（光学专业论文）光镊测量生物大分子力学量方法的建立及光阱势能曲线的测量.pdf

摘要 本论文工作主要包括光镊在生物研究中的应用和光阱势能曲线的测量两个 方面。 光镊从发明以来，已经被应用于生物大分子的研究中。蛋白质分子之间的相 互作用是生命体活动的基础。经典生物学研究结果往往得自于生物分子功能的群 体值。然而在生命活动中，分子群的个体在特定时空中呈现出不同的特性。为此， 研究单分子的实时运动将有助于诠释细胞动力学规律。 我们构建了一个借助微米小球为“手柄”，用光镊间接操控生物大分子的方 法。具体实验以抗体a 6 d 蛋白( 肌醇磷酸激酶的单克隆抗体) 与抗原p 1 4 一k i n a s e ( 肌醇磷脂激酶) 为例，对它们之间结合强度进行了实验研究。 我们建立了利用光镊技术测定驱动蛋白k i n e s i n 运动特性的系统，并观察到 表面连接驱动蛋白的小球沿微管的移动。而且我们还尝试用光镊来测定马达蛋白 c e n p - e 与染色体动点的结合力，这为进一步精确地定量研究动点蛋白在动点结 构和功能中的作用积累了一定的经验。 提出了利用c c d 测量技术描绘完整的光阱势能曲线的方法，分别对氦氖光阱 和半导体光阱进行了研究。 关键词：光镊技术c c d 生物大分子结合强度驱动蛋白c e n p e 势能曲线 a b s t r a c t t h ea r t i c l ei n c l u d e st h eu s eo fo p t i c a lt w e e z e r si nb i o l o g ya n dt h e m e a s u r e m e n to fo p t i c a l t w e e z e r s p o t e n t i a le n e r g yc u r v e o p t i c a lt w e e z e r s ，h a v eb e e nu s e di nu n d e r s t a n d i n gt h eb e h a v i o ro f s i n g l eb i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o n s u n d e r l i n ev i r t u a l l ya l l1 i f ep r o c e s s e s i m a g i n gs p e c i f i cm o l e c u l e sa n d t h e i ri n t e r a c t i o n si n s p a c ea n dt i m e i se s s e n t i a lt ou n d e r s t a n dh o w g e n o m e sc r e a t ec e l l sa n do r c h e s t r a t ec e l l u l a rf u n c t i o n s m o s to fo u r t e x t b o o ks t a t e m e n t sw e r ed e r i v e df r o mm e a nv a l u e so fl a r g ee n s e m b l e so f m o l e c u l e s h o w e v e r ，e a c hm o l e c u l ed i s p l a y su n i q u ec h a r a c t e r i s t i c si n s p a t i o t e m p o r a l s p e c i f i cm a n n e r t h u s ，ab e t t e ru n d e r s t a n d i n go fs i n g l e m o l e c u l a r p r o p e r t i e s i nr e a lt i m e w i l le l u c i d a t e t h e p r i n c i p l e s u n d e r l y i n gc e l l u l a rd y n a m i c s am e t h o dt om e a s u r et h ea d h e s i o n b e t w e e nb i o m a c r o m o l e c u l e sw a s d e v e l o p e d ，w i t hu s e sam i c r o b e a da s “h a n d l e ”a n di n d i r e c t l yc o n t r o l s t h eb i o m a c r o m o l e c u l ew i t h o p t i c a lt w e e z e r s a sam o d e ls y s t e mt h ea d h e s i o n b e t w e e na n t i b o d ya 6 dp r o t e i na n da n t i g e np 1 4 一k i n a s ew a se x p e r i m e n t a l l y s t u d