（微生物学专业论文）新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究.pdf

i l i 东大学博上学侮论文 摘要 随着基因工程的发展，微生物表面展示系统己发展出噬菌体展示系统、细菌 表面展示系统、酵母表面展示系统等，广泛应用在生物学研究及工业生产的许多 领域，例如研究蛋白质蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白 质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、 开发生物传感器、开发细胞吸附剂等等，成为竞相研究的热点。 但己发展的微生物表面展示系统都存在自身明显的缺陷：噬菌体展示系统展 示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影响噬菌体的装配与感染；革兰氏阴性 菌表面展示系统表达的重组蛋白易以包涵体形式存在，展示的蛋白不仅要通过质 膜层，还要在外膜上正确的整合，这可能对展示蛋白的结构和活性产生影响；革 兰氏阳性菌细胞壁厚，转化效率较低，这样会影响大容量肽库的构建；两种细菌 表面展示系统均缺乏翻译后修饰功能，容易使展示的真核蛋白失活：酿酒酵母中 虽存在蛋白质翻译后修饰，但糖基化方式与哺乳动物不同，它对外源蛋白n 糖 基化修饰形式是高甘露糖型，糖链平均为5 0 1 5 0 甘露糖残基，并且核心寡糖末 端是1 ，3 甘露糖，从而使生产的蛋白在人体中有比较强的免疫原性，过度糖基 化还可能使表达的酶等功能性蛋白失活。 毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核 表达系统。其具有易于培养、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因诱导型强启动子，可 调控外源基因的表达、可对外源蛋白进行更接近高等生物的加工折叠和翻译后修 饰、便于基因工程操作和高密度发酵等的特性，成为微生物表面展示系统极有应 用前景的宿主菌。 目前已有的毕赤酵母表面展示系统主要是利用来自酿酒酵母f l o l 蛋白的n 端絮凝结构域为锚定蛋白将外源蛋白展示于菌体表面，融合蛋白非共价连接于毕 赤酵母细胞壁上。展示的外源蛋白通过n 端与锚定蛋白融合，c 端蛋白游离， 这样的系统适合脂酶等活性位点在c 端的功能蛋白。但对活性位点在n 端的功 能蛋白表达不利，限制了更广泛的应用。为丰富毕赤酵母展示系统，展示不同需 山东大学博士学位论文 要的外源蛋白，本文做了以下3 部分工作： 第一部分：p i r l 型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究 p i t ( p r o t e i n sw i t hi n t e r n a lr e p e a t s ) 系列蛋白是酿酒酵母中共价连接细胞壁的 甘露糖蛋白，c 端无保守的g p i 锚定序列，直接与细胞壁中p l ，3 葡聚糖相连。 成熟肽蛋白n 端有数目不等的重复序列，可被温和碱( 3 0m m n a o h ，1 2h ，4o c ) 从细胞壁抽提。外源蛋白可通过与p i r 蛋白n 端融合、c 端融合或插入融合展示 在菌体表面。目前p i r 系列蛋白在酿酒酵母表面已成功展示了多种外源蛋白。 本研究克隆了来自酿酒酵母e b y l 0 0 的p i r l 蛋白成熟肽基因( 尸驴j 口) ，连接入 毕赤酵母分泌表达载体p p i c 9 k q ，构建了新型毕赤酵母表面展示的通用载体 p p i c 9 k - p i r l - a 。利用a f a c t o r f 言 号肽将蛋白引导分泌至细胞外。通过免疫荧光分 析以c 端与p i r l a 蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的增强型绿色荧光蛋白 ( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，e g f p ) ，证明新的毕赤酵母表面展示系统 的构建是成功的。但激光荧光共聚焦显微镜( c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ， c l s m ) 观察到e g f p p i r l a 融合蛋白的展示是不规则的，分析这种不规则的展示 可能与p i r l 蛋白自身性质相关。进一步以p i r l 成熟肽n 端重复序列( p i r l b 蛋白) 为锚定蛋白，构建新的毕赤酵母表面展示载体p p i c 9 k p i r l b ，表面展示的模式蛋 白仍采用e g f p 。c l s m 观察到新的融合蛋白e g f p p i r l b 是规则的展示在重组毕 赤酵母表面。w e s t e r nb l o t 证明了融合蛋白e g f p p i r l a 与e g f p p i r l b 可被温和碱 从重组毕赤酵母细胞壁抽提，并且很少分泌到培养基中。荧光分光光度计及流式 细胞仪检测发现，分别以p i r l 瘌p i r l - b 为锚定蛋白时，相同诱导条件下，表面展 示e g f p 的重组毕赤酵母菌株的荧光强度是相当的。以上结果说明酿酒酵母的p i r l 蛋白可作为毕赤酵母的锚定蛋白，将外源蛋白展示于毕赤酵母表面，融合蛋白没 有改变p i r l 蛋白自身的锚定性质：同时说明了p i r l 成熟肽蛋白中，其n 端重复序 列对其锚定在细胞壁起主要作用，c 端序列对其在表面的不规则展示起主要作 用。 第二部分：a 凝集素型毕赤酵母表面展示系统的构建及毕赤酵母表达重组蛋 白纯化新方法的探讨 a 凝集素是是酿酒酵母中共价连接细胞壁的g p i ( g l y c o s y lp h o s p h a t i d y l i i j 东大学博士学何论文 i n o s i t 0 1 ) 型甘露糖蛋白的一种，c 端有g p i 锚定序列，并通过p 1 ，6 葡聚糖连接至 p 1 ，3 葡聚糖，可被p 1 ，3 或p 1 ，6 一葡聚糖酶作用。外源蛋白可通过c 端与o 【凝集 素c 末端融合表达而锚定在细胞表面。目前以o 【凝集素c 末端为锚定蛋白在酿 酒酵母表面己成功展示了多种外源蛋白。 本研究克隆了来自酿酒酵母e b y l 0 0 的o 【凝集素的c 末端基因，连接入毕赤酵 母分泌表达载体p p i c 9 k 中，构建了新型毕赤酵母表面展示通用载体 p p i c 9 k a g a l 。