果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）.doc

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）摘要：从1934年人们发现果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）活性开始，经过几十年的探索研究，现在人们对FBA了解越来越透彻，发现了FBA在不同生物中，其分布，活性中心，结构，功能都具有差异性，并且FBA在生物体中具有重要的生物学功能。此外，人们已经可以利用不同生物中的FBA基因构建工程菌进行FBA的大量生产，并且可以对其产量和活性进行检测和优化。将下来本文将综述近些年来人们对FBA的研究进展，检测FBA活力的方法，和FBA活性中心的研究等。关键词：果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）；FBA在生物体内的作用；FBA活力检测方法；FBA活力1. 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的研究进展果糖-1,6-二磷酸酸缩酶(FBA, EC 4.1.2.13),系统命名为D-果糖-1,6-二磷酸D-甘油酸-3-磷酸裂合酶,简称醛缩酶(Aldolase, ALD)。酸缩酶活性最早于1934年被Meyerhof等人发现1。根据作用机制不同可将其分为类I类FBA和II类FBA2。I型FBA主要存在于真核生物中,动物和高等植物中的FBA均为I型3, 这类果糖 1, 6-二磷酸醛缩酶在底物的羰基和自身活性部位的赖氨酸之间形成一个以Schiff键为基础的中间物4。I 型FBA由同源四聚物组成，硼氢化物能抑制其活性。I 型果糖 1, 6-二磷酸醛缩酶蛋白质的三级结构中存在一个典型的保守结构域：TIM barrel, 这个结构域第一次是在磷酸丙糖异构酶中发现，形状似桶，故简称为 TIM barrel结构域。TIM barrel 是一个保守的蛋白质折叠形式，由8个-螺旋和 8个-折叠交替在蛋白质主肽段上出现，因而也称（/）8-barrel folds。而 II 型FBA则存在于真核绿藻，真菌以及原核细菌5。与 I 型不同的是，II 型果糖 1, 6-二磷酸醛缩酶催化裂合反应的时候不会形成酶-底物中间物，而是需要一个二价的过渡态金属离子如 Zn2+5。II 型FBA的三级结构和I 型FBA一样，都是（/）8-barrel 结构。II 型FBA由同源二聚体构成，并依赖二价金属阳离子，故金属离子螯合剂（ EDTA） 能够抑制其活性6I 型和 II FBA不论是在基因的序列上，蛋白质的结构上以及对化学反应的催化机理上，都不存在同源或相同的地方，因此两者被认为具有独立起源，相互独立的蛋白家族。II 型FBA主要有两条肽链组成，不同的生物中其构型也不相同。此外，型FBA和II 型FBA还可以进行细分，其中，型FBA 具有两种同工酶；细胞质醛缩酶（cFBA） 和叶绿体醛缩酶（CpFBA）。人们从1967年开始研究植物 FBA 的生物化学特性，已经陆续从菠菜、 小麦、 水稻、 玉米等植物中纯化出 FBA。而II 型FBA可以根据氨基酸序列的同源程度近一步划分为A型和B型7，目前人们已经从各类细菌中分离纯化出FBA，并且可以利用细菌中的FBA构建工程菌，进行FBA的大量生产。2、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）在生物体内的作用FBA的是一个糖酵解过程中催化FDP分解成二羟丙酮磷酸和三磷酸甘油醛的酶 。在生物中FBA被分为两大类，一类是存在于高等动物，植物等真核生物中的I型FBA，另一类是存在于原核生物、真菌和大部分细菌体内的II型FBA。因此两类FBA在不同生物中参与和发挥的作用必然是不同的。2.1 I型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（I型FBA）在生物体内的作用对I型FBA的研究对象主要是植物和动物，主要认为其在生物体内在糖酵解和糖异生途径中发挥作用8。在植物中植物体中的FBA均属于I型，其结构为四聚体蛋白，但是至少存在两种异构形式9。它们是由具有一定同源性的不同的基因所编码，因此蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性，但也有各自的特异性。FBA在糖酵解、糖异生以及卡尔文循环中的作用很早就已经阐明了，但是越来越多的研究发现，FBA还具有着自己的“第二职业”。它还可作为一个蛋白质分子不依赖于其自身的酶催化活性参与细胞内多种生物学反应，也可能作为信号分子介导细胞内复杂的信号传导过程。植物中的FBA的“第二职业”作用近年来也越来越多的被人们发现。在植物体内果糖、葡萄糖和蔗糖是FBA代谢途径的产物/底物，目前被认为是重要的糖信号分子。目前有文献报道FBA在糖信号、激素和胁迫响应过程中具有重要的功能。例如FBA定位于胡杨细胞质中其果糖-1,6-二磷酸醛缩酶通过促进糖酵解和有氧呼吸途径来提高植物对盐胁迫的适应性；在小麦生理型与遗传型雄性不育中理型雄性不育系和遗传型雄性不育系FBA基因表达量在幼穗期和单核期均下调，而对应同时期的 FBA 酶活力也下调，而遗传型不育系FBA基因在三核期表达量和FBA 酶活力均上调，揭示了FBA影响了小麦花药的育性程度；对拟芥南细胞质FBA和叶绿体FBA两个酶家族成员的进化关系、表达模式和初步的功能进行了探究；对紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因全长克隆及分析发现，MsALD（紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因全长）基因编码的氨基酸与红三叶草、马铃薯、烟草等的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列一致性高达90%以上,确定其属于I型FBA。