（茶学专业论文）茶黄素对癌细胞的抑制及与抗坏血酸的协同作用.pdf

g s e h p v l p s m l m m p s m t t n f kb o p c p b e p d g f r i p s p k c r t p c r 缩略词 a b b r e v i n t i o n s a s c o r b i ca c i d 抗坏血酸 a c u t em y e l o i dl e u k e m i a 急性髓细胞性白血病 a c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a 急性早幼粒细胞白血病 d i m e t h y s u l f o x i d e二甲基亚砜 e p i c a t e c h i n 表儿茶素 e p i c a t e c h i ng a l l a t e表儿茶素没食子酸酯 e l o n g a t i o nf a c t o r2延长因子2 e p i g a l l o c a t e c h i n表没食子儿茶素 e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e表没食子儿茶素没食子酸酯 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子 e x t m c e l l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dk i n a s e 细胞外信号调控蛋白 激酶 g r a p es e e de x t r a c t 葡萄籽提取物 h u m a np a p i l l o m a v i r u s 人乳头瘤病毒 l i p o p o l y s a c c h a r i d e脂多糖 m i s t l e t o el e c t i n 植物凝血素 m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s 金属巯蛋白 3 一 4 ，5 - d i m e t h y t h i a z o l y l 一2 5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e 四甲基偶氮噻唑盐 n u c l e a rf a c t o rkb 核因子 o l i g o m e r i cp r o a n t h o c y a n i d i n s原花青素 p in eb a r ke x t r a c t松树皮提取物 p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r血小板源性生长因子 r i b o s o m ei n a c t i v a t i n gp r o t e i n s i i 型核糖体灭活家族 p r o t e i nk i n a s ec蛋白激酶c r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 逆转录聚 合酶链式反应 d l l s g 2 c c f k 从 川 舻 腓 跹 盯 职 阱 踮 盼 隙 p y c r o s s o d t f t f 2 a t f 2 b t f d g t f s t p u c v c e p y c n o g e n o l碧萝芷 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 活性氧 s u p e r o x i d ed i m u t a s e 超氧物歧化酶 t h e a f l a v i n 茶黄素 t h e a f l a v i n 一3 z g a ll a t e a茶黄素一3 一双没食子酸酯 t h e a f l a v i n 一3 一g a l l a t e茶黄素一3 一双没食子酸酯 t h e a f l a v i n - 3 37 一d i g a l l a t e 茶黄素一3 3 一双没食子酸酯 t h e a f l a v i n s 茶黄素复合物 t e a p o l y p h e n o l s茶多酚 u n i d e n t i f i e dc o m p o u n d 不确定的茶叶提取物 v i s c u mc o l o r a t u m 槲寄生提取物 5 中文摘要 本论文用茶黄素复合物及单体对多种癌细胞进行抑制作用研究，并且首次将 抗坏血酸与茶黄素进行人肺癌细胞a 5 4 9 的协同抑制作用试验。此外，分析了多 种植物提取物对人肺癌细胞的抑制作用效果，主要结果概括如下：用m t t 法检测 了浓度分别为1 、0 2 5 、0 0 6 3 、0 0 1 6 、0 0 3 9 w g m l 的t f s 、t f d g 、t f 2 b 和u c 对肝癌b e l 一7 4 0 2 细胞和胃癌m k n 一2 8 细胞的生长抑制效应。结果显示这些化合 物对上述细胞有明显的生长抑制效应，其抑制率随药物浓度的升高和作用时间延 长而增加。