全身用药的毒性研究

第二十章全身用药的毒性研究,第一节急性毒性试验,一、概念和目的,（一）急性毒性实验是指机体（实验动物）一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒作用甚至死亡的中毒效应。观察指标主要是死亡效应，还包括一般行为和外观改变、大体形态变化。,主要目的：,1了解新药急性毒性的强弱以半数致死量LD50为例，化合物的LD50越小毒性越强。治疗指数：是指LD50与半数有效量ED50间的比值。新药研究早期主要用治疗指数来衡量候选化合物的安全性，治疗指数至少大于10，才具有进一步作其他新药临床前研究的价值。安全系数：是指基本无害剂量LD5与基本有效剂量ED95之间的比值，比值越大越安全。,2为长期毒性和特殊毒性试验的剂量设置提供依据3获取新药毒性反应信息4新药研制过程中，工艺路线尚未定型时，对产品除了理化性质分析外，还可通过LD50值的比较，观察生物效应的显著差异，以明确试验产品的质量。此外，研究复方制剂新药时，还应判断配伍后与单药应用的毒性大小的差别。,（二）需注意的几个问题：1.急性接触一次：在经口、经注射途径染毒时，是指瞬间给予实验动物染毒；对于经皮、经呼吸道染毒，则是指在一段规定时间内使实验动物持续接触毒物；多次（24h内）：当外源化学物毒性很低时，一次最大染毒尚不足以充分了解其急性毒性作用的特性，从而在24h内多次染毒。,2.中毒效应出现的时间/特征急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。观察时间：一般为7-14天，如有必要可延长至14天以上。注意：急性指的是接触，而不是效应,3.中毒效应的强度与亚慢性、慢性中毒相比，中毒症状严重，常发生死亡。,常用急性毒性评价参数,绝对致死剂量或浓度（LDl00，LCl00）：指试验中引起一群实验动物全部死亡的最低剂量和浓度。半数致死剂量或浓度(LD50，LC50)指药物能引起一群实验动物50死亡所需的剂量或浓度。最小致死剂量或浓度(MLD，MLC)：指试验中引起一群实验动物中仅个别动物死亡的剂量或浓度。最大耐受剂量(MTD，LC0)：指实验中动物不引起死亡的最大剂量或浓度。,二、基本内容,急性毒性试验的设计，应根据化合物的结构特点、理化性质、适应证特点和试验目的等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其他药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。急性毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复。,急性毒性实验的基本内容,实验动物的选择受试物处理及染毒方式的选择染毒剂量与设组观察周期，观察指标的选择计算方法和评价,(一)实验动物的选择,BALB/c小鼠C57BL/6小鼠BALB/c-nu裸小鼠,SD大鼠金黄仓鼠豚鼠,啮齿类动物：是哺乳动物中种类最多分布范围最广的一个类群上下颌只有一对门齿，门齿无根，能终生生长。,-种属和品系,兔,非啮齿类动物：,犬猴猪,2.常用实验动物的物种和品系首选哺乳动物哺乳动物中首选大鼠、小鼠若规定用两种物种：啮齿类：大鼠、小鼠非啮齿类：犬或猴根据不同接触途径，选择不同的物种,急性毒性试验所用大鼠的品系以SD、Wistar为主；,小鼠则以昆明种、NIH、ICR为多,豚鼠，皮肤致敏试验首选,兔，眼刺激试验首选,Beagle犬,猕猴,-微生物学等级和饲养环境,-微生物学等级和饲养环境,普通动物（CV,Conventioalanimals）是未经积极的微生物学控制，普遍地饲养在开放卫生环境里的动物。垫料和食物不经高压消毒，饮水为自来水。鼠应排除肺炎病毒，沙门氏菌和链球菌，地鼠不应有蛲虫。普遍动物只能供一般性实验，不适用于研究实验。,清洁动物（CL,Cleananimal)除普通动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和影响科学研究的微生物。垫料、饲料、用具等均应经过高压消毒。鼠盒上带过滤帽，空气亦应经过一定的过滤，工作人员穿干净服装操作，此类动物的微生物控制标准基本与SPF相同，不同之处为血清病毒抗体检查（脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒）经常可检出一定滴度的抗体，但不允许出现临床症状和脏器的病理变化和自然死亡。,无特殊病原体动物Specificpathogenfree(SPF)animal简称SPF动物。非特定的微生物和寄生虫是不允许存在的，故其实际上就是指无传染病的健康动物。由于用疫苗和药物进行预防及治疗，或用淘汰带菌动物来作出SPF动物的方法并不实用（既浪费时间，又难保确实除去病原）。故一般大多先培育出无菌动物或悉生动物后，再把其转移到有封闭系统（BarrierSystem）的设施中饲育繁殖。原则上SPF动物室内是不允许存在病原菌。