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浙江人学坝j 学位论文 海藻中砷的含量和形态分析及砷在小鼠体内的代谢研究 专业：海洋生物学 作者：李俊 导师：朱亚尔副教授 摘要 常见的海藻海带、紫菜、裙带菜和羊栖菜等都含有丰富的钙、铁、磷、 碘等物质，能促进骨骼正常发育，是具有保健功效的营养价值丰富的海产品”i ， 然而藻类通常具有富集海水中砷的作用”“，这几种海藻中也含有大量有毒的砷， 包括无机砷和有机砷，进入人体后在体内蓄积，对人体健康构成潜在的威胁，特 别是无机砷对人体的危害尤其值得关注。所以在海产品的利用和加工过程中必须 及时检测和有效地控制砷含量。 其次，由于砷对人体健康带来的危害从而引起了越来越多的人的关注。有关 砷在人体内的代谢变化以及砷的致癌机制，便成了各国学者关注的热点。同时， 砷虽然是一种毒物，也有报道采用亚砷酸注射液治疗急性早幼粒细胞白血病和慢 性粒细胞白血病的情况。i ，具有良好的疗效，因此研究砷化合物在体内的代谢 和牛物转化情况具有很重要的意义。 本实验主要围绕两个方面进行 1 埘海藻中砷的形态和含量进行了分析。海藻样品的总砷采用于法消解处 理，含量测定分别采用银盐法和氢化物原子荧光法进行，并对原子荧光测定的条 件包括硼氧化钾的用量、还原剂的影响以及盐酸介质酸度的影响等进行了考察 还对两种方法进行了比较。结果表明，与银盐法相比，采用氧化物原子荧光光谱 法进行砷含量的测定，灵敏度高，精密度更好，方法简便可靠。冈此，无机砷的 含量测定采用氢化物原子荧光光谱法，样品采用盐酸溶液浸提法处理。总砷和无 机砷的测定方法线性都较好，相关系数o 9 9 9 0 以上，四种海藻的精密度和平均 问收事都能满足要求，结果可靠。几种海藻的总砷岔爱水平都较高，无祝砷的禽 量也很高，差异较大，其中二# 栖菜的总砷和无机砷含量最高分别是6 48 9 9 9 g 2 和4 55 3 9 9 g ，无机砷的分栖具有地区差异。本文为系统研究海藻中砷的宙量 分佑特征提供了一个可靠的方法。其次采用毛细管电泳技术对几种硐f 形态进行了 分析，对其f 赶泳条件、线性范豳及检测限进行了探讨，为咀后迸步海藻中砷形 态分析提供了参考依据，也为其它样品中砷的检测提供了依掘。 2 采嘲( j c 肭s 和g c 分别送行了砷的检测，) c j 廓浆和血细胞叶；砷的样6 处 理方法进行了摸索首次建立了血浆和m 细胞中砷的气榻色谱测定，方法，并依释 此方法进行，砷在小鼠体内的代谢研究。以5 m g k g 。剂量给小鼠静嗽注射给弱 后，绘制j 小同时蚓点砷在l 缸浆祁血细胞中的浓度曲线，考察了其在两相之间的 分配情况并得到。些相关的药动学参数。 关键词：砷，海藻，小鼠，代谢 s t u d yo i lc o n t e n t sa n ds p e e i a t i o no fa r s e n i ci na l g a ea n d m e t a b o l i z eo fa r s e n i ci nm i c e s p e c i a l i t 3 。：m a r i n eb i o l o g y g r a d u a t e ：l jj u n s u p e r v i s o r ：z h uy a e r a b s t r a c t t h ef o u rc o n l i t l o l l a l g a e l a m i n a r i aj , f p o ni c c l 、p o r p k ) 7 1 n 、l h d a s ，l p i r m a t h l d na n ds ； r g a s s u mn s i f o r z n o 。a l lc o n t a i na b u n d a n tc a l c i u m i r o n p h o s p h o r u s i o d i n ea n do t h e rs u b s t a n c et h e yc a np r o m o t et h ed e v e l o p m e n to f s k e l e t o n s ，a n da r eh i g hn u t r i e n tv a l u es e a f o o dw h i c hh a v eh e a h h c a r ef l m c t i o n n e v e r t h e l e s s a l g a eh a v ef u n c t i o no fe n r i c h i n ga r s e n i c i ns e a x - , a t e rt h e s e a l g a e 浙江火学硕l 学位论史 c o n t a i np l e n t i f u lp o i s o n o u sa r s e n i ce l e m e n t ，w h i c hc a l lc u m u l a t ei nv i v oa n dr e s u l ti n l a t e n tt h r e a tt oh u m a nh e a l t ha f t e