t f s 、t f d g 、t f 2 b 和u c 与b e l 一7 4 0 2 细胞共同培养4 8 h 后测得i c 。分 别为0 1 8 m m 、0 1 6 m m 、0 1l m m 和0 0 8 m m 和胃癌m k n 一2 8 细胞的i c 。分别为0 5 8 m m 、 0 2 5 m m 、0 1 4 m m 和0 2 2 m m 。 通过e g c g 、g s e 、p b e 、t f d g 、t f 和t f s 的抗人肺癌a 5 4 9 细胞体外实验，结果 表明除槲寄生的作用较小以外其他化合物均有很强促进人肺癌细胞凋亡的作用， 并且e g c g 的效果为最强，顺序为e g c g 、t f s g s e p b e 、t f d g t f 。 细胞凋亡实验表明，单独的抗坏血酸对a 5 4 9 细胞的抑制几乎没有作用，但 它可以显著的提高茶黄素类物质对该细胞的抑制效果。其中协同效果与单体t f c 最大，抑制率高达8 4 2 8 。茶黄素各单体与浓度为2 5 0 - - 6 2 5 t i m 抗坏血酸协 同抑制肺癌细胞a 5 4 9 时最少可以提高2 0 的抑制率。其中最好的协同抑制效果 存在于t f c 和抗坏血酸之间，。茶黄素单体与抗坏血酸的协同普遍高于e g c g 与 从的协同。但不同浓度的抗坏血酸与单体t f 协同效果差别不明显。 电镜观察t f c 和t f c 与从协同诱导的a 5 4 9 细胞的凋亡现象，观察到细胞核 发生固缩，染色质浓缩边集和产生由膜状物包裹内溶物的凋亡小体。并且协同诱 导时凋亡效果最明显。 d n a 凝胶电泳结果显示，在此处理中可非常明显的看到细胞凋亡。凋亡细胞 的d n a 断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现了1 8 0 - - 2 0 0 b p 整倍体的d n a 片断，而坏死细胞的d n a 断裂点为无规律的杂乱片断。还可以清晰的看到标志细 胞罚亡的梯形条带( d n al a d d e r s ) 。 综上所述，茶黄素及其单体可以诱导多种肿瘤细胞凋亡并且与抗坏血酸有良 好的协同作用。由于细胞膜有不同程度的损伤，细胞膜是茶黄素、抗坏血酸或两 者相互作用时对细胞损伤的主要作用位点。 6 关键词：茶黄素，e g c g ，槲寄生提取物，葡萄籽提取物，松树皮提取物，肺癌a 5 4 9 细胞 胃癌m k n 2 8 细胞，肝癌b e l 一7 4 0 2 细胞，抗坏血酸，协同作用 7 a b s t r a c t i nt h ep r e s e n ts t u d yi n h i b i t i o n so ft h e a f l a v i n sa n di t s m o n o m e r s a g a i n s t t h eg r o w t ho ff o u rh u m a nc a n c e r c e l l si n v i t r ow e r ec o n c e r n e d s y n e r g i s t i ci n h i b i t i o no ft h e a f l a v i n sa n da s c o r b i ca c i da g a i n s tt h e g r o w t ho fa 5 4 9c e l i sw a ss t u d i e d b e s i d et h e s e ，w ed e t e r m i n e ds o m ee f f e c t s o fs o m en a t u r a lp r o d u c t so nh u m a nc a n c e re e l l sa 5 4 9 t h er e s u l t sa sb e l o w ： 。t h ei n h i b i t i o ne f f e c t so ft f s ，t f d g ，t f 2 ba n du co nt h eg r o w t ho f h u m a n l i v e rc a n c e rb e l 一7 4 0 2 c e l l s ，g a s t r i c c a n c e rm k n 一2 8c e l l sw e r e i n v e s t i g a t e db ym t ta s s a y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s ef o u rc o m p o u n d s s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h eg r o w t ho fb o t ht w ok i n d so fc a n c e rc e l l s ，a n d e f f e c t i v ei ni n h i b i t i o nr a t ei nad o s ed e p e n d e n tm a n n e r t h ei c 5 0v a l u e s w e r e0 1 8 ，0 1 6 ，0 11a n d0 0 8 m mo nb e l 一7 4 0 2f o rt f s ，t f d g ，t