i e du s i n gt h em e t h o d w es e tu pt h es i n g l e k i n e s i nm o t i l i t ya s s a ys y s t e mb a s e do no p t i c a l t w e e z e r s ，a n do b s e r v e dt h ek i n e s i n c o a t e db e a d sm o v i n go nm i c r o t u b u l e s i na d d i t i o n ，t h ea r t i c l et r y st om e a s u r et h eb i n d i n gf o r c eo fc e n p ea n d k i n e t o c h o r eb yu s i n g o p t i c a lt w e e z e r s ，w h i c hp a v e dt h ew a yf o ra c c u r a t e l y a n dq u a n t i t a t i v e l yc h a r a c t e r i z i n gt h er o l eo fk i n e t o c h o r e p r o t e i n s i n k i n e t o c h o r es t r u c t u r ea n df u n c t i o n t h ea r t i c l ef u n d sam e t h o d t om e a s u r e o p t i c a lt w e e z e r s w h o l e p o t e n t i a lc u r v eb yu s i n gc c d a sam o d e ls y s t e mt h ec u r v eo fh e n ea n d d i o d eo p t i c a lt w e e z e r sw a sm e a s u r e d k e yw o r d s ：o p t i c a lt w e e z e r sc c db i o m a c r o m o l e e u l e a d h c s i o k i n e s i n c e n p ep o t e n t i a le u r v 绪论 第一章绪论 1 1 光镊原理 光与物质相互作用的过程中往往都伴有动量的传递。考虑光作用在一个 细胞上，对入射光束来说细胞的膜层结构是浸泡在液体中的很多界面，光入射 到这些界面处就会发生反射和折射。光子有动量，入射光束因反射和折射作用 而产生动量的改变，改变的动量就传递给了细胞，这样，光束就对被照射的细 胞施加一定的力。这种由于光辐射对物体产生的力常常表现为压力，因而称之 为光辐射压力或简称光压。通常，光压指的就是这种动量转移产生的力学效应。 光对物体的作用力都是推力。但是，在一定条件下光也可以对物体产生拉力， 或更一般的，产生束缚力。这就牵涉到光对物体作用的梯度力m 1 。 为了阐明梯度力的概念，我们以透明介质小球为模型来进一步讨论光压对 物体的作用，这里小球折射率n 应大于周围媒质的折射率n 0 。选用透明介质小 球作为模型，是考虑到球形物体的高度对称性便于讨论，另方面生物细胞大 多数近似是透明的球状体。为了形象的揭示出光束如何产生对微粒的束缚力， 采用几何光学近似，通过考察光穿过介质小球的行为来分析光作用于物体的力。 反射光 折射光 均匀光场b 非均匀光场 图1 1 ：梯度力原理 当一束光穿过这个小球时， 中国科学技术大学硕士毕业论文 由几何光学可确定光传播的路径。以a 、b 两条 1 物理系激光生物实验室 绪论 光线为代表，光线在进入和离开球表面时产生折射( 黑粗线表示) 同时在表面 也产生一定的反射( 虚线表示) 。若折射前所有的光线均沿z 方向传播，即光的 动量是沿z 方向的，然而离开小球的光传播方向有了变化，也即光的动量有了 改变。由于动量守恒，各束光施加给小球一个与它们动量改变等值，但反向的 动量( 图1 1 中的空心线) 。与之相应的有力f 。和f 。施加在小球上。若小球处 于均匀光场中，则各柬光给予小球的力在横向上将完全抵消。如图1 1 a 所示。 如果小球处在一个非均匀的光场中，小球所受到的作用力在横向上就不会完全 抵消。例如，小球置于如图1 1 b 中光自左向右增强的光场中。其结果是，与左 边的光线a 相比较，右边较强的光线b 作用于小球，使小球获得较大的动量， 从而产生较大的力( r ) 。结果，射到小球上的所有光束的合力在横向上不再完 全抵消。总的合力是把小球推向右边略偏下处。小球在这样一个非均匀( 即强 度分布存在梯度) 的光场中所受到的是一个指向光最亮点的力。这种由于光场 强度分布不均匀而产生的力，我们称之为梯度力。实际上，当光束入射到小球 上时，除了产生梯度力外，还有光被反射而施加在小球上的力，这个力习惯上 称之为散射力。 对于强会聚的激光束，如一束经过显微物镜强聚焦的激光，照射到透明微 粒上，由于激光束在微粒表面的反射和折射，光束动量发生了变化，根据动量 守恒原理，微粒的动量也发生相应的改变，即微粒受到光场的作用力，包括梯 度力和散射力。