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氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的 电化学及光谱研究 摘要 本论文主要用电化学方法和光谱方法研究了一种配合物( 氨基吩嗪铜) 和两 种染料( 核固红、红紫素) 与d n a 的相互作用。 论文主要由四部分组成，第一部分综述了小分子与d n a 相互作用的研究和 d n a 电化学传感器的研究；第二部分合成并表征了一种新型铜配合物，以电化学 和荧光光谱法研究了配合物与d n a 的相互作用。配合物与d n a 主要以静电作用 模式结合，并计算了二者间的结合位点和结合常数；第三部分研究了核固红与 d n a 的相互作用。结果显示，核固红与d n a 主要以静电作用模式结合，结合位 点为1 ，结合常数为7 2 9 x 1 0 5l m o l ；而在高离子强度下，其主要作用模式改变为 嵌插作用；第四部研究了红紫素与d n a 的相互作用。实验结果表明，二者是以 静电结合模式相互作用。并对结合条件及测定条件进行了优化。最后对论文的主 要内容作了总结。 关键词d n a 铜配合物核固红红紫素相互作用电化学 氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 e l e c t r o c h e m i c a la n ds p e c t r o s c o p i c s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fc o p p e r c o m p l e xa n dd y em o l e ( 、u l e s a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h ei n t e r a c t i o no fo n ec o m p l e x ( c u ( d a p h 2 + ) a n dt w od y e s ( n u c l e a rf a s tr o da n dp u r p u r i n c ) w i t hd n aw e r ei n v e s t i g a t e du s i n ge l e c t r o c h e m i c a l a n ds p e c t r o s c o p i cm e t h o d s t h ep a p e ri sm a d e 叩o ff o u rp a n s f i r s t l y , as u m m a r yr e f e r r i n gt ot h ei n t e r a c t i o n o fs m a l lm o l e c u l e sw i t hd n a , a n dt h ed e s i g n a t i o no fd n ae l e c t r o c h e m i c a ls 9 1 1 , n a n di t sp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c ew a sr e v i e w e d i np a r tt w o ，an o v e lc o p p e rc o m p l e xw a s s y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e d t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc o m p l e xa n dd n aw a ss t u d i e d b ye l e c t r o c h e m i c a la n df l u o r e s c e n c em e t h o d s t h ec o u l db i n dt od n am a i n l yb y e l e c t r o s t a t i cb i n d i n gm o d e t h eb i n d i n gs i t es i z eo ft h ec o m p l e xt od n ai sc a c u l a t e d t ob c2 5a n dt h eb i n g d i n gc o n s t a n ti s4 0 7 x 1 0 41 m 0 1 p a r tt h r e ei sa b o u tt h eb i n d i n g m o d eo f n u c l e a rf a s tr e dt od n a t h ee x p e r i m e n t sc o n f i r mt h a tn u c l e a rf a s tr e db i n d t od n at of o r ma1 ：1a s s o c i a t i o nc o m p l e xw i t ht h eb i n d i n gc o n s t a n t7 2 9 x 1 