rt h e ye n t e rh u m a nb o d y t h e r e f o r e ，c o n t e n t so f a r s e n i cm u s tb ed e t e c t e di ng o o dt i m ea n dc o n t r o l l e de f f e c t i v e l y i nc o u r s eo fe x p l o i t a n dm a c h i n i n go fs e a f o o d s e c o n d l y ，a r s e n i cb r i n ga b o u ta t t e n t i o no fm o r ea n dm o r ep e o p l eb e c a u s eo ft h e i r e n d a n g e r m e n tt oh u m a nh e a l t h m e c h a n i s mo nm e t a b o l i z ea n dc a r c i n o g e n i c i t yo f a r s e n i ci nh u m a nb o d yh a sb e e nah o t s p o tp r o b l e mw h i c hw a sc o n c e m e db ys c h o l a r s f r o mm a n yc o u n t r y a tt h es a m et i m e ，a l t h o u g ha r s e n i ci sap o i s o n o u ss u b s t a n c e ，t h e r e a r er e p o t so nc u r i n ga c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i aa n dc h r o n i cm y e l o i dl e u k e m i a p a t i e n t sw i t ha r s e n i t ea c i di n j e c t i o n ，a n dh a sg o o dc u r a t i v ee f f e c t c o n s e q u e n t l y , t h e r e s e a r c ho nm e t a b o l i z ea n db i o t r a n s f o r m a t i o no fa r s e n i cc o m p o u n di nv i v oh a s i m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e t h ee x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e ds u r r o u n d i n gt w oa s p e c t ， 1 a n a l y s i so fc o n t e n t sa n ds p e c i a t i o no fa r s e n i ci ns o m ea l g a es a m p l e sw e r e p r e p a r e dw i t hd r yd i g e s t i o np r o c e s st od e t e r m i n et h et o t a l a r s e n i cc o n t e n t s ，a n d d e t e r m i n a t i o no fc o n t e n t sa d o p t e ds i l v e rs a l ts p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o da n dh y d rid g e n e r a t i o na t o m i cf 1 u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ym e t h o dr e s p e c t i v e l y t h e c o n d i t i o n s0 fd e t e r m i n a t i o nw h i c hi n c l u d et h ee o n c e n t r a t i o no fk b h d e f f e c t0 f r e d u c i n ga g e n ta n dc o n c e n t r a t i o no fh c lm e d iu mw e r ed is c u s s e d ， a n dt h et w od e t e r m i n a t i o nm e t h o dw e r ec o m p a r e d s a m p l e sw e r ee x t f a c t e d w it hh c 】s 0 1ul i o nf o r1 8 ht od e t e r m r et h ei n o r g a n