f 2 ba n du c ， a n d0 5 8 ，0 2 5 ，0 1 4a n d0 2 2m mo nb e l 一7 4 0 2f o rt f s ，t f d g ，t f 2 ba n du c ， r e s p e c ti v e l y e g c g ，g s e ，p b e ，t f d ga n dt f sa l s os h o w e ds i g n i f i c a n ti n h i b i t i o n so n t h eg r o w t ho fa 5 4 9e x c e p tv c e t h er a n ko fi n h i b i t i o na b i li t yo fe a c h c 0 1 i l p o u n d a g a i n s ta 5 4 9i nv i t r oa sf o l l o w i n g ：e g c g 、t f s g s e p b e 、t f d g t f i nt h i ss t u d yw eg o tt h ed i f f e r e n tr e s u l tw i t hp r e v i o u sr e s e a r c h ， a s c o r b i ca c i dh a sn oe f f e c to nt h eg r o w t ho fa 5 4 9c e l l s i tw a sf o u n dt h a t a s c o r b i ca c i dc o u l di n c r e a s e dt h ei n h i b i t i o no ft h e a f l a v i n sa t1 e a s t2 0 h i g h e rt oc o m p a r ew i t hc o n t r o l sa g a i n s tt h eg r o w t ho fa 5 4 9c e l l s t f c s h o w e d t h e h i g h e s ts y n e r g i s t i c e f f e c tw i t ha s c o r b i ca c i d i na 1 1 t r e a t m e n t s ，h o w e v e r ，a s c o r b i ca c i dn og o o dp o s i t i v ea c t i o nw i t h e g c g w h e r e a s ，t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n ti n h i b i t i o no nt h eg r o w t ho f a 5 4 9c e l l sw h e ns a m ec o m p o u n dt oc o m b i n e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n o fa s c o r b i ca c i d t h ec h a n g e so fa p o p t o s i si n d u c e db yt f ca n dt f cw i t ha s c o r b i ca c i dw e r e 8 o b s e r v e dw i t he l e c t r o nm i c r o s c o p y w ed i s c e r n e dt h et y p i c a la p o p t o t i c m o r p h o l o g yi n c l u d i n ga n dc o n d e n s a t i o n i n t od e n s eg r a n u l e s ，a n dt h e f o r m a t i o no fa p o p t o t i cb o d i e di n c l u d i n gc o n d e n s a t i o ni n t od e n s eg r a n u l e s a n db l o c k s at y p i c a ld n ad e g r a d a t i o na s s o c i a t e dw i t ha p o p t o s i sw a sd e t e r m i n e db y d n aa g a r o s ee l e e t r o p h o r e s i s t y p i c a ld n al a d d e r sw a sv e r yc l e a r ，t h i si s d i f f e rf r o mn e c r o t i c i nc o n c l u s i o n t h e a f l a v i n sa n d t h e a f l a v i nm o n o m e r sc a ni n d u c et h e a p o p t o s i so fc a n c e rc e l l s a s c o r b i ca c i dh a st h es y n e r g i s t