（微生物学专业论文）l色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化.pdf

摘要 本文以代谢控制理论为指导，研究了工广色氨酸高产菌的选育及其发酵条件 的优化。主要研究内容和结果如下： 1 根据微生物菌株生物合成l 色氨酸代谢途径的的特性，设计了产色氨酸 的细菌选择性分离筛选培养基。对从土壤分离得到的8 3 2 株细菌，通过初筛和复 筛，筛选到6 株l 色氨酸产生菌株，并对其进行了初步分类鉴定，确定了这6 株均 为谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a n i c u m ) 。其中一株编号为j x q 3 2 8 的菌株 延滞期短，生长良好，产色氨酸达到0 8 0 9 l 。 2 以谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a n i c u m ) j x q 3 - 2 8 为出发菌株，采 用n t g 、紫外线多次诱变，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离 和连续传代，定向选育出一株l 色氨酸高产菌株s g - 1 1 6 ( p b 帅5 f 1 5 m r 卜4 珊嶂s g f ) ，其遗传性状稳定。在未经优化的摇瓶发酵条 件下，发酵9 6 t j , 时，最高产酸量达7 3 1 9 ：l 。 3 研究了菌株s g - 1 1 6 的摇瓶分批发酵条件。采用单因素、正交设计、均 匀设计等实验设计方法，应用d p s 数据处理系统获得了该菌株种子培养基与发 酵培养基优化配比，并对种子培养条件与发酵条件进行了研究。在优化条件下， 菌株s g - 1 1 6 摇瓶分批发酵9 0 h , 产l 色氨酸达1 0 1 5 9 l 。 关键词：l 色氨酸；土壤分离：谷氨酸棒杆菌；诱变育种；分批发酵 a b s t r a c t a c c o r d i n gt o t h et h c o r yo fm c t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t o n , t h ed i s s e r t a t i o n f o c u s e so nt h eb r e e d i n go fl - t r y p t o p h a nh i g h - y i d d i n gs t r a i na n di t sf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ca sf o l l o w s ： l b a s e do nt h ep r o p o r d e so fm e t a b o l i c p a t h w a yo fl - t r y p t o p h a ni n m i c r o o r g a n i s m s , a b a c t e r i a ls e l e c t i v ec u l t u r e m e d i u m t o i s o l a t e l - t r y p t o p h a n - p r o d u c i n gb a c t 耵i a ls t r a i n sf r o ms o i ls a m p l e sw a gd e s i g n e da n du s e dt o i s o l a t eo u t8 3 2 、s t r a i n s 。t h r o u g ht h ep r i m a r yi s o l a t i o na n dt h ec o m p o u n d s c r e e n i n g , s i x p o t e n t i a l s t r a i n sw e r es e l e c t e da n dw e i o g e n e r a l l yi d e n t i f i e d a st ob e c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a n i c u m t h eb e s ts t r a i nj x q 3 2 8c o u l dp r o d u c el - t r y p t o p h a n o 8 0g l ，w h i c hg r e ww e l la n dh a das h o r tl a gp h a s e 2 c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mj x q 3 - 2 8a sas t a r t i n gs t r a i nw a ss t e p w i s e m u m t e dw i t hn - m e t h y l - n - n i t r o - n - n i t r o s o g n a n i d i n ea n du v o n el - t r y p t o p h a n h i g h - p r o d u c i n gs t r a i ns g - 11 6w i t hg e n e t i cm a r k