ica r s o n icc o n t e n t sw i t h t l y d r idg e n e r a t i o n a t o m i cf 1 u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y m e t h o d r e s u l t s s h o w e d ， c a m p a r e d w i t h s i1v e f s a l t s p e c t r o p h o t o m e tr y m e t h o d ， d e t e r m in al i o n0 1 、c o n t e n t so f a r s e n i cw i t h h y d r i dg e n e r a t i o na t o m ic f i u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ym e t h o di sm o r es e n s it i v e ，p r e c is e ，e a s ya n d t e l i a b lc t h e 1 i n e a r i t y o ft o t a la n d i n o r g a n ica r s e n icw a sg r e a t ， c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tisa b o v e0 9 9 9 0 ，t h ef o u ra l g a eh a v eh i g ha r s e n ic l e v e is ，a r ea l1a b o v et 6 5 8 9 9 g - 。t h ein o r g a n i ca r s e n i cc o n t e n t sa r ea ls o h i g h ，a n dh a v eg r e a td if f e r e n c e s a r g a s s u mf u s if o r m eh a st h eh i g h e s tt o t a l 一 塑竖叁兰堕! 二兰垡丝兰 一 _-_-_-，_，_-_一 a n din o r g a n i ca r s e n i cc o n t e n t si n t h e s e a l g a e ，a r er e s p e c t i v e l y 6 4 ，8 9 9 9 菩。和4 5 5 3 p g g - , ：t h ed i s t r i b u t i o no f i n o r g a n i ca r s e n i ch a sr e g i o n d i f f e r e n c e t h isp a p e rp r o v i d e s ar e l i a b l em e t h o d t os t u d yt h e d i s t r i b u t j o n f e a t u r eo fa r s e n icc o n t e n t so f a l g a es y s t e m c a l l y c a p i l l a r y e l e c t r o d h o f e s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e dt oa n a l y z ea s ( i i i ) 、a s ( v ) a n dd m a i na l g a e t h ee l e c t r o p h o r e s isc o n d i t i o n ，1 i n e a r i t yr a n g e ，1 i m i t o f d e t e c t i o na n ds a m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o dw e r ed i s c u s s e d a l t h o u g h n o a s ( 1 1 1 ) 、a s ( v ) a n d 嗍i na l g a ew e r ed e t e c t e d ，i tp r o v i d e d r e f e r e n c e f o u n d a t i o nf o rs p e c i a t i o na n a l y s i so fa r s e n i ci na l g a el a t e r ，a n df o r d e t e r m i n a t i o no fa r s e n i ei no t h e rs a m p l e s 2 s t u d yo nm e t a b o l iz eo fa r s e n i ci nm i c ew i t hg cm e t h o d g c m sa n dg c w e r ea d o p t e dt od e t e c ta s ( 1 1 1 ) r e s p e c t i v e l y ，a n d f i n do u ts a m p l e d r e t r e a t i i l e n tm e t h o do fa s ( 1 1 1 ) i np l a s m aa n dr e dm o o dc e l l s 。