图1 2 用几何光学模型说明了一束强会聚的高斯光束通过透明 小球时，由于折射施加于小球上的梯度力与小球位置的关系。 图1 2 强聚焦激光高斯光场中粒子受力图 小球在焦点f 之外时( 图1 2 1 ) ，梯度力f 指向光最亮处，表现为拉力， 中国科学技术大学硕士毕业论文物理系激光生物实验室 霭专娥 绪论 小球在焦点f 之内时( 图1 2 2 ) ，梯度力f 也指向光最亮处，表现为推力。由 于光束在小球表面的反射，光束还会施加在粒子上一个散射力，它的方向与光 的传播方向一致，它趋向于使小球沿光束传播方向运动。对于强聚焦的激光光 场来说，梯度力起主要作用，因此处于光焦点附近的微粒都受到一个趋向于焦 点的回复力而被稳定的束缚于焦点附近。这样，束高度会聚的光束便构成了 三维空间的一个势场或势阱，能量最低处在焦点附近，这就是单光束梯度力光 镊。 1 2 光镊的特点 “光镊( o p ti c a lt w e e z e r so rl a s e rt w e e z e r s ) ”其实是比拟宏观机械 镊子对光势阱效应的一种形象描绘。它的应用范围是微米量级正好适合于生物 微米量级结构的研究；而且还可通过选用适当波长的激光，使形成的光镊对物 质的热学或化学等效应也非常弱，从而对细胞产生的损伤非常小。 与机械镊子相比，光镊是以一种温和的非机械接触的方式来完成夹持和操 纵物体的，它可以对目标细胞进行非接触式的捕获和固定，以及对细胞进行精 确的操作。这种新型的单细胞操作技术克服了以往单细胞操作中细胞难以固定 和易产生机械损伤这两个致命弱点，因此在生命科学的研究中，几乎所有的单 细胞操作都可以应用光镊技术“。1 “。 光镊另外一个最重要的功能是作为力的探针，实现微小力的测量，它所产 生的力从亚皮牛到几百个皮牛“。生物大分子的力学性质、分子间的相互作 用都涉及皮牛量级的力，因此光镊产生的力和生物大分子中涉及到的力非常匹 配。这些都注定了光镊技术在生物科研中是一个非常有效的研究手段。 1 3 光镊在生物中应用 光镊在它问世之初是被看作微小的宏观粒子( 微米量级) 的操控手段。光 镊的发明人a s h k i n 当时就敏锐地觉察到光镊在生命科学中的意义，他预言光镊 “将细胞器从它们正常位置移去的能力，为我们打开了精确研究细胞功能的大 门”。 然而仅十余年的发展，光镊技术就已从微米精度的操控与探测发展到了纳 中国科学技术大学硕士毕业论文 3 物理系激光生物实验室 米精度的操作与探测。尽管光镊技术本身在结构细节的分辨上，不能超越光波 长的限制，但是由于它兼具对个体进行“遥控”操作和静态动态力学量测量的 独特优势，光镊技术在生物大分子的操控、静态力学性质和生命过程中的动力 学行为的研究方面做出了令人瞩目的成果，可以分为以下几个方面给出概要的 应用介绍： a 、研究生物大分子的静态力学特性 通过光镊对单分子进行扭转、弯曲、拉伸等操作，研究其力学特性，是研 究较多的方向。例如，单个d n a 分子在光镊拉力作用下的非线性弹性拉伸应变 的实验研究。“，这为研究单个d n a 分子构型提供了进一步的实验基础。再如， 用光镊测量了微管的刚度和驱动蛋白的扭转刚度。 b 、对生物大分子进行精细操作 例如，日本和美国的科学家采用双光镊实现了d n a 分子( 2 纳米直径) 的 扭转、打结，这表明分子操作达到相当高的水平，为细胞内蛋白纤维相互作用 等分予力学的研究开辟了新的途径“”。 c 、分子水平上的特异性识别和生命过程的调控 以往对细胞或单分子的观察依赖于“微粒”之间自由运动而随机“配对” 或“配群”，无法进行“科学设计”，限制了研究的深度和广度。利用光镊技术 可以将拟观察“对象”或“对象们”以研究者的意愿进行“配对”或“配群” 并观察“配对”或“配群”后的新变化。这种操控使得生物微粒个体行为的研 究真正从“观测”上升到“科学实验”。特别是纳米光镊技术所具有的纳米量级 的操控精度和观测精度，使得这种“配对”的定位精度达到了分子尺度。这使 人们能在纳米精度上实时动态的研究诸如天然杀伤( n k ) 细胞特异性识别中的 单分子机制并显示其特异性相互作用，从而为解开细胞特异性分子识别之谜提 供微观基础和新的信息。 d 、研究生物大分子的动力学特征 光镊在生物大分子研究中最重要的成果之是动力原蛋白的研究d g - 2 t o 科 学家利用光镊观察到了生命运动的元过程，发现分子马达是以步进方式运动， 并且测量了其运动步长。单个驱动蛋白分子产生的力以及单个驱动蛋白的速度 与a t p 浓度的函数关系。还利用光镊研究了肌动蛋白丝与单个肌球蛋白分子间 中国科学技术大学硕士毕业论文4物理系激光生物实验室 绪论 的相互作用，测量了没有a t p 水解时单个肌球蛋白分子和肌动蛋白纤维分离时 所需的力。单个分子运动实验引发了对运动详细模型、a t p 水解环、单酶动力 学的深入研究。光镊逐渐成为一种研究分子动力结构的重要技术手段。 这些应用成果充分说明，光镊技术纳米生物学研究中具有广阔的应用前景。 1 4 论文主要内容简介 本文主要分为两个方面讨论：光镊技术在生物科学研究中的应用和光阱势 能曲线的测量。 第一部分是光镊技术在生物科学研究中的应用。