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西南大学硕七学位论文摘要 基于纳米材料为载体的电流型及电位型免疫传 感器的研究 无机化学专业硕士研究生刘凯歌 指导教师柴雅琴教授 摘要 免疫分析方法在抗原一抗体特异性反应的原理上建立起来的分析方法。基于免疫分析法和电化 学传感器结合的电化学免疫传感器因其灵敏度高，分析速度快，操作简单，价格低廉及选择性好等 优点，在临床诊断、生物分析、环境监测等领域得到了高度重视和广泛应用。电流型和电位型免疫 传感器是根据抗原抗体结合前后的电流、电位的变化来检测生物分子的浓度。传感器的性能主要取 决于生物活性物质的固定方法，因此解决把生物活性物质固定在电极上并能保持其生物活性的方法 成为当今电化学免疫传感器研究中的重点。纳米材料因其具有良好的吸附能力和生物兼容性等特点 已被广泛应用到免疫传感器中作为生物活性物质的载体，且很大程度上提高了传感器的性能。本论 文基于此考虑，研究了一系列基于纳米材料为载体的电化学免疫传感器。 1 电沉积普鲁士蓝和双层纳米金修饰的免疫传感器的研究 用 a u c h 和f e 3 + f e ( c n ) 6 】3 - 派生物修饰电极表面制备简单且灵敏的电化学免疫传感器。电化学 还原 a u c l 在玻碳电极( o c e ) 表面沉积上一层多孔纳米金( n g ) ，然后再电沉积上一层普鲁士蓝 ( p b ) ，随之电沉积上第二层纳米金以固定癌胚抗体( a n t i c e a ) f l ；i j 备出一种免疫传感器。双层多孔纳米 金颗粒的引入增大了生物分子的固定量，且提高了免疫传感器的灵敏度。p b ，一种很好的氧化还原 探针，广泛用于电化学分析测定中。在优化的条件下，所制电极的线性范围为3 肛8 0 0n g m l ，检 测限为0 9n g m l ( s n = 3 ) 。而且，此免疫电极的选择性、重现性及稳定性都是可以接受的。 2 三维立体s i 0 2 a u 和聚硫堇修饰的金电极用于检测c a1 5 3 的研究 基于三维立体s i 0 2 a u 纳米颗粒和聚硫堇( p 1 h ) 膜修饰金电极制备新型先进的免疫传感器。并 利用交流阻抗测试系统( e t s ) 和循环伏安法( c 对免疫传感器的制备、性能及检测癌抗原1 5 3 ( c a1 5 3 ) 中的相关特性进行了研究。基于三维立体s i 0 2 a u 纳米颗粒的免疫传感器提供了更多的 活性位点和更好的吸附特性以固定c a1 5 3 抗体来选择c a1 5 3 抗原。在优化的条件下，应用于多 个标准样品检测时，修饰好的免疫传感器表现出良好的线性和灵敏度，线性范围为1 - 8 和8 2 5 0 u m l ，检测限为0 4 2u i m l ( s n = 3 ) 。更重要的是，此方法可以延伸至其他抗原或生物分子的检测。 3 基于p v c 和聚乙烯皿胺复合膜修饰的电位型免疫传感器的研究 基于聚四氯乙烯和聚乙烯亚胺复合膜电极吸附纳米金以固定抗体的癌抗原1 2 5 ( c a1 2 5 ) 制备出 西南大学硕士学位论文摘要 新型的电位型免疫传感器。所修饰免疫传感器和实验条件利用电位方法来检测。在最优的实验条件 下，所制电极关于c a1 2 5 浓度呈现s 形曲线，具有较高的灵敏度，线性范围为0 0 9 0 到1 2 6 1 2u m l ， 检测限为0 0 2 8u m l ，较快的电位响应( 小于4m i n ) ，且重现性和选择性较好。 关键词：电流型免疫传感器电位型免疫传感器纳米金硫堇普鲁士蓝 西南大学硕十学位论文 a b s t r a c t s t u d l e s0 na m p e r o m e t n ca n dp o t e n t m m e t r l c i m m u n o s e n s o r sb a s e do ng o l dn a n o p a r t i c l e s i n o r g a n i cc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：k a i g el i u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ry a q i nc h a i a bs t r a c t l m m u n o a s s a yw a sd e v e l o p e db a s e do nt h ep r i n c i p l eo ft h es p e c i f i c i t yr e c o g n i t i o no fa n t i g e na n d a n t i b o d y e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sb a s e do nt h ec o m b i n a t i o no fe l e c t r o a n a l y s i sa n di m m u n o a s s a y , h a v eb e e ng a i n e dh i g hr e c o g n i t i o na n da p p l i c a t i o ni nc l i n i c a ld i a g n o s i s ，b i o a s s a ya n de