i t 1 i f a s e s t a h l i s h e dd e t e r m i n a t i o nm e t h o do fa s ( i i i ) i np l a s m aa n dr e db l o o dc e l l s ， a n dm e t a b o l i z eo f a s ( i j i ) i nm i c eb l o o dw a ss t u d i e da c c o r d n gt ot h i sm e t h o d c o n c e n t r a t i o n t i m ec u r v ea n dd i s t r i b u t i o no fa s ( 1 1 1 ) inp l a s m aa n d r e d b l o o dc e l l sw e r ed e s c r i b e da f t e ri n t r a v e n o u sa d m i n is t r a t i o nw i t hd o s eo f 5m g k g t h ep h a r m a c o k a e t i e sp a r a m e t e ro fa s ( 1 1 1 ) w e r eg a i n e dt h r o u g h s o f t w a r ef in a 】1y k e y w o r d s ：a r s e n i c ，a l g a e ，m i c e ，m e t a b o l iz e 浙江大学硕士学位论文 前言 我国的海藻资源异常丰富，种类多，分布广。海藻中含有许多营养物质，包 括海藻多糖、多酚、活性碘、多种维生素、氨基酸等；同时也含有一定数量的重 金属元素，其中砷元素就是与人类健康和生命活动有至为密切的关系，是毒性金 属研究的代表性物质”1 。海水中的砷浓度比较稳定，总砷的含量为1 0 2 o “g l 。海洋生物可以直接从海水以及食物链中摄取砷，因此一般海洋生物含 有的总砷浓度要高于陆生生物。海藻中的砷含量也高于陆生植物”3 。海藻中的砷 化物是一类很有意义的物质。了解藻体中砷的存在状态及其含量，对人们研究海 藻、利用海藻至关重要：海藻中砷的含量、分布和形态直接关系到各种海藻的利 用价值和方法。 国际上自上世纪初已开始了进行海藻中砷的研究。1 9 1 9 年c o m e c 首次对海 藻灰分进行定性的光谱分析发现其中含有砷。1 。此后，关于海藻砷含量的研究 一直没有间断，大量文献对海藻中的砷及其测定方法进行了较为详细的研究报 道。早年从事研究的科学家有j o n e s “、w i l l i a m s “和w h e t s t o n e “23 等。他们报道 说褐藻( p h a e o p h y c e a e ) 的砷含量为3 0 1 0 t 2 1 8 1 0 击( 占干重，以下同) 。红藻 ( r h o d p h y c e a e ) 和绿藻( c h o l o r p h y c e a e ) 贝, l j 为1 1 0 。6 1 5 1 0 。6 。根据m a h e r 和 c 1 a r k e ( 1 9 8 4 ) 对澳大利亚南部的两个海区海藻的研究s t e n h o u s e 湾褐藻的砷含量 范围为4 2 2 1 0 一1 7 9 1 0 缶，红萍为1 7 6 1 0 击3 1 3 1 0 6 ，绿藻为6 3 1 0 。6 1 6 3 1 0 ；而s tv i n c e n t 湾的褐藻、红藻和绿藻的砷含量范围分别为2 6 3 1 0 。6 6 5 3 1 0 一、1 25 1 0 - 61 62 1 0 4 、9 9 1 0 4 1 0 8 1 0 6 。对同本海藻的研究也 表明，褐藻、红藻和绿藻的砷含量分别为5 0 1 0 4 1 4 8 1 0 一、4 6 1 0 4 2 2 1 0 、3 0 l o - - 6 8 1 0 。6 。因此，从己体上说，三大经济海藻的砷含量依次为 褐藻 红藻 绿藻“。w h y t e 和e n g l a r 分析了褐藻的海带科、翅藻科和巨藻科 中的砷，发现无机砷含量为0 5 1 0 4 2 7 1 0 1 ，而有机砷含量为4 0 3 1 0 1 8 9 7 1 0 1 。有机砷占总砷9 5 以上，无机砷只是少数。e d m o n d s 和f r a n c e s c o n i 也认为大多数海藻中的砷化合物主要是有机砷。因此，目前国内外普遍认为，海 藻中的砷以有机态和无机态并存，其中有机砷化合物占绝大多数“。“3 。 但也有例外情况。有的海藻如马尾藻科( s a r g a s s a c e a e ) ，它的无机砷含量 浙江人学硕 ：学位论文 及占总砷的比例明显高于其他褐藻。