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9 2扬州人学硕十学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：虿i 事粤、 签字日期：力参年易月f d 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：弘垦， 签字日期：纱。莎年z 月lb 日 导师签名：玄知同 签字日期：矗年e 月【o 日 韩恩：基于壳聚糖，粘十复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 摘要 一血红蛋白l a p o n i t e 壳聚糖自组装膜电极的直接电化学特性及其对 过氧化氢的催化还原 通过层层自组装的方法依次将壳聚糖、l a p o r m 、血红蛋白固定到羧基化的 玻碳电极表面，制备成了高稳定性的h b l a p o n i t e c h t g c 电极，从而实现了血红 蛋白与玻碳电极之间的直接电子传递过程。固定扫速为0 1 v s 一，控制磷酸缓冲溶液 p h 为6 0 ，电位为0 8 0 8 v 范围内，该自组装电极循坏伏安扫描在大约0 0 3 5 v ( v s s c e ) 处表现出了一对稳定的、准可逆的氧化还原峰。这是由血红蛋白中血 红素辅基f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对发生氧化还原反应引起的。固定在自组装膜上的血红蛋 白直接电化学反应是一个薄层控制的电化学过程。并且，血红素附基中的 f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对的形式标准电位随着外界溶液的p h 变化( p h 3 o 8 0 ) 而成线性变 化，其斜率为6 3m vp h ，这表明在该电化学反应中进行一个电子传递的同时，还 伴随着一个质子的转移。紫外光谱表明，血红蛋白的s o r e t 吸收峰并未发生移动， 这说明固定在自组装膜中的血红蛋白很好地保持了其原有的二级结构。自组装电 极还表现出了较好的使用寿命，使用了6 0 天后还能保持其氧化还原峰位置不变， 且还原峰电流仍保持原来的9 0 。该电极还对过氧化氢表现出了较好的催化还原作 用，其线性检测范围为6 2 1 0 击2 5 5 1 0 刁m ，当信噪比为3 时，检测下限为 6 2 】0 。6 m 。 二基于壳聚糖l d h 杂化材料的新型高灵敏度的酚类安培型生物传感 器的研究 研究了一种基于壳聚糖类水滑石杂化材料的新型高灵敏度酚类生物传感器。 该杂化材料既具有无机粘土类水滑石( l d h ，l a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s ) 的强吸附能 力和较好的亲水特性，也具有壳聚糖( c h i t o s a n ) 这种生物学特性优良的高分子氨基 2扬州人学硕士学位论文 多糖的易成膜和较好的生物相容特性。用f t - i r 对杂化膜进行表征，结果表明：该 杂化材料能为多酚氧化酶提供良好的生物微环境，从而保持其原始结构的基本特 性和其生物活性，延长生物传感器的使用寿命。研究结果表明：类水滑石和壳聚 糖最佳质量比为4 ：1 ；在此比例下该杂化膜表现出了最好的亲水特性。该生物传感 器对儿茶酚表现出了快速的生物电化学响应特性( 5 s 就可以达到最大响应电流的 9 5 ) 、较低的检测下限( 0 3 6 n m ) 、宽广的线性检测范围( 3 6 1 0 。9 4 1 0 。5 m ) 和较高 的检测灵敏度( 2 7 5 0 5 2m a m 1c m 。2 ) 。传感器的表观米氏常数( 胪) 为0 1 3m m 。 酶催化反应的活化能是2 7 6k jm o l 。同时，该生物传感器还表现出了较好的使用 寿命。 三包埋在类水滑石壳聚糖无机有机杂化材料中的葡萄糖氧化酶生物 传感器 用壳聚糖类水滑石( l d h ，z n 3 a 1 c 1 ) 杂化材料固定葡萄糖氧化酶( g o d ) ，制备 成了壳聚糖l d h g o d p t 电极。实验寻找到了制作葡萄糖氧化酶生物传感器的最 佳条件，即壳聚糖和l d h 之间的最佳质量比为2 ：1 ，还研究了膜层厚度以及酶的 用量对传感器响应电流的影响。研究发现传感器使用的最佳条件为：测量温度为 5 0 0 c 、工作电位为o 6 v 、底物溶液p h 为6 5 。同时，考察了该传感器在优化的实 验条件下对葡萄糖溶液的响应特性。实验结果表明：该生物传感器对葡萄糖表现 出了宽广的线性检测范围( 0 0 0 1 1 0m m ) ，酶催化反应的表观米氏常数为1 7 3 m m ， 酶催化反应的表观活化能为2 2 1k j 。同时该传感器还表现出响应快、重现性好等 优点。 