肿瘤细胞免疫治疗.ppt

北京大学基础医学院王月丹,肿瘤免疫细胞治疗,肿瘤是机体中正常细胞，在不同始动与促进因素长期作用下所产生的增生与异常分化所形成的新生物。肿瘤的特点新生物一旦形成，不因病因消除而停止增生。它不受机体生理调节，而是破坏正常组织与器官。,肿瘤的概述,恶性肿瘤已经成为我国人群死亡的首要原因,免疫系统抗肿瘤细胞的免疫监视系统,肿瘤细胞免疫逃逸机制,肿瘤抗原变异与表达抗原的调变肿瘤细胞的“漏逸”肿瘤细胞低表达MHC分子肿瘤细胞缺乏共刺激分子肿瘤细胞产生大量抑制因子肿瘤微环境肿瘤细胞的抗凋亡作用,肿瘤细胞免疫治疗,肿瘤治疗的常用方法,手术化疗放疗生物治疗其他（如中医等等）,肿瘤生物治疗的内容,肿瘤细胞免疫治疗的时机,肿瘤（过继）细胞免疫治疗的类型,非特异性细胞免疫治疗LAK细胞TILCIKT细胞NK细胞特异性细胞免疫治疗DC肿瘤抗原特异性CTL转特异性TCR基因T细胞CAR-T/NK,肿瘤非特异性细胞免疫治疗,肿瘤非特异性细胞免疫治疗,LAK细胞TILCIKT细胞,肿瘤非特异性细胞免疫治疗的理论基础和原理,肿瘤的LAK细胞治疗,肿瘤的LAK细胞治疗,1982年Grimm等首先报道外周血单个核细胞（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异性的杀伤细胞，这类细胞可以杀伤多种对CTL、NK不敏感的肿瘤细胞，被称为淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）。目前尚未发现LAK细胞特有的表面标志。实验表明，LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。,ElizabethAGrimm,StevenA.Rosenberg,LAK细胞的来源和实质,目前尚未发现LAK细胞特有的表面标志。实验表明，LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞。应用LAK细胞过继免疫疗法或直接注射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，可获得一定的疗效。,LAK细胞的效果,1984年11月Rosenberg研究组经美国食品和药品检验局（UsFoodandDrugAdministration,FDA）批准下，首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。治疗用LAK细胞数量在0.6-18.4*1010，IL-2用量2.8*105-3.32*106U/kg。其中11例肿瘤缩小超过50%，1例黑素瘤完全消退。1988年该研究组总结了IL-2与LAK细胞协同治疗222例肿瘤患者，其中16便患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50%以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著。有报道乳腺癌、膀胱癌局部应用IL-2进行治疗也获得明显疗效。,LAK细胞的常见副作用,由于IL-2用量大，在治疗过程中，患者可出现毒副反应。最常见和最严重的毒副作用是出现毛细血管渗漏综合征（capillaryleaksyndrome,CLS），主要表现为全身性水肿和多器官功能失调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。引起该副作用的机理可能与内皮细胞损伤及其产生血管活性物质有关。,IL-2用量大易导致免疫细胞的AICD,卫生部关于禁止细胞制剂非法临床使用的通知1994-12-190:0发文单位：卫生部发布日期：1994-12-19执行日期：1994-12-19LAK细胞即淋巴因子活化的杀伤细胞，是国外八十年代后期开发的一种新制剂，据称治疗恶性肿瘤等有效果，但学术界对其评价不一，经过几年的临床研究，国外对其疗效倾向否定。但我国却在九十年代初，纷纷上马，用于治疗肿瘤。由于治疗方案各异，技术差异很大，操作环境不洁净，为此，危及病人生命安全的事例时有发生。为了加强细胞免疫制剂类临床研究的管理和质量控制，我部药政局曾以卫药发（93）第285号文下发了人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点，同时提出了一些初步管理规定，要求研究单位按质控要点的技术及条件规定进行报批。但至今仍有一些单位和个人无视国家的各项药政法律法规，不顾广大患者的生命安全，在利益驱动下，无限夸大LAK细胞的治疗效果，甚至将其使用到一些非肿瘤患者的身上，滥制滥用，给患者造成了不应有的伤害。,附：CD3AK细胞,CD3AK细胞是人体外周血单个核细胞经抗CD3单抗和IL-2联合诱导产生的，其扩增能力强、体外存活时间长、细胞毒性活性高、分泌淋巴因子能力强和体内外抗肿瘤效果显著等优点，成为多细胞治疗当中不可缺少的组成部分。针对病毒性肿瘤有较好的治疗效果。比如，宫颈癌、肝癌、鼻咽癌和B细胞淋巴癌等，同时对于成熟癌细胞也具有杀伤功效。