其中s a r g a s s u mm u t i c u m 的无机砷含量为 2 0 8 1 0 1 ，约占总砷的3 8 ；日本羊栖菜( h i z i k i af u s i f o r m e ) 的无机砷含量 高达7 1 8 1 0 1 ，约占总砷的5 8 “，这表明马尾藻科累积无机砷的能力高于其 他海藻。 海藻中砷的化学形态，在代谢上与海水中的砷形态有着紧密联系。在海水中 砷主要是以砷酸盐a s ( v ) 、亚砷酸盐a s ( 1 1 1 ) 、甲胂酸c h 3 a s o ( o h ) 2 ( 嘲a ) 和二 甲基次肿酸( c h 3 ) 2 a s o ( o h ) ( d m a ) 四种形存在，其中以砷酸豁占优，因此， 海水中的砷具有较高的毒性。大量研究表明：海藻中有机砷的存在形态主要有两 种：砷糖( m r s e n o - - s u g a r s ) 和砷脂( a r s e n o - - l i p i d s ) t 6 1 ，即海藻中的有机砷主要与糖 类和脂类相结合而存在，除此之外甲基砷类m m a 、d m a ，有的还含有三甲基砷 化物( t m a o ) 。 我国在这方面的研究起步较晚，获得的资料也有限。根据中科院海洋所利用 分光光度法、原子荧光法、砷滴定法的测定结果”几种主要中国海藻中的总砷 含量分别为：中国海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 4 2 xl o 6 2 1 0 4 、马尾藻 ( s a r g a s s u ms p ，) 3 6 1 0 。6 - 5 0 x1 0 - 6 、江蓠( g r a c i l a r i as p ) 3 1 0 西9 1 0 南、石莼 ( u l v as p ) 2 1 0 - 6 1 0 1 0 一。目前掌握的中国海藻的砷含量数据大多只限于总 砷，海产品中无机砷的含量也有少部分研究，但我国海域广阔，季节气候也有很 大差异，因此不同产地、不同季节以及不同气候等条件下海藻中砷的含量都可能 不同，可能存在一定的规律，还有海藻巾砷的代谢机制等均有待丁去研究。 海藻及其他海产品中的砷元素，进入人体后在体内蓄积，对人体健康也构成 潜在的威胁。砷及其化合物也早己被国际癌症研究机构确认为致癌物“，特别是 无机砷的毒性更大，包括对氧化磷酸化过程的解偶联作用与巯基基团结合从而破 坏酶系统还可以诱使d n a 发生互换和断裂，造成基冈的变异“，而且会导致各 种循环和神经功能紊乱以及突变致癌和畸形等后果“9 ，所以在海产品的利用和 加工过程中必须及时检测和有效地控制砷含量。 一方面，砷对健康的危害是多方面的，可引发多器官的组织学和功能上的异 常改变，严重者还可导致癌变，譬如皮肤和内脏器官朋，瘤、心血管及神经系统疾 病等都与砷暴露明显相关，尤其是饮水型砷暴露，可以导致皮肤损伤、血管疾病、 癌症等“。2 2 。“1 ，砷在环境中的分布极为广泛，存在于地壳、土壤、海水、河水、 浙江大学硕 学位论文 大气及食物中，使特定地方病区居民、工人甚至一般环境人群接触过量的砷，因 丽砷中毒已成为医学研究的重要内容。然而由于砷对机体的毒作用非常复杂，许 多问题至今悬而未决。砷的毒作用机制，尤其是分子机制还不十分清楚甚至存 在些争议。长期以来，砷摄入后所表现出来的健康效应的差异一直是困扰研究 者的问题，近年有学者提出，砷在体内的代谢可能受到代谢酶基因多态性的影响， 但还缺乏相关的分子流行病学研究结果的支持。砷健康危害的研究存在一定的不 平衡性，对皮肤、神经、循环等的危害研究历史较长，了解也比较深入，而在某 些领域，如对免疫功能影响的研究则较少见。砷对健康危害的研究具有相当大的 发展空间，砷暴露对免疫功能、儿童健康的影响，以及砷毒性作用机制的深入探 讨很可能成为未来研究的重要领域”“。 另一方面，体内微量砷元素的存在对人体或动物也具有一定的生理作用，古 代就有利用砒霜来美容的典故。据文献”报道，体内微量的砷元素的存在可以刺 激造血器官，使骨骼造血机能活跃，促经红细胞和血色素新生，改善皮肤营养。 有时候能抑制肠道寄生虫，对各种链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌及厌氧菌均有抵 抗作用。很多动物饲料中添加砷化合物就是利用砷的这些生理作用。很多文献报 道采用砷化合物治疗白血病的案例。1 8 6 5 年，l i s s a u e r 用亚砷酸钾治疗慢性白血 病，1 9 3 1 年f o r k n e r 等用亚砷酸钾溶剂治疗慢性粒细胞白血病获得成功”! 。1 9 6 6 年后f o r k n e r 和s c o t t 的报道仍然热衷于亚砷酸钾( f o w l e r s 液) 治疗慢性粒细胞白 血病。尽管试验了许多其它试剂，无一药物能达到此药的治疗效果。可以说，最 早用来治疗白血病的药物应该是砷化物。近十年来，亚砷酸注射液治疗急性早幼 粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病的研究进展很快，取得很好的疗效，对早幼粒 细胞有诱导分化和诱导细胞凋零作用，具有广阔的前景，因而其药代动力学研究 也显得尤为重要。