0 5l m o l ， a n dt h em a j o rb i n d i n gm o d eo fn u c l e a rf a s tr e dt od n ai se l e c t r o s t a t i cb i n d i n g h o w e v e r , a th i 曲i r o ns t r e n g t h ，t h em a j o rb i n d i n gm o d ec h a n g e si n t oi n t e r c a l a t i v e b i n d i n g p a r tf o u ri sa b o u ti n v e s t i g a t i o no nt h ei n t e r a c t i o no fp u r p u r i n ew i t hd n a w i t ht h ee x p e r i m e n tr e s u l t s ，t h ee l e c t r o s t a t i cb i n d i n gi n t e r a c t i o nb e t w e e np u r p u r i n e h 青岛科技大学研究生学位论文 a n dd n ac a nb ec o n c l u d e d t h eo p t i m a lb i n d i n gc o n d i t i o n sw e l ea l s os t u d i e d a tl a s t , t h ec o n c l u s i o no f t h et h e s i si sl i s t c d k e yw o r d sd n a , c o p p e rc o m p l e x ，n u c l e a rf a s tr e d , p u r p u r i n e ，i n t e r a c t i o n , e l e c t r o c h e m i s t r y i l i 符号说明 c v ：循环伏安 c ：溶液浓度m o l l ， d p v ：微分脉冲伏安 e ：峰电位v 岛：峰电流肚 a i p ：峰电流差值肛a m ：质量 g p h ：溶液酸度 t ：时间s t ：温度 v ：扫描速度m v s v 忱：扫描速度的平方根( m y s ) 1 彪 v ：溶液体积“l 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请 的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名 日期：1 椰 年月v 日 ， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 本人签名： 导师签名： 日期：年月日 r 期：聊年占月二日 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 d n a ( 脱氧核糖核酸) 是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础。d n a 在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着重要的作用。早在一百多年前，人 们就发现微生物的细胞核可与碱性染料结合显色，便于在显微镜下观察。由于染 料往往具有氧化还原活性，小分子有机染料与d n a 的作用便成为电化学研究的 一个重要课题。后来又发现以磷酸酯为底物的多种天然酶，如d n a 聚合酶lp 1 核酸酶等都含有两个或多个金属离子，这给人们以提示，使得金属配合物与d n a 相互作用的研究逐渐增多。 分析化学方法是研究d n a 与小分子相互作用的有力手段。如电化学法 可以模拟生理条件下的氧化还原反应等，用来研究生命现象有其天然优势。 用分析化学方法来研究d n a ，不仅能促进自身学科的发展，也为生命科学 的研究提供了新的手段。 1 1d n a 的结构与性质 1 , 2 1 1 1 1d n a 的化学组成 一盛苷 d _ 2 = 了戮 、 i 胞嘧啶 d n a 是一种由很多单元组成的线性大分子，它的基本结构重复单元是脱氧核 苷酸，组成结构如上图所示。d n a 在碱基组成上遵从c h a r g a f f 规则，即腺嘌呤和 胸腺嘧啶的物质的量相等，鸟嘌呤和胞嘧啶的物质的量相等，嘌呤的总数等于嘧 啶的总数。 氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 1 1 2d n a 的结构 虽然d n a 分子的形态和大小多种多样，但作为遗传的物质基础，d n a 的基 本结构存在许多共同点。 ( 1 ) d n a 的一级结构。d n a 由多条脱氧核糖核苷酸链构成，每条链均以磷酸 基( 磷酸酯键) 为桥，从一个核苷的3 。连接到相邻核糖的54 位置上。d n a 的一级 结构是指脱氧核糖核苷酸通过3 。，5 。磷酸二酯键连接成没有支链的直线或环形结 构。 ( 2 ) d n a 的二级结构。