（发育生物学专业论文）大鼠骨髓间充质干细胞促进胰岛细胞再生的研究.pdf

个人简介4 6 中文论著摘要 大鼠骨髓间充质干细胞促进胰岛细胞再生的研究 背景及目的 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ) 是一种以高血糖为主要特征严重威胁人类健康的 疾病。全球每年有5 死亡是由于糖尿病的原因，据w h o 估计若不采取有效措施， 未来1 0 年每年因糖尿病而死亡的人数会增加5 0 。其中1 型糖尿病是由于自身免 疫病造成的l a n g e r h a n s 内的p 细胞的缺失，而2 型糖尿病是由于组织对胰岛素的 不敏感和b 细胞分泌胰岛素的减少。目前，临床上主要是采用注射胰岛素治疗1 型 及部分2 型糖尿病，但治疗效果未尽如人意。最近对患者成功移植胰岛或者b 细 胞，为攻克糖尿病提供了新的希望。但是，胰岛来源不足是目前最大的难题。 干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞，已经逐渐成为人们寻找胰岛b 细 胞替代物的新资源。利用胚胎干细胞体外诱导胰岛素分泌细胞为治疗糖尿病提供 了希望，但诱导胚胎干细胞分化比率低，诱导过程复杂，具有免疫排斥反应且易 成瘤，距离临床应用还需要克服很多技术上的困难。成体干细胞具有跨系分化的 能力，如肝干细胞可以分化为胰腺p 细胞，神经干细胞能够分化为血细胞等。骨髓间 充质干细胞( b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc d l s ，m s c s ) 是一类具有向多种细胞 分化潜能的细胞，是一种理想的组织工程种子细胞，易于提取，分离及扩增，在 特定的条件下，可以分化为骨、软骨、肌肉等中胚层组织细胞，还可以跨胚层分 化为神经细胞等。体外诱导m s c s 分化为胰岛素分泌细胞，为治疗糖尿病提供了 新的策略，但仍然面临分化过程复杂、分化比率低等困难。有研究报道，移植骨 髓可以缓解糖尿病症状，在一定程度上降低了糖尿病的高血糖。有研究表明小鼠 骨髓来源的干细胞( c 1 ( i t + ) 可以启动内源的胰腺的增殖，该项研究成果认为供体的 内皮细胞( p e c a m + ) 参与了胰腺细胞的再生。同种异体移植小鼠、大鼠的m s c s 可以修复多种组织损伤，如心肌缺血、肾、肺、脊髓损伤等，然而其修复机理仍 不清楚。在成年小鼠与成人中胰岛的增殖是通过已存在的胰岛p 细胞产生新的p 细胞，而不是通过干细胞分化的途径。移植m s c s 缓解糖尿病高血糖症状是否与 胰岛的增殖有关，尚未见报道。 c d k 4 基因是调节细胞的增殖一种细胞周期调节蛋白，通过与d c y c l i n 形成 复合物指导细胞由g 1 期进入到s 期。研究认为c d k 4 基因是胰岛p 细胞的再生、 增殖与衰老的重要的调节因子。因而m s c s 是否通过c d k 4 基因促进胰岛细胞的再 生缓解糖尿病高血糖症状，需要进一步的研究。 文献报道人与小鼠的胰岛在体外可以去分化成胰岛前体细胞n r s f r e s t ( n e u r o nr e s t r i c t i v es i l e n c i n gf a c t o r r e p r e s s o re l e m e n ts i l e n c i n gt r a n s c i p t i o nf a c t o r ， n r s f r e s t ) 基因在成熟的神经细胞与胰岛细胞中不表达，只在它们的前体细胞 中表达。胰岛的增殖是否通过去分化为r e s t 表达阳性细胞来完成，m s c s 是否 通过这种途径促进胰岛细胞的再生缓解糖尿病高血糖症状尚不清楚。 本课题组前期工作发现体外共培养胰腺细胞与m s c s ，可以诱导m s c s 分化 为胰岛样细胞。移植m s c s 到s t z 诱导的糖尿病大鼠体内观察到糖尿病症状的改 善，血糖的降低。本研究通过体内和体外实验两部分来探讨m s c s 是否促进胰岛 细胞的再生以及胰岛中c d k 4 与r e s t 基因表达情况。 方法 1 、大鼠骨髓间充质干细胞( m s c s ) i 构1 分离培养和鉴定 ( 1 ) 无菌条件下取大鼠股骨骨髓细胞离心做原代培养 ( 2 ) 根据细胞的贴壁性能不同选取贴壁不牢的细胞继续传代培养 ( 3 ) 流式细胞鉴定c d l 4 ，c d 3 4 ，c d 4 4 ，c d 4 5 ，c d 7 3 ，c d 9 0 的表达 2 、慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞( m s c s ) ( 1 ) 带有g f p 标签的慢病毒质粒的包装 ( 2 ) 慢病毒转染m s c s 3 、大鼠糖尿病模型的建立及移植转染的大鼠骨髓间充质干细胞 ( 1 ) 一次性腹腔注射链脲菌素建立大鼠糖尿病模型 ( 2 ) 监测大鼠血糖以确定建模是否成功 2 ( 3 ) 尾静脉注射转染的大鼠m s c s ( 4 ) 检测移植后糖尿病大鼠的空腹血糖的变化 4 、胰岛素免疫荧光染色评估胰岛大小并进行软件分析 ( 1 ) 获得大鼠的胰腺冰冻切片 ( 2 ) 禾i j 用胰岛素免疫荧光染色评估胰岛的大小 ( 3 ) , l j 用软件分析不同处理组胰岛大小的差异 5 、大鼠骨髓间充质干细胞( m s c s ) 分别与胰岛素分泌细胞系( i n s l ) 、 胰岛细胞共培养 ( 1 ) 大鼠胰岛细胞原代培养 ( 2 ) 分隔培养的方法将m s c s 分别和i n s l 细胞、胰岛细胞共培养 ( 3 ) r e a l t i m ep c r 检测细胞周期调控基因c d k 4 和r e s t 的表达情况 实验结果 1 、分离培养大鼠m s c s ，并经流式细胞术鉴定为c d l 4 ( 一) ，c d 3 4 ( 一) ，c d 4 5 ( ) ， c d 4 4 ( + ) ，c d 7 3 ( + ) ，c d 9 0 ( + ) 。 