n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g ，o w i n gt ot h ea d v a n t a g e so ft h e i rh i g hs e n s i t i v i t y , f a s ta n a l y t i c a lt i m e ，s i m p l em e a s u r e m e n t ， l o w - c o s ta n dh i 【曲s e l e c t i v i t y t h ed e t e c t i o no ft h ei m m u n o a s s a yb a s e do nt h ec h a n g ei nt h ea m p e r o m e 仕i c o rp o t e n t i o m e t r i cr e s p o n s eb e f o r ea n da f t e ra n t i g e n - a n t i b o d yr e a c t i o n t h ei m m o b i l i z a t i o no ft h ea n t i - b o d yo fi l t l l t r m o s e n s o rw a sv e r yi m p o r i a n tt oi t sp e r f o r m a n c e ，s 0 ，t h e m e t h o d so fi m m o b i l i z a t i o no fa n t i b o d yt ot h ee l e c t r o d ea n dr e t a i nt h e i rb i o c a t a l y t i ca c t i v i t i e sb e c a m em o s t i m p o r t a n tf o rt h ep e r f o r m a n c eo ft h ei n l l t l n o s e n s o r i nr e c e n ty e a r s ，m a n yk i n d so fi m m u n o s e n s o r sh a v e b e e nd e v e l o p e db a s e do i lt h en a n o p h a s em a t e r i a l sa st h ec a r r i e rf o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fa n t i b o d yo w i n g t ot h e i rg o o db i o c o m p a r t i b i l i t ya n ds p e c i a l i t ya d s o r p t i o n ，a n ds oo n f o rt h e s er e a s o n s ，w eh a v es t u d i e dt h e r f l l i l l n o s 朗i i s o y sb a s e do i ln a n om a t e r i a l sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa n t i g e n p a r t1 a u c g d 。a n df e 3 + f e ( c n ) 6 】3 。i o u s - d e r i v a t e di m m u n o s e n s i n gi n t e r f a c ef o re l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a y o fc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e ni nh u m a ns e r u m as i m p l ea n ds e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a yf o rc e aw a sd e v e l o p e db yu s i n g 【a u c i , - a n d f e 3 + f e ( c n ) 6 孓i o n s d e f i v m e di m m u n o s e n s i n g i n t e r f a c e a u c h w a si n i t i a l l yd e p o s i t e db y e l e c t r o c h e m i c a lr e d u c t i o n0 1 1 ag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) t of o r mp o r o u sn a n o g o l dl a y e r , t h e n p r u s s i a nb l u e ( p b ) w a se l e c t r o d e p o s i t e do n t ot h ea s - p r e p a r e dn a n o g o l dl a y e r , a n dt h e ns e c o n d a r yn a n o g o l d p a r t