w a t s o n 和c r i c k 于1 9 5 3 年提出了d n a 的双螺旋模型， 即d n a 是由两条反向平行的多核苷酸链围绕着同一中心构成的双螺旋结构。两 条链都是右手螺旋，碱基在螺旋的内侧，碱基平面与纵轴相垂直。磷酸基与脱氧 核糖在外侧，彼此间通过磷酸二酯键相连，形成d n a 骨架。两条多核苷酸彼此 依靠碱基对之间的氢键连结在一起。对于整个d n a 链来说，其碱基位于螺旋链 的内侧，是疏水性的，而由磷酸二酯键形成的多核苷酸骨架位于外侧，是亲水性 的。在双螺旋的表面有两条深浅不一的沟：大沟和小沟。 1 1 3d n a 的性质 d n a 具有严格的双螺旋结构，天然d n a 分子最长可达数厘米，而分子的直 径只有2 n m ，这种丝状的双螺旋结构使d n a 具有显著的物理化学特性：极大的 粘度、机械张力，在溶液中加热变性转变成线团等。 ( 1 ) 紫外吸收。由于d n a 中含有共轭双键结构的嘌呤和嘧啶碱基，因而具有 强烈的紫外吸收性质，其最大吸收波长在2 6 0 n m 处。蛋白质的最大吸收波长为 2 8 0 n m ，通过测定2 6 0 n m 处与2 8 0 n m 处的吸光度，并计算他们的比值可估计d n a 的纯度。 ( 2 ) 酸碱性。溶液的p h 值直接影响d n a 双螺旋结构中碱基之间氢键的稳定 性。碱基对在p h4 1 1 0 之间最稳定，超出此范围，d n a 就要变性。 ( 3 ) 变性。包括酸碱变性和热变性，同时某些有机溶剂也可引起d n a 的变性。 d n a 的变性是指d n a 的双螺旋结构解开，氢键断裂，但并不涉及核苷酸间共价 键的断裂。 ( 4 ) 电化学性质。在d n a 的组分中，核糖和核磷酸均不具有电活性，鸟嘌呤、 腺嘌呤和胞嘧啶均可在汞电极上还原产生还原峰，而鸟嘌呤在汞电极1 6 0 v 下还 原的产物还可在0 3v 产生一个氧化峰。鸟嘌呤和腺嘌呤可在碳电极上氧化，腺 嘌呤的氧化峰约在+ 1 2v ，鸟嘌呤的氧化峰约在1 0v 【3 1 。 2 青岛科技大学研究生学位论文 1 2 与d n a 的相互作用的小分子物质 1 2 1 金属配合物 无机金属配合物是近年来研究d n a 与小分子相互作用的热点之一。由于在 合成上简单、与d n a 作用明显，以过渡金属为中心离子的配合物更加受到人们 的关注，特别是铜配合物及一些铁配合物。金属配合物和d n a 相互作用的研究 具有很高的理论价值和使用价值 4 - 9 。研究目的主要有以下几点： ( 1 ) d n a 探针。八十年代初，b a r t o n 发现配合物刚p h 锄) 3 2 + 的不同异构体与 d n a 作用时存在选择性，由此在生物无机化学方面开辟了用金属配合物作为 d n a 结构探针的新研究领域。通过插入作用与d n a 结合的八面体过度金属多吡 啶配合物具有结构稳定，光化学和光物理性质丰富等特点，当它们与d n a 结合 时，其紫外或荧光光谱均表现出明显的变化。金属配合物作为d n a 探针，对探 索d n a ，尤其病变d n a 的结构和遗传信息具有重要的实用价值。例如以钌( ) 多吡啶配合物为探针研究d n a 的结构及构象变化是近来生物无机化学的热点 1 0 - 1 3 在研究d n a 内部的电子转移和识别d n a 的结构方面，都起到了重要的作 用。 ( 2 ) 抗癌药。1 9 6 9 年，顺铂首次被报道具有抗肿瘤活性，随之被应用于i 临床 试验。尽管单核顺铂抗癌药物具有一定的副作用，但它却开辟了小分子金属配合 物作为抗癌药研究的新领域，因为配合物种类繁多、结构和性质易于调整，完全 可以开发出副作用小、抗癌效果更好的药物来。深入研究金属配合物和d n a 的 相互作用，从复制、转录及遗传基因等方面揭示金属配合物的抗癌机理，对抗癌 药物的研制与开发将具有非常重要的理论指导意义。 ( 3 ) d n a 特异性位置识别及d n a 的断裂。利用金属配合物的构型选择，使 其特定插入d n a 的某一沟区，然后再通过辅助配体与d n a 沟壁上碱基的氢键作 用和范德华力，可望实现对d n a 的定点位置的识别，从而能模拟某些d n a 结合 蛋白的特异性识别功能，达到对某些结合蛋白反应性的顶点抑制。配合物通过对 特定d n a 位点的选择性结合，然后对其磷酸二酯键的水解断裂可尝试作为天然 d n a 限制性内切酶的替代品，从而用来切割核酸，然后通过核酸连接酶将不同的 d n a 或r n a 片段连接起来，以达到对核酸的重组。 因此研究金属配合物和d n a 相互作用方式和机理，总结其相互作用的一般 规律，对探索配合物在抗肿瘤药物、分子生物学、生物工程技术及其它相关领域 的应用具有非常重要的意义。 3 氮基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 1 2 2 染料分子 一些有机染料分子 1 4 - 1 9 3 ，如具有平面结构的多环芳香烃，可以嵌插结合方式 作用于d n a 分子碱基对，还可以其自身所带电荷与d n a 发生静电作用。这类小 分子如吖啶类、吩噻嗪类、吩嚷嚷类、卟啉类等多用作检测d n a 的各类探针。 此外，一些三苯甲烷类染料如乙基紫f 2 0 , 2 、结晶紫等常用于研究d n a 与小分子 之间的作用。 