2 、移植细胞第1 1 天检测到移植组血糖显著比对照组低，但此后血糖值又再次 升高，与对照组无显著差异。 3 、在胰腺组织中发现带有g f p 标签的m s c s ，移植的m s c s 植入到胰腺组织 内部，并得到一定的增殖，但m s c s 自身并不表达胰岛素。 4 、移植组胰岛荧光面积显著大比对照组，体内损伤的胰岛细胞获得再生。 5 、m s c 分别与i n s l 细胞、胰岛细胞共培养后，i n s l 细胞、胰岛的c d k 4 基 因分别高表达2 2 8 1 、1 8 6 9 倍，即共培养后促进了i n s l 细胞与胰岛p 细胞增殖。 6 、m s c 与胰岛细胞共培养后，使胰岛r e s t 表达量提高1 6 0 8 倍。 结论皇日 - ，匕 1 、移植m s c s 短期可降低s t z 诱导的糖尿病模型大鼠的高血糖。 2 、m s c 与胰岛细胞共培养后，上调了胰岛c d k 4 、r e s t 的表达。 关键词 骨髓间充质干细胞，胰岛细胞再生，糖尿病，c d k 4 ，r e s t 3 英文论著摘要 b o n em a r r o wd e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s p r o m o t et h er e g e n e r a t i o no fi s l e t s i n t r o d u c t i o n d i a b e t e sw i t ht h em a i nc h a r a c t e ro fh i g hb l o o dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni sc o n s i d e r e d t ob eas e v e r ed i s e a s eo fh u m a nb e i n g d i a b e t e sc a u s e sa b o u t5 o fa l ld e a t h sg l o b a l l y e a c hy e a r d i a b e t e sd e a t h sa r el i k e l yt oi n c r e a s eb ym o r et h a n5 0 i nt h en e x t10y e a r s w i t h o u tu r g e n ta c t i o n t h et y p eid i a b e t e si sd u et ot h ed e c r e a s eo fa b s o l u t eq u a n t i t i e s o fi s l e t i s l e t t r a n s p l a n t a t i o nb e c o m e sa l le f f e c t i v e m e t h o df o rd i a b e t i ct h e r a p y h o w e v e r , t h ei m m u n er e j e c t i o na n dt h ed e f i c i e n c yo ft h ed o n o ra r eb i go b s t a c l e sf o r t h i sm e t h o d s t e mc e l l sa r em u l t i c l o n a lc e l l sc a p a b l eo fb o t hs e l f - r e n e w a la n dm u l t i l i n e a g e d i f f e r e n t i a t i o ni n t oa n yt y p eo fc e l la n dt ob eg e n e t i c a l l ym o d i f i e di nv i t r o ，t h u s p r o v i d i n gc e l l sw h i c hc a nb ei s o l a t e da n du s e df o rt r a n s p l a n t a t i o n i n d u c i n gt h ee s c e l l si nt ot h ei n s u l i n - s e c r e t i n gc e l lc l u s t e ri nv i t r oi sa n o t h e rd i r e c t i o nf o rt h ed i a b e t e s t h e r a p y b u tt h ep r o b l e m sa r et h el o wi n d u c t i o nr a t i o ，t h ec o m p l e xi n d u c t i o np r o c e s s ， t h ei m m u n er e j e c t i o na n dt h ee a s i n e s so ft u m o rf o r m a t i o n m a n yt e c h n o l o g i e sn e e dt o b er e s o l v e di no r d e rf o rt h ec l i n i c a la p p l i c a t i o n b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) a r ea d u l ts t e mc e l l si s o l a t e df r o mt h ea d u l tb o n em a r r o w , w h i c hp o s s e s sa n e x t e n s i v ep r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a la n da b i l i t yt od i f f e r