i ce f f e c tw i t h t h e a f l a v i n s a g a i n s tt h eg r o w t ho fa 5 4 9c e l l s w ef o u n dc h a r a c t e r so f a p o p t o s i sa n dd a m a g e so fc y t o p l a s mm e m b e r a n c ei na 5 4 9c e l l sc u l t u r es y s t e m a n d c y t o p l a s m m e m b e r a n c e m i g h t b et h e i m p o r t a n tt a r g e tp o i n t o f t h e a f l a v i n s ，a s c o r b i ca n dt h e i rc o m p l e x k e yw o r d s ：t h e a f l a v i n ，e g c g ，v i s c u mc o l o r a t u m ，g r a p es e e de x t r a c t ，p i n k b a r ke x t r a c t ，h u m a nl u n ga 5 4 9c a n c e rc e l l s ，g a s t r i cc a n c e rm k n 一2 8 c e l i s ，h u m a nl i v e rc a n c e rb e l 一7 4 0 2c e l l s ，a s c o r b i ca c i d ，s y n e r g i s t i c e f f e c t 9 第一章综述 茶黄素和其他的抗肿瘤天然产物对癌症细胞的作用 1 前言 肿瘤是当今世界直接危机人类生命的一种最常见、最严重的疾病之一，尤其 是在一些工业发达的国家和地区，更是成为人们健康的主要杀手。在我国，恶性 肿瘤的死亡率占死因的第三位。随着工农业的发展，环境中有机物的污染越来越 严重，致癌物的分布越来越广泛，严重威胁人类的健康。目前，约有1 8 的患者 采取手术治疗，约i 3 的患者在接受放化疗。 临床上应用的抗肿瘤化疗药物都 有不同程度的毒性，往往在杀伤癌细胞的同时，正常的组织细胞也遭到致命的伤 害，出现轻重不同的毒副作用，尤其对肝功能和肾功能的影响很大。随着癌症对 人类健康威胁和开发治疗此类疾病的合成药物耗资巨大，现在科学家把目光投向 绿色天然药物或其衍生物。每年，约有2 3 的患者在使用天然药物或其衍生物， 而且，越来越多的人正在加入这个行列中。 茶作为世人普遍使用的饮料，几千年的实践证实茶具有多种保健功效，其中 对癌症的预防就是其中之一。二十世纪六十年代人们开始调查饮茶与癌症发生之 间的关系，发现饮茶确实能够降低多种癌症的发生率。随后，饮茶对何种癌症具 有明显的防治作用在后来便成为研究的热点。茶多酚类物质中研究最多的是绿茶 多酚，特别是儿茶素类的抗氧化和抗肿瘤作用。红茶在世界茶消费中占最大比重， 其抗氧化和抗肿瘤作用也逐渐引起研究学者的重视。茶黄素最早是由r o b e r t s e a h ( 1 9 5 7 ) 发现的是指红茶中溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质。它由多 酚类及其衍生物氧化缩合而来，是红茶的重要品质成分之一。 1 0 r = r = t lt f r = 没食予醛基r = i tt f 2 a r = hr = 没食子酰簇t f 2 b r = r = 没食子酰纂t f d g 潮1 - 1 茶黄素懿篓零续擒霾 如( 图1 1 ) 所示，茶叶中多酚类化合物抗氯化活性的结构基础是b 环上的 邻二羟蒸( 3 ，4 一o h ) ，a 琊上5 和7 位上的二个羟基，以及c 环l 二的3 位上的 羟基，藏终j l 茶素结稳上翁3 ，4 t 邻二羟基霹将游褒金羼离子螫会以减少金属 离子滔化两产生的活性氧离子。j l 茶素清除翻由基靛作霜与其结构中b 环含有 二个羟撼有关。5 一碳中含有的羟基基团对儿茶素抗氧化作用也是必需的。茶 黄素的结构中含有两个b 环形成的苯并酚酮结构和多个酚羟基，也应该具有提 供质子的作用。茶黄素类中食酚羟基的数目越多，其清除自由基的熊力也越强， 抗氧纯箨嗣龟雯舞。磺突袭明，茶黄素吴寿良好懿医药僚链臻黥娃h ”“。表l 列出荣黄索、儿茶素和其他天然抗氧化剂活性的比较结果。其中，茶黄素双没食 子酸醮鼹有最强的抗氧化作用。茶黄素类具有抗氧化、预防心脑血瘸疾病、预防 衰老、增强免疫机能、预防龋馥、防癌抗癌、抗菌抗病毒等药理功熊，甚至某些 方嚣憨蕊效毙，l 茶素还要强。在蠢蘸戆茶色豢蘩褒功能豹磺究中囊予茶黄素类 的高满性，因而对茶黄豢炎含量都提出了较商鹣臻求。如何提高茶麓褰类的含量， 已成为渴前的主要研究热点之一。 