,无菌动物（Germfreeanimals）是指机体内外均无任何寄生物（微生物和寄生虫）的动物。此种动物在自然界中并不存在，必须用人为的方法培育出来。其法：一般将临产前的健康动物用麻醉药品或颈椎臼法处死后，立即浸泡在37灭菌液中，送进无菌室（或无菌隔离器），按无菌手术进行剖腹，切除带胎子宫（子宫内首先应无菌），将其浸入消毒液里并输送到另一隔离器中，切开子宫取胎，经用灭菌纱布揩拭仔体并断脐（电刀切断）后，放隔离器内人工喂乳或用其它品系的无菌母鼠作保姆供养。,悉生动物（Cnotobiotesanimals）是指机体内带着已知微生物（动物或植物）的动物。此种动物原是无菌动物，系人为的将指定微生物丛投给其体内，例如使大肠杆菌定居在无菌小鼠体内，在进行微生物检查时，仅能检出大肠杆菌。亦有人工投给二种以上的已知微生物。悉生动物一般分为：单菌（Monoxenie）双菌（Dixenie）三菌（Trixenie）多菌（Polyxenie）,（2）按遗传学控制分类相同基因类型近交系是采用兄妹交配（BXSbrothersister）或亲子交配（PXOparentoffspring，父母与子女交配），连续繁殖20代以上而培育出来的纯品系动物。一般以小鼠为典型代表。优点：基因纯正缺点：价格昂贵，抵抗力差,突变系动物（Maiantstrainanimals）是保持有特殊的突变基因的品系动物，也就是正常染色体的基因发生了变异的、具有各种遗传缺陷的品系动物。生物在长期繁殖过程中，子代突变发生变异，其变异的遗传基因等位点可遗传下去，或即使没有明确的遗传基因等位点，但经过淘汰和选拔后，仍能维持稳定的遗传形质。,nude小鼠,先天性无胸腺,杂交群动物（Hybridanimals）,也称杂交一代动物或系统杂交动物。是指两个近交品系动物之间进行有计划交配所获得的第一代动物。简称F1动物。一般只用子一代F1，有时也用子二代F2。例如由C57BL/6J和DBA/2小鼠交配后培育的第一代为DBF1或D2B6F1，C57L/J和A/He交配后的第一代为LAF1。最理想的品系：基因纯正，杂交优势,封闭群动物（Closedcolonyanimals）是指一个动物种群在五年以上不从外部引进其他任何品种的新血缘，由同一血缘品种的动物进行随意交配，在固定场所保持繁殖的动物群。一般对群的大小、封闭年月、繁殖结构等均有明确的规定。一般至少连续繁殖4代以上。常见有：NIH小鼠、ICR小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠、Harley豚鼠和新西兰兔等。毒理最常用的品系：基因较纯，抵抗力强，经济，易获得。,*尽量选择毒性反应与人近似的动物；*易于饲养管理、试验操作方便的动物；*繁殖生育能力较强，数量较大能够保障供应；*价格较低，易与获得的动物。,总原则：,实验动物的性别、年龄、体重和数量要求刚成年、健康未曾交配和受孕的动物。其目的是尽量保持实验动物基本条件的一致，减少实验误差。同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20%。性别通常要求雌雄各半，但要视具体实验要求而定动物。分组应严格遵循随机化原则。,实验动物年龄和体重有较好的相关性,大鼠小鼠出生体重5-6g1.5g45天龄约180g约18g成年(2月龄以上)180-240g18-25g,实验动物的预检疫目的为：一是让外购来的实验动物适应本试验室条件，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响；二是筛检健康等不符合试验要求的动物。,实验动物的给药前禁食处理如采用经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰，因此在试验给药前应作禁食处理。隔夜禁食,(二)剂量与分组,LD50测定方法：通过预试找出0及100接近致死剂量正式试验，小鼠一般分46个剂量组，各剂量组距一般为0.65-0.85等比级数为宜，每组10只。对于非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，给药剂量没有必要达到致死水平。给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性(危及生命的)剂量，同时设空白和(或)溶媒(辅料)对照组。,(三)给药途径和给药容积,两种以上给药途径，其中一种必须推荐临床用药的途径。对溶于水的药物必须测定静脉注射的LD50。除非实验动物上无法进行时，则作特殊说明。可用别的给药途径。给药容积，各组动物一般用不同浓度同体积给药。常规给药体积小鼠为0.2-0.4ml/10g，大鼠1-2ml/100g，特殊情况另作说明。明确注明给药时间。,1.一般观察7-14天观察和记录内容主要包括5个方面：1).死亡效应：死亡数是计算LD50的依据，一般情况下，剂量越大，死亡时间越短，呈负相关2).中毒体征及发生过程3).涉及的器官和系统4).不同化学物出现的毒性症状5).