i c l e sw e r ef a b r i c a t e da g a i no nt h ep bs u r f a c eb ye l e c t r o c h e m i c a lr e d u c t i o nf o rt h ei m m o b i l i z a t i o no f a n t i - c e aa n t i b o d i e s t h ep r e s e n c eo fd o u b l e - l a y e rp o r o u sg o l dn a n o p a r t i c l e se n h a n c e dt h ei m m o b i l i z e d a m o u n to fb i o m o l e c u l e s ，a n di m p r o v e dt h es e n s i t i v i t yo ft h ei m m u n o a s s a y p b ，a sag o o dr e d o xp r o b e ，w a s f a c i l et oe l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sa n dm e a s w e m e n t u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ed e v e l o p e d i m m u n o a s s a ye x h i b i t e dd y n a m i cr a n g ef r o m3 0t o8 0 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 9n g m lc e a ( s n = 3 ) m o r e o v e r , t h es e l e c t i v i t y , r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yo f t h ei m m u n o s e n s o rw e r ea c c e p t a b l e 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t p a r t 2 e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o - b i o a n a l y s i sf o rc a r c i n o m aa n t i g e n1 5 3b a s e do nt r i d i m e n s i o n a l s i 0 2 a u a n de l e c t r o p o l y m e r i z e dt h i o n m e - m o d i f i e dg o l de l e c t r o d e an o v e l a p p r o a c ht o w a r dd e v e l o p m e n to fa d v a n c e d l q - l r n u n o s e l 砖o r sb a s e do i lt r i d i m e n s i o n a l s i 0 2 a un a n o p a r t i c l e sa n de l e c t r o p o l y m e r i z e dt h i o n i n e ( p t h ) f i l mo ng o l de l e c t r o d ew a sd e m o n s t r a t e d i nt h i sp a p e r , a n dt h ep r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n , a n dm e 龇e m e n to fr e l e v a n tp r o p e r t i e so ft h e i r r l m u n o s c n s o ru s e f u lf o rt h ed e t e c t i o no fc a r c m o n ma n t i g e n1 5 - 3 ( c a1 5 - 3 ) w e r es t u d i e db ym e a n so f e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) a n dc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) t h ei n l n l u n o s e n s o rb a s e do n t r i d i m e n s i o n a ls i 0 2 a un a n o p a r t i c l e sp r o v i d e sm o r ea c t i v es i t e sa n dg o o da d s o r p t i o np r o p e r t i e sf o rt h e a t t a c h m e n to ft h ec a15 3a n t i b o d ys e l e c t i v et oc a15 3 