e rw a gs c r e e n e dt h r o u g hs h a k et u b e p r i m a r ys c r e e n i n g ，s h a k ef l a s kc o m p o u n ds c r e e n i n g , g e n e t i cm a r k e rt e s t , s i n g l ec l o n e i s o l a t i o na n dc o n t i n u o u sp a s s a g ec u l t i v a t i o mt h i ss t r a i nc o u l dp r o d u c el - t r y p t o p l m 7 3 1 9 la f t e rf e r m e n t a t i o nu n d e rt h ef o r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw i t h o u tb e i n go p t i m i z e d g e n e t i cc h a r a c t e r i s t i c so f t h es w a i ns g - 11 6w a gv e r ys t a b l e 3 t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fs t r a i ns g - 11 6i ns h a k ef l a s k 僦 s t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n t h ep r o p o r t i o no fs e e dm e d i u ma n df e = r i 】n e n t a t i o nm e d i u m c o m p o n e n l $ w 铘o p t i m i z e db y 咖g l ef a c t o r , o r t h o g o n a ld e s i g n , u n i f o r md e s i g n e x p e r i m e n ta n dd p s ( d a t ap r o g l 强ss y s t a n ) s o f t w a r e t h es e e dc u l t u r ec o n d i t i o n sa n d f e n n e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e a l s os t u d i e d u n d e r t h e 叩t m i u mc o n d i t i o n s s t r a i n s g - 1 1 6c o u l dp | o d l l c e l 4 x y p t o p h a n1 0 1 5 9 la f t e ri n c u b a t i o nf o r9 0h o u r sb y f l a s k - s h a k i n gb a t c hf e r m e n t a t i o n k e y w o r d ：l - t r y p t o p h a n ；s o i ls a m p l e ；c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ；m u t a g e n e s i s b r e e d i n g ；b a t c hf e r m e n t a t i o n n 缩略语 b t r p r l 色氨酸 l 广p h e o 苯丙氨酸 l - - t y r l - 酪氨酸 5 f 1 一5 一氟儿色氨酸 5 m t - - 5 甲基d l - 色氨酸 6 兀岳氟d l 色氨酸 4 m 卜一4 甲基色氨酸 t r 瞳k 色氨酸氧肟酸盐 4 矸。一对氟苯丙氨酸 p h e i - i x - - 苯丙氨酸氧肟酸盐 4 a 卜对氨基苯丙氨酸 3 - a t - - 3 - 氨基酪氨酸 t y r h ) 【- 酪氨酸氧肟酸盐 s e 磺胺胍 a s a s c r 一重氯丝氨酸 m f 一吲哚霉素 d s - - 3 脱氧- d 一阿拉伯庚酮耱酸7 磷酸合成酶 c m 分支酸变位酶 t s 色氨酸合成酶 a s - 邻氨基苯甲酸合成酶 p d 一预苯酸脱氢酶 p 1 - 预苯酸脱水酶 s r 丝氨酸消旋酶 1 1 1 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论 文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题 再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。 篡黧篓亍盏：塑学位论文作者签名：皇盘j 鱼盛指导教师签名：兰： 印年e j 多e t k 帅年月j 日 西北大学学位论文独创性声明 本入声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下迸行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：髁俊本 z o o 年月多日 西北大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1i 厂色氨酸的理化性质及应用 l 色氨酸( t r y p t o p h a n ) 的化学名称为：l - a 一氨基移吲哚基丙酸，别名为l 胰化蛋白氨基酸，l 氨基吲哚丙酸。