表1 - 1 各种天然抗氧化剂抗氧化活性”1 撬氧纯赍j穰对挠氧袍螽幢( m m ) 维生豢c 维生豢e 槲皮酮 e c 鹃c 1 o 0 0 2 1 o 0 0 3 4 7 0 1 0 2 4 o 0 2 3 ，8 士o 0 6 e g c g e c g 茶黄素( t f ) 茶黄素一单没食子酸酯a ( t f 2 a ) 茶黄素一单没食子酸酯b ( t f 2 b ) 茶黄素一双没食子酸酯( t f d g ) 4 8 o 0 6 4 9 0 0 2 2 ，9 o 0 8 4 7 0 1 6 4 8 0 1 6 6 ，2 0 4 3 槲寄生寄生于橡树、桦树、榆树、柳树、枫树和杨树，广泛分布于中国北部 和朝鲜，其细干枝和叶做药用；产于华南者称为广寄生，其细干茎和叶人药。从 桑寄生的提取物中分离到多种化学成分，主要有外源凝集素、甾体化合物、三萜、 倍半萜内酯、黄酮类化合物、有机酸、胺类化合物、生物碱、氨基酸和肽类化合 物等。这些桑寄生科植物传统用于补肝肾、强筋骨、除风湿、安胎、生乳，现代 药理证明有降压、抗菌、抗病毒、利尿、抗肝炎、抗血小板凝聚和强心等作用， 也可治疗急性心肌梗死，心动过速、精神分裂症。此外还有抑制r n a 的合成、 肉瘤一1 8 0 ( s 一1 8 0 ) 和其他肿瘤系生成的作用1 5 1 。葡萄籽提取物主要含类黄酮， 由儿茶素和其他酚类组成，组分中生物活性最强的部分是低聚( 二一四聚体) 原 花青素( o p c ) 。目前的试验已证明葡萄籽提取物有抗脂质过氧化和清除自由基、 保护心脑血管和预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老的作用嵋1 。松树皮提取物 和葡萄籽提取物的主要成分类似，是水溶性极高的原花青素低聚物( 6 0 6 5 ) ，同时还含有其他四十多种水溶性成分，其中多数为有机酸。香草酸、阿魏 酸、没食子酸等，以及葡萄糖脂和其他对人体有用的生物活性成分。生理活性和 葡萄籽提取物基本相同。 2 茶黄素类抑制癌症细胞的作用机理 2 1 抑制癌细胞信号传输和增殖 肿瘤的发生是外源物通过细胞生长因子、生长因子受体、信号传导分子及转 录因子将外界信号传到细胞核，从而促使细胞分裂、增殖。在这个传导的过程中 只要阻断其中一个环节就可抑制肿瘤产生。 n f kb ( n u c l e a rf a c t o rkb ，核因子) 是一种转录因子，存在于胞浆中，并 被ikb 结合抑制。ikb 可以抑制n f kb 与其操纵基因结合。当ikb 上s e r 3 2 1 2 s e r 3 6 磷酸化后，ixb 就与n f kb 脱离开，并经泛素途径分解从而激活n f xb 。 具有活性的n f kb 就会启动i n o s 基因转录并表达成i n o s 合酶( 诱导型n o 合酶) 。 、在乙酰辅酶i i 等辅因子存在的条件下，这种酶能催化l 一氨酸生成n o 。n o 是引起 炎症的重要因子，同时在肿瘤的各个阶段也发挥着重要作用，胞内高浓度的n 0 会导致基因毒性效应。t a s i 等人研究发现，t f d g 、e g c g 可抑制由l p s ( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，脂多糖) 激活的鼠巨噬细胞( r a w 2 6 4 7 细胞) 中n 0 和 i n o s 的产生，t f d g 比e g c g 强，而其他多酚类没有这种作用。通过蛋白质印迹法 和r t p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，逆转录聚合 酶链式反应) 分析证实了t f d g 可以降低1 3 0 一k d 蛋白的产生，同时抑制i n o s 的表 达也受到抑制。同样e m s a 分析也显示t f d g 阻止n f kb 活性的降低。其机制是 t f d g 抑制了ikb 中s e r 3 2 的磷酸化，并且减少转录因子n f kb 亚结构p 6 5 和p ” 的积累从而阻断肿瘤的发生。 a p - 1 ( a c t i v a t o r p r o t e i n1 ) 是一种人细胞转录因子，控制与信号传入有 关的基因表达。它由含d n a 结合结构域的j u n 蛋白同源二聚体或j u n 和f a s 成的 杂二聚体构成。其中j u n 由3 3 1 个氨基酸组成，可由p k c ( p r o t e i nk i n a s ec ，蛋 白激酶c ) 催化其s e r 6 3 、s e r 7 3 磷酸化而激活，活化的a p l 可以促进许多基因 转录“1 。l i a n g 等“”研究红茶多酚类及绿茶e g c g 对n i h 3 t 3 细胞中的p k c 和a p l 活性的抑制作用时发现：t p a ( 诱变剂) 能提高膜结构上p k c 激酶的活性，而t f d g 可强烈抑制p k c 活性的升高，抑制率为9 4 5 ，e g c g 的抑制率只有9 4 。其 机理是：p k c 激酶的专一性底物为m b p 的磷酸化，并能阻止p k c 激酶由细胞溶胶 向细胞膜结构上转移。通过电泳法、蛋白质印迹法分别分析a p l 的活性和c j u n 基因表达，结果表明：t f d g 不仅强烈抑制t p a 诱导的a p 一1 活性，同时也是c j u n 基因表达的强烈抑制剂，其机制是抑制c - j u n 蛋白s e r 7 3 位点的磷酸化。c h u n g 等“”在体外利用小鼠表皮j 8 6 细胞层和一个突变形h - r a s 基因构建模拟的癌细 胞，并研究t f s 对这些细胞的作用。