u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s , t h er e s u l t i n g i l t l n l u l l o s e n s o rp r e s e n t sg o o dl i n e a r i t ya n ds p e c i f i c i t yw h e ni tw a se v a l u a t e do ns e v e r a ls t a n d a r ds e r u l l l s a m p l e sa n dt h ew o r k i n gr a n g ew a s1 - 8a n d8 2 5 0u m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 4 2u m l ( s ：n = 3 ) i m p o r t a n t l y , t h ep r o p o s e dm e t h o d o l o g yc o u l d b ee x t e n d e dt ot h ed e t e c t i o no fo t h e ra n t i g e n so r b i o c o m p o u n d s p a r t 3 s t u d i e so np o t e n t i o m e t r i ci l t l n l u n o s e n s o rb a s e do np o l y ( v i n y lc h l o r i d e ) - p o l y e t h y l e n e i m i n e m e m b r a n ee l e c t r o d e an o v e lm e t h o df o rf a b r i c a t i o no fac 盯c i n o m aa n t i g e n12 5 ( c a1 2 5 ) p o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o r h a sb e e nd e v e l o p e db ym e a n so fi m m o b i l i z i n gc a1 2 5a n t i b o d y ( a n t i - c a1 2 5 ) o ng o l dn a n o p a r t i c l e s ( n g ) a n dp o l y ( v i n y lc h l o r i d e ) - p o l y e t h y l e n e i m i n em e m b r a n ee l e c t r o d eh a sb e e nd e v e l o p e d p o t e n t i o m e t r i c t e c h n i q u ew a gu s e dt od e t e c tt h ep e r f o r m a n c eo ft h er e s u l t i n gi m m u n o s e n s o ra n dt h ec o n d i t i o n so ft h i s e x p e r i m e n t a t i o n a tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h er e s u l t i n gi n l l t l u n o s g t i s o fe x h i b i t e das i g m o i d c u r v e1 i l c a1 2 5c o n c e n t r a t i o n , h i g hs e n s i t i v i t y , l m e a rr a n g ef r o m0 0 9 0t o1 2 6 1 2u m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f o 2 8u m l ，f a s tp o t e n t i o m e t r i cr e s p o n s e ( 4r a i n ) ，g o o dr e p r o d u c t i o na n ds e l e c t i o n k e y w o r d s ：a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r ；p o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o r ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ( n a n o - a u ) ；t h i o n i n e ( t h ) ；p r u s s i a nb l u e ( p b ) i v 独创性声明 学位论文题目：基王麴苤越盘羞惑篮鲍鱼速型丞电焦型鱼疫笾盛墨鲍盈究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了标注。 学位论文作者：封凯歌 签字日期：加。