分子式为c l l h l 2 0 2 n 2 ，相对分子质量2 0 4 2 1 ， 熔点2 8 9 c ，结构式为： 咿茳洲 l 广色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽六角片白色结晶， 无臭，有甜味。水中溶解度1 1 4 ( 2 5 ) ，溶于稀酸和稀碱和热乙醇及吡啶， 微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。在碱液中较为稳定，在强酸中分解。在生物体 内以游离态或结合态存在。色氨酸有两种光学异构体即l 色氨酸、d 一色氨酸和 消旋体d l - 色氨酸。 l 色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生 长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸。广泛应用于医药、 食品和饲料等方面。在生物体内，从l 色氨酸出发可合成5 羟基色胺、吲哚乙 酸、烟酸、色素、生物碱和辅酶等激素和生理活性物质。这些激素和生理活性物 质参与生物体特定的生命活动。其中吲哚乙酸是一种植物生长激素，5 羟基色胺 是脊椎动物的一种神经递质，它在神经系统中的含量与神经的兴奋和抑制状态有 密切关系，同时它也是一种血管收缩素。因此，色氨酸具有消除精神紧张、改善 睡眠效果、预防和治疗糙皮病等功效，在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨基 酸制刘”。另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中容易严重缺乏的氨基酸，可用它 来强化食品和做饲料添加剂，这对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作用，它 是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸 2 1 。此外，l 色氨酸还有防霉、 消毒以及阻止氧化的作用，可以作为鱼类保鲜剂1 3 1 西北大学硕士学位论文 1 2 【广色氨酸生产方法及研究现状 。色氨酸的生产最早主要是依靠化学合成法和蛋白质水解法制造。随对微生 物法生产色氨酸的研究的不断发展，人们开始利用微生物法发酵生产色氨酸。现 已走向实用并且处于主导地位。微生物法大体可分为微生物发酵法和酶促转化 法，一些主要生产厂家和生产方法见表1 1 。近年来还出现了直接发酵法和化学 合成法，直接发酵法和转化法相结合生产色氨酸的研究。另外，基因工程、酶的 固定化和高密度培养等技术在微生物育种和酶工业上的应用极大地推动了直接 发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。下面分别予以介绍。 表1 1 色氨酸的主要生产厂家 t a b 1 1t h em a i np r o d u c 2 1 o f l - t r y p t o p h a n 1 2 1 蛋白质水解法和化学合成法 l 色氨酸的生产最早主要是依靠蛋白质水解法和化学合成法制造。蛋白质水 解法是以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原科，通过碱水解法和酶水解法生产l 色氨酸。随着氨基酸生产技术的发展，现在已很少使用该法生产l 色氨酸。 化学合成法就是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制备氨基酸 的方法。d l - 色氨酸的化学法合成，大致可分为以吲哚为原料的合成法和以苯肼 为原料的合成法两种。s n y d c r 和m a c d o n a l d l 4 1 研究出了一种简单的合成d l - 色氨酸 的方法，即在乙酸和乙酸酐的存在下利用吲哚和a - 7 , 酰氨基丙烯酸直接缩合，得 到n - 乙酞一d l - 色氨酸，此物质在氢氧化钠溶液中水解即可得到d l - 色氨酸，收率 为5 7 7 。m o e 和m a c d o n a l d 【5 】报道以苯肼为原料合成色氨酸，即在乙酸钠存在下， 将丙烯醛和乙酰氨基丙二酸二乙酯缩合，缩合体再与苯肼反应而生成苯腙，苯腙 2 西北大学硕士学位论文 在h 2 s 0 4 或b f 3 水溶液中回流水解，环化得到化合物3 吲哚基甲基乙酰氨基丙二 酸二乙酯，将此化合物水解脱羧可得d l - 色氨酸。 化学合成法的最大优点是在氨基酸品种上不受限制，既可制备天然氨基酸， 又可制备各种特殊结构的非天然氨基酸。但这并不意味着具有工业生产价值，由 于合成得到的氨基酸都是d l - 型外消旋体，必须经过拆分才能得到人体能够利用 的l 广氨基酸。故用化学合成法生产d l - 色氨酸时，除需考虑合成工艺条件外，还 要考虑异构体的拆分与d 色氨酸异构体的消旋利用，三者缺一不可。因此，化 学法合成l 广色氨酸在工业上的应用也受到一定的限制。 