熟的花粉形成研究表明，a b o r t e d m 1 c r o s p o r e s ( a m s ) 基因所编码的蛋白可能被依赖e x c e s sm a l es p o r o c f t e s l ( e m s l ) ， e x t r a s p o r o g e n o u s c e l i 岱( e x s ) 基因的途径所调控( s o r e n s e n 甜a l 。2 0 0 3 ) 。 a t m y l 3 2 6 是一类r 2 r 3m y b 转录因子，它特异地在绒毡层和表皮毛中表达。饵j 黯i n s e t a 1 ，2 0 0 3 ) m s l 、a m s 和a t m y b l 0 3 都是在e m s i 表达水平最高时开始表达，并且都对绒毡层发育和小 孢子发育至关重要，暗示着它们可能是e m s l 信号转导途径的下游组分，或者受e m s l 信号转导 途径的间接调控( m a ，2 0 0 5 ) 1 2 表观遗传学的研究进展和植物发育 表观遗传学是指在不改变d n a 朐；j j 的情况下，在碱基序列外的各种修饰和与之相关的各种蛋 白质或r n a 的协同作用下，调控基因的表达，以完成生命周期或适应环境变化，而且这套系统还 能在世代之间传递( n a n n e y , 1 9 5 8 ) 表观遗传修饰发生在染色质的两个基本组分上一是针对d n a 中胞嘧啶碱基的甲基化；二是组蛋白不同氨基酸残基( 如h 3 的第4 、9 位赖氮酸) 的各种类型的修饰， 包括乙酰化、甲基化、磷酸化及泛素化各种形式的染色质修饰之间及其与转录调控因子之间存 在着交互作用，以响应细胞内外信号的变化，构成了基因表达的表观遗传调控网络如果表观遗 传调控发生紊乱，正常生命活动就会受到影响 1 2 1d n a 的甲基化 d n a 甲基化n a m e t h y l a t i ) 是真核生物基因组最常见的一种d n a 共价修饰形式，广泛存在 7 中国农业大学硕士学位论文拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 于各种有机体中。它是在甲基转移酶( 甲基化酶) 的催化下将s 腺苷甲硫氨酸( s a d o m e t ，s a m ) 上的 甲基基团连接到d n a 分子的腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上进行d n a 修饰的过程d n a 的甲基化修 饰影响蛋白质d n a 的相互作用，因此在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的 调节作用。如d n a 甲基化与基因的转录失活，尤其是转酆1 0 r a n s g e n e ) 的失活、转座予( t r a n s p o s o n l 的转移失活等多种表观遗传基因( e p i g e n e t i cg e n e ) 的失活存在密切的关系。 1 2 1 1d n a i 羽基转移酶 d n a 的甲基化是由d n a 甲基转移酶( d n am e t h y t r a n s f e r a s 。d n am i 搬滩化完成的原核胞 嘧啶甲基转移酶是由l 阶保守蛋白质组分所构成的单一酶( f i n n e g a n ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。这些蛋白质组 分依次捧列，其间镀非保守的不同长度的序列所分隔。组成i 和x 形成s 腺苷甲硫氨酸辅因子的结 合位点组分上完全保守的脯氨酸上半胱氨酸酸残基形成甲基转移的活化位点在v i i i 和组 分之间的不同区域( 识别区域) ，指导酶识别目的胞嘧啶。 真核生物胞嘧啶甲基转移酶也是一个保守的结构，包括一个碳末端甲基化转移酶区域，含有 原生物1 0 个组分中的8 个在大多数真核生物酶中，该区域与一个大的氨基末端调节区域相连 ( f i n n e g a n ，e ta l 。1 9 9 8 ) 。 d n a 甲基化转移酶通过两种方式对d n a 进行甲基化。