利用0 【f a c t o r 信号肽将外源蛋白引导分泌至细胞外，同时在锚定 蛋白序列前增加了m u i 、a p a i 限制性内切酶位点及x p r e s s 抗原序列，提供了肠激 酶作用位点。通过免疫荧光分析以c 端与0 【凝集素的c 末端蛋白融合而展示于毕赤 酵母表面的e g f p ，证明新的毕赤酵母表面展示系统的构建是成功的。通过荧光 显微镜观察及w e s t e r nb l o t 分析证明了肠激酶可将展示在重组毕赤酵母表面的 e g f p 与菌体分离，从而探讨了纯化毕赤酵母表达重组蛋白的新方法：外源蛋白 可利用毕赤酵母的体系进行需要的折叠、翻译后修饰并分泌到胞外，通过锚定蛋 白展示于菌体表面，经肠激酶作用，可从菌体表面分离下来。 第三部分：两种毕赤酵母表面展示系统展示外源蛋白能力的比较 在成功地以来自酿酒酵母的p i r l 蛋白及a 凝集素c 末端为锚定蛋白构建了毕 赤酵母表面展示系统的基础上，以通过c 端分别与两种锚定蛋白融合的e g f p 为报告蛋白，通过研究诱导温度、诱导时间、诱导培养基初始p h 、甲醇诱导浓 度等摇瓶培养的发酵条件，探讨不同发酵条件分别对两种重组毕赤酵母菌株表面 展示融合蛋白的影响。并在两者各自最适的发酵条件下对其展示外源蛋白的能力 进行比较，结果发现( i t 凝集素c 末端为锚定蛋白时，其展示通过c 端与其融合 的外源蛋白的能力强于p i r l 成熟肽蛋白。 关键词：毕赤酵母；表面展示：p i r l 蛋白；a 凝集素：增强型绿色荧光蛋白 i i i 东大学博士学何论文 a b s t r a c t w i t ht h e a p p l i c a t i o no fr e c o m b i n a n td n at e c h n o l o g y , c e l l - s u r f a c ed i s p l a y s y s t e m sh a v eb e e nd e v e l o p e di nv a r i o u sm i c r o o r g a n i s m s ，s u c ha si np h a g e ，i nb a c t e r i a a n de s p e c i a l l yi ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e m i c r o b i a lc e l l - s u r f a c ed i s p l a yh a sb e e n w i d e l yu s e di nb i o t e c h n o l o g i c a lr e s e a r c ha n di n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s ，i n c l u d i n g ： i d e n t i f y i n gp r o t e i l l - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ，d i s p l a y i n gp o l y p e p t i d el i b r a r i e sa ss e l e c t i o n d e v i c e s ，m a p p i n gf u n c t i o n a lp r o t e i ne p i t o p e s ，i m m o b i l i z i n gp r o t e i n sa n de n z y m e sa s w h o l ec e l l b i o c a t a l y s t s ，p r o d u c i n g a n t i b o d i e sa n dl i v e v a c c i n e s ，p r o d u c i n g b i o a d s o r b e n t sf o r t h er e m o v a lo fh a r m f u lc h e m i c a l sa n dh e a v ym e t a l s ，e ta 1 t h e r ea r eo b v i o u sd i s a d v a n t a g e si nt h ep r e s e n tm i c r o b i a lc e l l s u r f a c ed i s p l a y s y s t e m s i np h a s e - d i s p l a ys y s t e m ，w h e nl a r g e r - s i z e dp o l y p e p t i d e sw e r ef u s e dt ot h e m a j o rc o a tp r o t e i no ft h ep h a g e ，t h eh y b r i d sw e r en o tr e a d i l yi n c o r p o r a t e di n t ot h e p h a g ep a r t i c l e ；i ng r a m - n e g a t i v ed i s p l a ys y s t e m s ，b o t ht r a n s l o c a t i o nt h r o u g ht h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n ea n dc o r r e c ti n t e g r a t i o ni n t ot h eo u t e rm e m b r a n em a ya f f e c tt h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h ep r o t e i n s i ng r a m p o s i t i v eb a c t e r i ad i s p l a ys y s t e m s ，t h e l o w e rf r e q u e n c yo ft r a n s f o r m a t i o nr e s t r i c t st h ec r e a t i o no fl a r g ec o m b i n