在第二章中讨论的是利用 光镊技术测量生物大分子之间的结合强度，并对p 1 4 一k i n a s e 抗原与a 6 d 抗体的 结合强度的进行了实验研究。第三章是运用已建立的方法对驱动蛋白k i n e s i n 的 运动特性做了初步的研究。 第二部分是测量光阱的势能曲线。在第四章中讨论的是利用c c d 技术测量 光阱的势能曲线，将测量出来的势能曲线可以作为一种衡量光阱性质的标志。 参考文献 1 李银妹光镊原理、技术和应用，中国科学技术大学出版社 2 a a s h k i n f o r c e so fas i n g l e b e a mg r a d i e n tl a s e rt r a po nad i e l e c t r i c s p h e r e i nt h er a yo p t i c sr e g i m e m e t h o d si nc e l l b i o l o g y ，1 9 9 8 ， 5 5 ：1 2 7 3 k s v o b o d a s m b l o c k o p t i c a lt r a p p i n g o fm e t a l l i c r a y l e i g h p a r t i c l e s o p t l e t t ，1 9 9 4 ，1 9 ：9 3 0 9 3 2 4 p c k e m g u c h a r a c t e r i z a t i o no ft r a p p i n gf o r c eo nm e t a l l i cm i e p a r ti c l e s a p p l o p t ，1 9 9 9 ，3 8 ：1 6 0 1 6 7 5 周辉，李先锋，李银妹，楼立人等，单光镊技术测量红细胞膜弹性新方法 的建立，生物化学与生物物理学进展，2 0 0 1 ，2 8 ( 6 ) ：9 0 4 9 0 7 6 a m i td m e h t a ，m r i e f j a s p u d i c h b i o m e c h a n i c s ，o n em o l e c u ea ta t i m e j j o fb i o l o g i c a lc h e m i s t r y ，1 9 9 9 ，2 7 4 ：1 4 5 1 7 - 1 4 5 2 0 7 a m i t d m e h t a ，m r i e f ，j a s p u d i e h ， e ta 1 s i n g l e m o l e c u l e b i o m e c h a n i c sw i t ho p t i c a lm e t h o d s j s c i e n c e ，1 9 9 9 ，2 8 3 ：1 6 8 9 1 6 9 5 8 s v o b o d a ，k ，c fs c h m i d t ，m js c h n a p p ，e ta 1 d i r e c to b s e r v a t i o no f 中国科学技术大学硕士毕业论文 5 物理系激光生物实验室 k i n e s i n s t e p p i n gb yo p t i c a l t r a p p i n gi n t e r f e r o m e t r y j n a t u r e ，1 9 9 3 ，3 6 5 ：7 2 1 7 2 7 9 h t c h e n ，y m l i ，l r l o u ，e ta 1 h i g hp r e c i s i o nm e a s u r e m e n t si n a n o p t i c a l t w e e z e r sf o rs t u d y i n gs i n g l eb i o m o l e c u l em o t i o n c b r i t t o nc h a n c e ，p h o t o n i c sa n di m a g i n gi nb i o l o g ya n dm e d i c i n e ， p r o c e e d i n g so fs p i e ，2 0 0 l ，v 0 1 4 5 3 6 ：7 5 8 1 1 0 f i n e r ，j t ，s i m m o n s ，r m a n ds p u d i c h ，j a s i n g l em y o s i nm o l e c u l e m e c h a n i c s ：p i c o n e w t o n f o r c e sa n dn a n o m e t r e s t e p s j n a t u r e ，1 9 9 4 。