结果表明：t f s 表现出对3 0 7 6 r a s 红细胞 生长的抑制及对a p 一1 作用的抑制。c 环上的没食子酰基可以促进t f s 对细胞生 长及a p 一1 作用的抑制。在己加入t f s 的细胞中加入过氧化氢酶，不能阻止t f s 对a p l 作用的抑制。这表明：在t f s 的抑制作用中，h 。o ：没有发挥重要作用。 t f s 还可以通过抑制生长因子受体阻断肿瘤的启动。l i a n gy u c h i h 等”研 1 3 究茶黄素和茶红素对a 4 3 1 细胞和鼠n i h 3 t 3 纤维母细胞胞外信号和增殖的抑制， 结果发现，在茶多酚预培养的细胞中，t f d g 能抑制由e g f ( e p i d e r m a lg r o w t h f a c t o r ，表皮生长因子) 和p d g f ( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，血小板源 性生长因子) 诱导的e g f 受体和p d g f 受体自动磷酸化，并且强烈抑制e g f 与其 受体结合，从而阻断与游丝分裂相关基因的信号传导，其作用比e g c g 更强。另 外上述试验物分别与e g f 同时加入培养液中，结果发现仅t f d g 起作用。 a p o s t o i d e ss v “”等研究了t f s 和儿茶素对2 一氨基一卜甲基一6 一苯丙咪唑 4 ，5 - b 吡啶 诱导的突变的抑制作用，结果表明：t f s 及含有没食子酸酯的几茶素都能 抑制p h i p 诱导突变( 此途径经过细胞色素p 4 5 途径) 。其机制是t f s 能清除自由 基、超氧阴离子等，并能切断脂质过氧化链式反应。 2 2 抗肿瘤转移 t f s 可以促进各种细胞的凋亡，抑制癌细胞的增殖和扩散。h i b a s a m ih “ 等发现茶黄素类可以抑制胃癌细胞k a t o 的生长并诱导凋亡。通过形态学变化观 察可以看到细胞凋亡体。检测凋亡d n a 条带的结果表明：细胞凋亡与茶黄素类的 剂量、时间等成依存关系。z h a n ggy “”等人的研究结果表明：绿茶、乌龙茶及 红茶提取液可以抑制大鼠腹水肝癌a h l 0 9 a 细胞层的增殖和扩散，但对正常的大 鼠m 一细胞( m e s o t h e l i ac e l l s ，内皮细胞) 无影响。高浓度的红茶、乌龙茶提 取液还可以抑制l 9 2 9 癌细胞的增殖。在加入1 0 小牛血清时，a h l 0 9 a 细胞可以 扩散到m 一细胞单细胞层的底部。当利用口腔插管法饲喂茶提取液分别0 5 、l 、2 、 3 、5 小时后，再加入小牛血清，则a h i o g a 细胞的扩散和增殖均得到抑制。茶黄 素是红茶提取液中抑制癌细胞a h l 0 9 a 增殖和扩散最有效的成分，而其作用也与 细胞本身的特异性和细胞对茶黄素类作用的高灵敏性有关。根据 m a r i m a e d a y a m a m o t o “等人的研究，t f 可以抑制人体纤维肉瘤h t l 0 8 0 细胞的 扩散，并与剂量呈依存关系。 m m p s ( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，金属巯蛋白) 是以锌为活性中心的蛋白 质酶谱，在癌细胞的转移中具有促进作用，其中m m p 一2 和m m p 一9 在癌细胞扩散和 转移中具有重要作用。多酚类可与各种物质( 蛋白质，金属离子) 形成复杂化合 物。茶黄素可以与锌结合，从而抑制m m p s 酶的活力，达到抑制癌细胞扩散的目 1 4 的。根据m a r i 的研究t f 可以抑制h t l 0 8 0 细胞分泌m m p s ，但其浓度范围与抑制 h t l 0 8 0 细胞扩散的浓度范围不同 1 7 1 0s u z u k am 等1 的研究也表明：t f 、t f 2 a 、 t f 2 b 和t f d g 可以抑制鼠肺细胞的扩散。酶谱结果显示：癌细胞分泌的m m p s 中 主要包括m m p 一2 和m m p 一9 。茶黄素类可以通过抑制m m p 一2 和m m p 一9 的分泌来抑制 肿瘤细胞的扩散。 2 3 诱导肿瘤细胞凋亡 t f s 可以促进各种肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和扩散。y a n g g u a n g y u 等人研究t f s 、e g c g 、e g c ( e p i d e r m a lg a l l a t ec a t e c h i n ，表没食子儿 茶素) 对3 3 b e s ( 永生化s v 4 0 细胞) 署n 2 1 b e s ( h a r a s 基因突变体细胞) 人体支气管 上皮细胞的作用时发现，用上述物质分别处理2 种细胞，2 4 h 后t f d g 、e g c g 、e g c 表现出抑制作用，i c 。( 半数抑制浓度) 值均为2 3 pm o l ，t f s 其他成员没有这种作 用“”。这表b 拥t f s 没食子酸酯结构起了关键性作用。