动物毒性的发生规律,（四）试验期限及观察指标,对死亡动物进行大体解剖，观察有无充血，水肿等病理现象。如有改变须取材做病理切片。对存活动物观察期结束后也进行解剖检查。,2.病理检查及其它指标,3.观察时间和周期,高剂量组动物染毒后常在数分钟或数十分钟内出现死亡，染毒后应立即开始观察动物的中毒表现和死亡情况。给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直到试验周期结束。,经典急性致死试验设计流程图,三计算方法和评价用统计学方法计算LD50的值及其95%可信区间。药物毒性分级评价：现行的分级标准是以LD50值为基础划分的，而各国际组织以及不同的国家都自行制订了分级标准，至今尚无完全统一标准。,计算方法,LD50的计算方法寇氏法改良寇氏法霍恩氏法MTD计算法近似致死量法固定剂量法上下法积累剂量设计法,中国食品毒理急性毒性分级法,急性毒性分级大鼠一次经口LD50大致相当于体重70kg人的致死剂量6级(极毒)：15000mg/kg1050克,LD50大，说明化学物的毒性低，是安全的,？,1.LD50相近，但是毒性特征、毒作用带或致死剂量范围可明显不同；,急性毒性试验的局限性：结果不能作为全面反映受试物毒性的特点，同时还须进行长期毒性以及其他特殊毒性试验，以便有较全面的认识。,用LD50来描述急性毒性需全面描述中毒体征及程度、出现体征的时间、死亡前征兆、死亡的时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化等。,2、死亡为观察指标，仅作为初步判断。其变异依赖多种因素影响，即同样品系在不同实验室其结果差别大，从分级亦可看出。,第二节长期毒性试验,一、概念和目的,长期毒性试验(反复给药毒性研究)：是指动物反复多次接触药物所引起的毒性反应。目的是通过重复给药的动物试验表征受试物的毒性作用，预测其可能对人体产生的不良反应，降低临床受试者和药品上市后使用人群的用药风险。,49,给药的期限不同,给药的剂量范围不同,观察的毒效应不同,长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别,2019/12/4,50,长期毒性试验的目的,二、试验内容,一、试验原则二、实验动物三、分组、给药剂量及周期四、观察指标五、结果处理,2019/12/4,52,（一）一般原则和要求,基本原则,全面、严谨、合理,整体性,随机、对照、重复,2019/12/4,53,（一）一般原则和要求,基本原则,整体性,长期毒性试验不能与药效学、药代动力性和其他毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其他药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性试验的结果应该力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。,2019/12/4,54,（一）一般原则和要求,总体原则,选用两种实验动物,三个剂量,给药途径应与临床拟用途径相同,(一)实验动物,长期毒性试验应至少在两种动物以上，包括啮齿类和非啮齿类，啮齿类主要是大鼠，非啮齿类为犬如计划生育用药，应选择猴或其他大动物。大鼠体重要求在68周龄，试验周期3个月以上则选56周龄。每组试验体重差异不应超过平均体重的20。犬，如beagle犬一般用4-9月龄，性别要求为雌雄各半。,(二)受试药物和给药途径,对受试药物应注明药名，批号，来源，规格，纯度，理化性质，保存条件及配制方法。理想的受试药物应与药效试验，一般药理，急毒，致突变，生殖，药代有相同质量标准，对所用溶剂应注明规格，来源，批号。给药途径原则上与临床用药途径一致,(三)分组，给药剂量及给药周期,分组，一般设三个剂量组和一个对照组高剂量组原则上要求使动物产生明显或严重毒性反应，甚至个别动物死亡，但死亡动物数不应超过20，目的是为寻找毒性靶器官，毒性反应症状及临床抢救措施提供参考依据。中剂量组要求动物产生轻微的或中等的毒性反应，一般应高于药效学试验的高剂量组低剂量组应当略高于动物有效剂量而不出现毒性反应，目的是寻找动物安全剂量，为临床剂量的设计提供依据。,根据不同的临床用药周期，决定动物长毒试验的周期，以一个临床治疗疗程为一个临床用药周期。临床用药1-3天的药物，动物试验给药周期为1个月；临床用药1周的药物，动物试验给药周期为1个月；临床用药4周的药物，动物试验给药周期为3个月临床用药3月的药物，动物试验给药周期为至少半年以上。对于临床3个月内长期毒性试验必须每天给药一次，但对于3个月以上的毒性试验，每周可给药6次。每天给药最好是固定时间。,限度试验，如小鼠急性毒性试验毒性很低，测不出LD50或口服给药剂量大于5g/kg，注射给药剂量大于2g/kg，也未见明显毒性反应，可设大鼠高剂量组为拟用于临床剂量的50倍，犬的高剂量组为拟临床用量的50倍。