韩恩：基于壳聚糖粘土复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 3 a b s t r a c t 1 s e i f - a s s e m b l e df i i m so fh e m o g i o b i n l a p o n i t e c h i t o s a n ：a p p i i c a t i o n f o r t h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r ya n dc a t a i y s i st oh y d r o g e np e r o x i d e a h i g m ys t 曲l eb i o l o 酉c a lf i l m 、v a sf o n n e do nt h e 劬c t i o n a l 西a s s yc a r b o ne l e c t r o d e v i as t e p - b y s t 印s e l f - a s s e m b l yo fc l l i t o s a n ( c h t ) ，1 a p o n i t e 锄dh e m o g l o b i n ( h b ) c y c l i c v o l t 锄i i 】e 仃yo fh b 1 印o i l i t e c h t g c es h o w e dap a i ro fs 怯山l e a n dq u a s i - r e v e r s i b l e p e a l 【sf o rh b f e ( i i i ) f e ( i i ) r e d o xc o u p l ea ta b o u t - 0 0 3 5vv e r s u ss a t u r a t i 甜c a l o m e l e l e c t r o d e ( s c e ) i np h6 0p h o s p h a t eb u 舵r ，a tm es c a nr a t eo fo 1 v s t l l e e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o no fh be n t r 印p e do nt h el a p o l l i t e c l l i t o s a i ls e l f a s s e m b l e df i l m e x h i b i t e das u r f a c e - c o n t r o l l e de l e c 们d ep r o c e s s 1 1 1 ef 0 肌a lp o t e n t i a lo fmh e m e f e ( i i i ) f e ( i i ) c o u p l ev a r i e dl i n e a r l y 丽t ht h ei n c r e a s eo fp h o v e rt h e 龇g eo f3 o - 8 0 谢t has l o p eo f - 6 3m vp h ，w 1 1 i c hi m p l i e dt h a ta i le l e c t r o n 仃a n s f e rw a sa c c o m p a i l i e d 丽t l ls i n g l ep r o t o nt 姗s f e ri i lt h ee l e c 仃o c h e m i c a lr e a c t i o n p o s i t i o no fs o r e ta b s o r p t i o n b a n do ft l l i ss e l f - a s s e m b l e dh b l a p o n i t c h i t o s a nf i l ms u g g e s t e dt h mt h ee n t r a p p e dh b k e p ti t ss e c o n d a 巧s t m c t l 胎s i m i kt oi t sn a t i v es t a t e n l es e l f a s s e m b l e df i l ms h o w e d e x c e l l e n tl o n g t e m 虹b i l i 吼t h ec vp ea ：kp o t e n t i a l sk e p ti nt l l es 锄ep o s i t i o n sa i l dt l l e c a t l l o d i cp e a kc u r r e n t sr e t a i n e d9 0 a r e r6 0d a y s t h ef i l mw a su s e d 嬲ab i o l o g i c c a t a l y s tt 0c a ：t a l y z e 也er e d u ( 嫩o no fh y d r o g e np e r 0 x i d e t h ee l e c t r o c a t a l 舛cr e s p o n s e s h o w e dal i n e a rd e p e n d e n c eo nt h eh 2 0 2c o n c e m r a t i o nr 觚g i n g 诵d e l yf r o m6 2 10 - o t o2 5 5 】o 3m 、v i t l 】ad e t e c t i o nl i m i to f 6 2 1 0 6ma t3o 2 h v b r i dm a t e r i a lb a s e do nc h i t o s a na n dl a y e r e dd o u b l e