一种是维持甲基化它是在甲基化母链 指导下使处于半甲基化的d n a 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化；二是重新甲基 化，即甲基化酶催化母链未甲基化的c 位点，在子链进行甲基化，称为重新甲基化 在植物中有3 种催化d n a 甲基化的酶( v i n n e g a n ，“a 1 2 0 0 0 ) 一种是m e t i 家族，另一种为 染色质甲基化酶( c m t ) ，第三种为重新甲基化酶加盯1 编码的蛋白在结构上相似于老鼠的甲基 化酶d n m t l 。在拟南芥，胡萝b 、豌豆、西红柿和玉米中己识别到m e t l 及其同源物m e t i 家族 的主要功能就是在重复和单拷贝的d n a 序列维持甲基化，但也可能在重新甲基化中起着一定的作 用该酶多在c p g 序列上进行甲基化，但在c p n p g 序列处也可以甲基化d n a c m t 广泛分布于植 物中，为植物所特有该酶在异染色质区甲基d n a ，而且甲基化的序列为c p n p g ，所以认为异染 色质甲基化酶是c p n p g z 核苷酸甲基化酶。重新甲基化酶主要催化c 的重新甲基化，类似于哺乳 动物的d n m t 3 甲基化酶。 1 2 1 2d n a 甲基化在植物生长发育中的生物学意义 1 2 1 2 1d n a 甲基化与植物正常发育 在植物中，d n a 甲基化是植物生长发育所必需的，如果甲基化不足，将会导致生长发育不正 常和表型异常。例如拟南芬d n a 甲基化水平的降低将会引起植株矮化、叶片变小、株成丛状、结 实率降低等( k a k l i m n ic ta l ，1 9 9 6 ；f i n n e g a ne ta l2 0 0 0 ；r o n e m u se ta l ，1 9 9 6 ：j e d d e l o he ta l ，1 9 9 8 ) 。 f i n n e g a n 等和n a k a n o 等将甲基转移酶反义基因m e t l ( m e t l 反义转基因包含一个2 8 k b 的片段，该 片段编码完整的甲基转移酶功能域和大约3 0 0 个氨基酸的n 一端功能域，在反义方向上，与组成型 启动子结合在一起汾别转人拟南芥和烟草中，这些反义植物d n a 甲基化水平较对照显著降低 由于甲基化水平的降低，反义植物及后代营养器官及生殖结构均表现异常，而且不正常的类型和 8 中国农业大学硕士学位论文 拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 去甲基化的程度有关甲基化水平越低，表现出的异常现象越严重反义植物除了外部形态发生改 变外，从营养生长向生殖生长转变的时间也发生改变这说明d n a 甲基化是植物正常生长发育所 必需的，在植物的生长发育进程和其它过程中起着关键的调控作用 1 2 1 2 2d n a 甲基化与植物的春花作用和开花有关 f i n n e g a n 等( 1 9 9 8 ) l l b u m 等( 1 9 9 3 ) 自) t 究春化机理的结果表明：春化促进开花通过d n a 甲基化 的改变发挥作用延长在低温中的暴露时间可促进开花，这是春化作用的效果而用5 一a z a c 处理也 可引起早花( b u r ne ta t , 1 9 9 3 ) ，5 a z a c 是一种去甲基剂，可引起基因甲基化程度的降低，这说明甲 基化水平降低也可以促进开花但对春化不敏感的植物对5 a z a c 的处理无反应。这说明春化和 5 a z a c 处理促进早花的机制是密切相关的反义构建植物引起的甲基化水平降低在无低温处理时 也促进开花( f n n e g a ne ta l , 1 9 9 8 ) ，而且促进开花的效果在同一个反义植物各系中与甲荃化水平降 低的程度呈正相关，证实仅d n a 甲基化水平的降低就足够引起早花，而且甲基化水平降低的程度 与促进开花的效果呈正相关。另外有的实验结果还表明去甲基化和低温促进开花的效果具有加成 性，这说明春化促进开花与甲基化水平的降低有关这个结果也得到t b e m 等( 1 9 9 3 ) 和s h e l d e n 等 ( 1 9 9 9 ) 实验结果的进一步支持说明春化促进开花可能是由于对诱导开花非常重要的基因或基因 启动子的去甲基化引起的 1 2 1 2 3d n a 甲基化在基因组防御中的作用 在原核生物中，为了防止外源d n a 的入侵以及对外源d n a 的利用，生物本身演化出限制酶而 同时又对自己d n a _ i z 相应的限制酶位点进行修饰，也即甲基化，从而使自己d n a 不被自己的限制 酶所破坏，免遭降解，以保护d n a 的完整性。