另将2 1 b e s 细胞分别用2 5 um o l t f d g 、e g c 、e g c g 处理以诱导细胞凋亡，2 4 h 后发现经t f d g 处理的细胞死亡得早， 峰值出现在8 1 2 h ，形态学观察表明，细胞形状不规则，且出现细胞质微粒，表 现出毒性效应；而e g c 、e g c g 诱导细胞凋亡则出现滞后现象，峰值在1 6 2 4 h ，并 且未表现出任何明显的形态学变化，跟h 2 0 2 诱导的细胞凋亡相似。上述实验若加 入外源过氧化氢酶则会显著地阻止e g c 和e g c g 诱导的细胞凋亡，而对t f d g 诱导细 胞凋亡无作用。以上结果表明：e g c g 、e g c 诱导细胞凋亡可能与h ：0 ，有关，而t f d g 则表现出不同的诱导机制。据l uj i e b o “”报道，在比较4 种主要t f s 对正常细胞 和癌细胞的生长、凋亡、基因表达的作用时发现：t f ( 1 0 5 0 um 0 1 ) 能抑制突变 体细胞w 1 3 8 v a ( w 1 3 8 突变体) 和c a c o 一2 结肠癌细胞的生长，但对相应的正常细胞没 有影响，而t f d g 没有表现出显著的抑制效果。其机理是t f ( 5 0 um 0 1 ) 能在m r n a 和 蛋白质水平上抑制血清诱导的c o x 一2 基因的表达，从而诱导细胞凋亡。g i o v a n n a c a d e m i 等”在研究红茶、绿茶提取物及红葡萄酒对a o m 诱导的小鼠( 1 6 周后) 肠道 肿瘤时发现，在喂食红茶提取物和葡萄酒的试验组中患腺瘤的小鼠( 雄f 3 4 4 鼠) 数量明显低于对照组( 对照组、红茶、绿茶提取物及红葡萄酒试验组中患腺瘤的 小鼠分别为8 6 ，5 9 ，9 0 ，5 0 ) ，而红茶组在诱导肿瘤细胞凋亡上又明 显优于其他组。通过形态学观察得到，主要是因为细胞发生收缩，与相邻细胞失 1 5 去联系且铬氨盐浓度升高，形成圆形或椭圆形的核碎片，从而诱导细胞凋亡。中 国预防医学科学院营养与食品卫生研究所在研究茶色素( 包括茶黄素、茶红素、 茶褐素) 抗肿瘤作用的实验中发现：茶色素1 0 1 0 0ug m l 对h e l a 细胞存活的抑制 率为2 2 3 4 1 ，对s 1 8 0 在小鼠体内的增殖有明显抑制作用，并有较明显 的量效关系 2 2 1 表明对肿瘤细胞的增殖阶段有抑制作用。y a n g “”发现t f s 可抑 n n n k 诱导的a j 鼠的肺癌。m o r s em a 等”研究t f s 矛d e g c g 对n 一硝基化甲基苯甲 胺( n m b a ) 诱导鼠食道癌的影响时发现，t f s 和e g c g 浓度在3 6 0 1 2 0 0 m g l 可明显减 少其食道癌的形成。 3 其他抗肿瘤天然产物抑制癌症细胞的作用机理 3 1 槲寄生抑制癌症细胞的作用机理 早在1 9 2 0 年，两个奥地利学者就发现槲寄生的提取物是一种天然的抗癌药 物，从此它在欧洲等地被广泛的用于肿瘤的治疗，近十几年研究发现其中的植物 凝血素( m i s t l e t o el e c t i n ，m l ) 在其表现的各种生物学活性中发挥最为重要的 作用。f r a n z 等从槲寄生的提取物中分离出3 种植物凝血素：m l i 、m l i i 、m l i i i “”。 其中m li 的含量最为丰富，其次是m l i i 和m l u i 。3 类m l 具有同源的氨基酸序列， 但它们的四级结构不尽相同。 3 1 - 1 植物凝血素杀灭肿瘤的遗传学机制 根据m l 的结构特点及其表现的细胞毒性，人们认为m l 应归为r i p s ( r i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ，i i 型核糖体灭活家族) 。r i p s 包括仅由单链组成的i 型 r l p s 年f l 由a 链、b 链共同组成的i i 型r i p s 。i i 型r i p s 的b 链可与细胞表面受体末端 的半乳糖结合，通过受体介导的胞吞作用进人细胞内；进人细胞后其a 链表现出 r n a 糖苷酶的活性，可以水解2 8 sr r n a 中腺瞟呤a 4 3 2 4 的n 糖苷键，使核糖体无法 与e f 2 ( e l o n g a t i o nf a c t o r2 ，延长因子2 ) 结合，从而抑制细胞内蛋白的合成： 而i 型r i p s 由于不具备高效的侵入细胞途径，相对r i p si i 来说表现较低的细胞毒 性1 。 3 1 2 植物凝血素通过c a s p a s e 途径诱导细胞凋亡 经典的细胞凋亡途径是：死亡受体f a s 或t n f r 被配体( c d 9 5 l 或t n f ) 结合后， 通过f a d d ( f a s a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i n ) 的接头蛋白使c a s p a s e 8 前体 】5 ( p r o c a s p a s e8 ) 聚集，这种聚集通过d e d ( d e a t he f f e c t o rd o m a i n ，死亡效应) 结构域的疏水作用来实现。c a s p a s e8 前体具有成熟c a s p a s e8 酶的1 2 的活 性，聚集后的p r o c a s p a s e8 足以通过自身或相互之间的切割产生成熟的c a s p a s e 8 ，成熟的c a s p a s e8 又可激活下游的效应c a s p a s e ，并最终使细胞凋亡。