直接杀伤作用：CD3AK细胞通过癌细胞受体，或不同于TCR复合体的识别机构，识别癌细胞，并与其结合，启动细胞溶解反应，释放一些细胞毒颗粒或因子，从而溶解癌细胞。间接杀伤作用：CD3AK细胞除自身直接溶解癌细胞外，还能分泌IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)、-干扰素(-IFN)等多种细胞因子对肿瘤细胞产生间接杀伤作用，此类因子对肿瘤细胞均有直接的细胞毒活性或抑制作用。,肿瘤的CIK细胞治疗,概述,CIK细胞最早疗法是美国斯坦福大学SchmidtWolf等于90年代首次报道的。CIK是人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(CD3单抗、IL-2、IFN-、IL-1等)共同培养1214天后获得的一群异质细胞。该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，因此具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞(NK)的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的特点。对肿瘤细胞的识别能力很强，能精确杀伤肿瘤细胞，但不会伤及正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。,CIK细胞抗肿瘤的机制,识别：CIK的细胞杀伤肿瘤细胞作用是非MHC限制性的；杀伤：表达的CD3+CD56+的CIK细胞能够产生最大的颗粒释放量，从而直接杀伤靶细胞；CIK细胞活化后产生大量炎性细胞因子：如IFN-、TNF-、IL-2等，可以直接抑制肿瘤细胞；还可以通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞；诱导肿瘤细胞凋亡：CIK细胞表达型跨膜糖蛋白(FasL)，增强了其对FasL+肿瘤细胞引发的Fas-FasL凋亡的抵抗性，还可通过对Fas+肿瘤细胞诱导凋亡行使其对肿瘤细胞发挥慢性杀伤作用，保证抗肿瘤活性的长期持久。,CIK的特点与优势,1、增殖能力强，主要效应细胞CD3+CD56+可增殖1000倍；2、杀伤活力强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子干扰素、白细胞介素2等；3、杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不受环孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，无严重不良反应。5、由于CIK细胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长或白发变黑，精神状态或体力明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量，延长生存期。,CIK细胞制备的流程,CIK细胞制备的关键细胞因子,细胞因子中IL-2效应最强，它能促进所有T细胞亚型增殖，虽然CIK细胞的杀瘤活性在体外并不依赖IL-2，但IL-2在体外可促进CIK细胞的增殖和杀瘤活性。将IL-2基因用电穿孔法转染CIK后，患者血清中的GM-CSF、IFN-、TGF-水平均有所升高，外周血中CD3+的淋巴细胞也增加。进一步研究发现IFN-加入CIK培养基中的时机至关重要，在加IL-2前24h向培养体系中加入IFN-比两者同时或在IL-2之后加入IFN-更能提高细胞毒性。,CIK的应用范围,转移性肾细胞癌（与化疗联合患者）卵巢癌胰腺癌肝细胞癌（相对疗效较低）白血病（CIK细胞联合造血干细胞移植）淋巴瘤多发性骨髓瘤肺癌等肿瘤,存在的问题与展望,获取CIK治疗的最佳疗效和最佳疗效的维持是目前CIK治疗的核心问题CIK细胞的数量和毒力是CIK治疗疗效的关键对CIK细胞的抗瘤机制还不是完全清楚CIK细胞的不良反应和治疗效果尚缺乏大规模随访及临床调查结果如何将CIK治疗和其他治疗手段结合获得更好的疗效如何获得足够数量具有更高细胞毒活性的效应细胞,肿瘤的TIL细胞治疗,肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL）,1986年Rosenberg研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocyte,TIL）。TIL细胞表型具有异质性，一般来说，TIL中绝大多数细胞CD3阳性。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例有差异，大多数情况下以CD8+T细胞为主。NK细胞的标记（CD16，CD56）在TIL体外加IL-2培养过程中有先增高后降低的趋势。,TIL细胞的制备与特点,用机械处理和酶消化方法，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润的淋巴细胞，加入高剂量IL-2体外培养，残存的肿瘤细胞7-13天全部死亡。