1 2 3 抗生素 以d n a 为靶向的抗生素可分为多种类型：( 1 ) 多肽及蛋白质类抗生素，如博 来霉素 2 2 , 2 3 1 ，它是一种天然存在的糖肽，临床上常被用来治疗头、颈及鳞状细胞 癌。文献等曾对博来霉素与d n a 相互作用的条件、机理作过报道。( 2 ) 葸环类 抗生素，这是一类研究较多的抗癌抗生素，如阿霉素 2 5 , 2 6 、道诺霉素 2 3 5 、诺加霉 素【2 8 】、柔红霉素等。( 3 ) 烯炔抗生素，这是一类在临床与理论研究中都有很大价 值的抗癌抗生素。这类抗生素结构上的独特之处在其分子中含有一个张力较大的 烯二炔环，一个能与d n a 接近的引导系统，另有激发系统以激活并起动级联反 应。新制癌素 3 0 l 是此类抗生素的代表。( 4 ) 乙撑亚胺类抗生素，这类抗生素的代表 物丝裂霉素 3 1 , 3 2 1 是一种临床上常用的重要抗肿瘤药物。 1 3 小分子与d n a 的相互作用 1 3 1d n a 与有机小分子的作用模式 3 3 - 3 q d n a 分子中平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架和两条核苷酸链螺旋形 成的大沟和小沟构成了有机小分子与d n a 相互结合的位点，作用的方式主要有 共价结合、剪切作用、长距组装及非共价结合等四种类型，另外还有氢键、范德 华力、疏水作用等弱相互作用。绝大多数的小分子与d n a 的作用形式为非共价 结合，它又包括静电作用、嵌入结合和沟面结合，而且通常不是一种力的单独作 用，而是多种作用力的协同作用。 1 3 1 1 共价结合 共价结合包括d n a 与亲核试剂及亲电试剂的作用，是指有机小分子与d n a 的各种碱基以共价键结合生成稳定的配合物，主要有核酸的烷基化反应，d n a 的 链内交联、链间交联反应等，虽然符合条件的有机小分子不多，但与非共价结合 相比，其特异性识别能力要强得多，而且反应不可逆。 4 青岛科技大学研究生学位论文 1 3 12 剪切作用 有机小分子通过与d n a 分子双链的特异性结合而导致d n a 链的断裂，断裂 的位点是由小分子与d n a 结合的选择性决定的。这种剪切作用导致d n a 的损伤， 也是导致基因突变的原因。 1 3 13 长距组装 带正电的有机小分子对d n a 有凝聚作用，当其与d n a 作用时，会诱导d n a 超螺旋结构的形成。有机小分子在d n a 表面进行排列或堆积称为有机小分子在 d n a 分子表面的长距组装。 1 3 1 4 非共价作用 ( 1 ) 静电作用。指小分子与d n a 分子的带负电荷的核糖磷酸基骨架之间通过 静电作用而结合。该作用没有选择性，是非特异性的。 ( 2 ) 嵌入结合。是指平面芳环的小分子嵌入d n a 分子双螺旋的碱基对之间。 结合的作用力来自芳环的离域f 体系与碱基的丌体系间形成1 1 - i 相互作用及疏水 相互作用。大部分金属配合物和抗癌药物与d n a 的相互作用都存在插入方式。 ( 3 ) 沟槽结合。即小分子与双链d n a 的大沟或小沟的碱基边缘直接发生相互 作用。小分子与d n a 的小沟壁紧密作用，作用形式主要是氢键作用和范德华力。 小分子主要在小沟区发生结合，这是由于小沟区为a t 富集区，而且存在水合结 构，具有芳香环结构的小分子易于自由扭转来适合小沟区，同时取代沟内的水分 子进入小沟区。大沟结合的药物和d n a 主要以氢键结合。 1 3 2 小分子与d n a 相互作用的研究方法 用来研究小分子与d n a 的相互作用技术多种多样，主要有紫外可见吸收光 谱法( u v - v i ss p e c t r a ) 、核磁共振( n m r ) 光谱法、荧光光谱法、x - r a y 晶体衍射法、 圆二色谱( c d ) 和线二色谱( l d i ) 法、红外光谱( 和共振拉曼光谱法( r r ) 、序列凝 胶电泳、足印迹分析技术、表面等离子体共振技术( s p r ) 和电化学方法等。 与其他方法相比，电化学在d n a 研究方面相对较少，起步也较晚，但它可 以获得其他方法难以得到的信息。本文主要采用电化学分析法研究d n a 与小分 子的相互作用。 1 4d n a 电化学传感器的研究 d n a 杂交生物传感器为基因的识别和疾病的诊断提供了一种快速、简便、廉 氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 价的方法。d n a 传感器包括光学型、质量型和电化学型【3 8 1 。d n a 传感器技术广 泛地应用于生命科学、医学和药物筛选等领域。对于它的研究有助于认识生命的 起源、遗传、发育与进化，以及为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径， 同时也为生物大分子的全新设计、药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因 组学研究提供技术支持平台。d n a 电化学传感器是9 0 年代出现的一个新的研究 热点。它是将有反应活性的一单链寡核苷酸固定在某种支持物( 如电极) 上作为 探针，它可以在含有复杂成分的环境下特异地识别出某一靶子底物，并通过换能 装置把非电量生物信号转换为电信号。