a t o r i a lp r o t e i n l i b r a r i e s b o t ht h eg r a m n e g a t i v ed i s p l a ys y s t e m sa n dg r a m p o s i t i v eb a c t e r i ad i s p l a y s y s t e m sc a n n tf o l da n dg l y c o s y l a t et h ee u k a r y o t i cp r o t e i n i nsc e r e v i s i a ed i s p l a y s y s t e m ，s e c r e t e dp r o t e i n sa r eh y p e r g l y c o s y l a t e da n dh a v e 5 0 15 0m a n n o s e sp e r n g l y c a n ，w h i c hm a ya f f e c tt h ea c t i v i t yo fe n z y m e i na d d i t i o n ，sc e r e v i s i a ec o r e o l i g o s a c c a r i d e sh a v et e r m i n a la - 1 ，3 - g l y c a nl i n k a g e sw h i c hm a ym a k ep r o t e i n s h y p e r - a n t i g e n i ca n du n s u i t a b l ef o rt h e r a p e u t i cu s e t h e m e t h y l o t r o p h i cy e a s t ，p i c h i ap a s t o r i s ，i s a s i n g l e c e l l e u k a r y o t e m i c r o o r g a n i s ma n dh a s b e e ns u c c e s s f u l l yu s e dt op r o d u c ev a r i o u sr e c o m b i n a n t h e t e r o l o g o u sp r o t e i n sf o rb o t hb a s i cl a b o r a t o r yr e s e a r c ha n di n d u s t r i a lm a n u f a c t u r e t h ea d v a n t a g e sf o rpp a s t o r i st oe x p r e s sh e t e r o l o g o u sp r o t e i n sa r ef o l l o w i n g ：i ti s e a s yt og e n e t i c a l l ym a n i p u l a t ea n dc u l t u r ea n dc a nb eg r o w nt oh i g hc e l ld e n s i t i e s ；i t c a np e r f o r mh i g h e re u k a r y o t i cp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s ，s u c ha sg l y c o s y l a t i o n a n d d i s u l p h i d e b o n df o r m a t i o nf o rt h e p r o d u c eo fs o l u b l e ，c o r r e c t l yf o l d e d r e c o m b i n a n tp r o t e i n s ；i th a ss t r o n gp r o m o t e r sw h i c hc a nd r i v et h ee x p r e s s i o no f i n t e r e s tp r o t e i n v 山东大学博士学位论文 只p a s t o r i sh a sb e e ns t u d i e df o rp r o t e i n - s u r f a c ed i s p l a yb a s e do nt h ea n c h o r s y s t e mf r o m c e r e v i s i a e t a n i n oe ta 1 i m m o b i l i z e dt h el i p a s ef r o mr h i z o p u so r y z a e 、析廿lap r o s e q u e n c eo nt h ep p a s t o r & c e l ls u r f a c eu s i n gt h ef l o c c u l a t i o nf u n c t i o n a l d o m a i no ff l olp ( f s ) f r o m c e r e v i s i a ea sa l la n c h o r t h i ss y s t e mw a sn o n c o v a l e n t l y l i n k e dt ot h ec e l lw a l la n ds u i t a b l ef o rt h ee n z y m e sp o s s e s s i n ga c t i v i t i e sa tt h ec t e r m i n u s i ti su n s u i t a b l ef o rt h ee n z y m e st h a tp o s s e s sa c t i v i t i e sa tt h ent e r m i n u s ， w h i c hm a y b el i m i tt h ea p p l i c a t i o no f 只p a s t o r i sa sap r o s p e c t i v ec e l l u l a rh o s tf o r p r o t e i n s u r f a c ed i s p l a y t h i sa r t i c l ei sd i v i d e di n