3 6 8 ：1 1 3 1 1 9 1 1 l p g h i s l a i n ，n a s w i t z ，w w w e h b m e a s u r e m e n to fs m a l lf o r c e s u s i n ga no p t i c a lt r a p r e v s c i i n s t r ，1 9 9 4 ，6 5 ：2 7 6 2 2 7 6 8 1 2 a r o h r b a c h ，e h k s t e l z e r t r a p p i n gf o r c e s ，f o r c ec o n s t a n t s ，a n d p o t e n t i a ld e p t h sf o rd i e l e c t r i cs p h e r e si nt h ep r e s e n c eo fs p h e r i c a l a b e r r a t i o n s a p p l o p t ，2 0 0 2 ，4 1 ：2 4 9 4 2 5 0 7 1 3 r i l i t v i n o v ，h s h u m a n ，j s b e n n e t t ，j w w e i s e l b i n d i n gs t r e n g t h a n da c t i v a t i o ns t a t eo fs i n g l ef i b r i n o g e n i n t e g r i np a i r so nl i v i n g c e l l s p r o c n a t a c a d s c i ，2 0 0 2 ，9 9 ：7 4 2 6 7 4 3 1 1 4 f g i t t e s c f s c h m i d t i n t e r f e r e n c em o d e lf o rb a c k f o c a l p l a n e d i s p l a c e m e n t d e t e c t i o ni n o p t i c a lt w e e z e r s 0 p t l e f t ，1 9 9 8 ， 2 3 ：7 9 1 5 a p r a l l e ，m p r u m m e r ，e l f l o r i n ，e t a 1 t h r e e d i m e n s i o n a l h i g h r e s 0 1 u t i o np a r t i c l et r a c k i n g f o ro p t i c a lt w e e z e r sb yf o r w a r d s c a t t e r e d l i g h t m i c r o s c o p y r e s e a r c ha n d t e c h n i q u e ，1 9 9 9 ， 4 4 ：3 7 8 3 8 6 1 6 f g i t t e s c f s c h m i d t s i g n a l s a n dn o i s ei nm i c r o m e c h a n i c a l m e a s u r e m e n t s m e t h o d si nc e l lb i o l o g y ，1 9 9 8 ，5 5 ：1 2 9 1 5 6 1 7 c b u s t a m a n t e ，s b s m i t h ，j l i p h a r d t ，d s m i t h s i n g l e m o l e c u l e s t u d i e so fd n am e c h a n i c s c u r r e n to p i n i o ni ns t r u c t u r a lb i o l o g y ，2 0 0 0 1 0 ：2 7 9 2 8 5 1 8 f i n e rj w ，i m m o n sr m ，s p u d i c hj a s i n g l em o l e c u l em e c h a n i c s ： 中国科学技术大学硕士毕业论文 6 物理系激光生物实验室 绪论 p i c o n e w t o nf o r c e sa n dn a n o m e t e rs t e p s n a t u r e1 9 9 4 ，3 6 8 ：1 1 3 - 1 1 9 1 9 y i nh ，w a n gm d ，s v o b o d ak ，l a n d i c kr ，g e l l e sj ，b l o c ks m t r a n s c i p t i o n a g a i n s ta l la p p l i e df o r c e s c i e n c e 1 9 9 5 2 7 0 ：1 6 5 3 1 6 5 7 2 0 b e r r y 附b e r gh c a b s e n c eo fab a r r i e rt ob a c k w a r d sr o t a t i o no ft h e b a c t e r i a lf l a g e l l a rm o t o rd e m o n s t r a t e dw i t ho p t i c a lt w e e z e r s p r o c n a t la c a ds c iu s a1 9 9 7 ，9 4 ：1 4 4 3 3 1 4 4 3 7 2 1 s v o b o d ak ，s c h m i d tc e ，s c h n a p pb j ，a n db l o c ks m ，d i r e c to b s e r v m i o no f k i n e s i n s t e p p i n gb yo p t i c a lt r a p p i n gi n t e r f e r o m e t r y n a t u r e ，3 6 5 ( 1 9 9 3 ) 7 2 1 中国科学技术大学硕士毕业论文 7 物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体- 抗原结合强度 第二章光镊技术测量抗体抗原结合强度 在许多生物物理研究领域的一个重要目标就是描述出那些控制生物大分子 相互作用力的大小，并且用这些力学信息去合理地利用蛋白质的功能“。生物 大分子相互作用力的大小在l o o p n 左右，是以下几种作用力的共同作用的结果“3 ： a ) 范德瓦耳斯力； b ) 静电力； c ) s a l v a t i o n ( b y d r a t i o na n dh y d r o p h o b i c ) f o r c e ； d ) s t e r i cf o r c e ； e ) 熵作用力； 其中范德瓦耳斯力和静电力起着主要的作用。 现在已经建立和发展了多种生物物理模型，借助计算机来研究此类问题”“ 1 。因为生物大分子的复杂性，上述的模型与计算也只是间接的和近似的研究。 所以现在还没有比较方便的直接测定生物大分子之间作用力的实验手段，虽然已 有一些技术如1 a f m ( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ) 技术以及s f a ( s u r f a c ef o r c e a p p a r a t u s ) 装置“1 以及b f p ( b i o f o r c ep r o b e m i c r o p i p e t t e a s p i r a t i o n ) ”1 技术可以 用来测定抗体与抗原之间或其它生物大分子间的作用力。但是，它们有一定极限 性，如a f m 用于液体中的研究具有一定的难度；s f a 方法测量力的分辨率低( 最小 分辨率是1 0 n n ) ，适合于平均相互作用的分子数在几万以上的情形；b f p 方法在测 量中是利用膜囊( m e m b r a n ec a p s u l e ) 作为力学传感器的，膜的张力控制着传感 器的刚度，这样要精确地钡0 量生物大分子之间的相互作用力，首先就必须要有膜 张力的精确的测量，这无疑又会增加实验结果的难度及降低了实验结果的准确性 。”。由于种种原因，上述方法都没有能够很好地推广应用。与上述技术相比，由 于光的穿透特性，光镊很容易在液体环境中应用，而且它对个体的操作是用光 “遥控”进行的，对微粒周围环境干扰较小。本章将讨论我们利用光镊技术建立 测量生物大分子间结合强度的方法及其在抗体一抗原结合强度测量上的应用。 中国科学技术大学硕士毕业论文物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体抗原结合强度 2 1 测量方法的建立和模拟实验： 我们借助微米小球为“手柄”，将生物大分子包裹在微球表面，实现用光镊来 间接操控生物大分子，测量生物大分子之间的结合强度。我们先将抗体和抗原包 裹在不同大小的微球上，接着用光镊捕获包裹有抗体的微粒，被光阱捕获的微球 会受到与激光功率成线性关系的阱力，改变激光功率可以改变阱力的大小。当光 镊操控包裹抗体的微球与包裹抗原的微球相结合后，只有阱力大于抗体一抗原的 结合强度，光镊才能将它们拖开。 2 1 1 实验装置 实验中使用的光镊装置如图2 1 所示：光镊光源为波长7 8 0 n m 的半导体激光器， 最大输出功率为9 6 m w 。通过改变工作电流可以连续调节激光输出功率。显微镜为 o l y m p u si x 7 0 倒置显微镜，工作物镜为i 0 0 倍油浸物镜。激光由显微镜耦合窗口 耦合入显微镜，经双向分束器和物镜会聚在物镜焦平面处，形成光阱，用以实现对 粒子的捕获。实验中光阱位置不变，通过移动载物平台来实现被捕获粒子的相对 移动和操控。载物台在x ，y 平面内的移动由计算机控制，位移精度为l 卢研。显微 操作过程的图像由c c d 摄像机采集，摄录监视系统和图象处理系统实时监测显微 操作过程、记录存储显微图像。 2 1 2 光镊操控力的标定 图2 1 实验装置示意图 光镊对粒子的操控力来源于光与物质的相互作用，因此粒子所处环境的物 理参数如分散介质液体的折射率、粘滞系数或粒子的半径的改变，操控力的大小 中国科学技术大学硕士毕业论文 9 物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体- 抗原结合强度 也会随之改变。因而必须针对具体实验条件，对阱力进行标定。 光镊操控力的标定采用的方法是流体力学法。在一个给定激光输出功率下， 最大操控力的测量就是找出揉控粒子相对于周围液体运动所能达到的最大速度 v 。，当粒子相对周围液体的速度大于这一最大速度时，液体对粒子的粘滞力 就大于光镊最大操控力，粒子就将从光阱中逃逸，这一速度称为粒子在光阱中的 逃逸速度。 