d n a 电化学传感器是一种全新的基因检测 技术，它不仅具有分子识别及传感功能，而且还具有良好的分离纯化基因功能 1 3 9 “】。因此在分子生物学和生物医学工程领域有很大的实际意义。 1 4 1d n a 电化学传感器 d n a 电化学传感器一般由基底电极、d n a 探针和杂交指示剂三部分构成h 坷。 常用的基底电极有碳质电极和金属电极。d n a 探针是含有互补基因序列的短寡聚 核苷酸探针，能与靶基因杂交形成双链。杂交指示剂是一类能与s s d n a 和d s d n a 以不同方式相互结合的物质，基于杂交指示剂与s s d n a 和d s d n a j 盘择性结合能力 的差异来识别d n a 的杂交是否发生。 d n a 电化学传感器测定d n a 的整个过程包括三个环节：( 1 ) 探针d n a 的固 定，即将长度为十几到几千个碱基不等的单链d n a ( s s d n a ) 片段固定到电极表 面，这种s s d n a 与目标d n a ( 靶基因) 呈碱基序列互补。( 2 ) 杂交过程，将探针 d n a 与靶向d n a 在适当的温度、离子强度、p h 、缓冲溶液等杂交条件下杂交形 成双链，从而导致电极表面结构的变化。( 3 ) 杂交的指示，即通过电极表面电活性 指示剂所引起电信号( 如电压、电流、电导或电化学阻抗) 的变化体现出来，进 而可用于靶基因的定性定量分析。 目前基因探针电极的制备主要有6 种方法：自组装膜法、共价键合法、生物 素一亲和素反应法、吸附法、合成法和l b 膜法。固定基因探针必须要考虑使寡核 苷酸探针能有效地连接于电极上并保持其与待测分子的特异结合活性。上述方法 各有利弊，但总的来看，通过巯基化合物自组装共价键合反应固定基因的方法比 较有发展前景。 1 4 2d n a 电化学检测方法 杂交信号的检测技术是d n a 电化学传感器的关键技术。根据电化学检测方式 的不同主要可分为伏安法、电位法、电致化学发光法等。 ( 1 ) 伏安法。伏安法d n a 传感器是以所加入的氧化还原活性物质与杂交后的 6 青岛科技大学研究生学位论文 d s d n a 分子作用引起的氧化还原峰电流或电位的变化或位移来进行测定。 m i l l e l s e l l 等【4 6 j 以c o 帅y ) 3 3 + 及c o ( p h e n ) 3 3 + 为杂交指示剂，由于杂交后双链d n a 的形 成导致电极表面金属配合物的富集，从而给出高于单链时的峰值电流。通过测定 杂交指示剂阴极峰电流响应的增大，检测了1 8 个碱基长度的囊性纤维变性基因 af 5 0 8 序列缺失，杂交快速，结果满意。电极经热去离子水浸泡冲洗后可进行2 3 轮杂交。m 器c i n i 【4 7 】等用吖啶橙、苯酰胺染料h o e s c h t 3 3 2 5 8 、道诺霉素( d a t m o m y c i n ) 等氧化还原试剂作为指示剂比较发现：在杂交反应后将电极置于含d a u n o m y c i n 的 溶液中，由于指示剂插入到电极表面形成的d n a 双链分子的碱基对之间，引起伏 安测定中峰的正向漂移增加，增加幅度与被检测基因的浓度有关，从而可检测靶 基因。对于非互补基因序列，峰的漂移很小，可以忽略。h a s h i m o t o 等【删以h o e s c h t 3 3 2 5 8 作为添加指示剂，以巯基化的d n a 修饰a u 电极，通过检测反应后峰电流的增 加量可对1 0 气1o 1 0 9 ，l 的靶d n a 进行定量检测。文献报道印l 在杂交反应后将电极 置于含道诺霉素的溶液中，由于峰的正向漂移，增加的幅度与被检基因浓度有关， 从而可检测靶基因。唐平等1 5 0 l 研究了在接近人体生理条件下肾上腺素在d n a 修饰 a u 电极上的伏安行为。有学科5 1 l 采用循环伏安法研究了米托蒽醌与经杂交的 d s - d n a 修饰层的插入作用。 ( 2 ) 电位法。电位法不同于伏安分析，对固定在电极上的d n a 加上一恒定电 流，根据电位随时间的变化来进行检测。计时电位溶出法检测d n a 杂交，与c v 和 方波伏安法相比能获得很高的灵敏度和有效的背景补偿。w a n g 等t 5 2 】报道了一种用 于检测与人类免疫缺陷有关的d n a 电化学生物传感器，将结构及碱基配对规律类 似于d n a 的2 l i n e r 或4 2 m e r 的单链肽核酸( p n a ) 通过吸附法固定于碳糊电极上，以 指示剂c o o h e n ) 3 ”的计时电位峰电流的增加来测定杂交程度，此法不需要使用 h i v - 1d n a 传统的溶液分析，只需很短的杂交时间，传感器的选择性良好，检出限 为4 x1 0 9 m o i l 。2 1 个核苷酸全部配对的峰值信号是有三个碱基不匹配时的5 2 倍。 江丽萍等【5 3 l 利用恒电位法将d n a - 3 吡咯甲基四聚乙二醇单醚聚合到铂盘电极上 制备d n a 芯片。 ( 3 ) 电致化学发光( e c l ) 。e c l 是通过对电极施加一定的电压而促使反应产物 之问或与体系中某种组分进行化学发光反应，通过测量发光光谱和强度来测定物 质的含量。