t ot h r e ep a r t s p a r ti ：c o n s t r u c t i o no fan o v e lp i c h i ap a s t o r i sc e l l s u r f a c ed i s p l a ys y s t e mb a s e d o nt h ec e l lw a l lp r o t e i np i r l p i tp r o t e i n sa r et h ec o v a l e n t l yl i n k e dc e l lw a l lp r o t e i n si nsc e r e v & i a e ，w h i c h a t t a c hd i r e c t l yt ot h e9 - 1 ，3 - g l u c a no ft h ec e l lw a l l p i tp r o t e i n sd on o tc o n t a i na c - t e r m i n a lg p is e q u e n c ea n dt h e ya r ea l lp r o c e s s e db yk e x 2p r o t e a s e t h e yc a nb e r e l e a s e df r o mi n t a c tc e u sb yv e r ym i l da l k a l i n et r e a t m e n t ( 3 0m mn a o h ，1 2h ，4o c ) 灿lp i rp r o t e i n sh a v eo n eo rs e v e r a lu n i t so fa ni n t e r n a lr e p e t i t i v es e q u e n c ea tt h en t e r m i n u s t h et a r g e tp r o t e i n sc a nb ef u s e dt op i rp r o t e i n se i t h e ri nt h em i d d l eo ra tt h e n o rc - t e r m i n u so fp i rp r o t e i n s p i rp r o t e i n sh a v eb e e ne f f i c i e n ta n c h o r sf o rt h e d i s p l a yo ft a r g e tp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fs c e r e v & i a e an o v e ls y s t e mb a s e do np i r lf r o m & c e r e v i s i a ew a sd e v e l o p e df o rc e l l - s u r f a c e d i s p l a yo fh e t e r o l o g o u sp r o t e i n si npp a s t o r & 、析t l lt h ea l p h a - 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t e r m i n a ls e q u e n c e c o n t r i b u t e st ot h ei r r e g u l a rd i s t r i b u t i o no ff u s i o np r o t e i n si np p a s t o r i s p a r ti i ：c o n s t r u c t i o no fan o v e ls y s t e mf o rc e l ls u r f a c ed i s p l a yo fh e t e r o l o g o u s p r o t e i n so np i c h i ap a s t o r i s a - a g g l u t i n i nb e l o n g st o a n o t h e rc o v a l e n t l yl i n k e dc e l lw a l l p r o t e i n s i ns c e r e v i s i a e ，w h i c hh a v eag p ia n c h o ra t t h e i rct e r m i n u sa n da r ea t t a c h e dt o p - l ，3 一g l u c a no f t h ec e l lw a l lv i aas h o r tp - 1 ，6 一g l u c a n g p ip r o t e i n sc a nb er e l e a s e db y 1 3 - 1 ，3 - o rp - 1 ，6 - g l u c a n a s ef r o mc e l lw a l l t h ec - t e r m i n a lh a l fo fa - a g g l u t i n i nh a s b e e nw i d e l yu s e dt oa n c h o rh e t e r o l o g o u sp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fs c e r e v i s i a e av e r s a t i l ev e c t o rw a sd e v e l o p e df o rh e t e r o l o g o u sp r o t e i n sd i s p l a yo nt h ec e l l s u r f a c eo fp p a s t o r i su s i n gt h ec - t e r m i n a lh a l fo fa - a g g l u t i n i nf r o ms c e r e v i s i a ea sa m e m b r a n ea n c h o ru n d e rt h ec o n t r o lo ft h ea l c o h o lo x i d a s e1p r o m o t e r ( p a o x 1 ) m u l t i p l ec l o n i n g s i t