因此，有关砷化合物在体内的代谢的研究越来越多地受到人们 的关注，不管是为了避免或减少砷对人体的危害，还是利用其独特的作用促进人 体或动物的健康或治疗疾病，都具有很重要的指导意义。 本研究以此为目的进行了海藻中总砷、无机砷和有机砷的含量分析以及利用 毛细管电泳进行了砷的形态分析研究；以小鼠为研究对象，研究了砷在体内的代 谢情况，考察了砷在血浆和血细胞中的分前i 和消除情况以及随时问的浓度变化， 为进一步研究砷在体各组织内的代谢和生物转化打下基础。 浙江人学硕士学位论文 第一部分海藻中砷的含量测定和形态分析 海藻具有富集砷的作用，不同种类或不同产地的海藻中富集砷的能力也不 样，含量都有所差别，本文采用不同的方法对不同产地的四种海藻的总砷、无机 砷及有机砷进行了测定和比较。 1 总砷含量测定 总砷的测定方法有很多，本实验中主要采用银盐法和原子荧光法对总砷进行 了检测，对两种方法的测定条件进行了探讨，并对这两种方法进行了比较。 1 1 银盐法测定海藻中总砷含量 1 1 1 试剂和仪器： l m g l 儿1 砷标准溶液( 国家标准物质中心提供) ，2 0 酸性氯化亚锡溶液， 醋酸铅棉花，盐酸为优级纯试剂，其他均为分析纯试剂。 u 一2 0 0 0 紫外分光光度计，砷测定器， 1 1 2 样品处理 海藻样品用自来水清洗三次，去除泥沙和其它杂质，再用蒸馏水清洗两次， 盛放在托盘中风干至水分散失。将干燥的样品用打粉机粉碎，密封保存。 样品消化处理采用干法消解。按g b t5 0 0 91 l 一1 9 9 6 和文献。中的干法消 解方法进行样品处理，称取1 o g 的样品，粉碎，精密称量后加入氧化镁粉未1 9 ， 1 5 的m g f n 0 3 ) 2 溶液5 m l ，用玻棒搅匀，静置1 小时，接着水浴蒸干，再詈予 电炉j ：炭化至无烟后转移到马弗炉中5 5 0 高温灼烧5 小时，冷却后取出后再加 m g f n 0 3 ) 2 溶液2 m l ，混匀后再同法蒸干、炭化，转入马弗炉中灼烧2 小时。最 后取出样品加少许水润湿，再用盐酸( 1 ：1 ) 溶液溶解，加水定容到5 0 m l 。 1 1 _ 3 标准曲线 吸取1 m g i 也。砷标准溶液l m l 到1 0 0 m l 的容量瓶中，用5 的h c i 溶液 稀释并定容，再吸取该溶液t o m l 到另一个1 0 0 m l 的容量瓶中，用5 的h c l 溶液稀释并定容，摇匀此溶液即为l g g m l 。1 砷标准工作液。 分别取l f g ml _ i 砷标准工作液0 、2 、4 、8 、1 2 、1 6 m l ，置于锥形瓶中，加 浙江人学硕j 学位论文 水至4 0 m l ，再加h 2 s 0 4 ( 1 ：1 ) 1 0 m l ，k i 溶液3 m l ，s n c l 2 溶液o 5 m l ，混匀，静置 1 5 m i n ，向瓶中加入3 9 无砷锌粒，立即塞上装有醋酸铅棉花的导气管，在常温反 应4 5 r a i n ，最后吸收液补足氯仿，在u 2 0 0 0 紫外分光光度计上5 2 0 n m 处测吸收 值，得到线性方程如下 y = 0 0 2 8 3 x 一0 0 3 7 r = 09 9 9 2 结果表明在0 1 6 9 9 的线性范围内砷的线性良好，检出限为2 p g 。 1 1 4h 2 s 0 4 ( 1 ：1 ) 用量的考察 取干法消化处理好的羊栖菜样品溶液，采用h 2 s 0 4 ( 1 ：1 ) 不同用量，按照“1 1 3 标准曲线”项下操作进行反应，反应时间4 5 m i n ，测得吸收之结果见表l 。 表1 不同的h 2 s 0 4 ( 1 ：1 ) 用量对吸收的影响 有此可见，h ：s o 。( 1 ：1 ) 的加入量为1 0 m l 时，溶液的吸收值开始稳定。 1 ，1 5 吸收液稳定性考察 取l 峙m l 。砷标准工作液6 m l ，按照“1 1 3 标准曲线”项下操作进行反应 测吸收值，见表2 。 表2 放置时间对砷吸收液的影响 结果显示，砷的氯仿吸收液放置的时间不能超过2 h ，否则测定的结果会偏 高。 1 1 6 精密度与回收率实验 为了考察本方法的精密度与准确度，分别进行了精密度和回收率实验。分别 称取四种海藻样品若干份，按照同样的处理和测定方法进行测定，计算相对标准 偏差；回收率实验分高、中、低三个浓度分别加入一定量的标准物质，按照同样 的处理方法计算加样回收率。结果见表3 和表4 。 浙江大学顿j 学位论文 表4 银盐法测海藻中总砷的回收率结果( n = 5 ) 样品 本底值 ( g g 百1 ) 海带 紫菜 2 3 1 6 2 3 1 6 2 3 1 6 3 5 0 4 3 5 0 4 3 5 0 4 加标量 ( 1 a g g 1 ) 测得量 ( p - g g 。