而外来的d n a 容易遭限制醉的切割降解从而起到 对自身的保护作用，抵御外来基因组的干扰。在真核生物中，d n a 的甲基化对基因组的捧列是非 常重要的。d n a 的甲基化可以抑制转座因子和外来d n a 的转录，降低由非等位基因之问的转座和 重组导致的基因组的破坏，并可免遭病原的侵染( m a t z k ee ta l , 2 0 0 0 ) 。 1 2 1 2 4d n a 甲基化与转基因植物的基因沉默 转基因是指所有通过基因工程手段构建、导入受体生物细胞并稳定整合到该受体细胞基因组 中的外源基因是一种用以研究基因的功能，并通过改进某些特性提高植物的农艺性状的重要工 具限制这种改进的一个因素就是转基因时常不能被激活。其原因有二，一种是转录沉默，即引 入基因的r n a 产物被抑制；另一种为转录后沉默，虽然可以进行正常的转录，但转录产物发生降 解，不能在原生质中积累，因而不能进一步表达从所报道的转基因沉默的例子来看，几乎所有 的转基因沉默现象与转基因编码区及其启动子的甲基化有关，转基因植物中d n a 甲基化严重影响 了转基因的正常表达转录水平的沉默与转基因的甲基化有关。尤其是在启动子区域许多研究 表明( f uc t a l ，2 0 0 0 ；g u o e t a l ，1 9 9 9 ；l o u i s e e ta l ，1 9 9 8 ；b o c h a r s te t a t , 1 9 9 2 ) 发生在转基因植 物基因启动子5 端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因虽然转基因的甲基化可延伸至 转基因的3 t 端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的转录沉默的转基因可被5 a z a c 的处理重 新激活但新的研究也表明甲基化不是造成转基因沉默的唯一原因吴刚( 2 0 0 0 ) 研究抗虫转基因 9 中国农业大学硕士学位论文 拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 水稻的基因表达的结果表明，启动子区域部分拷贝的非甲基化不一定能保证转录的正常起始，也 不能保证转基因不发生沉默，非甲基化启动子拷贝的存在仍会造成删6 基因在转基因水稻中发 生沉默；但用去甲基化试剂5 - a z a c 处理可以使转录沉默的c r y l a 6 基因恢复一定的表达活性。这说 明：转基罔水稻c w 翻6 墓罔沉默与基闻启动子发生甲基化有关，但甲基化并不是造成基罔沉默的 唯一原因。基因转录后沉默也与基因的甲基化有关。但不是在启动子区域，而是在编码区。编码 区甲基化是由于转录产生的r n a 指导与其同源的d n a 进行重新甲基化( m a t z k ee ta l ，2 0 0 0 ；v a ne l a l , 1 9 9 7 ；w a s s e n e g g e re ta 1 1 9 9 8 ) ，从而造成基因的转录后沉默。 1 2 1 3d 的去甲基化 作为一种调控方式，甲基化过程必然要求相应的去甲基化过程与之协调来解除甲基化的抑制 作用使沉默基因激活。在胚胎发育期组织特异性基因的脱甲基化可能是由一种酶所催化，也可能 通过碱基或核苷酸切除修复途径实现特定基因的去甲基作用似乎需要特异序列识别机制的参 与序列附近的顺式调控元件在该识别过程中可能起着重要作用。肌母细胞中的a , z 肌动蛋白基因， 巨噬细胞中m 溶菌酶基因及免疫球蛋白k 轻链基因的去甲基化，就是通过这种方式实现的( n e t a l , 1 9 9 8 ) 免疫球蛋白k 轻链基因内含子中的增强子序列及基质结合区( m a t r i xa t l a c l u n e n t y e g i o n m a r ) 与其去甲基化作用相关目前己经在鸡胚中发现一种具有主动脱甲基作用的酶，m ，c 糖墓化酶( 5m e t h y lc d n a g l y o y l a s e ) ( f r e m o n tc ta l ，1 9 9 7 ) ，它可以将o c 从半甲基化的d n a 中脱 去，其催化过程需要双链r n a 参与后者可能通过与d n a 同源互补而起着定位作用，而使d n a 去甲基反应具有基因特异性。