e sa n dt h e s e q u e n c ee n c o d i n g t h e x p r e s se p i t o p e ( - a s p - l e u - t y r - a s p - a s p - a s p - a s p - l y s - 1w e r ei n t r o d u c e di n t ot h ev e c t o rf o ri n s e r t i o n o fh e t e r o l o g o u sg e n e sa n ds e l e c t i v ec l e a v a g eo ft a r g e tp r o t e i n s e g f pw a su s e da sa m o d e lp r o t e i nt oc h e c kt h ef u n c t i o no ft h i sv e c t o r t h ee x p r e s s i o no fe g f po nt h e 尸 p a s t o r i ss u r f a c ew a sc o n f i r m e db yc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p ya n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i sc o n f i r m e dt h a te g f pc a nb es u c c e s s f u l l y c l e a v e df r o mt h ec e l ls u r f a c eb yt r e a t i n gw i t he n t e r o k i n a s e t h i ss y s t e mc a nb e a p p l i e dt op u r i f yh e t e r o l o g o u sp r o t e i n se x p r e s s e di npp a s t o r i s p a r ti i i ：c o m p a r i s o no fc e l lw a l lp r o t e i n so fp i r la n dt h ec t e r m i n a lh a l fo f a - a g g l u t i n i na sa n c h o r sf o rh e t e r o l o g o u sp r o t e i nc e l l - s u r f a c ed i s p l a y t h em a t u r ep e p t i d eo fp i r la n dt h ec - t e r m i n a lh a l fo f0 【一a g g l u t i n i nh a v eb e e n p r o v e dc a p a b l eo fi m m o b i l i z i n ge g f p o nt h ec e l ls u r f a c eo fp p a s t o r i s t h ef r a c t i o n o ft h et o t a la m o u n to ff u s i o np r o t e i nl o c a l i z e dt ot h ec e l lw a l lv a r i e dd e p e n d i n go n b o t ht h ea n c h o rd o m a i nu s e da n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s t h ee x p r e s s i o no f f u s i o np r o t e i nu n d e rv a r i o u sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，e g ，t h ei n d u c t i o nt e m p e r a t u r e ， i n i t i a lp ha n dm e t h a n o lc o n c e n t r a t i o nw e r es t u d i e d a n dt h ea b i l i t yo ft h em a t u r e p e p t i d eo fp i rla n d t h ec - - t e r m i n a lh a l fo f a a g g l u t i n i nt oa n c h o re g f p t ot h ec e l lw a l l o f 尸p a s t o r i sw a sc o m p a r e du n d e re a c ho ft h eo p t i m a li n d u c t i o nc o n d i t i o n i tw a s f o u n dt h ec o n s t r u c t e d 户p a s t o r i ss t r a i nc o u l dd i s p l a ym o r ef u s i o np r o t e i nw h e nt h e c t e r m i n a lh a l fo fi x - a g g l u t i n i nw a su s e da sa na n c h o r v i l 由东大学薅学位论文 k e yw o r d s ：p i c h i ap a s t o r i s ；s u r f a c ed i s p l a y ；p i r l ；t - a g g l u t i n i n ；e n h a n c 嬲g r e e n f l u o r e s c e n c ep r o t e i n v m l | | 东大学博一l 学侮论文 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n ) a i d a ia d h e s i ni n v o l v e di nt h ed i f f u s ea d h e s i o n 自体转运蛋白 a m p b p e l s m d t t e b f i g f n b p i a h