1 2 2 酶促转化法 酶法是利用微生物中l 色氨酸生物合成酶系的催化功能生产l 广色氨酸的，能 够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产 物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易等优点，是一种成本较低 的生产色氨酸的工业化生产方法。目前在l 色氨酸的生产中应用较为广泛。这些 酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种 类数，可以分为双菌酶法和单菌酶法两种类型。 双菌酶法是利用两种菌分别提供酶促反应所需的色氨酸合成酶( t s ) 、丝 氨酸消旋酶( s r ) ，以吲哚和d l - 丝氨酸为底物酶促转化l 色氨酸。这种方法可 以将具有不同高活性的酶促转化色氨酸所需的酶结合在一起，实现菌种的优势互 补，提高底物的转化率。m a k i g u c h i 等嘲用大肠杆菌的色氨酸合成酶和恶臭假单胞 菌的丝氨酸消旋酶，以吲哚和d l - 丝氨酸为底物，在2 0 0 l 反应罐中反应2 4 h ，l 广 色氨酸产量可达n 1 1 0 9 l ，对吲哚吸收率为1 0 0 ( 摩尔比，下同) ，对d l - 丝氨 酸收率为9 1 。单菌酶法是利用一种菌提供色氨酸合成所需的色氨酸酶、色氨酸 合成酶、丝氨酸消旋酶等酶类酶促转化色氨酸。w o n - # b a n g 掣q 对单酶菌法生 产色氨酸进行了研究，利用大肠杆菌b 1 0 的高t s 活性转化吲哚和d l - 丝氨酸，添 加非离子表面活性t r i t o nx - 1 0 0 ，3 7 c 反应6 0 h ，色氨酸产量可达至1 1 4 1 4 9 i , ，对 吲哚收率为9 3 2 ，对d l - 丝氨酸收率为9 3 6 由于底物吲哚对色氨酸合成酶抑制强烈，而对色氨酸酶抑制较弱，所以近年 3 西北大学硕士学位论文 来人们更为倾向于将色氨酸酶用于l 色氨酸的生物合成。色氨酸酶正常情况下降 解l 色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高浓度的丙酮酸和氨条件下也能有效地 催化丙酮酸、吲哚和氨合成i 广色氨酸。该酶还能催化b 丝氨酸或l 半胱氨酸和吲 哚合成l 色氨酸。n a k a z a w a 等【7 】以2 吧吲哚、3 0 9 丙酮酸钠、5 0 9 7 , 酸铵和4 9 p r o t e u s r e t t g e r i ( 雷氏变形杆菌) 菌体作为色氨酸酶源，3 7 3 2 反应4 8 h 可积累2 3 9l - 色氨 酸。u j i m a r u 等 s l 用a c h r o m a b a c t e r l i q u i d u m ( 液形无色杆菌) 色氨酸酶催化l 丝氨 酸和吲哚合成l 色氨酸，工广丝氨酸转化率为8 2 4 ，吲哚转化率为9 2 4 。 国内也有研究以i 广半胱氨酸和吲哚为原料酶法生产l 色氨酸。韦平和等1 9 】用 色氨酸酶基因工程菌w w w - 4 催化l 半胱氨酸和吲哚合成l 色氨酸，8 0 m l 反应液 ( l 半胱氨酸0 7 5 9 ，吲哚0 7 5 9 ) 3 7 ( 2 反应4 8 h ，可积累l 色氨酸1 1 8 9 ，l - 半胱氨 酸转化率为9 3 2 0 0 ，吲哚转化率为9 0 1 ，产品总回收率达7 0 。另外，也有报道 利用具有丙酮酸高产率和高活性色氨酸酶的菌株酶促转化l 色氨酸。 酶促转化法既可以直接利用高活性色氨酸合成酶、色氨酸酶，或者具有高活 性色氨酸合成酶或色氨酸酶的菌体催化l 色氨酸的合成，也可以将酶或菌体固定 化后进行l 色氨酸的合成。菌体和酶固定化后具有提高酶的稳定性便于反复使 用，便于实现生产连续化和自动化等优点。w o n b a n g 等1 1 0 喇用聚丙烯酰胺固定 具有高活性色氨酸合成酶的大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l ib 1 0 菌体细胞，在连续搅拌 槽反应器中连续使用5 0 天，色氨酸合成酶活性保持8 0 n , 4 ，最高产酸0 。1 2 9 l 1 h - 1 。 还有利用其它固定化技术进行酶促转化【广色氨酸。e g g e r s 等0 搬道了一种利用有 机脂膜系统利用色氨酸酶酶促转化l 色氨酸。它是以环己烷作为有机相，有机脂 膜将两水相和有机相分开，其中一水相构成酶促反应体系，另一水相构成反萃取 体系，利用b i s - t r i s - p r o p a n e 作为两水相的缓冲剂维持两水相的p h 差值，从而影响 反应体系中各物质在两水相的分配常数，再通过有机相中的阴离子交换剂 a l i q u a t - 3 3 6 交换两水相中的丙酮酸和l 色氨酸。这种体系有利于l 色氨酸转运到 反萃取水相中，而有助于色氨酸的提取和降低l 广色氨酸对酶的抑制作用；而且， 有机相还可以储存吲哚，使吲哚在酶促反应体系中的浓度低于对酶的抑制水平。 e g g e r s 等1 12 l 还建立了一种反胶团酶促转化l 色氨酸的反应体系，它是将色氨酸酶 溶解在含有表面活性剂b r i j 5 6 的环己烷和水构成的反胶团的水相中，利用吲哚和 4 西北大学硕士学位论文 丝氨酸为底物，在有机相中添加阴离子交换剂a l i q u a t - 3 3 6 转运水相和有机相中的 l 色氨酸。