7 年 月2 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保 密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：引号屯敬 签字日期：矽9 9年午月刁日 锄鲐般移 签字魄即年严月z 阳 l 西南大学硕士学位论文第一章 皇曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼! 皇曼曼蔓曼皇曼曼蔓曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼鼍曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼鼍鼍曼皇曼曼曼曼曼曼曼鼍曼鼍曼曼皇曼曼量鼍曼量曼曼曼! 曼曼ii 皇曼曼曼曼曼量曼曼皇曼 第一章绪论 用现代的观点来讲，人体具有一种“生理防御、自身稳定与免疫监视的功能叫“免 疫”。免疫医学、生物学方面的概念是机体免疫系统对抗原物质的一种生物学应答过程， 是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己 和“非己成分，从而破坏和 排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持机体的 生理平衡与稳定。抗原是能刺激机体免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞又能与相应抗体 或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。抗体是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的 一组免疫球蛋白，抗体具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应，其最 基本的生物功能是防御外界物质对机体的侵袭。抗原抗体结合的特点是：特异性结合、 结合具有可逆性、结合常数很高、结合具有阶段性【l ，2 】。免疫分析法是基于抗原与对应 抗体之间高度选择性反应而建立起来的一类分析方法【3 羽。免疫传感技术的概念由h e n r y 等在1 9 9 0 年提出的，是免疫传感技术是将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合 起来，用以检测抗原抗体反应的一种生物传感技术，生物传感器的一类睁9 1 。免疫传感 器作为一种耐用、可携带、易操作、低成本的分析装置，是目前开发研究的热点已广泛 地应用在临床、医学、生物、化学、环境、农业、工业、分析等领域【l 叫5 1 。由于免疫传 感器是以抗原抗体为分子识别元件，因此具有优良的选择性。相对其它的生物传感技 术，由于抗原和抗体的结合具有很高的特异性，减少了非特异性干扰，提高了检测的准 确性。 免疫传感器由感受器、转换器和电子放大器组成。在感受器单元中抗体与抗原选择 性结合产生的信号敏感地传送给感受器，抗体与抗原的结合具有高度的特异性。免疫传 感器的优劣取决于抗体与待测物结合的选择性和亲和力。在传统的免疫传感器研究中， 抗原抗体结合前后可导致多种信号的改变，如在重量、光学、热学、电化学等方面。光 学分析的研究比较活跃，但是由于电化学分析有其独到之处，如可以实现在体检测，不 受样品颜色、浊度的影响( 即样品可以不经处理，不需分离) ，所需仪器设备相对简单， 因此前景看好。对生物样品中的低浓度成分进行选择性分析有两个基本要求：高选择性 和高灵敏度。免疫传感器由于利用了抗原抗体反应的高亲和性和分子识别的特点，加之 感受器的高灵敏度，从而在这一方面显示了突出的优越性。在免疫传感器的研制过程中 特别值得注意的是保持传感器中生物活性单元对于目标物的识别活性和将识别过程转 化为一种可检测的连续信号。 根据所使用的信号转换器不同，免疫传感器可分为：电化学免疫传感器、光学免疫 传感器、压电免疫传感器及s p r 型免疫传感器等。 1 1 电化学免疫传感器的简介 西南大学硕士学位论文 第一章 电化学免疫传感器是将免疫技术与电化学检测技术相结合的免疫传感器。1 9 5 1 年， b r e y e r 和r a d c l i f f 首次用极谱方法测定了由偶氮标记的抗原，这成为电化学免疫分析的 开端【16 1 。电化学免疫传感器按在免疫分析过程中是否使用标记物可分为非标记型和标记 型免疫传感器： ( 1 ) 标记型免疫传感器标记型免疫传感器采用酶、荧光物质、电活性化合物等进行 标记，抗体与抗原反应过程通过电化学、光学等手段进行检测，同时对浓度信息加以化 学放大，从而实现高灵敏检测目标物。此类传感器的测定原理主要有夹心法和竞争法， 其原理见f i g u r e1 1 。前者是在样品中的抗原与传感界面上的抗体结合后，再加标记的 抗体与样品中的抗原结合，形成夹心结构 f i g u r e l 1 ( a ) 】；后者是利用标记的抗原与样品 中的抗原竞争结合传感界面的抗体 f i g u r e1 1 ( b ) 。 抗 抗 原 9 移移 标 记 的 抗 体 卅睁c ( 卜a 叫卜 【 ( a ) 夹心法 已知量的标记抗原 ? 9 妒 专 国) 竞争法 f i g u r ei it h ep r i n c i p l eo fl a b e l e di m m u n o s e n s o r ( 2 ) 非标记型免疫传感器其原理见f i g u r e1 2 。在抗体与其相应抗原识别结合时候直 接转变成可测信号。