半定量RT-PCR分析表明,MsALD基因可能与紫花苜蓿抗盐机理相关；此外还有文献报道I型FBA还可能参与植物激素的调节和细胞中信号的转等10-13。但是FBA在植物中参与这些生理活动的机理还没有更深入的研究，相关的文献报道也比较少，有待进一步的研究。2.2 II 型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（II型FBA）在生物体内的作用II 型FBA真核绿藻，真菌以及原核细菌中，II 型FBA可以根据氨基酸序列的同源程度近一步划分为A型和B型，虽然两类FBP醛缩酶的共享相同的整体折叠和催化相同酶促反应，但是它们既不具有重要序列的同源性，也没有共同的催化残基，并且他们的活性位点也不相同，这表明A型和B型的FBA是独立演进而来的7。其中 A 型的FBA其结构为二聚体蛋白，主要是负责糖酵解和糖异生的过程；B 型的FBA其结构一般是二聚体蛋白但也发现四聚体蛋白和把具体蛋白结构的存在，其功能具有一定的多样性，可以参与多种不同的代谢过程同时具有一定的底物特异性14。酿酒酵母、大肠杆菌以及结合分支杆菌中的FBA为A型。其中有文献报道，鱼腥草中果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶确实为II型FBA并且在 Calvin循环中固定 CO2后的第一个催化由 3C化合物转化为 6C化合物的酶, 处于第一个分支点上, 也是控制光合碳同化速率的重要酶之一15；弓形虫中的II 型FBA可能在在弓形虫速殖子入侵中发挥作用20；在白色链球菌中通过收集侵袭性白色念珠菌病人血清,用重组FBA包被ELISA微孔板,测定血清中的抗FBPA1抗体,与健康体检者、细菌感染者相比具有明显的统计学意义,说明人抗果糖二憐酸醛缩酶抗体对侵袭性白色念珠菌在早期诊断中有潜在的诊断价值。此外，在肺结核分支杆菌中的FBA可能与致病有关7。也有学者通过过检测果糖二磷酸酸缩酶快速诊断症疾的测验。有此可见，目前人们对人们对II 型FBA的研究主要集中在利用II 型FBA作为治疗很多由寄生虫或者细菌所引起疾病的候选疫苗和药物靶点。II 型FBA中的A型比较了解，并且从大肠杆菌中分离提取了II 型FBA中的A型。这种类型的FBA的 每个亚基的多肽折叠成对应的桶状结构，活性部位位于桶状结构的C-末端还包含了一个阳离子和两个Zn2+结合位点。有文献说B型可以以不同的二价金属阳离子作为辅因子18。总之，II 型FBA在生物体内必须的，除了扮演裂解FBP的角色外，往往还有一些其他生物学上功能。3、FBA活力检测方法FBA的的活力也是人们一直关注的研究，人们一直在摸索PH、温度、催化剂等不同的条件对FBA活力影响，以及在不同物种内的FBA活性最适环境师傅具有普适性。如今，人们植物和某些细菌体内FBA的活性条件进行了初步探索。目前，人们已经可以从不同植物或细菌中克隆FBA的基因并构建工程菌15。人们在生产研究FBA的同时， 对于FBA活性的测定方法也一直在优化和探索， 目前主要有两种测定方法：一种是根据FBA催化FBP分解为磷酸二羟丙酮与三磷酸甘油醛的过程中 NADH被氧化的量来计算酶活性16另一种是根据 可逆催化二羟丙酮磷酸与三磷酸甘油醛合成FBP的量计算酶活性17。对 FBA酶活性的测定原理是基于它催化FBP分解与合成的可逆步骤。还有常见的醛缩酶活力测定试剂盒，其原理是FBP在 FBA 的作用下，产生3-磷酸甘油醛后， 通过磷酸丙糖异构酶和甘油磷酸脱氢酶系统，将NADH 转化为NAD， 可以通过测定NADH 在340nm下的吸光值变化来定量分析FBA的总活性。此外，谢里万诺夫在前人的基础对FBA的活力检测进行了改进 。测定原理是酮糖可以与谢里万诺夫试剂作用生成鲜红色复合物， 此物质在520nm处有吸收峰。在 FBA的作用下，二羟丙酮磷酸与三磷酸甘油醛可逆合成FBP，FBP 属于酮糖，与谢里万诺夫试剂反应生成红色产物，测定 OD520， 通过标准曲线得到生成FBP的量， 就可以计算出FBA的酶活性19。4、问题与展望从1934年人们发现FBA 的活性至今，人们已经对FBA的了解更加深入，总结一下包括一下几个方面。首先，人们发现不同生物体内的FBA的类型是不同的 ，一种是I型FBA主要存在于真核生物中,动物和高等植物中,另一类是II 型FBA主要存在于真核绿藻，真菌以及原核细菌中。并且这两种类型的FBA在不同生物体内还可以细分。其次，人们还探究了这两种FBA的活性中心，I型FBA的活性中心是以自身活性部位的赖氨酸和底物的羰基会形成中间物，而II 型FBA的活性部位位于其亚基多肽链的C-末端，还依赖二价金属阳离子的催化。同时人们也对这两种FBA的结构和三维模型进行了探究。再次，人们发现这两种类型的FBA除了具有分解FBP的功能外，在特定的生物体内还扮演者“第二职业”的角色。另外,大部分醛缩酶对于其亲核性的供体具有高度的专一选择性,而对亲电性的受体的选择性并不高。因而,醛缩酶作为一种很有前景的生物合成剂引起有机化学研究者的极大兴趣。最后，人们对测定FBA活力的方法也进行了探究。但是由于不同生物体内FBA活力影响条件不同，人们关于FBA活力最适环境的探究较少。我觉得目前可以对我们实验室生产的II 型FBA的活力最适环境进行探究，可以从。温度、PH、二价阳离子的种类和浓度等条件进行探究，以期在生产应用中发挥更大的作用。参考文献：1 Meyerhofo, Lohmann K. 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