我们将聚苯乙烯小球( 直径为l u r e ) 悬浮液滴入样品池中。设定光镊输出功 率，用该光镊捕获样品池中一个聚苯乙烯小球。实验中光镊不动，微动平台以初 始速度v 0 运动，也即光镊捕获的微球以v 0 的速度相对周围液体运动。若此时微球 在光镊中未被流体冲走，则继续提高平台的运动速度，每次提高5 u m s ，直到小 球从光镊中逃逸。此速度即为该光镊输出功率下的逃逸速度。小球在逃逸速度下 相应的流体粘滞阻力称为临界粘滞力f ，在此逃逸速度下，光镊的最大捕获力f 光_ 与临界粘滞力f 大小相等，方向相反。根据流体力学中的s t o k e s 公式： f = 6 z r l r v 计算出临界粘滞力的大小，从而得到光镊最大捕获力的大小，式中玎为粘滞系 数，r 为小球半径，v 为小球相对于周围液体的速度。 s t o k e s 公式只有在没有涡流的情况下才成立。当液体内部有涡流出现时， s t o k e s 公式就失去了有效性。有一个经验判据( r e y n o l d s 判据) 来判断涡流的 强弱程度：当液体内部有涡流出现时，对应的无量纲r e y n o l d s 数： r e = v r p r 约大于1 2 0 0 ，其中p 为液体密度。光镊中典型的物体半径在微米尺度，液体密 度与水相近：l g c m 3 ，温度2 0 摄氏度时卵= o 0 0 1 0 2 5 n s - m 。如果物体在水中以 1 0 微米秒的速度运动时，可以算出这时的r e y n o l d s 数：r e “1 0 ，远小于湍 流时的值。所以在光镊应用中，s t o k e s 公式是适用的。 在我们的实验条件下，粘滞系数野= 1 6 5 1 0 。3p a 。然后改变光镊功率， 测量光镊最大操控力与光镊输出功率的关系。标定结果如图2 2 所示。在测量分 子间结合强度时，利用该标定曲线得出光镊操控力。 中国科学技术大学硕士毕业论文 l o 物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体抗原结合强度 图2 2 激光输出功率与光镊操控力的关系曲线( 横坐标为激光输出功率，纵坐标为操控力) 2 1 3 模拟实验 我们选择在光阱最大阱力是1 2 p n 时候，进行裸露小球和包裹生物大分子小 球的实验。使用的包被小球有：裸露小球、g l y 小球、b s a - j , 球、h a s 小球、a h s a 小球，溶液环境一共使用了纯水、h c l 溶液( 调节p h 值) 实验步骤如下： a 将抗体和抗原包裹在不同的微球上，微球的直径选择1 0 , u r n 和1 t m 的两 种； b 配肯t 1 0u m 和1 芦m 微球的混合溶液，l o , u m 微球沉底； c 用光镊捕获1g m 的微球，并调节光阱阱位离底面的距离为5u m ； d 移动平台使沉底的1 0 t m 微球靠近光镊捕获的1 , u m 微球，直至接触； e 在确定两个微球已粘结后，接着通过移动平台带动样品池运动，从而拖 拉1 0 z m 微球使之脱离1 , u m 微球，如果此时光阱施加的捕获力大于抗体 和抗原的结合强度，它们就会在拖拉的过程中分离，反之，就不会分离， 而1 t m 微球就会被拖出光阱中心。 通过实验可以确定的现象有： a 1 完全裸露的小球在纯水中几乎不发生结合。 m 裸露小球与o l y 小球、裸露小球与包裹蛋白的小球在纯水中，介于结合 与不结合之间。 c ) g l y 小球之间在纯水中结合，光镊分不开；在低p h 条件下看不出很大差 异； 中国科学技术大学硕士毕业论文 1 1 物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体抗原结合强度 g l y 与包裹蛋白的小球之间在纯水中即可结合，光镊不能将它们分开。 e ) 同种包裹蛋白的小球之间在纯水中容易结合。 f ) b s a 小球与a h s a 小球在水中即可很容易结合。 g ) h s a 小球与a h s a 小球在水中容易结合，在p h 较低的h c l 溶液中也能够 结合，但结合程度似乎低于正常环境( 一是从聚集程度来看，二是需要 两球十分靠近才能够结合) 。 实验中除了不作任何包被的小球在没有盐离子的环境中不发生结合外，光镊 既拉不开蛋白质问的特异性和非特异性结合，就连g l y 之间的吸附也分不开。而 在水冲实验中，可以看出o l y 之间的吸附结合要比蛋白间的结合弱很多。我们在 给小球包被蛋白时选用g l y 作为封闭剂，就是认为较小的吸附作用相对于较大的 蛋白间结合力可以忽略，但此时这种封闭剂并没有很好的完成这个作用。从实验 现象中判断，只要小球表面不是完全赤裸，即只要有蛋白或是氨基酸等带电分子， 小球表面静电力和范德瓦耳斯力作用使小球发生结合，从实验结果看，这种静电 力和范德瓦耳斯力的共同作用力已经超出了我们所用光镊的阱力范围，也就是说 实验中的困难时阱力太弱。为了验证建立的方法的可行性，可以有两个方法解决 上述的困难： 一、提高光功率，增加光镊的最大阱力； 二、改变生物大分子样品以及它们相互作用溶液环境，降低它们的相互 作用力； 短时期内提高光功率的方法没有可能，所以我们选择了第二种方法来测量 p 1 4 一k i n a s e 抗原与a 6 d 抗体结合强度。 