经IL-2活化的TIL与来自PBMC的LAK细胞相比，其特点是：（1）可扩增50-100倍，在治疗中可以减少效应细胞和IL-2的用量，对LAK治疗无效的肿瘤仍有一定治疗效果；（2）主要由CD8阳性细胞诱导而来，在动物实验中发现TIL杀伤肿瘤作用具有特异性；,TIL细胞的制备与特点,（3）宿主的抑制状态有利于TIL的杀伤作用，因此治疗时加用环磷酰胺（Cy）100mg/kg可明显提高疗效，可能与免疫抑制药能消除抑制性细胞或因子，增强过继免疫治疗作用有关，因而可减少IL-2的用量，降低毒副反应；（4）可从手术切下肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中获得淋巴细胞，经加IL-2培养后，其生长、扩增能力强于LAK细胞，副作用明显低于IL-2/LAK疗法。,LAK/CIK和TIL的发展趋势,应用LAK或TIL细胞治疗发展的方向是：（1）提高LAK细胞的纯度（2）改变国际转移细胞在体内的分布，如改变注射细胞途径和方法（3）与其它细胞因子如IL-12、IFN、TNF-和CSF联合治疗，增强LAK的杀伤活性（4）将编码某些细胞因子（如IL-2、TNF等）cDNA转染LAK或TIL用于细胞免疫治疗（5）与DC疗法联合应用，提高治疗效率,肿瘤的T细胞治疗,T细胞,T细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由和链组成。主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3+T细胞的0.5%-1%。其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。,T细胞所识别的抗原种类有限,HSP；感染细胞表面CD1分子提呈的脂类抗原；某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；细菌裂解产物中的磷酸化抗原。,T细胞的作用机制,T细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。T细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。T细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。T能够利用细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。T细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿瘤信号。T细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。,T细胞疗法的特点及应用,T细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但杀伤肿瘤干细胞的作用不如NK细胞。杀伤癌细胞后，可协助DC细胞识别肿瘤抗原，并提呈给其他免疫细胞。T细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症（如消化道、呼吸道、生殖系统的肿瘤）治疗效果较显著。,肿瘤特异性细胞免疫治疗,DC肿瘤抗原特异性CTL转特异性TCR受体基因的T细胞CAR-T细胞/NK,肿瘤树突状细胞（DC）治疗,树突状细胞的发现,树突状细胞是由加拿大学者Steinman于1973年发现的，是目前所知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突状的突起而得名。DC能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。,RalphM.Steinman,人体内大部分DC处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和黏附分子，但未成熟DC具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟DC，成熟的DC表达高水平的协同刺激分子以及黏附分子等。,DC发挥作用的关键在于成熟,DC在恶性肿瘤的发生、发展及预后中发挥着一定作用，外周及肿瘤组织中DC数量减少或功能缺陷均会使其不能有效地递呈肿瘤抗原、激活T淋巴细胞、诱导抗肿瘤免疫反应，从而导致免疫缺陷或免疫无应答，最终导致肿瘤的发生、发展。,DC功能异常与肿瘤的关系,树突状细胞用于肿瘤免疫治疗的历史,2010年4月美国食品药品管理局(FDA)批准Provenge治疗激素抵抗的前列腺癌,DC免疫治疗的原理,使未成熟DC接触肿瘤相关抗原物质(肿瘤细胞溶解物、人工合成肿瘤多肽、DNA或RNA、肿瘤蛋白抗原等)或肿瘤抗原基因通过载体导入DC。联合体外细胞因子培养扩增获得DC，并模拟DC在体内的成熟过程，随后将这些致敏的DC回输到患者体内，作为疫苗可诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫反应。