e n t i a t ei n t ov a r i o u sc e l lt y p e s ，s u c h 龃o s t e o c y t e s ，c h o n d r o c y t e s a n dm y o c y t ee ta 1 m s c si se a s i l ya v a i l a b l e ，b e a r sl o w i m m u n er e a c t i v i t y , c a nb ee x p a n d e dl a r g e l yi nv i t r ow i t h o u ta l t e r a t i o no fg e n e t i c c h a r a c t e r s t r a n s d i f f e r e n t i o no fm s c si n t oi n s u l i ns e c r e t i n gc e l lc l u s t e r sh a sg r e a t c l i n i c a la p p l i c a t i o np r o s p e c t h o w e v e r , i ta l s oh a st h ep r o b l e m sl i k el o wd i f f e r e n t i a t i o n 4 r a t i o i tw a sr e p o r t e dt r a n s p l a n t i n gb o n em a r r o wc a nm i t i g a t et h ed i a b e t i cs y n d r o m e s a n dr e d u c et h eh i g hb l o o dg l u c o s e t h em e c h a n i s ms t i l ln e e d st ob ee l u c i d a t e d h e s s r e p o r t e d t h a tm o u s eb o n em a r r o wd e r i v e ds t e m c e l l s ( c k i t + ) c a ni n i t i a t e t h e r e g e n e r a t i o no ft h ee n d o g e n o u si s l e t t h e yt h o u g h tt h ed o n o rd e r i v e de n d o t h e l i a lc e l l s ( p e c a m + ) p a r t i c i p a t e di nt h er e g e n e r a t i o n h o w e v e r , t h em e c h a n i s mt h a tw h i c hc e l l f r o mt h eb o n em a r r o wc o n t r i b u t e ，a n di nw h i c hw a yt or e d u c et h eb l o o dg l u c o s es t i l lt o b ee l u c i d a t e d a l l o g e n i ct r a n s p l a n t a t i o no fm o u s ea n dr a tm s c sc a nr e p a i rm a n yt i s s u e i n j u r e s ，s u c ha sm y o c a r d i a li s c h e m i a ，k i d n e y , l u n gi n j u r e se ta 1 b u tt h em e c h a n i s ms t i l l r e q u i r e sb e i n gu n c o v e r e d s o m er e p o r t si n d i c a t e dt h a tt h en e w 1 3c e l l sw e r ef o r m e d f r o mt h ee x i s t i n gbc e l l sr a t h e rt h a nf r o mt h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h es t e mc e l l s i th a sn o tb e e nr e p o r t e dw h e t h e rm s c st r a n s p l a n t a t i o na l l e v i a t i n gs y m p t o m so fh i g h b l o o dg l u c o s eo fd i a b e t e sw a sr e l a t i v et ot h ep r o l i f e r a t i o no fi s l e t c d k 4g e n ei st h o u g h tt ob ek e yc e l lc y c l ep r o t e i nt or e g u l a t et h ec e l lp r o l i f e r a t i o n i tc a nd i r e c tt h ee n t r a n c et ot h esp h a s ef r o mg1 p h a s eb yf o r m i n gt h ec o m p l e xw i t h c y c l i nd c d k 4i sr e p o r t e dt or e g u l a t et h er e g e n e r a t i o n ，p r o l i f e r a t i o na n ds e n e s c eo f i s l e tbc e l l s s ow h e t h e rm s c sa l l e v i