它既具有化学发光的灵敏度，又有根据电位进行分离的高选择性。方 法快速、灵敏、重现性好。已发展了定量测定d n a 的聚合酶链反应( p c r ) 扩增产 物的商业化传感装置( q p c r 5 0 0 0 系统, p e 公司) 。通过亲合素生物素亲合体系使 含r u ( b p y ) 2 + 3 标识的d n a 探针固定，在三丙胺( t p a ) 存在下，通过每毫秒几十万次的 电化学发光循环，大大提高了分析的灵敏度，检出限达1 0 - ”m o l l ，l h 可检测5 0 多 个样品。b a r d 等唧】通 , x t a 1 3 + - 0 2 p d n a 静电吸引自组法，将d n a 探针固定后，以 7 氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 r u ( p h c n ) z ”为嵌入剂，在t p a 存在下，通过检测其电化学氧化所产生的发光信号 进行d n a 的识别。继而，他们 5 5 1 又将r u q h e n ) 3 ”或r u ( b p y ) 3 2 + 标记与探针互补的 靶序列，进行t d n a 的定量测定。 1 4 3 小分子杂交指示剂的研究现状 1 4 3 1d n a 杂交指示剂 杂交指示剂必须是具有电活性的物质。当它与d n a 结合后发生可逆的氧化 还原时，可与d n a 发生电子交换，且其还原电位处于d n a 的电化学窗口之中 ( + 1 2 v 0 o r , v ss c e ) ，通过d n a 长程电子传递而使指示剂与电极发生电子交换 完成电化学反应过程。一般杂交指示剂应对d s d n a 有比对s s d n a 更高的特异性 结合能力，这样才能指示灵敏。目前使用的杂交指示剂大致可分为三类：( 1 ) 金属 配合物，如o s 、r h 、c o 的邻菲咯啉、邻吡啶配合物等。( 2 ) 抗生素，如阿霉素、 道诺霉素【5 6 垮。( 3 ) 染料分子，如亚甲兰、h e o c h s t 3 3 2 5 8 等。 b a r d 5 7 5 s 等人研究了外源分子( 实质上是杂交指示剂) 与d n a 之间不同的 相互作用方式对外源分子的循环伏安法的影响，结果发现当作用方式为疏水的相 互作用即嵌入结合时，峰电位正移，而为静电作用时，峰电位负移。这点对于 选择适合电化学d n a 传感器并能高灵敏度检测特定序列碱基序列的嵌入指示剂 是很有帮助的。有文献1 5 9 】还指出分子几何形状的影响对指示剂与d n a 结合最为 重要。 1 4 3 1 金属配合物检测d n a 杂交 m i l l a n 6 0 - 6 2 等将1 8 个碱基的寡聚脱氧核糖核酸固定在修饰十八胺或十八酸 的碳糊电极上作为d n a 电化学传感器的支持电极，采用亚毫摩尔量 c o ( b p ”3 ( c 1 0 4 ) 3 ，o s ( b p y ) 3 c b 及c o ( p h e n ) 3 ( c 1 0 4 ) 3 作为杂交指示剂，实验中发现在 严格控制杂交条件下，仅仅完全互补的靶序列才能与电极表面的寡聚核苷酸杂交 形成杂交分子，从而使杂交指示剂的峰电流增加，因此能选择性地检测囊性纤维变 性基因af 5 0 8 序列，在1 8 烷基酸修饰的电极上，利用o s ( b p y ) 2 3 + 较c o ( b p y ) 3 ”和 c o ( p h e n ) 3 3 + 作指示剂好，而1 8 一烷基酸修饰的电极上c o ( p h e n ) 3 3 + 作指示剂较好。 同时，他们也研究了离子强度对杂交的影响，结果表明，在低离子强度时，杂交 缓慢，至少需要l h ；而在高离子强度下，杂交迅速，至多需要l o m i n 。杂交后的电 极可用热的去离子水冲洗而再生，反复杂交和再生，传感器性能稳定。 w a n g 等【6 3 】采用c o ( p h e n ) 2 3 + 作为杂交指示剂，将杂交后的电极先在0 2m o l l p h7 0 的t r i sh c l 溶液中清洗1 0s ，然后插入含有0 2m o l lc o ( p h c r t ) 2 3 + 的t r i sh c l 青岛科技大学研究生学位论文 溶液中，在0 5v 反应1r a i n ，c o ( p h e n ) 2 3 + 即与电极表面的d s d n a 结合，采用计时电 位法检测杂交前后c o ( p h e n ) 2 3 + 的峰面积变化，从而测得特定序列d n a 的含量。 w a n g 还研究了指示剂c o ( p h e n ) 3 + 3 的浓度对杂交响应的影响，发现随指示剂浓度 的增加，响应信号增加，浓度达到5 x 1 0 - 5m o l l 时持平。e r d e m 魄6 5 1 等将合成的 s s d n a 探针固定到碳糊电极表面，以c o ( p h e n ) 3 3 + 作为杂交指示剂，采用差示脉冲 伏安法检测肝炎b 病毒。 k a i h u l 6 6 j 等用原子力显微镜检测d n a 在电极上的固定，发现只有双链d n a 与r u ( p h c n ) 3 3 + 发生嵌合作用，而电极表面固定的单链d n a 不与其嵌合，这说明 r u ( p h e n ) 3 ”可以用来作为d n a 杂交与否的指示剂。 