,(四)观察指标,动物长期毒性试验观察指标主要有：1一般观察进食量、体重、外观体征和行为活动、粪便性状等，发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养，重点观察以避免被其他动物吃掉。发现死亡或濒死动物应及时尸检。,2检测项目(1)血液学指标：红细胞计数、网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血时间、平均红细胞血红蛋白浓度，平均红细胞血红蛋白、平均红细胞容积。(2)血液生化学指标：天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(W)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(Grea)、总胆固醇(T-CHO)、肌酸磷酸激酶、甘油三酯、非啮齿类动物还有7谷氨酰转移酶、K+、Na+、Cl-指标。对于血液学和生理指标，还需重点观察网织红细胞，丙氨酸氨基转换酶，总胆红素，血糖，尿素氮，总蛋白等。,(3)系统尸解和病理组织学检查系统尸解：应全面细致，发现异常器官应重点进行病理组织学检查。脏器称重合脏器系数：剖解后取出脑、心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸腺。,病理组织学检查：高剂量组、对照组动物及尸检发现异常器官检查要仔细。其他剂量组可取材保存。在高剂量组发现有异常病变时才进行检查。检查内容：心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、垂体、前列腺、胸腺、睾丸(连附睾)、卵巢、子宫、胃、十二指肠、回肠、胰腺、膀胱、食管、气管、主动脉、乳腺、脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、骨髓、视神经、坐骨神经、淋巴结(包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结)、给药局部。非啮齿类动物还需进行唾液腺、胆囊、乳腺等组织病理学检查。,非啮齿类动物除了上述的指标外，还应进行还应进行体温、心电图、眼科检查和尿液分析(尿液外观、比重、pH值、尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、酮体和尿液沉渣的显微镜观察)。,3可逆性观察最后一次给药后24小时，每组活杀部分动物(2/3-1/2)，检测各项指标，余下动物停药，继续观察2-4周。,4指标观察时间一般状况和症状的观察，每天观察一次。每周纪录饲料消耗和体重一次。试验周期在三个月内的，一般在最后一次给药24小时和恢复期结束时各进行一次各项指标的全面检测。必要时，在试验中间检测指标一次。试验周期在三个月以上的，可在试验中期活杀少量动物(高剂量组和对照组)全面检测各项指标。对濒死或死亡动物应及时检查。,应根据试验周期的长短和药物的特点确定检测时间和检测次数。原则上应尽早发现毒性反应，并反映出观测指标或参数的变化与给药时间的关系。犬的长期毒性试验除了上述指标外，还应包括体温、心电检查、尿常规检查。,(五)结果处理,软件计算，分析各项指标与空白对照之间是否具有差异性,第三节制剂的全身毒性试验,一、静脉注射制剂的全身毒性试验,根据我国药政部门的规定，静脉注射制剂必须进行全身毒性试验，又叫常规安全性评价。血管刺激性试验体外流血试验过敏性试验热原试验等。,(一)血管刺激试验,目的：观察受试静脉注射剂经多次静脉给予后对血管刺激的情况。方法：取6只家兔，在试验开始前预先饲养一周以观察动物活动表现。将家兔随机分成2组，每组3值，一组为受试药物组，另一组为生理盐水组。观察家兔耳静脉注射后血管的刺激反应情况，肉眼观察是否出现明显的肿胀、充血和坏死等刺激症状。生理盐水组注射等量生理盐水，每天一次，连续三天。在第四天取家兔耳注射部位和向前5cm部位的血管组织作病理切片检查。以病理组织等检查结果判定受试药物有无血管刺激作用。,(二)体外溶血试验,目的：观察静脉注射剂是否发生溶血现象。方法：(1)制备2红细胞悬液：取家兔颈动脉血l0ml，除去纤维蛋白，反复离心洗涤后，用生理盐水配成2红细胞悬液供试验用。(2)取试管7支，按表顺序加入药物及其他试剂，1、2、3、4、5管加不同剂量的受试药，6管加2.5ml0.9%氯化钠注射液，作为阴性对照，7管加2.5ml蒸馏水，作为阳性对照。摇匀后，用封口胶纸将试管口封好，置37恒温水浴，保温4小时。,体外溶血加样表,(3)结果观察：1小时前每30分钟观察一次，1小时后每小时观察一次，共观察4小时。全溶血：溶液澄明，红色，管底无红细胞残留。部分溶血：溶液澄明，红色或棕色，底部尚有少量红细胞残留。镜检红细胞稀少或变形。不溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色透明。镜检红细胞不凝集。凝集：水不溶血，但出现红细胞凝集，凝集物在试管，经振摇后不能分散，在显微镜下玻片上凝集红细胞不能被冲散，或出现药物性沉淀