1 ) 回收率 ( ) 1 0 2 0 3 0 2 0 3 5 5 0 3 2 9 4 4 2 2 7 5 3 3 7 5 4 8 8 7 22 2 8 7 1 4 裙带菜 羊柄菜 3 1 0 6 3 10 6 3 1 0 6 7 3 1 0 7 3 1 0 2 0 3 5 5 0 4 0 7 0 5 2 6 l 6 8 3 6 8 4 1 7 1 1 1 6 8 1 4 22 2 平均回收率 ( ) 9 7 8 0 9 5 5 59 8 0 2 1 0 0 7 9 9 - 2 0 1 0 6 2 31 0 3 2 1 1 0 4 2 0 1 0 7 7 5 1 0 6 5 7 1 0 6 2 2 1 0 6 8 5 9 6 ，4 5 9 8 7 49 9 5 l 7 3 1 0 1 0 01 7 6 4 4 1 0 3 3 4 1 2 原子荧光法测定海藻中总砷含量 1 2 1 试剂和仪器 l m g m l a s 标准溶液( 国家标准物质研究中心提供) ，m g o ，1 5 m g ( n 0 3 ) 2 溶液，硫脲抗坏血酸溶液，2 的k b h 4 溶液溶液，盐酸( 】：1 ) 溶液，5 的 o 浙江大学硕士学位论文 盐酸载流溶液。盐酸为优级纯；其余试剂均为分析纯试剂。 a f s 一2 3 0 断序流动原子荧光光度计( 北京海光仪器厂) ，恒温水浴锅 1 22 样品处理 样品处理方法也采用干法消解。取0 5 9 的样品，粉碎，精密称量后加入氧 化镁粉末o 5 9 ，其他按“1 1 _ 2 ”项下操作处理。最后处理好的样品用盐酸( 1 ：1 ) 溶液溶解，加水定容到5 0 r a l 。放置3 0 m i n 后用原子荧光仪测总砷的含量。同法 作试剂空白。 1 2 3 仪器操作条件 负高压：2 8 0 v ，砷空心阴极灯电流：6 0 m a ：原子化器高度：8 m m ；载气流 速4 0 0 m l m i n ：屏蔽气流速：1 0 0 0 m l m i n ：读数延迟时间2 s ：读数时间：l o s 。 1 2 4 标准曲线 按照“11 3 ”项下操作配置l p g m l 。的a s 标准工作液。 分别吸取l p g m l 。1 的a s 标准工作液0 、0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m l 于5 0 r n l 的容量瓶中，加盐酸( 1 ：1 ) 溶液5 m l ，硫脲一抗坏血酸溶液1 0 m l ，加水定容， 振摇均匀( 各相当于含a s 浓度0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 u g l ) 。用原子荧光光谱 仪测定上述标准溶液得到标准曲线如下 y = 7 3 0 0 7 x + 1 3 4 4 8 r = o 9 9 9 8 结果表明在o 5 0 熘尾豹线性范围内，砷的线燃良好，总砷测定的捡出嫩为 0 0 3 5 g l 。 l ，2 5 矮氢纯镳弱鬓麴影莲连 为了考察最适假的硼氢化钾用缀，我们分别配制浓度为o 5 、l 、2 、3 强、4 静磁氢纯舞溶滚，较照“i ，2 4 标准藏线”颈下操 謦溺定溺一碡浓躞豹荧 光强度值。结果表明，硼氢化钾浓度为i 2 时荧光强度值最大，且较稳定， 浓度再高时困反应产生的氯气过多，对砷化氢有稀释作髑，灵敏鹰反而下降，且 测定精度变蒺。故选择硼氢化钾浓度为2 。 表5 不问浓度k b i - h 溶液对砷旮勺荧光强度的影响 浙江大学硕j j 学位论史 1 2 6 还原剂的影响 由于样品消化后，砷以高价态存在。直接用硼氢化钾不能定量地将五价砷还 原为三价砷，加入还原掩蔽剂后反应方能达到完全。按照文献”，我们采用5 硫脲一5 抗坏血酸将五价砷还原为三价砷，同时也是抗干扰的掩蔽剂。实验表 明在5 0 m l 测定体系中加入5 硫脲一5 抗坏血酸还原掩蔽剂超过5 0 m l 时荧光 强度达到基本稳定。本文选择用量1 0 m l 。 1 2 7 盐酸介质酸度的影响 根据文献”原子荧光光度法测砷采用h c l 介质灵敏度优于h c l 0 4 、h 2 s 0 4 、 h n 0 3 介质，且砷在h c l 介质中更易还原，荧光强度高，线性好。我们采用h c i 为反应介质，并对3 2 0 h c i 介质酸度进行了实验，结果表明同一砷浓度在 该范围的盐酸浓度介质中，荧光强度变化不明显，呈平缓上升趋势，与文献。1 的结果一致，说明所允许的酸度范围较宽。为了降低干扰和试剂消耗，选择5 反应介质酸度。 根据以上实验，我们可以得出氢化物原子荧光法测总砷最终的实验条件为硼 氧化钾浓度2 、5 硫脲5 抗坏血酸混合液用量1 0 m l 、盐酸介质浓度5 。 1 2 8 精密度与回收率实验 为了考察本方法的精密度与准确度，分别进行了精密度和回收率实验。分别 称取四种海藻样品各若干份，按照同样的处理方法测定，计算相对标准偏差；回 收率实验分高、中、低三个浓度分别加入一定量的标准物质，按照同样的处理方 法计算回收率。结果见表6 和表7 表6 原子荧光测海藻中总砷的精密度结果 样品 测得的砷含量( t a g g 。) 平均值 r s d ( s d ( 1 a g 9 1 ) 1 海带 1 99 2 1 9 8 62 0 1 41 9 0 5 紫菜 3 8 0 1 3 9 7 13 9 2 83 9 2 1 裙带菜 3 4 5 23 5133 5 8 73 3 8 5 2 0 5 0 1 9 8 905 3 4 326 9 3 7 4 93 87 4 0 9 4 1 92 4 3 3 4 4 93 4 7 7 0 7 6 2 72 19 浙江大学硕 ：学位论立： 羊栖菜6 4 5 6 6 4 7 56 5 7 l6 4 8 96 4 5 46 4 8 9 o 4 8 0 50 7 4 1 3 两种测定方法的比较及样品中总砷含量的测定 1 3 1 两种测定方法的比较 上面我们对两种方法测定海藻总砷的结果进行了比较，我们接着对这两种方 法的方法学进行比较，从精密度和加样回收率两个方面进行考察。