a t et h eh i g hg l u c o s es y n d r o m e so ft h es t z i n d u c e dd i a b e t e st h o u g ht h ep a t h w a yo fp r o m o t i n gt h er e g e n e r a t i o no fi s l e tn e e d st ob e e l u c i d a t e d i tw a sr e p o r t e dt h a th u m a na n dm o u s ei s l e t sc a nd e d i f f e r e n t i a t ei n t op a n c r e a t i c p r e c u r s o rc e l l si nv i t r o w h i l er e s tg e n ed i dn o te x p r e s si nm a t u r en e u r a lc e l l sa n d i s l e tc e l l s t h em e c h a n i s mo ft h ei s l e tp r o l i f e r a t i o nv i at h ed e d i f f e r e n t i a t i o nt or e s t p o s i t i v ec e l l ss t a g er e m a i n st ob ee l u c i d a t e d w h e t h e rm s c sp r o m o t et h er e g e n e r a t i o n o fi s l e tc e l l sb yt h i sw a yt oa l l e v i a t es y m p t o m so fh i g hb l o o dg l u c o s eo fd i a b e t e si sn o t c l e a r w ec o c u l t u r e dt h ep a n c r e a sl y s a t ea n dm s c si nv i t r o m s c sc o u l db ei n d u c e dt o b ei s l e t - l i k ec e l l s m s c sw e r et r a n s p l a n t e di n t ot h ed i a b e t i cr a ta n do b s e r v e dt h e d e c r e a s e so ft h eb l o o dg l u c o s ea n di m p r o v e m e n to fd i a b e t e ss y n d r o m s t h ea i mo fo u r s t u d yi st oe x p l o r et h ep o t e n t i a lm e c h a n i s mo fm s c s t op r o m o t et h er e g e n e r a t i o no ft h e s i s l e t1 3c e l l sb o t hi nv i t r oa n di nv i v oa n dt h ec d k 4a n dr e s t g e n ee x p r e s s i o nl e v e l s m e t h o d 1 、i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm s ci nv i t r o ( nt h et i b i a sa n df e t u s e so fr a t sa r er e m o v e da s e p t i c a l l yf o rt h ep r i m a r yc u l t u r e ( 2 ) s u b - c u l t u r et h ep r i m a r ym s c st og e tt h eh o m o l o g o u sc e l l s ( 3 ) i d e n t i f yt h ee x p r e s s i o n so f c d l 4 ，c d 3 4 ，c d 4 4 ，c d 4 5 ，c d 7 3 ，c d 9 0o f t h e m s c s b yf l o wc y t o m e t r ym e t h o d s 2 、l e n t i v i r u st r a n s f e c t i o no fm s c s ( 1 ) p a c k a g et h er e c o m b i n a n tl e n t i v i r u sp l a m i d sp g c l g f p ( 2 ) l e n f i v i r u st r a n s f e c t i o no ft h em s c s 3 、e s t a b l i s h m e n to ft h ed i a b e t i cr a tm o d e la n dm s c s t r a n s p l a n t a t i o n ( 1 ) e s t a b l i s h m e n to ft h ed i a b e t i cr a tm o d e lb yi n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f s t r e p t o z o c i n ( 2 ) g l u c o s ed e t e c t i o nt ov a l i d a t et h es u c c e s s f u le s t a b l i s h m e n to ft h ed i a b e t i cr a t m o d e l ( 3 ) c