l 强 i n p k d a m c s o d o m p 眦 r 气g e p b s p c r 翠m s d s u v a m p i c i l l i n b a s ep a i r 氨苄青霉素 碱基对 c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y 激光荧光共聚焦显微镜 d i t h i o t h r e i t o l e t h i d i u mb r o m i d e f i g u r e f i b r o n e c t i nb i n d i n gp r o t e i na h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i c e n u c l e a t i o np r o t e i n l d l od a l t o n m u l t i p l ec l o n i n gs i t e o p t i c a ld e n s i t y o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n p e p t i d o g l y c a na s s o c i a t e dp r o t e i n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r o u n dp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e u l t r a v i o l e t 二硫苏糖醇 溴化乙锭 图例 纤连蛋白结合蛋白a 辣根过氧化物酶 冰晶核蛋白 干道尔顿 多克隆位点 光学密度 外膜蛋白 肽聚糖结合蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 转速 十二烷基硫酸钠 紫外 i x 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责 任由本人承担。 论文作者签名：日期：独塞喳“ 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电 子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：邀导师签名：曼型之日期：麴篁竺，6 ljj 东大学博士学位论文 1 1 毕赤酵母介绍 第一章绪论 毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核 表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶( a l c o h o lo x i d a s e ，a o x ) 编 码基因a o x l 和a 0 ) ( 2 ，两者序列相似，a o x l 基因严格受甲醇诱导和调控。当甲 醇为唯一碳源时，a o x l 启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而利 用甲醇进行代谢【2 2 】。含a o x l 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基 因的表达。 随着i n v i t r o g e n 公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该系 统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、 包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构域 3 2 ，9 0 。 1 1 1 毕赤酵母表达宿主菌 菌株基因型表现型 g s l l 5h s 4m u g h i s l ( i 7 1 a r 9 4 h 括4 a o x l ： s a r g 4 m u t 5a r g + a r 9 4h i s 4a o x l ：s a r g 4 m c l 0 0 - 3m u t h i s a o x 2 ：p h i s 4 s m d l l 6 8 h i s 4 p e p 4m u t + h i s 。p e p 4 s m d l l 6 5 h i s 4 p r bl m u t + h i s 。p r b l 。 s m d l l 6 3h i s 4p r b l p e p 4m u t + h i s 。p r bl p e p 4 。 表1 1 常用的毕赤酵母表达菌株 t a b l e1 1 只p a 盯o r i se x p r e s s i o ns t r a i n s 目前所采用的毕赤酵母表达宿主菌均由n r r i ，y 11 4 3 0 株衍生而来，这些宿主 菌大多都有一个或多个营养缺陷型突变，方便筛选。根据乙醇氧化酶一个基因或 由东大学博士学位论文 二个基因的缺失丽造成对甲醇利用能力的改变，可分为甲醇利用快速型菌株 ( m u t 十) 、甲醇利用慢速型菌株( m 心) 或甲醇不利用型( m 眦) 2 2 ，3 2 ，9 0 】( 表 1 1 ) 1 1 2 毕赤酵母表达载体 表达方式载体名称启动子选择粝记 p p i c za ，b ，c a o x lz e o c i n p p i c 6a ，b ，c a o x lb l a s t i c i d i n p g a p za ，b ，c 鳓夕z e o c i n 胞肉表达 p p i c 3 5 k a o x l h i s 4 、k a n m y c i n 、a m p i c i l l i n p a 0 8 1 5 轰0 x l 壤薛、a m p i c i l l i n p f l d f l d z e o c i n 、a m p i c i l l i n p p i c z aa ，b ，c a o x lz e o c i n p p i c 6 aa ，b ，c a o x lb l a s t i c i d i n 分泌表达 p g a p z a a ，b ，c 鳓pz e o c i n p p i c 9 k a o x l h i s 4 、k a n m y c i n 、a m p