以b i s - t r i s - p r o p a n e 作为两水相的缓冲剂，选择合适的含水量和p h 值等 参数条件，结果在l d m 3 反应体积内，每g 色氨酸酶经过l h 反应可产酸l o g 。该系统 除了上述脂膜反应体系的优点外，还可以提高色氨酸酶的稳定性。因此，在l 色氨酸的酶促转化中有着广阔的应用前景。 1 2 3 微生物发酵法 微生物发酵法包括直接发酵法和添加前体发酵法。 1 2 3 1 直接发酵法 直接发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生 产菌株，在合适的发酵条件下，直接发酵生产色氨酸。选育高产稳产的色氨酸优 良菌株是直接发酵法研究的中心问题在育种技术方面，传统的诱变育种国内外 进行了大量的研究。s h i i o 掣”1 以黄色短杆菌酪氨酸缺陷型、对氟苯丙氨酸( 4 f p ) 抗性变异株为出发菌株，选育5 氟色氨酸( 5 f t ) 抗性变异株n o 1 8 7 ，该菌株可 产l 色氨酸8 0g ，l 。继续以n o 1 8 7 为亲株选育具有邻氨基苯甲酸结构类似的重氯 丝氨酸( a s a s e r ) 抗性变异株a 1 0 0 ，其产酸率提高到l o 3g “1 4 1 ，再从a - 1 0 0 选 育磺胺胍( s g ) 抗性变异株s - 2 2 5 ，其产酸率进一步提高到1 9 9 l f 嘲。国内的张 素珍等【1 6 1 人以亚硝基胍处理北京棒杆菌a s l 2 9 9 ，得到c g 4 5 突变株。该菌株具有 5 m t ，6 f t ，4 m p 抗性标记，且以精氨酸和尿嘧啶为必需生长因子，在含1 2 葡 萄糖的培养基中，3 0 c 振荡培养5 天。可积累色氨酸8 9 ，l 。该方法研究比较早， 但在相当长的时间内无法达到工业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到色氨酸 的生物合成途径比较长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物 质( p r p p 、谷氨酰胺、i 广丝氨酸等) 。要想进一步提高l 色氨酸的产量还必须提 高这些前体物的产量。另一方面色氨酸生物合成途径中的调节机制比较复杂，除 了存在多重反馈调节外，还存在着弱化子系统。这使得色氨酸成为氨基酸发酵工 业中最难发酵的氨基酸之一随着d n a 重组技术的在微生物育种中的应用，为 优良色氨酸菌种的筛选提供了可靠的技术保证。使得产酸水平逐渐达到工业化生 产的要求。k a t s u m a t a r 等将带有d a h p 合成酶( d s ) 和色氨酸合成酶( t s ) 5 西北大学硕士学位论文 基因的重组质粒引入产l 广色氨酸4 3 9 l 的谷氨酸棒杆菌k y l m 8 9 4 中，使该工程菌 株的l 色氨酸产量达到t 6 6 9 l 产酸水平提高了5 4 。 1 2 3 2 添加前体发酵法 该法又称为微生物转化法，它是使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸 所需的前体物( 如邻氨基苯甲酸、吲哚、l 丝氨酸等) ，利用微生物的色氨酸合 成酶系转化前体来合成i 广色氨酸。这种方法很早就投入了工业化生产，目前世 界上最大的色氨酸生产厂家日本的昭和电工公司就是采用以邻氨基苯甲酸为前 体物，利用h a n s e n u l a ( 汉逊氏酵母) 或b a c i l l u s ( 芽孢杆菌) 菌种将其转化为色 氨酸的生产方法，y o k o z c n k i 等以d l - 5 吲哚甲基海因为原料，利用黄杆菌 t - 5 2 3 分解其为色氨酸，可产【广色氨酸7 1g l 。f u k u i 掣1 卵由枯草杆菌选育5 氟 色氨酸( 5 耵) 抗性突变株，在含l 葡萄糖和5 可溶性淀粉培养基中，连续 流加邻氨基苯甲酸，可积累l 色氨酸9 6 9 l 。n a k a y a r n a 等刚进一步改造该突变 株，使其具有5 - f t 和8 氮鸟嘌呤( 8 - a g ) 双重抗性，在含1 0 葡萄糖培养基中， 连续流加邻氨基苯甲酸，可积累l 色氨酸1 5 6 班 在国内，张素珍等【2 1 1 通过对北京棒杆菌a s1 2 9 9 的诱变选育获得一株能转 化吲哚、【广丝氨酸生产色氨酸能力较强的突变株1 3 2 9 8 6 3 ，当底物浓度为1 5 3 0 g l ，在适宜条件下转化2 4 h 即可产l 色氨酸2 0 - 3 0g l ，最高可达4 2 8e , l ，转 化率为8 m 9 0 。 微生物转化法的不足之处在于当转化液中前体物浓度较高时，转化率有所下 降，但可以通过分批次少量流加前体减少其抑制作用。另外，前体物价格比较昂 贵，不利于降低成本。因此，有人研究利用发酵法廉价提供一种前体物，再结合 其它方法的优势进行色氨酸的生产。h a j i m um o r i k o t a 等 2 2 利用黄色短杆菌p 3 9 0 直接发酵【广谷氨酸弘半醛( g s a ) 达1 3 2 9 ：l ，然后将发酵液适当稀释后加入苯 肼的l m o l l h 2 s 0 4 溶液中加热回流1 小时之后，4 8 的g s a 可转化为l 色氨酸。 