h y d r o x i d e s ： c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o nt ot h ed e s i g no f a m p e r o m e t r i cp h e n o lb i o s e n s o r an e w 哆p eo f 锄p e r o m e t r i cp h e n o lb i o s e n s o rb a s e do nc l l i t o s a 1 a y e r e dd o u b l e h y d r o x i d e so 培a i l i c i n o r g a l l i cc o m p o s i t ef i i m 、v 鹤d e s c 舶e d 1 1 1 i sh y b r i d m a t e r i a l c o m b i n e dt l l ea d v a n t a g e so fo r g a i l i cb i o p o l y m e r ，c l l i t o s a j l ，a n di n o 唱吼i cl a y e r e dd o u b l e 4扬州人学硕l 学位论文 h y d r o x i d e s p o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) i m m o b i l i z e di nt h e m a t e r i a lm a i n t a i n e di t s a c t i v 时w e l la l st h eu s a g eo fg l u t a r a l d e h y d e 、v a sa v o i d e d t h ec o m p o s i t ef i l m sh a v e b e e nc h a r a c t e r i z e db yf o u r i e rt r a n s f o mi n f r a u r e d ( f t i r ) t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp p o r e t a i n e dt h ee s s e n t i a lf e a t u r eo fi t sn a t i v es t m c t u r ei nt h ec o m p o s i t ef i l m t h ee n z y m e e l e c t r o d ep r o v i d e da1 i n e a rr e s p o n s et oc a t e c h 0 1o v e rac o n c e n t r a t i o nr a i l g eo f3 6 1o 一 4 1o 5mw i t has e n s i t i v i t vo f2 7 5 0 5 2m am 。1c m 2a i l dad e t e c t i o nl i m i to f0 3 6n m b 2 l s e do ns n = 3 t h ea p p a r e n tm i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t ( k m a p p ) f o rm es e n s o rw a s f o u n dt ob e0 13m m t h ea c t i v a t i o ne n e 略yf o re n z y m a t i cr e a c t i o nw a sc a l c u l a t e dt ob e 2 7 6k jm o l f u n h e n n o r e ，t h eb i o s e n s o re x h i b i t e de x c e l l e n t1 0 n g t e ms t a b i l i t y ，a n d s a t i s f a c t o r ) ，r e p r o d u c i b i l i 够 3 d e v e l o p m e n to fah i g ha n a l y t i c a lp e r f o r m a n c e - g i u c o s eb i o s e n s o r b a s e do ng l u c o s eo x i d a s ei m m o b i l i z e di na c o m p o s i t em a t r i x ： l a v e r e dd o u b l eh v d r o x i d e s c h i t o s a n t h i sp a p e ra i m sa ts h o w i n gt h ei n t e r e s to ft h ec o m p o s i t em a t e r i a lb a s e do nl a y e r e d d o u b l eh y d r o x i d e sa n dc h i t o s a i la ss u i t a b l eh o s tm a t r i xl i k e l yt oi m