这类传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。 前者是将抗体或抗原直接固定在传感器表面上，传感器与相应的抗体或抗原发生结 合的同时产生可测信号；后者是用抗体或抗原制作抗体膜或抗原膜，当其与相应的配基 反应时，膜电位( 或其他物理参数) 发生变化，测定膜电位的电极与膜是分开的。 1 2 电化学免疫传感器的分类 免疫传感器按测量信号可分为电位型、电导型、电容型、阻抗型和电流型( 安培型) 。 电化学免疫传感器具有灵敏度高、仪器简单、方法灵活多样等特点，所以广泛应用于生 物物质的测定。近年来，人们发现将生物学中的一些方法( 如免疫法、酶技术等) 与电化 2 西南大学硕士学位论文第一章 学结合起来，对于解决生物电分析化学及免疫分析中的问题，可能是更为有效的途径。 电极 ( 电位变化) 光纤 ( 光纤化学 性质变化) s p r 检测 ( 折射率变化) f i g u r e1 2t h ep r i n c i p l eo fn o n l a b e l e di m m u n o s e n s o r 1 2 1 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器在免疫传感器中占有重要的地位，代表了生物传感器中高度发达 的领域，已有部分产品商品化。是进行实时监测抗原抗体结合的常用方法，这一方法有 高度的敏感性和灵敏度，以及与浓度线性相关性等优点。这种免疫分析基于在恒定电压 下测量免疫反应前后通过电化学室电流的变化，进行待测抗原或抗体的定量检测。由于 抗原一抗体生物分子本身不具备电活性，电流型免疫传感器一般需要使用标记物标记抗 原或抗体，从而实现把抗原和抗体结合的信息转变为可测的电化学信息( 电流) 。其标记 物有酶和电活性物质两类。常用作标记的酶有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、乳酸脱氧 酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酞化酶和尿素水解酶等。以酶作标记物的电化学酶联免疫分 析首先将标记酶交联在抗体( 或抗原) 上，然后采用夹心法或竞争法进行安培分析【l7 1 。电 活性标记物一般有二茂铁、硝基雌三醇、d t p a 、对氨基酚及其衍生物、聚苯胺以及金 属离子等，其原理类似于酶标记，首先将电活性物质标记于抗原或抗体上，再通过竞争 法或夹心法将标记物结合在传感器上，通过电分析技术检测电活性标记物。由于酶的化 学放大作用，在安培免疫分析中大多采用酶作为标记物。 现在，已有大量电流型免疫传感器研究的报道，如：e e m e d y a n t s e v a 等【l8 】将含有 胆碱脂酶的硝化纤维膜固定在银电极表面中，利用戊二醛和正己烷将致病真菌抗体连接 窿杀 0回回 西南大学硕士学侍论文第一章 量曼曼曼曼曼曼鼍i - 一i | 量 在纤维膜上从而制得用于检测致病真菌抗原的电流型免疫传感器。该传感器可稳定存放 至少3 5 天，最低检测量为1 1 0 。1 5m g m l 免疫测定所需时间少于2 0m i n 。刘志国用纳 米金的优良吸附性能和褐藻酸钠的强负电性，将褐藻酸钠通过胱胺共价修饰到纳米金表 面形成褐藻酸钠纳米金复合物( a s n ) 标记t 3 抗体( 三碘甲状腺氨酸抗体) ，以f e ( c n ) 6 列舢 为电化学探针，用循环伏安法获取金电极表面微环境改变的电流信息来检测t 3 抗体， 检测的线性范围为1 0 0 - - 1 6 0 0n g m l ，检测限为4 5n g m l r l 9 l 。c i a n a 选择对羟基磷酸苯为 碱性磷酸酶的底物，结合f i a ( 流动注射分析) 使j 旧检测下限达到0 0 7n g m l t 2 0 j 。y i n g z h u o 等【2 l 】研制出纳米金和辣根过氧物酶修饰金表面的电流型免疫传感器，用于乙肝表 面抗原的检测。他们首次用辣根过氧化物酶代替牛血清( b s a ) ，封闭纳米金颗粒层上 可能存在的活性位点，阻止非特异性结合，同时可以放大抗原抗体反应信号，其线性范 围为2 5 6 5 6 3 2n g m l ，检测下限为0 8 5n e d m l 。从电流型免疫传感器研究开发的情况 来看，目前仍在寻找更合适的固定方法和固定材料，探求更灵敏稳定的标记系统和电活 性物质，追求更灵敏更稳定的信号检出系统。 1 2 2 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器是基于测量电位变化来进行免疫分析的生物传感器，是基于离子 选择电极原理而发展起来的【2 2 , 2 3 】，它结合了酶免疫分析的高灵敏度和离子选择电极、气 敏电极等的高选择性，将生物识别反应转换为电信号，该信号与生物识别反应过程中产 生或消耗的活性物质浓度对数成正比，从而与待测物质浓度的对数成正比，其关系遵循 能斯特方程：e e o + r t z f l g o 【m ，由此可直接或间接检测各种抗原、抗体，具有可实时监 测、响应时间较快等特点。1 9 7 5 年j a n a t a 首次描述了用电位测量来监测免疫化学反应1 2 4 1 ， 他通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特异性结合，抗体 膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相应发生改变，根据膜电位 的变化值与待测物浓度之间的对数关系即可求出待测物浓度。