s m g e r uo i t a 等【2 3 铡用硫辛酸和硫胺素双重缺陷性菌株砌纫d 施c f e r 口e f d g 鲫e l t - 9 4 ，在含5 的葡萄糖培养中产丙酮酸3 0 9 l ，然后再通过添加吲哚和氯化铵， 利用该菌的色氨酸酶酶促转化i 广色氨酸1 6 7 。 6 西北大学硕士学位论文 1 2 4 基因工程技术在l 色氨酸生产菌种选育中的应用 随着d n a 重组技术的发展，逐渐应用于色氨酸生产菌种的选育，构建的基 因工程菌也逐渐应用于色氨酸生产的各种方法中，大大提高了色氨酸生产菌株 产酸水平和转化底物的能力。i 广色氨酸基因工程菌的构建主要有三方面，包括色 氨酸操纵子基因工程菌的构建、色氨酸合成酶基因工程菌的构建和色氨酸酶基因 工程菌的构建。1 9 7 9 年，t r i b e t f o p i t t a r d l 2 4 埔一次将含有去除调节作用的仃p e 的色 氨酸操纵子在大肠杆菌中扩增、表达，但发酵产l 广色氨酸只有l g ，l 。1 9 8 2 年，a i b a 等i 黔谴过质粒将含有去调节功能的卸e 和印d 的操纵子引入到t q p r 和恤a a 突变的 大肠杆菌中，通过连续流加邻氨基苯甲酸，在以葡萄糖为碳源的培养基中，发酵 2 7 h 口- 1 生产l 色氨酸6 2 9 l 。丸眦m 等口q 通过对该菌株进行诱变，筛选出一株6 - f t ， 8 氮鸟嘌呤抗性突变株，在连续流加邻氨基苯甲酸情况下，产l 色氨酸超过了 5 0 9 l 。由于在色氨酸生物合成途径中存在阻遏、反馈抑制、弱化子效应以及分 支酸的分流作用，所以通过克隆整个色氨酸操纵子所构建的重组工程菌，其色氨 酸产率往往偏低。为了避开色氨酸生物合成途径中的这些限制作用，基因克隆技 术转向了色氨酸合成的关键酶，即色氨酸合成酶基因( t r p b a ) 的克隆。据日本“日 经生物技术明报道，日本三乐公司克隆了大肠杆菌色氨酸合成酶基因和丝氨酸 转羟甲基酶( s h t 撇) 基因，用甘氨酸为原科合成丝氨酸，再加入吲哚生产色 氨酸，产量为9 0 9 l ：三井东亚公司也用大肠杆菌色氨酸合成酶基因重组工程菌 生产l 广色氨酸；三菱石化公司用类似于三乐公司的方法，酶促转化色氨酸达到 2 0 0 9 g 。y u k a w a 等 2 8 】构建了带有色氨酸合成酶基因的大肠杆菌k - 1 2 ，酶促转化 产l 色氨酸2 0 0 9 l 。 由于吲哚对色氨酸合成酶有很强的抑制作用，而对色氨酸酶的抑制作用较 弱，因此，人们又将注意力集中于色氨酸酶的基因克隆表达。以氨、丙酮酸和吲 哚为底物在高浓度的条件下色氨酸酶催化合成【广色氨酸。h a m i l t o n 等 2 9 1 克隆了大 肠杆菌色氨酸酶基因，酶促转化产l 色氨酸2 0 0 9 无，吲哚转化率为9 5 ，丝氨酸 转化率为9 3 。t e r a s a t a m i 等 3 0 l 构建了重组质粒p b r 3 2 2 f - t n a a ，酶活性比供体菌提 高了5 0 0 倍，酶转化产i 广色氨酸2 0 0 9 l 。 由于在生产规模培养基因工程菌时，一般不允许添加抗生素而在无选择压 7 西北大学硕士学位论文 力的条件下，重组质粒容易会表现出不同程度的丢失。为使重组质粒能够稳定地 传代，人们对如何防治质粒的丢失进行了大量研究。其中较为有效的措施是在重 组质粒中插入具有质粒分配功能的d n a 片段。而质粒p s c l 0 1 含有一段具有分配 功能的d n a 片段e p p a r 区，它是专性负责质粒的分配和稳定的维持。s k o g m a n 掣”l 将p s c l 0 1 的p a r 区插入到p b r 3 2 2 仃p ，结果稳定性提高了l o 倍。另外，质粒m i n i - f 由大肠杆菌的f 质粒，经消化，环化而成，它也具有稳定质粒的功能。y u k a w a 等1 3 刁将m i n i - f 的e c o ri - b a m i - ii 片段插入重组质粒形成p b r 3 2 2 - t r p b a ，培养至结 束时可1 0 0 的稳定传代。t e r a s a w a 等同样将m i n i - f 的e c o ri - b a m hi 片段插入 重组质粒p b r 3 2 2 - t r p b a 中，培养1 0 0 代也可1 0 0 的稳定传代。随着这些技术的研 究的不断发展，使得利用基因工程菌生产色氨酸成为了可能。 1 2 5 高密度培养技术在色氨酸生产中的应用 在利用基因工程菌和酶促转化法生产l 色氨酸时，l 色氨酸的产量与加入反 应体系中总酶活性的高低成正比。所以，对于具有高酶活的菌株，特别是基因工 程菌可以利用高密度培养方法，使单位体积内菌量增加，从而提高酶促转效率和 产量。m a t s u i 掣3 4 】为了进行高菌体细胞浓度培养生产色氨酸合成酶，设计了一种 新型的高浓度合成培养基( t k - 2 5 ) ，再用t k - 2 5 培养含p b p 3 2 2 t r p b a 的工程菌 1 4 h 后，菌体量可达1 1 5 9 l ( 干重) 日本三菱石化公司1 2 9 1 培养重组工程菌2 0 h ， 菌体量达1 2 0 9 ，l ( 湿重) y u k a w a 等 2 8 1 报道了培养的菌体量为1 2 5g ，l ( 湿重) 。 1 3l 色氨酸的测定方法 l 色氨酸的测定方法主要有：纸层析法，微生物测定法，高效液相色谱法， 氨基酸分析仪测定法和比色法等。