a u d a lv e i n st r a n s p l a n t a t i o no f t h et r a n s f e c t e dm s c s ( 4 ) d e t e c t i o no f t h ec h a n g e so f t h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o na f t e rt r a n s p l a n t a t i o n 4 、d e t e c t i o ni s l e t s q u a r e sb yi m m u n o c y t o c h e m i s t r ya n ds t a t i s t i c a l a n a l y s i s ( 1 ) o b t a i nt h ec r y o s e c t i o n so fr a tp a n c r e a s ( 2 ) v a l u et h es q u a r eo ft h ei s l e tb yi n s u l i ni m n m n o f l u o r e s c e n c e ( 3 ) u s et h es o f t w a r et oa n a l y z et h ed i f f e r e n c e sa m o n g g r o u p s 5 、c o c u l t u r eo fm s c sa n di n s u l i ns e c r e t i n gc e l ll i n ei n s 1 ，i s l e t s ( 1 ) c u l t u r et h em s c sa n di n s1 ，i s l e ti ns e p a r a t er o o mo fo n et r a n s w e l l ( 2 ) d e t e c tt h ee x p r e s s i o no fc e l lp r o l i f e r a t i o ng e n ec d k 4a n dr e s tb yr e a l t i m e p c r 6 r e s u l t s 1 、t h er a tb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e dt h e e x p r e s s i o no fc d l 4 ( - ) ，c d 3 4 ( - ) ，c d 4 5 ( - ) ，c d 4 4 ( + ) ，c d 7 3 ( + ) ，c d 9 0 ( + ) b yf l o w c y t o m e t r y 2 、t h eb l o o dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no ft h et r a n s p l a n t a t i o ng r o u pw a s s i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u pii d a y sa f t e rc e l lt r a n s p l a n t a t i o n h o w e v e r , t h eb l o o d g l u c o s ec o n c e n t r a t i o ne l e v a t e da f t e rt h e nw i t h o u ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dt ot h e c o n t r o lg r o u p 3 、t r a n s p l a n t e dm s c se n g r a f t e dt h ep a n c r e a s ，w i t h o u te x p r e s s i o no fi n s u l i n 4 、t h ei m m u n o f l u o r e s c e n c es q u a r ef r o mt h et r a n s p l a n t i n gg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l y l a r g e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p t h ei n j u r e di s l e tw a sp r o m o t e dt or e g e n e r a t e d 5 、t h ec d k 4g e n eo fi n s lc e l lw a sh i l g he x p r e s s e db y2 2 8 1a n d1 8 6 9f o l d s r e s p e c t i v e l ya f t e rc o c u l t u r i n gt h em s c sw i t hi n s1 ，i s l e t s 6 、t h er e s t g e n eo fi s l e tw a sh i g he x p r e s s e db y1 6 0 8a f t e rc o c u l t u r i n gt h em s c s w i t hi s l e t s c o n c l u s i o n 1 、t r a n s p l a n t i n gt h eb o n e - m a r r o wd e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sc a na l l e v i a t e t h eh i g hb l o o dg l u c o s es y n d r o m e so fs t zi n d u c e dd