m o b i l i z ee nz ) ，m e s o n t oe l e c 仃o d es u r f i a c ef o rb i o s e n s i n g 印p l i c a t i o n t h i sh y b r i dm a t e r i a lc o m b i n e dt h e a d v a i l t a g e so fi n o 玛a n i c1 a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e sa n do 唱a n i cb i o p 0 1 y m e r ，c h i t o s a l l t h ec o m p o s i t ef i l m sh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e db yf o 谢e rt r a n s f o mi n f r a r e d ( f t - i r ) g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i m m o b i l i z e di nt h em a t e r i a lm a j n t a i n e di t sa c t i v i t yw e l la st h e u s a g eo fg l u t a r a l d e h y d ew a sa v o i d e d t h ep r o c e s sp a r 锄e t e r sf o rt h ef - a b r i c a t i o no ft h e e n z y m ee l e c t r o d ea 1 1 dv a r i o u se x p e r i m e n t a lv a r i a b l e ss u c ha sp h ，a p p l i e dp o t e n t i a la n d t e m p e r a t u r ew e r ee x p l o r e df o ro p t i m u ma n a l y t i c a lp e r f o m l a l l c eo f t 1 1 ee n z ) ，m ee l e c t r o d e t h eb i o s e n s o rc a nr e a c h9 5 o fs t e a d y - s t a t ec u r r e l l t1 e s st h a j l5s t h ee 1 1 z y m ee l e c t r o d e p r 0 v i d e da1 i n e a rr e s p o n s et og l u c o s eo v e rac o n c e n t r a t i o nm n g eo f1 10 - 3 x1o 3m w i t has e n s i t i v i t yo f6 2 6m am 。1c m 之a n dad e t e c t i o nl i m i to fo 1mb a s e do nt h e s i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 t h ea c t i v a t i o ne n e r g yf o re n z y m a t i cr e a c t i o nw a sc a l c u i a t e dt o b e2 2 1k jm o l m e a n w h i l e ，t h ee n z ) ，m ee l e c t r d ee x h i b i t e dw o n d e r f u l l o n g t e m s t a b i l i t y ，a 1 1 dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y 韩恩：基于壳聚糖粘士复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 第一章序言 生物传感器是二十世纪六十年代发展起来的一门技术【l 】。它是在化学传感器的 基础上发展起来的，是现代生物技术与微电子学、化学等多学科交叉结合的产物。 生物传感器研究的重点是广泛地寻求各种生物活性材料与传感器结合，研究具有 识别功能的换能器，并开发它们的应用。它与常规的化学分析及离线分析技术( 高 效液相色谱或质谱) 相比，具有选择性好、灵敏度高、检测速度快和操作简便等 优点。而且，减少了样品的破坏，避免造成污染，可以进行在线甚至活体分析。 生物传感科学是一门新兴的学科，它是生物工程和各种技术学科的相互渗透， 涉及到生物化学、电化学、固体物理学、微电子学和纤维光学等。随着科学技术 的迅速发展，新原理、新技术的应用，生物传感器出现了蓬勃发展的局面。从发 展趋势看，生物传感器将向以下方向发展：实用化、微型化、多功能化。此外， 缩短响应时间、提高感受器的耐久性( 稳定性) 也是重要的研究课题。从长远讲，开 发智能化生物传感器也是研究方向之一。近2 0 年来，生物传感器的研制发展迅猛， 应用于工业、农业、环境监测和生物医学等领域的微生物、动植物细胞、抗原抗 体等各种生物传感器相继开剔2 1 4 1 。