从表中i - 以看 出，两种方法的回收率都能满足要求，相差不大，而精密度却有所差别，原子荧 光法的相对标准偏差比银盐法要小的多，精密度要好，所以更适合用于总砷的测 定。 表8 银盐法和原子荧光法测定总砷的方法学比较 海带4 5 32 6 99 8 0 210 0 8 3 浙 】大学碗i 学位论义 1 _ 3 2 样品总砷含量的测定 几种海藻样品按照“1 1 2 ”项下进行样品处理，再分别用银盐法和原子荧光 法进行测定，结果见表9 表9 不同产地几种海藻中总砷的测定结果 从表中的结果可以看出，浙江羊栖菜的总砷含量最高，紫菜总砷含量总体上 要比海带高海带的总砷含量最低。其次不同产地海藻的含量也有所差别，产自 浙江的海带和紫菜的含量都较其它两地的含量低，紫菜中的大连的总砷含量最 高，而海南的海带的总砷含量明显高于其它两地的：裙带菜的总砷含量也较高。 但总体来说。不同产地的总砷含量的分布规律性不强。 除了羊栖菜总砷的测定结果偏差较大外，银盐法和原子荧光法测定的海藻总 砷含量基本相近，说明两种方法都适合测定总砷含量，几种海藻总砷的测定结果 也较准确。 2 无机砷的含量测定 因为海藻中的砷以有机和无机两种形式存在，有机砷的毒性小，具有m 生学 意义的主要是无机砷，而据报道海藻中大部分砷都以有机砷的形式存在，要想测 浙江大学硕士学位论文 定无机砷的含量就要使无机砷和有机砷得到有效的分离。在盐酸水浴条件f ，无 机砷可以氯化物形式被提取，实现无机砷和有机砷的分离。在酸性条件f ，碘化 钾一硫脲使五价砷还原成三价砷，采用常规方法便可测出其含量，进而测出总无 机砷的含量。 无机砷与总砷的测定方法相近，只是样品处理方法有所不同。根据两种测总 砷方法的比较，原予荧光法测砷含量更有优势，所以本实验中仍采用原子荧光法 对样品的无机砷进行测定，并对无机砷的样品处理方法进行了探讨。 2 1 试剂和仪器 同“1 ，2 1 ” 2 2 样品处理 按文献“”1 中方法进行样品处理。取1 9 样品，粉碎，精密称量后分别放入 2 5 m l 的具塞试管中，加入2 0 m l 盐酸( 1 ：1 ) 溶液，搅拌均匀，置于6 0 c 水浴中 1 8 小时，其蚓多次振摇使样品充分浸提。浸提液取出冷却后用脱脂棉过滤，取 续滤液适量于1 0 m l 容量牦中，加盐酸( 1 ：1 ) 溶液，使至盐酸2 m l 。加还原剂碘 化钾一硫脲溶液l m l 正辛醇数滴，加水定容，摇匀，放置1 0 1 5 r a i n ，再用脱 脂棉过滤，取续滤液用原子荧光仪测无机砷的含量。同法作试剂空白。 2 3 仪器操作条件 负高压：3 0 0 v ，砷空心阴极灯电流：4 0 m a ；原子化器高度：8 m m ：载气流 速4 0 0 r a l r a i n ；屏蔽气流速：1 0 0 0 m l m i n ；读数延迟时间2 s ；读数时矧：1 0 s 。 2 4 标准曲线与检出限 分别吸取i l a g m l 的a s 标准工作液0 、0 5 、i 0 、2 0 、3 0 、5 0 m l 于5 0 m l 的容量瓶中，加盐酸( i ：i ) 溶液2 0 m l ，碘化钾一硫脲混合溶液5 m l ，j f 辛醇数 滴，加水定容，振摇均匀( 各相当于古a s 浓度0 、1 0 、2 0 、4 0 、6 0 、l o o u g l ) 。 用原子荧光光谱仪测定上述标准溶液得到标准曲线如下 y = 3 6 7 8 3 x + 7 9 2 3 7 r = o 9 9 9 5 结果标明在o - - 1 0 0u g ，l 的线性范围内，砷的线性良好，无机砷测定的检出 限为01 4 7 l 。 2 5 无机砷的精密度和回收率实验 为了保证测定方法的精密度和准确度，我们进行了精密度和回收率实验。分 浙江大学硕j 一学位论文 别称取四种海藻样品各若干份，按照上述的无机砷处理方法进行操作比采用原子 荧光法进行测定，计算相对标准偏差；回收率实验分高、中、低三个浓度分别加 入一定量的标准物质，按照同样的处理方法计算回收率。 表l o ，海藻无机砷测定的精密度结果 表1 1 海藻无机砷测定的回收率结果 2 6 不同产地的海藻样品的测定 不同产地的几种海藻样品按照上面的无机砷测定的处理方法进行操作并测 浙江人学硕十学位论文 定，结果见表1 2 。 表1 2 海藻中无机砷的含量 2 7 不同产她海藻中不同砷形态含量的比较 不同产地的样品按照上面的方法处理，都采用原子荧光法进行总砷和无机砷 的测定，有机砷可由国际上通用的差减法计算而得，由总砷含量减去无机砷的含 量即为海藻有机砷的含量。结果见表1 3 。 表1 3 不同产地的海藻中砷的含量及比例 t a b 5a r s e n i cc o n t e n t s ( i i t g g ) a n dp r o p o r t i o n si na l g a ef r o md i f f e r e n tr e g i o n s