i a b e t i si nt h es h o r tp e r i o d s 2 、t h ec d k 4a n dr e s t g e n e sw e r eh i g he x p r e s s e da f t e rc o c u l t u r i n gt h ei s l e t sw i t h m s c s k e y w o r d s b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，i s l e tc e l lr e g e n e r a t i o n ，d i a b e t e s ，c d k 4 ，r e s t 7 英文缩略语 缩略语英文全称中文全称 m s c s d a p i g a p d h c d k 4 c d l 4 c d 3 4 c d 4 4 c d 4 5 c d 7 3 c d 9 0 s t z f b s p b s b s a g f p p e f n t r n r e a l t i m ep c r m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s骨髓问允质干细胞 4 ，6 一d i a m i d i n o 一2 一p h e n y l i n d o l e4 , 6 联脒2 苯基吲哚 h y d r o c h l o r i d e g l y c e r a l d e h y d e s p h o s p h a t e磷酸甘油醛脱氢酶 d e h y d r o g e n a s e c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e4细胞激酶4 c e l ld i f f e r e n t i a t i o n1 4 细胞分化簇1 4 c e l ld i f f e r e n t i a t i o n 3 4细胞分化簇3 4 c e l ld i f f e r e n t i a t i o n4 4细胞分化簇4 4 c e l ld i f f e r e n t i a t i o n4 5 细胞分化簇4 5 c e l ld i f f e r e n t i a t i o n7 3 细胞分化簇7 3 c e l ld i f f e r e n t i a t i o n9 0 细胞分化簇9 0 s t r e p t o z o c i n链脲菌素 f e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 p h o s p h a t eb u e f f e rs a l i n e磷酸缓冲液 b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n绿色荧光蛋白 p h y c o e r y t h r i n 藻红蛋白 f l u o r e s c e i n - 5 一i s o t h i o c y a n a t e 荧光素5 异硫氰酸 t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e四甲基罗丹明异硫 i s o t h i o c y a n a t e氰酸酯 d i t h i z o n e双硫腙 r e a l t i m ep o l y m e r a s ec h a i n 实时定量聚合酶链 r e a c t i o n 式反应 8 论文 大鼠骨髓间充质干细胞促进胰岛细胞再生的研究 刖舌 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ) 是一种以高血糖为主要特征严重威胁人类健康的 疾病。全球每年有5 死亡是由于糖尿病的原因，据w h o 估计若不采取有效措施， 未来1 0 年每年因糖尿病而死亡的人数会增加5 0 。其中1 型糖尿病是由于自身免 疫病造成的l a n g e r h a n s 内的p 细胞的缺失，而2 型糖尿病是由于组织对胰岛素的 不敏感和1 3 细胞分泌胰岛素的减少。胰岛移植正成为一种有效的治疗糖尿病的方 法，但又面临免疫排斥和供体来源不足的困难。 利用胚胎干细胞体外诱导胰岛素分泌细胞为治疗糖尿病提供了希望【l 】，但诱 导胚胎干细胞分化比率低，诱导过程复杂，具有免疫排斥反应且易成瘤，距离临 床应用还需要克服很多技术上和伦理上的困难。成体干细胞具有跨系分化的能力， 如肝干细胞可以分化为胰腺p 细胞，神经干细胞能够分化为血细胞等。由于 f e r i d n e s t e i n 掣i 】的开创性工作，发现在成年个体的骨髓中存在一定数量的m s c s ( m s c ) 能够分化形成多种中胚层组织，包括骨、软骨、肌健、肌肉、脂肪组织以 及骨髓基质结缔组织，而且注射人脑后，还能分化为神经细胞。骨髓间充质干细 胞( b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 是来源于骨髓的一种成体干细胞， 具有向中胚层分化能力和多胚层分化潜力。m s c s 易于获得，免疫原性低，可在 体外大量培养而仍保持其遗传性状不发生改变【2 】。尝试体外诱导m s c s 向胰岛素 分泌细胞转分化具有重要的临床意义【3 1 ，但是仍然面临分化比率低等问题【4 1 。研究 表明，骨髓移植可以缓解糖尿病症状，降低血糖，但其具体机理尚存争议【5 】【6 】。 同时移植m s c s 到糖尿病小鼠、大鼠体内，也发现了血糖的降低，糖尿病症状的 改善【7 】【8 1 。有报道称在成体小鼠与人胰岛的增殖是由于已存在的胰岛p 细胞产生新 的p 细胞，而不是通过干细胞分化的途型9 】【l o 】。 细胞的增殖主要与细胞周期蛋白有关，c d k 4 基因是g l 期到s 期一种细胞周 期调节蛋白，通过与d c y c l i n 形成复合物调节细胞的增殖，是判断胰岛增殖的一 9 个重要指标。