可以预见，随着微电子学、分子遗传学、新材 料科学的飞速发展，生物传感器将更加多功能化、高灵敏化和微型化。 2 1 世纪是生命科学的世纪，随着“人类基因组工作草图”的完成、纳米生物技术 和纳米微电子加工技术的出现，我们相信无论在原理上还是加工技术上，都将为 生物传感器的发展带来巨大的变革。 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器的概念、组成器件和工作原理 生物传感器定义为“使用固定化的生物分子结合换能器用来侦测生物体内或 生物体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置”。生物 传感器由两个主要关键部份构成，一为来自于生物体分子、组织部份或个体细胞 6扬州人学硕j ：学位论文 的分子辨认组件，这一组件为生物传感器信号接收或产生部分。另一属于物化仪 器组件部份，主要为物理信号转换组件。生物传感器是利用生物的因子或生物学 原理来检测或计量化合物的装置。它通常利用纯化的酶、免疫系统、组织、细胞 器或完整细胞作为催化剂，这些催化剂通常被固定化，并与物化仪器相结合使用。 物化仪器可监测被分析物质在固定的催化剂作用下所发生的化学变化并转换成电 信号【1 5 18 1 。其工作原理可用图1 1 表示： 坚。 黔 ， 酰 鼯，竖、 鬻圈 l ) r ) r 韩恩：基于壳聚糖粘七复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 7 当溶液中存在着葡萄糖时，葡萄糖在通过固定化酶膜时被葡萄糖氧化酶氧化。反 应时需消耗氧气，而这种消耗量可用氧电极测定到。由于固定化葡萄糖氧化酶的 稳定性极高，一张固定化酶膜可以使用一年以上，所以检侧费用很低。 免疫传感器【3 3 枷】是依赖抗原和抗体之间特异性和亲和性。利用抗体检测抗原 或利用抗原检出抗体的传感器。并非所有的化合物都有免疫原性，一般是分子量 大、组成复杂、异物性强的分子。但免疫传感器更适合于研制能连续、重复使用 的毒剂监测器材。免疫分析法选择性好，如一种抗体只能识别一种毒剂，可以区 分性质相似的同系物、同分异构体，甚至立体异构体，且抗体比酶具有更好的特 异性，抗体抗原的复合体相对稳定，不易分解。 微生物电极传感器【4 h 9 】是将微生物( 常用的主要是细菌和酵母菌) 作为敏感材 料固定在电极表面构成的电化学生物传感器。其工作原理大致可分为三种类型：( 1 ) 利用微生物体内含有的酶( 单一酶或复合酶) 系来识别分子，这种类型与酶电极类 似；( 2 ) 利用微生物对有机物的同化作用，通过检测其呼吸活性( 摄氧量) 的提高， 即通过氧电极测量体系中氧的减少间接测定有机物的浓度；( 3 ) 通过测定电极敏感 的代谢产物间接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物。微生物电极传感器在 发酵工业、食品检验、医疗卫生等领域都有应用。例如：在食品发酵过程中测定 葡萄糖的佛鲁奥森假单胞菌电极；测定甲烷的鞭毛甲基单胞菌电极；测定抗生素 头孢菌素菌电极等等。微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有很好的应 用前景，然而它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。 组织传感器【5 0 。”】是直接采用动植物组织薄片作为敏感元件的电化学传感器称 组织电极传感器，其原理是利用动植物组织中的酶，优点是酶活性及其稳定性均 比离析酶高，材料易于获取，制备简单，使用寿命长等。但在选择性、灵敏度、 响应时间等方面还存在不足。动物组织电极主要有：肾组织电极、肝组织电极、 肠组织电极、肌肉组织电极、胸腺组织电极等。植物组织电极敏感元件的选材范 围很广，包括不同植物的根、茎、叶、花、果等。植物组织电极制备比动物组织 电极更简单，成本更低并易于保存。 芯片生物传感器【5 4 - 5 8 1 是一种大型的生物传感器，它的生物识别部分就是生物 扬州大学硕士学位论文 芯片本身。转换器是生物芯片把信号转成电信号的装置，信号接收和分析一般由 微型计算机来承担。目前被广泛采用的生物芯片扫描仪，其信号转换和接收原理 与光纤生物传感器完全一致，只不过是扫描信号通道更多，分析软件更强大而已。 自2 0 世纪8 0 年代起，国际上对生物传感器进行了广泛的研究和探索，近些年来， 已经研制出一系列在环境监测、临床检验和生化分析等方面具有实用价值的生物 传感器。其中，以酶生物传感器的研究最为广泛。酶生物传感器的发展经历了三个 阶段，即以氧为中继体的电催化，基于人造媒介体的电催化和直接电催化。 1 2 酶生物电极及其在生物传感中的应用 自1 9 6 2 年c l 狄和l y o n 两人提出酶电极的观念，从而把酶催化反应的高度 专一性和电极响应的高度灵敏性结合起来【8 1 】。1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 把葡萄糖氧 化酶( g o d ) 固定化膜和氧电极组装在一起，首先制成了第一种生物传感器，即葡萄 糖酶电极5 9 1 。