去甲基化过程如何激活已失活的基因，就像甲基化如何抑制基因表 达一样，仍是一个有待解决的问题 1 2 ，2 组蛋白的甲基化和脱甲基化 d n a 和组蛋白( 1 1 2 a ，1 1 2 b ，1 1 3 ，1 1 4 ，h 1 ) 以及一些其他蛋白质组合在一起，反复折叠缠绕，形成 了浓集的染色体表观遗传修饰通常包括d n a 甲基化和组蛋白修饰及r n a 修饰，而组蛋白修饰有 组蛋白乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化，修饰部位大多位于组蛋白n 端这些修饰可影响组蛋白 与d n a 的亲和性而改变染色质的状态，也可以影响转录因子与d n a 序列的结合，对基因表达调控 具有类似d n a 遗传密码的作用，故被称作。组蛋白密码” 组蛋白甲基化是指发生在h 3 和h 4 组蛋白n 端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲 基转移酶介导催化组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、x 染色体失活和 转录调控方面目前发现2 4 个组蛋白甲基化位点，其中1 7 个位于赖氨酸，其他7 个位于精氨酸赖 氨酸可以是单甲基化、双甲基化和三甲基化，精氨酸也可以是单甲基化或者双甲基化如果把这 3 种甲基化状态都考虑在内，应该一共有3 x l o ”种组蛋白甲基化组合状态，复杂的组合为组蛋白甲 基化发挥功能调控作用提供更大的潜能以往认为组蛋白甲基化是稳定的表观遗传标志，但组蛋 白去甲基化酶的发现，使这一观点面临巨大挑战。 1 2 2 1 组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶 s u ( v a r ) 3 9 蛋白是在果蝇中发现的第一个组蛋白赖氨酸甲基转移酶，具有保守s e t 结构域， 1 0 中国农业大学硕士学位论文拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 该结构域包含约1 1 0 个氨基酸，是植物核酮糖二磷酸羧化酶一加氧酶中大亚基甲基转移酶( l s m t s ) 的一部分在哺乳动物中与s u ( v a r 3 9 类似的酶是s u v 3 9 h 1 和s u v 3 9 h 2 ，在酵母中与s u ( v a r ) 3 - 9 类似的是c l r 4 。以上这4 种酶只催化h 3 k 9 甲基化，而哺乳动物中另一种甲基转移酶g 9 a 不仅可以 催化h 3 k 9 甲基化，还可以催化h 3 k 2 7 甲基化为了发现更多的甲基转移酶，利用结构分析的方法， 对目前已知的蛋白质结构进行比对，发现s e t 结构域相关的蛋白质可以分为四个家族：s e t l ，s e t 2 , s u v 3 9 。r i z 。这些家族中有不少都具有组蛋白甲基转移酶的功能，其中不同的酶催化不同赖氨酸 位点的甲基化反应( 1 b n y k , 2 0 0 2 ) 目前为止，己发现了数十种赖氨酸甲基转移酶和两大类蛋白质 精氨酸甲基转移酶( p r o t e i na r g i n i n cm e t h y l t r a n s f e r a s e ，p r m l 第一类p r m t 催化形成单甲基精氮 酸和非对称的双甲基精氨酸；第二类p r m t 催化形成单甲基精氨酸和对称的双甲基精氨酸。p r m t 家族包括p r m t l ，p r m t 3 ，r m t l h m t l ，p r m t 4 c a m r l , p r m t 5 其中只有p r m t 5 属于第二类， 其余都属于第一类 除了存在组蛋白甲基转移酶以外，s h i 等( 2 0 0 4 ) 首次发现了去甲基化酶先前人们认为组蛋白 的甲基化作用是稳定而不可逆的，但这种去甲基化酶的发现使组蛋白甲基化过程更具动态性赖 氨酸特异性去甲基化酶i ( l s d l ) 是特异性作用于h 3 k 4 位点的去甲基化酶。