纸层析法利用试样与标准品的r f 值相比较可 进行定性检测，操作简单，同时可对发酵液中其它氨基酸副产物进行检测；微生 物测定法，是利用i 广色氨酸缺陷型菌株只有当其培养基中存在l 色氨酸时才能 生长，且培养基i 广色氨酸的量与菌体的生长量在一定范围内成线性关系的原理 而设计的一种简便快捷的测定方法。但该方法的测定所需时间长。高效液相色谱 法、氨基酸分析仪测定法对l 色氨酸的测定准确性最高，但设备昂贵，测定成 本高，不适合于一般实验室进行大量测样。比色法包括以对二甲氨基苯甲醛比色 8 西北大学硕士学位论文 测定法及荧光测定法等d 5 , 3 6 1 。对二甲氨基苯甲醛是i 广色氨酸的特异显色剂，在 实验室常用此法进行i 广色氨酸的定性定量分析 1 4l 色氨酸发酵生产的菌种 目前色氨酸发酵的生产菌种主要有谷氨酸棒杆菌( cg l u t a m i c u m ) 、黄色短 杆菌( 曰f l a v u m ) 、枯草芽抱杆菌( 且s u b t i l i s ) 、大肠杆菌( e c o l i ) 和产朊假 丝酵母( y e a s t c a n d i d a u t i l i s ) 等。 1 5l 色氨酸的生物合成途径及代谢调节机制 l 色氨酸属于芳香族氨基酸，在生物体内存在严格的调控机制。以谷氨酸棒 杆菌为例，对l 色氨酸的生物合成途径及调节机制予以阐明。 如图1 - 1 所示，在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖经e m p 途径和碰讧p 途径生成分别 生成磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 和4 - 磷酸赤鲜糖( e p ) ，两者在d a h p 合成酶( d s ) 的催化下生成3 脱氧- d 阿拉伯庚酮糖酸7 磷酸( d a m ) d a h p 经三步反应生 成莽草酸，莽草酸经三步酶促反应生成分支酸。由分支酸产生两个分支：一方面， 在邻氨基苯甲酸合成酶( a s ) 催化下合成邻氨基苯甲酸，邻氨基苯甲酸在邻氨 基苯甲酸磷酸核糖移换酶( p r t ) 和色氨酸合成酶( t s ) 的催化下合成色氨酸： 另一方面，分支酸在分支酸变位酶( c m ) 的催化下生成预苯酸( p p a ) 。由预 苯酸又产生两个分支：在预苯酸脱氢酶( p d ) 的作用下生成对羟基苯丙酮酸， 再生成酪氨酸；在预苯酸脱水酶( p t ) 作用下生成苯丙酮酸，最后合成苯丙氨 酸。在分支酸处，倾向于优先合成邻氨基苯甲酸；在预苯酸处，倾向于优先合成 对羟基苯丙酮酸。 在色氨酸的生物合成途径中受调节控制的关键酶有：d a h p 合成酶( d s ) 、 分支酸变位酶( c m ) 、预苯酸脱氢酶( p d ) 、预苯酸脱水酶( i r r ) 和邻氨基苯 甲酸合成酶( a s ) 。d a i - i p 合成酶( d s ) 受l 苯丙氨酸和l 酪氨酸的协同反馈 抑制，l 色氨酸能增强这种抑制作用( 当三种氨基酸并存时，最大抑制作用接近 9 0 ) 。第一个分支点( 分支酸) 处的分支酸变位酶( c l v l ) 受l 广苯丙氨酸和l 酪氨酸的部分抑制( ( o 1 m m o l l l - 苯丙氨酸的抑制作用为9 0 0 ，o 1 m m o l ll - 酪 氨酸的抑制作用为5 0 ) ，为l 苯丙氨酸所阻遏。当0 i m m o l l l - 苯丙氨酸和l 9 西北大学硕士学位论文 酪氨酸同时存在时，则完全抑制该酶活性。但l 色氨酸能激活该酶，并能恢复由 前两者所抑制的酶活性【3 7 3 第一个分支点处的另一关键酶邻氨基苯甲酸合成酶 ( a s ) ，受l 色氨酸的强烈抑制，同时为l 色氨酸所阻遏。第二个分支点处的 预苯酸脱氢酶( p d ) 受l 酪氨酸的轻微抑制。第二个分支点处的预苯酸脱水酶 ( p t ) 受l 苯丙氨酸的完全抑制( o 0 5 m m o l l 的抑制作用达到1 0 0 ) ，受l 色氨酸的交叉抑制( o i m m o l l 的抑制作用达到1 0 0 ) ，但i 广酪氨酸能激活该酶 活性，它能和抑制剂竞争，以解除由l 苯丙氨酸或l 色氨酸所引起的抑制作用。 l d a i i p 台威爵量舻妇嘲黼3 疆苯馥& 巍4 孺苯馥瑟泰疆 5 舞嗣基苯单麓身黼搿鬣基葶甲酮嘲翻嗣麓 按赢利酗田翻女棚 一p 反馈抑翻= = 反馈融遏 - = = = 激话一，一蠢够 抑材 图1 1 谷氨酸棒杆菌中的色氨酸合成途径及其调节机制 f i g i 1 p a t h w a y f o r b i o s y n t h e s i s o f l - t r y p t o p h a n a n d m e t a b o l i cr e g u l a t i o n m e c h a n i s m i n c o , y n e b a c t e n u mg l u t a m i c u m 迄今为止，所被研究的所有菌株中的l 色氨酸的生物合成途径都是一样的， 但不同的的菌种对各酶的调节机制又有所不同。在芳香族氨基酸共同途径中：黄 色短杆菌中d a h p 合成酶( d s ) 受到苯丙氨酸和酪氨酸的协同反馈抑制，苯丙氨 酸和酪氨酸单独存在时，对其只有微弱的抑制。d s 不受色氨酸的影响。