t a k e n a k 硐w i l s o n 研制了一类螺纹型的嵌入剂 6 7 - 7 0 。例如，他们将萘二酰亚 胺的两端分别接上两个电活性的二茂铁基团，利用萘二酰亚胺与d s d n a 分子形成 稳定的化合物，而所带的二茂铁基团可在电极上发生氧化还原而产生可被检测的 电化学信号。由于这种分子两端所带的两个体积庞大的二茂铁基团，使其从d n a 分子上脱开的速度大大减慢，因而易于电化学信号的测定，能获得更高的灵敏度。 t a k e n a k a 等 7 1 , 7 2 使用二茂铁萘二亚胺为杂交指示剂，发现二茂铁萘二亚胺可 同时插入双链d n a 的大沟和小沟。文献【1 0 l 】以微分脉冲伏安法检测合成寡聚核苷 酸( d a 2 0 和d t 2 0 ) 及自然基因片段( 酵母胆碱转运基因) 的杂交时，检出限低于 1p m o l l 。文献【1 0 2 】以二茂铁萘二亚胺为杂交指示剂，微分脉冲伏安法检测癌症抑 制基因p 5 3 的位点突变。当温度高于3 5 度时，探针与完全匹配的序列杂交前后 电流值有明显的变化，而与单碱基变异序列杂交时变化不明显。该方法的检出限 为0 1n m o l l ，但分析l p c r 样品的准确性较差，只有6 8 的样品能正确检出。 j u 等1 73 】以o s ( b p y ) 2 c 1 2 + ) j 杂交指示剂检测乙肝病毒( h b v ) j 临床样品p c r 产物。 在循环伏安法中，杂交发生时o s ( b p y ) 2 0 2 + 的阴极峰及阳极峰电流值明显增大， 该方法可检测低达1 0 2 m o l l 的p c r 模版。 a s l a n o g l u 等重点研究了金属配合物的离子电荷、几何形状和配体对键合常数 与键合位点数的影响，同时指出微电极在研究金属配合物与d n a 相互作用方面有 着常规电极无可比拟的优势1 7 ”。 a o k i 等【7 5 】以f e ( c n ) 6 4 - 为间接杂交指示剂检测d n a 杂交。其采用中性骨架的 肽核酸( p n a ) 为探针，当p n a 与互补d n a 结合后，带有负电荷d n a 对f e ( c n ) 6 排斥，抑制了f e ( c n ) 6 4 - 的氧化还原信号产生，单碱基错配的互补s s d n a 不产生 响应，该方法的灵敏度较低，只能检测毫克级的靶d n a 。 1 4 3 3 抗生素检测d n a 杂交 h a s h i m o t o l 7 q 等利用多种杂交指示剂来进行电化学基因检测，发现，利用电 9 氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 活性小分子道诺霉素( d a u n o m y e i n e ) 可通过电位的移动，来很好地区别d s d n a 和 s s d n a ，并且其电流密度很高，在在1 0 a n o l l 的溶液中达到6 5 “a e m 2 ，可以检测 到1 0 8 9 c m l 的靶基因序列。而其他的指示剂如米诺霉素( m i o e y e l i n e ) 、普匹碘铵 ( p r o p i d i u m i o d i d e ) 等，效果就不如前者。 方禹之等1 7 7 以道诺霉素为杂交指示剂，道诺霉素可专一与d s d n a 结合，在 杂交完成后，线扫伏安图中阴极峰电流值明显增大，峰电流与d n a 浓度在1 0 2 1 0 5 n g r l 之间呈线性关系，检出限3 0n g l 。 ， 刘盛辉等【7 8 】将人工合成的7 5 个碱基的s s d n a 共价固定在石墨电极表面，在杂 交缓冲溶液中用盐酸阿霉素( a d o 作为杂交指示剂进行杂交实验。实验表明，盐 酸阿霉素能够嵌n d n a 双螺旋结构的碱基对之间，在电极表面形成d s d n a a d m 层，采用循环伏安法( c v ) ，通过a d m 的氧化还原峰电流识别和测定了溶液中互补 链e d n 气c d n a 的质量浓度在1 0 l 矿巧0 l o - 7 m g m l 范围内与a d m 的氧化还 原峰电流呈线性关系，检测限为1 0 x lo - 7 m g m l 。对几种不同来源的d n a 片段进 行识别测定，发现含有与e d n a 互补序列的人体精子膜表面蛋白基因片段可产生 a d m 的峰电流，结果令人满意。 1 4 3 4 染料分子检测d n a 杂交 h 器h i m o t o 等1 7 9 用d n a 探针修饰的金电极和电化学活性染料检测致癌基因。 他们将5 端磷酸基上含有巯基己烷基团的2 0 个碱基的d n a 通过化学吸附固定在 金电极上作探针，以h o e c h s t3 3 2 5 8 为杂交指示剂。在磷酸缓冲底液中进行检测， 从而避免h o e c h s t3 3 2 5 8 的非特性吸附。h o e c h s t 3 3 2 5 8 能专一的作用于d n a 双螺 旋的小沟槽的a - t 碱基对，在线扫伏安法中，h o e c h s t 3 3 2 5 8 的峰电流与d n a 浓 度呈线性关系，其线性检出范围1 0 r 4 1 0 1 0 9 几。