与生物活性材料组合的传感器可以是多种类型的物理或化学传感器， 如电化学( 电位测定、电导测定、阻抗测定) 、光学( 光致发光、共振表面等离子 体) 、机械( 杠杆、压电反应) 、热( 热敏电阻) 或者电( 离子或者酶场效应晶体 管) 等等。所有这些具有生物识别功能的组合体通称为生物传感器。这些传感器 的出现改变了传统消耗试剂破坏试样的生化检测方法，可直接分析，反复使用， 且操作简单。 酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。生物酶的种类繁多， 把酶固定在电极上可以制成各种各样的酶生物传感器来检测底物，如：葡萄糖、 半乳糖、尿酸、肌氨酸、抗坏血酸、胆固醇等。目前达到实用水平已有2 0 0 种以 上，广泛用于生物、医药、化工等领域。应用酶生物传感器可以省去提纯酶的复 杂步骤，它具有一些独特的优点：( 1 ) 选择性好，灵敏度高，能够直接在复杂试 样中进行测定；( 2 ) 响应快、样品用量少，可反复多次使用；( 3 ) 一般不需对样 品进行处理，易于实现多组份的同时测定；( 4 ) 体积小，可实现连续在线、在位、 在体检测；( 5 ) 成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。 1 2 1 酶生物传感器的研究进展 韩恩：基于壳聚糖粘十复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 9 酶生物传感器的发展经历了三个阶段，即以氧为中继体的电催化，基于人造媒 介体的电催化和直接电催化。根据以上原理大致将酶生物传感器分为三代：第一 a i m m o b n 娩e de m 万m e 鍪麓 i 。赢品蕊 嬲 ；彩彩荔 ； i s o l u t i o n ； p r o d u c t 3 - _ i p r o d u c t l i m m o b i l i z e de n z v m e + m e d i a t o r b 。 隧 蹴 f a c t o r s o l u t i o n c i m m 。b i l i z e d l s 。l u t i 。n 彩老钐钐7 1 ，“，1 。z 。，7 乡哆么彩i - d e l 维1 1 5 d d e 獭i ? 7 j ，j ，? ， 戮i u b s t r a t p r o d u c t f i g u r e1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fd i 髓r e n tb i o s e n s o rg e n e r a t i o n ( a ) t h e f i r s tg e n e r a t i o n ，( b ) t h es e c o n dg e n e r a t i o n ，( c ) t h et h i r dg e n e r a t i o n 1 0扬州大学硕士学位论文 代生物传感器采用天然介体氧的催化机理设计制作；第二代生物传感器是将诸 如二茂铁、铁氰化钾等物质作为媒介体掺入酶层中，以减少溶解氧的干扰；第三 代生物传感器是指在无介体存在下，利用生物活性酶与电极间的直接电子传递制 作的生物传感器。三代生物传感器的工作原理如图1 2 所示。 第一代生物传感器 1 9 6 2 年，c l 狄和l y o n s 提出了葡萄糖生物传感器的原理，他们表示用一薄层葡 萄糖氧化酶覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧的消耗量，间接测 定葡萄糖的含量。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 根据此原理首次将葡萄糖氧化酶膜覆盖 在铂电极上制成酶传感器，用于定量检测血清中葡萄糖的含量，成功地制成了第 一支葡萄糖生物传感器，这标志着第一代生物传感器的诞生。从此以后，基于酶 电极生物传感器研究得到了迅速发展。 由于还原态葡萄糖氧化酶( g o d r e d ) 的氧化还原活性中心在酶分子内部，被蛋 白质包围，不易直接与常规电极交换电子，因而得不到可测量的电信号。可以通 过测量反应物中0 2 的减少量或生成物中h 2 0 2 的产生量这两种方法获得电信号。 葡萄糖将葡萄糖氧化酶还原后，溶液中的溶解氧再将其氧化，使得葡萄糖氧化酶得 以循环使用，而0 2 本身则被还原成h 2 0 2 ，所以，可以用氧电极测量溶液中溶解氧的变 化，间接地测出试样中葡萄糖的含量。如发明酶生物传感器的先驱者c 1 a r k 和l y o n s 在其设计中，将氧化酶固定在透析膜和氧穿透膜中间，形成一个“三明治”的结构， 再将此结构附着在铂电极的表面。在施加一定电位的条件下，通过检测氧气的减 少量来确定葡萄糖的含量。但是，该方法中由于大气中氧气分压的变化，会导致 溶液中溶解氧浓度的变化，从而影响测定的准确性。另外，当溶液中溶解氧浓度 过高时，低浓度底物灵敏度偏低；当溶液中溶解氧浓度过低时，对较高浓度的底 物又不能满足反应需求，难以得到灵敏的信号。 第一代生物传感器在测量时受诸多外部环境因素的制约，所以，其测量的准 确度和灵敏度不够理想。但无论如何，它的诞生推动了人们对传感技术的研究。 