而在谷 l o 西北大学硕士学位论文 氨酸棒杆菌中色氨酸存在时能够增强苯丙氨酸和色氨酸的协同反馈抑制【3 引。在色 氨酸的特异合成途径中，有的菌种所有酶都被色氨酸协调的阻遏，有的都不被阻 遏，有的只有a s 被阻遏。或者有的t s 被吲哚甘油磷酸诱掣3 9 1 。如在黄色短杆菌 中色氨酸合成途径中各酶都受到色氨酸的阻遏，但并不是协调阻遏的。在 p p u t i d a ，n c r a s s a d p t s 被吲哚甘油磷酸诱导。而在e c o l i , s t y p h i m u r i u m a e r o m o n a s f o r m i c u s , b a c i u a ss u b t i l i s , s e r r a t i am a r c e s , s t a p h y l a c o c o u s , a o r e u s 等菌种 中色氨酸合成途径中各酶是协调阻遏的，它们的t s 也不被吲哚甘油磷酸诱导。 又如在c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e c c m r f 】色氨酸一点也不阻遏酶的形成。在 a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s 中只有a s 受到色氨酸的阻遏。 1 6 代谢控制育种思路及实例 如上所述，芳香族氨基酸的生物合成存在着特定的代谢调节机制，因此不可 能从自然界中找到大量积累色氨酸的菌株。但是我们可以黄色短杆菌、谷氨酸棒 杆菌等为出发菌株，设法得到从遗传角度解除了芳香族氨基酸生物合成正常代谢 调节机制的突变菌株，用微生物直接发酵法生产色氨酸。这些方法包括：解除菌 体自身反馈调节、切断支路代谢、增加前体物的合成等，下面分别加以讨论。 1 6 1 切断支路代谢 切断由分支酸到预苯酸、v k 、c o q 的代谢支路，可节约碳源，使中间产物 分支酸更多地转向合成色氨酸，而且还可以解除苯丙氨酸、酪氨酸对合成途径中 d s 的反馈调节，从而有利于色氨酸积累。具体可采用预苯酸缺陷、苯丙氨酸缺 陷、酪氨酸缺陷、v k 缺陷、c o q 缺陷等标记据报道，有人以谷氨酸棒杆菌为 出发菌株，经诱变得到的k y 9 4 5 6 ( p h e + t y r ) 可积累l 色氨酸0 1 5g l t l 研。这 个产量是很低的，由此也可看出只选育缺陷型是不够的，还必须解除由色氨酸引 起的反馈调节。 1 6 2 解除菌体自身反馈调节 根据图l l 所示的调节机制，对于谷氨酸棒杆菌来说，如果解除色氨酸特异 途径的调节机制，即使有共同途径上反馈调节的存在，也能大量积累色氨酸。因 此可选育色氨酸结构类似物抗性突变株，解除其自身的反馈调节来达到积累色氨 西北大学硕士学位论文 酸的目的。 色氨酸的结构类似物有：5 甲基色氨酸( 5 - 仃) 、5 氟色氨酸( 5 一f t ) 、色 氨酸氧肟酸盐( t r p h x ) ，6 - 氟色氨酸( 6 - f t ) 、6 - 甲基色氨酸( 6 m t ) ，4 - 甲 基色氨酸( 4 - m t ) 和吲哚霉素( d 匹) 等。它们都可以由于结构与色氨酸类似而 被a s 酶误认，与a s 酶的调节部位结合。通过选育它们的抗性突变株就可以解 除色氨酸对a s 酶及该特异途径中其它酶的反馈调节，从而使色氨酸得以积累。 o s a m uk u r a h a s h i 等【帅】利用n t g 诱变处理枯草芽袍杆菌k ( b a c i l l u ss u b s t i l i sk ) 得到标记为5 卿4 和一的突变株a j l l t 0 9 ，在含1 3 葡萄糖培养基中培养1 2 0 h r ， 可产生9 0 9 l 的色氨酸。该菌株色氨酸特异途径的酶( 除t s 外) 的合成阻遏全 部被解除，所以表现出明显高于亲株的比活性。另外，a s 的反馈抑制也明显减 弱，同时也降低了分支酸变位酶的活性，从而导致色氨酸分支代谢流的增加。由 于防止色氨酸过剩合成的机制有合成抑制和合成阻遏两种，而且各个酶的合成阻 遏是各自独立进行的，所以很难通过一次诱变就将这些调节全部去除。 1 6 3 增加前体物的合成 为了积累更多的色氨酸，必须更多地增加前体物，其中包括减少p e p 和e p 的支路代谢，解除苯丙氨酸和酪氨酸对d s 的反馈调节，增加分支酸的浓度等方 法。为了积累更多的p e p ，防止丙酮酸生成更多的草酰乙酸，可以选育磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活力低的菌株或者选育硫辛酸和硫胺素( 分别为丙 酮酸脱羧酶系和丙酮酸羧化酶系的辅酶) 双重缺陷型突变株。 日本的k a t s u m a t ar y o i c h i 等人【4 i l 以n t g 诱变谷氨酸棒杆菌b p s l 3 ( t y r + p h o ) 得到具有上述遗传标记的突变株k 8 1 ，该菌株在种子培养基中3 0 振荡 培养2 4 h r ，再接入到发酵培养基中振荡培养7 2 h r ，结果生成色氨酸8 5 9 j i ( 亲株 产7 8 9 l ) 。s h i g e mo i t a 等口3 墚用硫辛酸和硫胺素( 分别为丙酮酸脱羧酶系和丙 酮酸羧化酶系的辅酶) 双重缺陷的产气杆菌l t 9 4 的洗涤细胞，由5 的葡萄糖 生成了3 0 s l 的丙酮酸，又经色氨酸酶催化，最终生成