早期的研究者利用此原理 测定了人血清中的梅毒抗体、人血清白蛋白，并完成了血清鉴定。彭图治等分别报道了 对人a f p 等一些疾病标志物直接检测【2 孓2 9 】。 酶标记电位型免疫传感器是将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏性融为一体，以实 现对低含量物质的检测。标记酶有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶 等。酶标记传感器( 电位型或电流型) ，最后均可归结为是对n a d h 、苯酚、0 2 、h 2 0 2 、 n h 3 及新近开发的电活性物质的检测。g h i n d i l i s t 3 0 】用乳糖酶标记胰岛素抗体，与样品中 的胰岛素抗体竞争结合固定在电极上的胰岛素。乳糖酶能催化电极上的氧化还原反应， 从而使电极上的电位增加，检测胰岛素，获得了很宽的线性范围。该方法操作快速，电 位变化明显，有利于免疫反应的动力学分析。敏感膜如p v c 膜、醋酸纤维素膜、聚合 物薄膜、蚕丝膜，以及固定化技术、膜电极制备技术的提高使离子选择电极、p h 电极 4 两南大学硕十学位论文第一章 和气敏电极也得到了极大的发展空间。虽然电位测量式免疫传感器能进行定量测定，但 是它们信号噪声比较低，线性范围窄，与离子选择电极相联系的免疫传感器不可避免 地要受到其他离子的影响，并未得到实际应用。 1 2 3 电导型免疫传感器 电导型免疫传感器是基于免疫反应引起溶液或薄膜的电导发生变化来进行免疫分 析的生物传感器。因为许多化学反应都产生或消耗多种离子体，从而改变溶液的的总导 电率，因此电导测量法可大量用于化学系统中。y a g i u d a 3 1 】用电导法测定了尿中的吗啡， 解决了原来吗啡测量设备昂贵、费时、麻烦的问题。d i i k s m a 3 2 1 用交流阻抗法测定了y 干扰素，下限达到0 0 2u m l 。但是电导法易受被测样品离子强度和缓冲液容积的影响， 并且难以克服非特异吸附，因此导电率测量式免疫传感器发展比较缓慢。 1 2 4 阻抗型免疫传感器 阻抗分析是一种有效的监测修饰电极表面特性的方法【3 3 。5 1 ，电极双电层结构影响电 极界面的电荷动力学迁移过程。它是一种测量电极界面性质的有效工具。阻抗型免疫传 感器的分析原理是基于抗原抗体之间的结合降低了电活性探针分子同电极之间的电子 转移速率，即增加了电子转移阻抗。通过测量免疫结合前后电子转移阻抗之差可以实现 高灵敏检测的目的。法拉第阻抗测量电路图如f i g u r e1 3 所示，包括有电解质溶液的阻 抗，w a r b u r g 阻抗z w ，双电层电容c d l ，以及界面电子传导阻抗。和z w 分别与 溶液和氧化还原探针的性质有关，因此不受电极表面电化学反应影响。c d l 和k 分别与 电极溶液界面的双电层和电极绝缘性的有关。当一个金属电极被修饰后，其双电层电 容就会包括未修实时的常电容和修层电容两部分，这时，其总电容就成了两个电容器的 串联电容，其电容满足如下关系式： 111 = + 一 f 。o 电子转移阻抗& 控制着氧化还原探针在电极表面电子转移速率。当电极表面被修 饰后，这层修饰物会阻碍电子在电极表面的传递，使得电子转移阻抗增加，其阻抗满足 如下关系式： r e t = 尺m + r r r i o d 两南大学硕士学位论文 第一章 曼曼曼皇曼皇曼曼曼罡i i 鼍寰曼曼曼皇曼曼皇曼曼曼蔓曼曼曼曼曼鼍量曼皇曼蔓曼曼曼曼曼曼曼曼! 皇量曼鼍曼量皇曼曼曼曼寰曼曼曼曼皇曼量曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼邑皇鼍曼曼曼量曼 c 4 1 毛氏t 八 八广二气 一卜= 一i h 卜 c d l c 疆c m d = = = 3 _ 一= = = 二卜= 二二 _ 一 k t r 曩口tr m f i g u r e1 3g e n e r a le q u i v a l e n tc i r c u i tf o ra ne l e c t r o c h e m i c a lc e l li nt h ep r e s e n c eo far e d o xp r o b e 1 2 5 电容型免疫传感器 电容型免疫传感器是建立在双电层理论上的一种高灵敏非标记型免疫传感技术。当 金属电极与电解质溶液接触，在电极溶液的界面存在双电层。物质吸附和表面电荷改 变对双电层结构都会产生显著影响。电容型免疫传感器是基于将识别分子固定在电极表 面，在电极溶液界面存在双电层，蛋白质分子是一类分子量极大极性小的生物分子， 当抗原抗体在电极表面复合时，相关复合物及液体移动引起双电层介电常数的改变，导 致电容变化而进行检测。电极上电层电容( c d ) 可用方程表达：c d - a o 以，其中o 为真空 介电常数，r 为电极与移动电荷隔离开的物质介电常数，a 是电极面积，d 是移动电荷 与电极表面最近的距离。电极表面抗原抗体复合物( 绝缘层) 的形成，导致d 增加而使界 面电容相应降低，同时，介电常数减小引起电容的进一步下降。其测定通常基于电化学 交流阻抗谱进行，有关这类传感器的报道甚少。 