第二代生物传感器 酶一般都是生物大分子，其氧化还原活性中心被包埋在酶蛋白质分子里面， 韩恩：基于壳聚糖粘十复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 1 1 它与电极表面间的直接电子传递难以进行，即使能够进行，传递速率也很低，这 是因为其氧化还原活性中心与电极表面间的电子传递速率随两者间距离的增加呈 指数衰减。电子传递介体( m ) 的引入克服了这一缺陷，它的作用就是把葡萄糖氧化 酶氧化，使之再生后循环使用，而电子传递介体本身被还原，最后又在电极上被 氧化。 利用电子传递介体后，既不涉及0 2 ，也不涉及h 2 0 2 ，而是利用具有较低氧化 电位的传递介体在电极上产生的氧化电流，对葡萄糖进行测定，从而避免了其他 电活性物质的干扰，提高了测定的灵敏度和准确性。h a l e 等6 0 1 人采用二茂铁修饰 硅氧烷聚合物，再用此聚合物与葡萄糖氧化酶混合，制成性能稳定、电子传递速 率较高的电极。用循环伏安法和稳态电势法测得：由上述方法制得的葡萄糖生物 传感器对小于o 0 1 m m o l l 的低浓度葡萄糖溶液也可快速响应( 响应时间小于 1 m i n ) 。 第二代生物传感器采用一些非生理的氧化还原媒介体如二茂铁及其衍生物等 代替氧，加强了酶与电极间的直接电子传输，起到了酶与电极间的电子开闭器作 用，加速了电极反应，降低了环境干扰，但目前第二代电流型传感器还存在着介 体流失、电极污染及一些电活性物质的干扰等问题。 第三代生物传感器 第三代生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子传递 设计制作的酶传感器。由于酶与常规电极之间的直接电子传递较为困难，考虑选 择合适的接合剂，将酶共价键合到化学修饰电极上，或将酶固定到多孔电聚合物 修饰电极上，使酶氧化还原活性中心与电极接近，直接电子传递就能够相对容易 地进行。与前两代生物传感器相比，直接电化学生物传感器既不需要氧分子，也 不需要化学介体分子作为电子传递体，通常还不需要固定化载体，而是将酶分子 直接吸附固定到电极表面，使酶的氧化还原活性中心与电极直接“交流”，能够更快 地进行电子传递，从而使酶电极生物传感器的响应速度更快、灵敏度更高，真正 成为“无试剂分析”。 蛋白质的直接电化学特性一直是人们研究的热点，它可以在无介体的情况下 1 2扬州大学硕士学位论文 研究生命物质的电子转移过程，并为构筑第三代生物传感器提供了理论依据。蛋 白质的准可逆直接电化学出现于1 9 7 7 年，y e h 等【6 1 】得到了细胞色素c 在二氧化锡的 氧化铟电极上良好的循环伏安响应，同时e d d o w e s 等【6 2 】将4 ，4 联吡啶加入细胞色 素c 的溶液中，在金电极上得到了很大的进展。r u s l i n g 等 6 3 】广泛地利用类脂膜的催 化作用研究肌红蛋白的电子转移过程，此后，人利用纳米粒子的催化作用对辣根 过氧化物酶、血红蛋白进行了研刭6 4 1 。 对氧化还原蛋白质和酶的直接电子转移反应的研究不仅可以获得蛋白质和酶 的热力学和动力学性质等方面的重要信息，而且还可以促进电极物质与具有高效、 专一催化活性和生物传感特性的生物大分子间的结合；对于了解生命体系的能量 转换和物质代谢、了解生物大分子的结构和各种物理化学性质的关系、探索蛋白 质和酶等生物大分子在生命体内的生理作用及机制具有重要的理论意义；对于开 发新型的生物电化学传感器及酶催化剂在生物燃料电池等方面的应用具有十分重 要的指导意义。 1 3 酶、蛋白质在电极上的固定方法 生物酶( 蛋白质) 在电极上的固定化方法是制作生物传感器过程中非常关键 的一个步骤。大多数酶是水溶性的，稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反 应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中得到更为广泛的应用。因此，固定 化酶的概念和技术得以提出和发展。 固定化酶，即把酶固定在特殊载体上，使它和整体的相分隔开来，酶固定化 后还能与底物进行分子交换。固定化技术在很大程度上决定着传感器的性能，如 选择性、灵敏度、稳定性、检测范围与使用寿命等。因此，研究酶的固定化方法 是非常重要而有意义的。酶的固定化方法有很多种，大致可分为以下几种：吸附 法、包埋法、共价结合法、自组装法和交联法。包埋法多以天然或合成的聚合物 凝胶为载体，如藻酸盐、树脂、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。吸附法多以无机材料 为载体，主要包括粘土、多孔玻璃、氧化铝及活性炭等。而自组装技术因其具有 人为干扰少、操作稳定性好等优点而越来越受到研究者关注【6 5 。7 2 1 。近年来，在酶 韩恩：基于壳聚糖粘十复合材料的生物电极的构筑及其传感性能研究 1 3 电极制备中，还出现了电化学聚合法【7 2 - 7 4 1 。这些方法有各自的优点，必须根据使 用的酶与具体环境加以选择，可以只使用一种方法，也可以两种或多种方法并用。 酶的固定化应达到以下效果：酶的活性损失最小；酶与载体结合牢固，不易脱落； 稳定性好，适用的温度范围及p h 范围宽；酶在载体上的负载量大；响应强，灵敏 度高；污染轻，干扰少等。 1 4 酶、蛋白质生物电极的固定化材料 生物传感器固定化材料的选择也将影响到固定在电极表面生物酶的活性。可 以说固定化酶的活性保持直接取决于固定化酶所使用载体材料的性质和固定化方 法，而酶的固定化程度直接决定酶生物传感器的检测性能。