并于1 9 9 8 年将其成功用于乙肝病 毒( i m v ) 临床样品的检测。 a r 2 u m s o l 等发现亚甲兰在单链和双链d n a 修饰电极上的不同电化学行为， 从而可以用作d n a 杂交的电化学指示剂。 k e r m a n 等【8 1 l 以亚甲兰为指示剂，采用微分脉冲伏安法测定了非互补序列、 单碱基错配序列及互补序列与d n a 的杂交，发现杂交后电信号依次变小，单碱 基错配的互补序列在杂交后电信号约为完全匹配序列的一倍，因此亚甲兰可以区 分单碱基错配序列。 文献t s 2 ) 以亚甲兰为指示剂在氧化锆修饰的金电极上检测d n a 的杂交，亚甲 兰的阴极峰电流与d n a 浓度的对数在2 2 5 1 0 - 1 0 - 2 2 5 l f f 8 m o l l 成线性关系。 总之，d n a 电化学传感器作为一种新型的生物传感器不仅具有d n a 杂交反 应高度的特异性和可逆性，又具有电化学传感器的微型化特点，已被认为是开辟电 1 0 青岛科技大学研究生学位论文 化学与分子生物学的交叉学科，成为生命科学研究的热门。在电化学d n a 传感器 性能研究方面，靶基因的痕量分析对于疾病诊断和治疗来说是十分重要的。然而， d n a 探针的灵敏度有限，对低于皮克级( p g ，1 0 - 1 2 曲的基因进行分析检测是比较困难 的。这一方面与杂交指示剂的选择有关，即与指示剂对d s d n a 和s s d n a 的选择性 结合能力的差异有关，另一方面在于杂质的干扰，如杂交指示剂直接与电极表面 的非特性吸附。因此，高灵敏度检测特定d n a 序列的良好的杂交指示剂的使用 就十分必要。在消除指示剂与电极的非特异性吸附方面，除可以选择类似道诺霉 素这样的在电极表面无非特性吸附的指示剂外( 道诺霉素尽管有此优点，但其灵 敏度不是很高) ，还可以采用修饰电极防止非特性吸附发生。 氨基吩嗪铜配合物及染料小分子与d n a 作用的电化学及光谱研究 第二章二( 2 ，3 一二氨基吩嗪) 合铜配合物的合成及与d n a 相互作用的电化学和荧光光谱研究 摘要：溶剂热法合成了二( 2 ，3 - - 氨基吩嗪) 合铜配合物 c u ( d a p ) 2 12 + ，元素 分析法和红外光谱法对其结构进行了表征。在p h = 6 5 的 i r i s h c l 缓冲溶液中， 采用电化学方法及荧光光谱法研究了该配合物与d n a 的相互作用。循环伏安实 验表明，配合物在0 0 4 和0 1 3v 处有一对氧化还原峰。加入双链d n a ( d s d n a ) 或单链d n a ( s s d n a ) 后，氧化还原峰电流明显降低且峰电位出现负移， 表明二者之间可能主要存在静电作用，但铜配合物与d s d n a 的相互作用强于 s 8 d n a 的相互作用，可用于识别d s d n a 和s s d n a 。通过d s d n a 加入前后峰电 流的变化，计算得出配合物与d s d n a 结合位点n - - 2 5 ，结合常数k = 4 0 7 x 1 0 4 l t o o l 。在荧光光谱图上，加入d n a 后配合物的荧光强度有较大降低，产生明 显的减色效应，验证了二者之问的静电作用。 关键词d n a ；2 ，3 - - - 氨基吩嗪；铜配合物；相互作用；电化学 金属配合物与d n a 相互作用的研究一直是生物无机化学领域十分活跃的研 究课题【s 3 4 7 。金属配合物已经广泛地用于d n a 结构探针、d n a 分子光开关、 d n a 足迹试剂、以及d n a 断裂试剂等研究领域【8 8 羽。近年来，人们从金属配 合物，天然小分子及人工合成的小分子等方面开展d n a 识别分子的研究，发现 了一批具有d n a 特异识别属性的小分子【9 3 1 ，为新型基因选择性药物的筛选提供 了选择。本文以邻苯二胺为原料合成了具有芳环结构的2 ，3 一二氨基吩嗪配体， 然后与有较强生物活性的铜离子配位形成金属配合物，采用电化学方法在水溶液 中和电极表面并辅以荧光光谱法研究了其与d n a 的结合作用。 1 2 青岛科技大学研究生学位论文 2 1 实验部分 2 1 1 仪器与试剂 c h 8 3 2 型电化学分析仪，上海辰华仪器公司；三电极系统，工作电极为玻碳 电极( 圣= 3 0 8m m ) ，参比电极为饱和甘汞电极( s c e ) ，对电极为铂丝电极； p e r k i n - e l m e r1 4 0 0 c 元素分析仪；n i c o l e t1 7 0 s x 傅立叶变换红外光谱仪；p h s 2 5 型p s 计，上海雷磁仪器厂； 鲱鱼精d n a ( 北京经科试剂公司) ，用前未作进一步处理，纯度以2 6 0n n l 吸 光度与2 8 0i l l s 吸光度的比值( a 2 6 0 a 2 s o ) 1 8 来衡量，浓度c d n a 用2 6 0 锄处吸光 度来确定( 摩尔吸光系数为6 6 0 0l m o l c m ，n p ) ，水溶液于4 0 c 冰箱保存( 且三天 后重新配制) ；将一定量1g ，l d n