研究认为c d k 4 基因调控胰岛d 细胞的再生、增殖与衰老【l l 】。c d k 4 通过促进胰岛中静息的p 细胞重新进入细胞周期，来增加胰岛的体积【1 2 】。移植后 的m s c s 是否通过改变c d k 4 的表达，促进自身胰岛细胞的增殖来发挥作用尚未见 报道。 然而增殖细胞的来源是胰岛细胞本身，还是胰岛以外的干细胞还有争议【b 】。 n r s f r e s t 基因在成熟的胰岛细胞沉默，是胰岛细胞成熟的必备条件。 n r s f r e s t 通过与r e l ( r e p r e s s o re l e m e n t1 ，r e l ) 序列的结合抑制神经相关的基 因的表达，而与胰岛1 3 细胞分化相关的基因中同样含有r e l 序列【1 4 】。r e s t 的沉 默后促进了神经干细胞向成熟神经细胞的分化f 1 5 】。成熟的胰岛p 细胞自身分裂比 例很低，文献报道人与小鼠的胰岛在体外可以进行去分化成胰岛前体细胞【1 6 】【1 7 1 ， 因而胰岛的增殖中是否含有胰岛p 细胞去分化为r e s t 表达阳性细胞，以及与胰 岛增殖的关系仍需进一步研究与探讨。 本课题组前期工作发现体外共培养胰腺细胞与m s c s ，可以诱导m s c s 分化 为胰岛样细胞。移植m s c s 到s t z 诱导的糖尿病大鼠体内观察到糖尿病症状的改 善，血糖的降低，但未观察到移植的m s c s 表达胰岛素【1 8 】。为进一步探讨移植 m s c s 治疗s t z 诱导的糖尿病的机理，我们采用体外共培养与胰岛大小定量分析 的方法，观察对损伤胰岛的增殖影响。检测胰岛增殖相关的基因c d k 4 与r e s t 的 表达情况，研究m s c s 在体内外对胰岛的影响。 材料与方法 一、试剂与仪器 1 、试剂 i n s l 细胞系购自武汉中国典型培养物保藏中心。低糖d m e m 、1 6 4 0 、0 2 5 胰酶培养基购自g i b e o 公司，特级胎牛血清购自h y c l o n e 公司，慢病毒转染试剂盒 购自上海吉凯公司，t r i z o lr n a 提取试剂盒购自i n v i t r o g e n 公司。l i b e r a s et l 购 自r o c h e 公司。血糖试剂盒购自a b b o a 公司，小鼠抗大鼠胰岛素单克隆抗体， h i s t o p a q u e - 1 0 7 7 、链脲菌素s t z 购自s i g m a 公司，d a p i 购自r o c h e 公司，藻红蛋 白( p e ) 标记的小鼠抗人c d 4 4 单克隆抗体，异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记小鼠抗 人c d 3 4 单克隆抗体，兔抗人c d l 4 多克隆抗体( s a n t ac r u z ) ，山羊抗人c d 7 3 多克 隆抗体，兔抗人c d 9 0 多克隆抗体购自s a n t ac r t l z 公司。异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标 记的山羊抗兔、兔抗山羊，罗丹日f ( t r i t c ) 标记的山羊抗小鼠i g g 购自北京中山 金桥公司。 2 、常用溶液的配制 m s c 培养液：低糖d m e m ( g i b c o ) 、1 0 胎牛血清( h y c l o n e ) i n s l 培养液：1 6 4 0 ( g i b c o ) 、1 0 胎牛血清( h y c l o n e ) 、l m m 丙酮酸钠、1 0 m m h e p e s 、o 0 5 m1 3 - 巯基乙醇 胰岛消化液：5 m g 的l i b e r a s et l 溶于2 4 m lh a n k s 液中，即工作液为 1 0 8 1 洲l i b e r a s et l 胰岛培养液：1 6 4 0 ( g i b c o ) 、1 0 胎牛血清( h y c l o n e ) 双硫腙( d t z ) 染液：称取1 0 m gd t z 溶于3 m l 无水乙醇中( 含5 0 “l 浓 n i l , o h ) ，加h a n k s 液1 2 m l ，此为储存液。临用时用h a n k s ( p h 7 8 ) 1 ：1 0 0 稀释，0 2 2um 孔径过滤除菌。 链脲菌素( s t z ) 溶液：将s t z 溶于o 1 m o l l 枸橼酸钠( p h 4 2 ) 。s t z 终浓度 为2 。 3 、常用仪器设备 ( 1 ) d n a 扩增仪( b i o m e t r at _ g r a d i e n t ) ( 2 ) a l p h a i m a g e r3 4 0 0 凝胶成像系统 ( 3 ) 7 2 2 型分光光度仪 ( 4 ) 水平琼酯糖电泳仪( 北京六一) ( 5 ) a b ip r i s m7 5 0 0r e a l t i m ep c rs y s t e m ( a p p l i e db i o s y s t e m s ) ( 6 ) 小型台式离心机( s i g m a1 1 5 ) ( 7 ) 电子分析天平( s a r t o r i u s ) ， ( 8 ) 倒置显微镜( o l y m p u sc k 4 0 ) ( 9 ) 荧光显微镜( o l y m p u sb x 5 1 ) ( 1 0 ) 低温高速离心机( s i g m a3 1 6 k ) ( 1 1 ) 半自动生化分析仪( v i t a l ) ( 12 ) i n s e r t ( b df a l c o n t m ) ( 1 3 ) 流式细胞仪( b d ) ( 1 4 ) c 0 2 孵箱( h e r af i l t e r ) ( 1 5 ) 解剖显微镜( n i k o ns m z 1 4 0 ) 二、实验方法 1 、大鼠m s c s