,DC疫苗可分为两类,目前DC疫苗可分为两类：DC基因疫苗和DC多肽疫苗DC基因疫苗：主要包括分别负载RNA、DNA、蛋白质的DC疫苗；导入编码肿瘤相关抗原、细胞因子基因的DC疫苗，通过提高其对抗原的摄取、加工、呈递能力，从而提高机体对肿瘤的抵抗能力。DC多肽疫苗：主要包括肿瘤细胞溶解物致敏DC；肿瘤特异性表位肽刺激的DC；肿瘤细胞与DC融合；Exosomes小体负载DC。由抗原递呈分泌的Exosome富含MHC、及其刺激分子，在肿瘤模型中可发挥有效的免疫刺激作用，已成为肿瘤免疫治疗的新热点。,DC基因疫苗,利用编码C-T抗原（HCA661）的病毒转染人DC用于诱导CTL应答,ChanRF,PangXW,WangYD,ChenWF,XieY.TransductionofdendriticcellswithrecombinantadenovirusencodingHCA661activatesautologouscytotoxicTlymphocytestotargethepatomacells.BrJCancer.2004Apr19;90(8):1636-43,DC多肽疫苗,DC多肽疫苗的原理,tetramerassays,IFN-ELISPOT,IFN-CytoSpot,美国Ludwig癌症研究所研制的NY-ESO-1b抗原肽疫苗已经取得了成功,Old与Rosenberg,DC免疫治疗的效果,手术,复发,免疫治疗,肿瘤消失,另一侧新生肿瘤,肿瘤组织减少,DC-CIK免疫治疗,DC-CIK,DC-CIK生物免疫疗法(或DC+CIK)是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillers,CIK）是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞（dendriticcell,DC）是有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可以通过型组织相容性抗原（MHC-）等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。,DC-CIK免疫治疗的原理,DC-CIK免疫治疗的制备过程,特异性CTL的肿瘤免疫治疗,特异性CTL肿瘤免疫治疗的原理,CTL细胞是机体抗肿瘤最重要的效应细胞，由肿瘤抗原激活并赋予抗肿瘤的特异性。CTL识别的是递呈在肿瘤细胞表面的并与MHC-I类分子结合的抗原肽片段被激活后的CTL主要通过分泌型（如穿孔素，颗粒酶，淋巴毒素，TNF相关蛋白等引起靶细胞裂解或凋亡）或非分泌型（表达FasL和TRAIL与靶细胞表面的相应受体分子结合，启动信号转导途径而诱导凋亡）途径杀伤靶细胞。,DC-CTL治疗的流程,第0天采集外周血50-100ml,经过实验室加工分离出DC细胞，在第6天的时候负载肿瘤抗原，于第7天获得成熟的树突状细胞；将获得成熟的树突状细胞与作为反应细胞的T淋巴细胞按照一定的比例共培养，在14天的时候即可获得CTL,获得CTL细胞分别于14天，21天，28天进行静脉回输。目前，DC-CTL治疗已经用于胰腺癌的免疫治疗中，并取得了一定的效果,DC-CTL细胞治疗,肿瘤特异性CTL很少单独应用于肿瘤的免疫治疗可以与DC联合应用，即DC-CTL治疗DC-CTL是指与DC细胞共培养的T细胞，其中T淋巴细胞作为反应细胞，通过DC细胞的抗原递呈，激活T细胞，生成效应性的CTL,转特异性TCR基因的T细胞肿瘤免疫治疗,TCR是T细胞识别抗原信号的受体,T细胞发育与TCR重排,CTL细胞抗肿瘤具有特异性，是因为其发育过程中，TCR基因重排，形成了TCR库的结果。,人体对肿瘤的免疫耐受导致肿瘤特异性T细胞数量少,常用的TCR基因转导系统,病毒载体系统逆转录病毒宿主细胞广泛，可高效感染大量细胞，应用20年慢病毒基因容量更大，不易沉默，自带启动子，不需修饰LTR，更安全非病毒载体系统转座子新型转导系统，随机整合，转导技术难度低，快捷方便RNA电穿孔技术要求高，易被RNA酶降解,2006年，Morgan等使用转MART1:p27-35表位特异性TCR转基因T细胞治疗黑色素瘤后来，又扩展到结直肠癌、滑膜肉瘤、神经母细胞瘤和淋巴瘤等CEA表位特异性TCR转基因T细胞结直肠癌NY-ESO-180%滑膜肉瘤和25%黑色素瘤,转特异性TCR基因T细胞的应用,在治疗黑色素瘤的过程中，由于黑色素抗原还会在眼、耳和皮肤等正常组织中表达，因此转特异性TCR基因T细胞，也可能造成这些组织细胞的损伤，而引起严重的副作用或不良反应癌/睾丸抗原（C/T抗原）特别适合制作转特异性TCR基因T细胞2015年，NY-ESO-1特异性TCR转基因T细胞治疗多发性骨髓瘤的临床应用报道连续在CancerCell，NatMed等杂志发表,转特异性TCR基因T细胞存在的问题,TCELLRESEARCHLAB,CTantigen:HCA587proteinexpression,IHCstainingwithanti-HCA587antibodya.Testis,intratubularstainingb.Purkinjicells,stainedincerebellumcPositivestaininginHCCd.Positivestaining