但b a n t e l 等报道m l 诱导的细胞凋亡程度在c d 9 5 受体突变细胞系和正常的含有c d 9 5 受体的 细胞系没有显著的区别，均表现较强的c a s p a s e 8 活性，提示m l 诱导的细胞凋亡是 c a s p a s e 8 非依赖性的过程乜”。进一步研究发现m l 可能是通过以下两条途径诱导 凋亡的：线粒体在某些化学或环境因素的作用下会开放p t 通道( p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o np o r e ) ，释放细胞色素c ，而细胞色素c 可以与a p a f l 、c a s p a s e9 的 前体结合在一起形成“凋亡体”( a p o p t o s o m e ) 激活c a s p a s e9 以及下游的c a s p a s e 3 等效应c a s p a s e 。b a n t e l 等用w e s t e n 印迹检测人白血病细胞系在被m l 作用后细胞 色素c 的含量，发现在m l 作用5 小时后，细胞色素c 的含量显著提高“。这个结果 提示由线粒体、细胞色素c 控制的凋亡途径在m l 诱导的细胞凋亡过程中十分重要； a k t p 1 3 k 信号传导途径是肿瘤细胞抵抗凋亡的一个重要途径“”：a k t ( b p p k b ， 蛋白激酶b ) 可以被3 一磷酸肌醇依赖性蛋白激酶作用，使其苏氨酸3 0 8 发生磷酸化， 进而导致其丝氨酸4 7 3 发生自身磷酸化。活化的a k t 可以进一步使c a s p a s e 9 磷酸 化，使c a s p a s e 9 失去诱导凋亡的能力，从而抑制细胞凋亡。c h o i 等人通过w e s t e r n 印迹比较人肿瘤细胞系a 2 5 3 在m l 作用前后磷酸化a k t 和去磷酸化a k t 含量的变化， 发现在a k t 总量不变的情况下，磷酸化的a k t 显著减少，而去磷酸化的a k t 明显增 多。提示a 2 5 3 细胞在韩国槲寄生凝血素作用后，a k t p 1 3 k 途径被抑制，c a s p a s e 9 等下游蛋白去磷酸化，恢复诱导凋亡的能力“”。 3 1 3 植物凝血素通过抑制端粒酶的活性诱导细胞凋亡 端粒酶是由作为模板的h t r n a 和h t e r t ( 反转录酶催化亚基) 组成的，它可以 向端粒的末端添加t t a g g g 六连体重复序列，从而维持端粒的稳定性，保证染色体 复制后的完整性。但是。人们发现8 5 9 0 的肿瘤及肿瘤衍生细胞都表现出较 强的端粒酶的活性，而在肿瘤细胞附近的正常细胞却不表现这种活性。正常细胞 的分裂次数是有限的，端粒酶的激活是细胞走向永生化的必要途径，而永生化又 被认为是肿瘤恶化的必要步骤。肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短将导致染色体 融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续分 1 7 裂、增殖和生存。端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。所以，如果 能够使肿瘤细胞中端粒酶失活，就可以抑制肿瘤细胞无限的增殖，端粒酶的抑制 剂也就成为了一种潜在的抗癌药物，而对端粒酶的检测也成为对癌症诊断的有效 方法”。 l y u 等用t r a p 法检测肝癌细胞系s k h e p 一1 ( p 5 3 一p o s i t i v e ) 和h e p 3 b ( p 5 3 一n e g a t i v e ) 在忆作用前后端粒酶的活性：他们在0 、6 、1 2 、2 4 小时等时间 点向培养液中加入k m l i i ，发现s k h e p 一1 细胞系的端粒酶活性在2 4 j j 、时后显著降 低，h e p3 b 细胞系的端粒酶活性则在4 8 小时后逐渐降低。这个结果提示m l 可以不 依赖p 5 3 的参与抑制端粒酶活性，使人们可以从一个全新的角度探索m l 的抗癌机 制，更重要的是它可以解释为什么m l 只对肿瘤细胞选择性杀伤，而不伤害正常细 胞”。但是，我们还不知道m l 对端粒酶的抑制是通过m l 与端粒酶的直接作用还 是通过其他的下游的诱导凋亡的途径实现的。如前所述，m l 是r i p s i i 家族中的一 员，可以水解r n a ，那m l 是否也可以剪切h t r n a ，使端粒酶失活呢? 发生这种情况 的可能性较小，因为m l 作为一个分子量为6 0 k d a 左右的蛋白很难进入到细胞核中。 所以，m l 对端粒酶活性的抑制在很大程度上还需要下游的c a s p a s e 3 等效应 c a s p a s e 发挥作用，引起核内一些p 5 3 非依赖性的效应蛋白活化”，降解或修饰 h t e r t 催化亚基。 3 2 葡萄籽和松树皮抑制癌症细胞的作用机理 葡萄籽和松树皮的有用成分都是原花青素( p r o e y a n i d i n ) 和儿茶素，很早以 前人们就发现了它们的药