2 2p 1 4 - k i n a s e 抗原与a 6 d 抗体结合强度的实验研究 抗体抗原间的结合强度依赖于它们所处的生化环境【l6 】，例如p h 值和离子环 境等，我们在不同p h 值的条件下进行了实验测量。实验得到，在样品溶液环境是 p h 值为2 6 的o i 倍p b s 的情况下，光镊可以将结合在一起抗体抗原分开，我们选 择在这一p h 值条件下，进行抗体抗原结合强度的实验研究。 在多种生长因子和激素调节细胞生长的信号转导途经中，肌醇磷脂循环起 核心作用。肌醇磷脂循环途经由肌醇磷脂激酶( p 1 4 一k ) 首先催化磷脂肌醇( p i ) 中国科学技术大学硕士毕业论文 物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体- 抗原结合强度 环上d 4 位磷酸化，产生p i p ，然后由p i p ( 5 ) k 激酶进一步催化合成p i p 。：p i p 。在 磷脂酶c 的作用下水解为i n s ( 1 ，4 ，5 ) r 和d a g i n s ( 1 ，4 ，5 ) p 3 使细胞内质网钙库 释放：d a g 则激活p k c ，起动细胞双信使系统。可见，p 1 4 一k 在细胞生长调控过程 中起着重要作用。通过对p 1 4 一k 单克隆抗原的基本力学特征的测定，可以深入 了解p 1 4 一k 参与细胞调控过程的分子机制。 将抗原重建到大豆磷脂脂质体上，形成脂酶体。将抗体与l “m 聚苯乙烯小 球( 含p r o t e i na ) 连接，用光镊操控小球与脂酶体接触，使携带抗体的小球与脂酶 体上的抗原相互结合，随后用光镊牵拉小球，由小到大改变光镊的操控力( f ) ， 直到刚好可以将小球和脂酶体拉开。由这一临界光镊操控力，得出抗体抗原相互 问的结合强度。 2 3 实验 2 3 1 样品准各 将抗原p 1 4 一k i n a s e ( 肌醇磷脂激酶) ，按文献“”方法进行纯化最后经s d s 凝胶 电泳证实产品分子量为5 6k d a ：纯度大于9 5 。同时将抗体a 6 d 蛋白( 肌醇磷酸激 酶的单克隆抗体) ，按文献“”1 方法得到并纯化。该抗体能识别并与抗原特异性结 合，这可以用w e s t e r nb l o t 实验证明。含p r o t e i na 的聚苯乙烯小球为分子探针公 司产品。其它所有试剂为分析纯产品。 然后将抗体与聚苯乙烯小球相联接。方法如下：在一定浓度的聚苯乙烯小球 悬浮液中加入a 6 d ，4 0 c 摆动过夜后，用p b s 洗涤三遍。这种连接有a 6 d 抗体的聚 苯乙烯小球，以后简称a 6 d 小球。带抗原的载体是将肌醇磷脂激酶( p 1 4 k ) 重组到 大豆磷脂上构成的，称之为脂酶体。用荧光方法证明重组后p 1 4 构象与溶液不同。 用同位素方法测p 1 4 k 酶活性，显示重组后p 1 4 k 酶活性增加( 约5 0 ) 。 2 3 2 p 1 4 一k i n a s e 脂酶体与链接有a 6 d 抗体的聚苯乙烯小球间的结合强度测量 先将带有p 1 4 一k i n a s e 的脂质体( 脂酶体) 悬浮液5 肛1 ，加入到9 5 u l 缓冲液o 1 倍p b s ( p h 值可调) 中。混匀后滴在用多聚赖胺酸预处理过的样品池中，于室温下 保持1 小时，使脂酶体固定在样品池底。实验时，是用荧光法观察加入的脂酶体是 否固定在样品池底。然后往样品池中加入已连接上抗体的聚苯乙烯小球( a 6 d 小 中国科学技术大学硕士毕业论文 1 3 物理系激光生物实验室 光镊技术测量抗体抗原结台强度 球) 。设定光镊操控力为0 7 0 p n ，利用计算机设置平台移动的速度为1 0 , u m s ( 即 相对地操控光镊) ，使光镊移向视场中的某一个a 6 d d , 球，并将它捕获；然后重新 设置平台速度为2 , u m s ，操控小球逐步接近脂酶体并与之接触。当两者接触1 分 钟后，关闭光镊。若小球不与脂酶体分离，则表明此时脂酶体上的抗原与小球上 的抗体己结合。重新打开光镊，先以较小操控力拉小球。若不能把小球从脂酶体 拉开，则增大光镊操控力，重复上述操作，直到某个操控力下刚好能把它们拉开。 由此确定该条件下，抗体抗原间的结合强度。 2 4 结果与讨论 图2 3 为p h2 6 的缓冲液中，对于a 6 d d 、球与腊酶体结合、拉开的动态过程 实验结果。图2 3 a 为光镊操作一个a 6 d - j 、球与脂酶体接触，关闭光镊，小球仍 与脂酶体紧密结合的情形。此时用光镊( 操控力0 7 0 p n ) 去拉动小球，还不能使它 离开脂酶体。图2 3 b 为增大光镊操控力到0 8 0p n 时，光镊囡q 好得以拉开小球。 这说明该条件下脂酶体与a 6 d 小球的结合力大约为0 8 0p n 。这意味着我们可以用 光镊直接观察与测定抗体抗原间的结合力。 ab 图2 3 抗体与抗原结合过程与结合力的测定 a 圈：- - j l 酶体固定在样品池，另一为抗体小球图中发荧光的小球为脂酶体。紧靠它上方的 为a 6 d 小球 b 图： 激光光镊操控抗体小球与脂酶体结合