因此，在制作生物传 感器的过程中，我们应力求寻找到生物相容性好并且能在最大程度上保持固定在 电极上生物酶活性的固定化材料。常用到的酶固定化材料包括无机、有机聚合物、 凝胶以及其它一些生物材料等7 5 斟】。在这些材料中，无机粘土因其具有诸如较大 的比表面积、较好的亲水溶胀特性和优良的生物相容性而备受关注。 1 4 1 无机粘土 无机微晶结构材料( 粘土，沸石或相关铝矽酸盐) 可以用来修饰电极，它们 的化学性质比较稳定，如能经受住高温和强氧化等条件。这些无机材料能通过离 子交换把离子结合起来( 如离子交联聚合物) 作为电活性离子的载体。这些材料 储量丰富而且便宜，如天然形成的粘土。大量研究表明粘土是土壤中固定酶的一 个重要因素。所以我们选用这种无机材料作为生物传感器的固定载体。 粘土是胶状的、含水的层状铝矽酸盐，大部分都是自然形成的并属于页硅酸 盐一类的矿物。根据交换离子的类型，粘土可分为阳离子粘土和阴离子粘土。 l a p o i l i t e 属于阳离子粘土，水滑石属于阴离子粘土，在本论文中，分别详细研究了 这两种粘土作为杂化材料的一种与酶构建生物传感器的性能。 无机阳离子交换粘土 无机粘土能够为电极表面的电子传递和催化反应提供良好的微环境【8 5 1 。通过 查阅文献得知已经有人报道过基于蛋白质粘土的直接电子传递特性【8 6 墙8 1 。 1 4扬州大学硕士学位论文 研究表明，人工合成的粘土具有更多的优良性质。合成的粘土可以人为控制 其多方面特性。诸如其成分、孔径和离子交换能力等。l 印o n i t e 是人工合成的锂蒙 脱石，分子式为： ( m 9 5 5 l i o 5 ) s i 4 0 l o ( 0 均2 ( n r o 7 3 n h 2 0 ) 其1 ：2 的主结构单元是由两层硅氧四面体之间夹着一层铝氧八面体而构成的 晶层，四面体和八面体的顶端共享氧原子，结构单元之间存在静电作用( 见图1 4 ) 。 s i 或者砧被其它同晶形阳离子替代会使得粘土的板层间带有电荷。例如，a l ”被 m 孑+ 、f e 2 + 或l i + 替代导致阶层有剩余负电荷，这样粘土粒子的净电荷就不为零。 因此，层板上过量的电荷必须由其它带相反电荷的离子来补偿。带电层板表面积 聚了相反离子就会形成双电层。粘土上吸附的相反离子会被一个或更多的阳离子 交换。粘土阳离子交换容量( c e c ，i n e q 1 0 0 9 ) 用可交换阳离子的总量来表示，可交 换阳离子分布在粘土粒子表面的内、外部。有机阳离子可降低矿物的表面能，同 时也改善矿物与聚合物载体之间的润湿作用，使无机粘土矿物与大多数高分子具 有很好的相容性。 当l a p o n i _ t e 悬浮在二次水中的浓度小于1 0 91 1 时，l 印o i l i t e 的结构单元被破坏 并且完全分层后板层堆积在一起形成带负电的胶状悬浮液。另外，l a p o n i t e 具有粘 土所有的特性。如：由于其在水溶液中容易发生溶胀而导致疏松多孔，能提供化 学反应惰性环境，较好的吸附能力，特殊的结构特征和强大的阳离子交换能力。 l a p o n i t e 粒子的平均大小是4 0 衄1 0 啪1n m ( 图1 3 ) ，用b e t 实验测得其表面 积为3 5 0m 2 。这与扫描电镜表征结果一致( 见图1 5 ) 。 lon m f i j 酗r e1 3 廿1 cs i z eo fe l e m e n t a r yp l g c e l e t s o 0 x y g e n eo r h y d r o x y l e a l u m i n i u m s i l i c i u m i n t e m a le x c h a n g e a b l ec a t i o n f i g u r e1 4c l a y1 a y e r s a r ec o m p o s e d ? f2 ：1 ( t e t r a h e d r a l o c t a h e d r a ls h e e l s ) c l a vl a v e r s f i g u r e1 5s e m o fl a p o n i t e 1 6 扬州人学硕： ：学位论文 无机阴离子粘土水滑石( l d h s ) 与l a p o n i t e 这种阳离子交换粘土不同，类水滑石( l a y e r e dd o u b l e h y d r o x i d e s ，l d h s ) 是一种阴离子粘土，可用 z n 3 一a 1 c 1 表示。它的基本结构单元是 八面体，八面体中心是金属离子，六个顶角是氢氧根离子，相邻八面体之间靠共 用边相互联结成二维延续的配位八面体结构层，单元层以面面堆叠形成晶体颗粒 构成层状结构，决定了它多以片状形态存在( 见图1 7 ) 。其理想的分子式是 m 1 1 ；m 1 。1 1 1 ( o h ) 2 k ，。 ”。枷n h 2 0 】i n t e ，。其中m 和m 1 1 1 是金属阳离子，a 是阴离子， i n t r a 和i n t e r 分别代表层内空间和层间地域，结构中类水滑石层由共边的m ( o h ) 6 八面体构成，部分m n 被m 1 1 1 取代产生多余的正电荷，使得l d h 带正电荷，晶体 结构中多余的正电荷由层间阴离子平衡以维持整个分子的电中性，层间通道