它只能作用于单甲基化 或者双甲基化，对于三甲基化无能为力该去甲基化酶是一种单胺氧化酶，通过氦基氧化作用生 成甲醛和去甲基化的精氨酸残基达到去除甲基的目的但奇怪的是l s d l 并不是一个大家族中的 一员，也没有明显的类似物，而且它只针对h 3 k 4 位点甲基化发生作用，那么到底该酶是否还存 在其他功能还有待进一步研究。哺乳动物中组蛋白精氨酸的去甲基过程比较特殊，主要是利用 p e p t i d y l a r g i n i n ed c i m i n a s c4 ( p a d 4 ) 酶催化精氨酸转变为瓜氨酸，使p r m t 等精氨酸甲基转移酶失去 作用位点而达到抑制甲基化反应的目的同样，p a d 4 也只催化单甲基化的精氨酸，对双甲基化 无效某些疾病，特别是自血病和结肠癌，初步被认为与错误的甲基化有关，因此组蛋白的脱甲 基能够为科学家提供一个诱人的药物治疗标靶 1 2 2 2 组蛋白甲基转移酶的结构特征 通过对小鼠中p r m t 3 的晶体学研究发现这种酶有以下两大特征( z h a n gc t a ，2 0 0 1 ) 以) v 砌w r 3 的整个核心结构可分为两个区域：a d o m e t - b i n d i n g 结构域t t 口s a r r e l - l i k e 结构域 ( 2 ) 酶的活性位点位于两个区域形成的深沟中在酵母中，对h m t i 的晶体学研究也发现其单体结 构与p p m t 3 的相似( w e i s se ta l ，2 0 0 0 ) 。这些结果尽管显示p r m t 家族中的蛋白质各不相同，但它们 可能都包含一个保守的催化核心区，并且用相似的机制催化底物，家族内各成员的不同可能表现 在非保守区域。前面曾说过催化赖氨酸( b s ) 甲基化的酶被通称为含s e t 结构域的家族。s e t 结构 域是一个包含约1 1 0 个氨基酸的基序，它是未知生化功能但与染色质紧密联系的蛋白质中的一部 分，也是植物核酮塘二磷酸羧化酶一加氧酶中大噩基甲基转移酶0 - s i t s ) 的一部分( t f i e v e ie t a l , 2 0 0 2 ) 有些含s e t 结构域的酶，在s e t 结构域两侧富含的半胱氨酸被称为前s e l 域( p r e - s 盯) 和后s e l 域( p o s t - s e t ) ，有研究表明这两个区域对于组蛋白赖氨酸甲基转移酶的催化活性并不是必 需的，因此，s e l 域是该类型酶的标志性的结构域。 1 2 2 3组蛋白甲基转移酶的功能 1 1 中国农业大学硕士学位论文拟南芥中组蛋白脱乙酰化酶抑制因子的筛选和遗传分析 i p r m t l 最初是以t i s 2 1 ( i m m e d i a t e - - e a r l yg e n e ) 和b t g l ( a n t i p r o l i f e r a t i v ep r o t e i n ) 为诱饵蛋白通过 酵母双杂发现的( i j ne ta l ，1 9 9 6 ) 。有研究证明p r m t l 可以通过甲基化核心组蛋白来参加转录调控。 w a n g ( 2 0 0 1 ) 和1 s t r a h l ( 2 0 0 1 ) 等用质谱法和“h 4 - r 3 的特异抗体研究表明h 4 - r 3 是p r m t i 基转移酶的 一个特异识别位点。此外，w a n g ( 2 0 0 1 ) 等发珊4 一r 3 的甲基化有利于p 3 0 0 乙酞化组蛋白h 4 。这个 发现为k o h ( 2 0 0 1 ) 等发现的p i 瑚t 1 为核激素受体的辅激活子提供了分子水平上的证据。 p r l l t 4 c a m r l ( c o a c t i v a t o r - a s s o c i a t e da r g i n i n em e t h y l t r a n s f e r a s e l ) 是以p 1 6 0 家族的成员g r l p l 的c 端区域为诱饵进行酵母双杂时发现的( c h e r te t a l ，1 9 9 9 ) 。c h e r t 等发现p r m t 4 c a m r i 优先甲基化体 外组