1 3 电化学免疫传感器中生物分子的固定方法 将具有分子识别能力的生物功能物质，如酶、抗原、抗体、细胞等，包裹或吸附于 某些高分子材料、生物高分子或无机材料( 如分子筛) 上制备成感应器，这些称为生物功 能物质的固定化。生物分子固定化方法是研制免疫传感技术的关键，成为改善生物传感 稳定性、灵敏度、选择性等性能的最有效途径之一，并代表当前免疫分子固定化技术的 发展方向。通常要求采用的固定化程序既使所固定的生物分子具有较高的固定量，又能 使其免疫活性得以完好保持，还应能减少背景非特异性吸附以及易于传感器件的反复再 生等。然而传感器表面构造不一，它们与抗原抗体的结合特性都不同，这就需要不同 的固定方法使固定的抗原抗体在反应中不会脱落【3 6 】。固定方法决定着技术的稳定性、 灵敏度、选择性等性能。为了研制廉价、灵敏度高、选择性好和寿命长的生物传感器， 固定化技术已成为研究和探索的目标。经过多年来的工作，已经建立的固定化方法有： 吸附、共价键合、包埋、电化学聚合、层层自组装法【3 7 。4 3 】等。 6 西南大学硕士学位论文 第一章 1 3 1 吸附法 吸附固定法是生物功能组分通过分子极性键、氢键、疏水键以及静电等吸附作用固 定在不溶载体表面上的一种较为简单的固定方法。吸附载体的种类繁多，如金胶【6 1 ， 壳聚糖以及纳米氧化物等。吸附的牢固程度与溶液的p h 、温度、溶剂性质和种类等有 适当处理，用抗体或抗原溶液浸泡或涂敷，抗体或抗原由于分子间作用力固定在电极表 面。吸附固定法具有无需化学试剂、活化和清洗步骤少、生物组分不易降解、对生物能 物质生物活性影响小等优点。固定后的生物分子由于与载体相互作用力弱而容易从基体 脱落，存在稳定性和重现性差，因而没有被广泛应用。此外，变化、温度、离子强度和 电极基底较为敏感，需对实验条件进行优化，但若能找到适当的载体，这是很好的固定 化方法。 1 3 2 共价键合法 共价键合法是蛋白分子上的特定官能团和电极表面修饰( 如硅烷化) 等固相支持物 表面上的反应基团之一间形成化学共价键或通过修饰生物吸附剂( 如生物素亲和素) 间 接进行化学键合，实现免疫物质固定化的一种方法【4 7 棚1 ，从而使蛋白分子固定的方法。 由于蛋白分子与载体间连接牢固，不易发生脱落，有良好的稳定性及重复使用性。当向 电极表面共价键合生物组分时，须考虑诸多因素。这样的过程通常包括三个步骤：基底 电极表面的功能化，酶的偶联及除去键合疏松的酶。其要求酶具有与基质能发生反应的 特殊的官能团，且固定化后酶分子的取向是固定的，使底物与酶反应位点间的接触受到 一定限制j 此外，共价键合和交联过程所发生的剧烈化学反应对酶的存活十分不利。 1 3 3 包埋法 包埋固定法是利用溶胶一凝胶和微囊结构将生物分子直接包埋在多聚合物中一种 方法【5 ”9 1 。包埋法一般不涉及化学反应，生物功能物质的生物活性嫩能得到较好的保持。 该方法简单易行，可采用较温和的固定条件，包埋的生物活性分子较牢固及聚合膜的孔 径和几何形状可以调控，并且可以固定较高浓度的生物大分子，但高分子凝胶或半透膜 分子的尺寸选择性不利于大分子底物与产物的扩散。所用凝胶主要有聚丙烯酞胺、聚氯 乙烯( p v c ) 、聚乙烯醇( p v a ) 、醋酸纤维等合成高聚物及海藻酸、明胶、胶原等溶胶状 高聚物。但是也存在酶易从传感层渗漏，扩散限制问题。近年来，人工合成的聚合物如 n a t i o n ，e a s t m a na q 等将酶直接包埋到电极表面这些膜不但能包埋生物分子，还可以 抗干扰、抗毒化且膜比较致密酶分子不易渗漏，是较好的包埋材料。 1 3 4 电化学聚合法 电化学聚合法是将聚合单体和生物分子( 通常是酶) 同时混合于中性电解液中，通过 7 西南大学硕士学位论文第一章 恒电位或电位循环扫描法将单体电氧化或还原聚合在基础电极的表面，同时由于吸附或 静电作用可以将生物分子及其相关物质包埋于高分子膜内，直接固定于电极表面，是近 年来发展的聚合物包埋技术。与传统的方法相比，这种方法具有快速、简便、可控、便 于实现自动化操作的特点，尤其适用于生物传感器的微型化构造。但是用这种固定化方 法也存在固定的生物分子的量较小，背景电流较大，并且大量的生物分子被浪费在电聚 合溶液中的问题。另外，基于该方法所构造的生物传感器的稳定性和储存寿命有待于进 一步提高。 1 3 5 层层自组装法 层层自组装方法利用静电作用固定带有相反电荷化合物的一种固定化方法。由于该 方法的简单、多样性，并能够在分子水平上建立一种高度有序、稳定、重现性能良好的 膜等优点，分子自组装已成为一种广泛的表面衍生化过程，并使得它成为裁剪表面，以 使之具有所期望的性质的最有前途的方法，现己应用于多种生物分子( 酶、d n a 、蛋白 质、病毒1 的固定中。层层自组装可以是利用静电作用固定带有相反电荷的化合物，也 可以是利用生物生物特异性结合的特点( 如抗原抗体、生物素抗生物素的特异性结合， 以及生物素一亲和素之间的强亲和作用等) 来实现层层自组装。由于自组装单分子层的 有序性、稳定性、绝缘性和可调控性，使通过这种方法所构建的传感器在生物技术领域 中具有潜在的优势。但是，杂质吸附、分子聚合、溶剂选择、基片表面加工、分子设计、 有序性、缺陷的程度和性质等需要更深入的研究使得这些研究目前大多还停留在实验室 阶段。 1 4 电化学免疫传感器的应用 电化学免疫传感器因以上所述各种优点现已广泛地用于医学临床诊断、环境监测和 食品工业等领域，且获得了良好的可检测性。在国外，电化学免疫传感器己被用于多种 物质的测定，如除草剂、苯酚、人尿中的刺激性药物、i