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独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要 特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或汪书使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：龟佛造 导师签字： 学位论文版权使用授权书 旁| 廖茜乒 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 遨可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 学位论文作者签名2 断# 谴 签字日期：2 0 0 7 年牟月，oe t 导师签字、怿也争 签字日期：2 0 07 年细，2 日 山东师范大学硕士学位论文 可控纳米材料在生物传感器上的应用 摘要 糖尿病是世界性的多发病和常见病，随着经济的快速发展、人们生活水平的提高和 老年人口的增多，其发病率呈明显上升趋势。糖尿病已经成为现代疾病中的第二杀手， 其对人体的危害仅次于癌症。全世界约有两亿多病人，已成为全球性的卫生保健问题， 因此，糖尿病的诊断和治疗是科学界、医学界所面临的重大课题。长期的临床研究表明： 如果血糖浓度能被严格控制在正常生理范围之内，糖尿病及其并发症就可以得到控制。 电化学葡萄糖生物传感器具有选择性高、简便、快速的特点，是检测葡萄糖浓度最常用 的方法。为提高传感器的性能，一个发展方向是制备直接电子传递的第三代电流型葡萄 糖生物传感器。目前把利用导电聚合物或导电有机盐制备的酶电极叫做直接电子传递的 生物传感器。但是这些研究都处在初级阶段，第三代传感器的制各方法仍在探索中。传 感器发展的另一个方向是微型化、集成化。微型化迫切需要提高传感器的电流响应，因 此，寻找新材料、新方法制备电流响应值高的新型直接电子传递生物传感器非常必要。 自1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 第一次提出用于测量葡萄糖的酶电极以来，已经有大量的 关于酶生物传感器的报导，其中葡萄糖的检测是该领域研究最多的分析物之一。在生物 传感器研究中，酶的固定化是最关键的一步。纳米材料目新月异的发展，为酶固定化的 发展提供了良好的契机，同时为生物传感器实现高灵敏度、简便、无创伤、成本低等要 求创造了机会。纳米颗粒不同于块体材料，由于纳米材料自身的特殊结构导致其具有以 下四大效应：小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应。同时由这四 山东师范大学硕士学位论文 大效应产生了很多独特的性质，如特殊的机械性能、电性能、磁性能、热性能、光性能 和化学活性等。由于纳米颗粒具有比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、催 化效率高、吸附能力强等优异性质，有效地提高传感器的响应灵敏度，所以研究者用各 种纳米材料来进行酶的固定化，如a u 、a g 、p t 、s i 0 2 、碳纳米管及它们的复合物。 本文的思路是将分别采用琥珀酸一2 一乙基己基磺酸钠环己烷反胶束体系制备纳米 z n o 和不同形貌的a u 纳米颗粒引入到葡萄糖生物传感器中。氧化锌纳米颗粒的导电能 力介于导体和绝缘体之间是一种典型的半导体。当其尺寸减小到纳米级时，他们表现出 许多独特的性质。与相应的块体材料相比，金纳米颗粒具有独特的化学和物理性质，可 应用于电学、催化、磁性材料、药物输送等领域，其中，生物传感器是其最有意义的应 用。因此金纳米颗粒的制备研究引起了人们的广泛兴趣。实验结果表明，把以这些纳米 颗粒作为载体来固定g o d ，能够显著提高酶电极的电流响应、增强稳定性。为临床应用 和传感器的微型化、工业化生产提供可供参考的依据，为纳米颗粒增强新型葡萄糖生物 传感器的研究、制备和应用奠定基础。 关键词：葡萄糖生物传感器、z n o 纳米颗粒、a u 纳米颗粒、酶固定 山东师范大学硕士学位论文 a p p l i c a t i o no f c o n t r o l l a b l en a n o m a t e r i a l s a b s t r a c t i nb i o s e n s o r s d i a b e t e sm e l l i t u si sac o r m n o na n df r e q u e n t l y o c c u r r i n gd i s e a s ea n di n c i d e n c eo fw h i c h i so b v i o u s l yi n c r e a s i n ga st h ee c o n o m yd e v e l o p s ，s t a n d a r d so fl i v i n ga l ei m p m v e aa n dt h e p o p u l a t i o no fe l d e ri n c r e a s e s a n dc o n s i d e r e d 嬲t h es e c o n dg r a v ek i l l e ro fh u m a nl i v e se x c e p t f o rc a n c e r s i ts e r i o u s l ym e n a c e st h eh e a a t h yo f t h eh u m a nb e i n g s ，t h e r e f o r e ，t h ed i a g n o s i sa n d t r e a t m e n to fd i a b e t e sm e l l i t u si sah e a v yr e s p o n s i b i l i t yf o rt h eb i o m e d i c a le n g i n e e r i n gf i e l do f t h ew o r l d l o n g - t e r mr e s e a r c h e so fc l i n i cs u g g e s tt h a td i a b e t e sm e l l i t u sa n ds y n d r o m ec o u l d b ec o n t r o l l e di fb l o o ds u g a rc o n c e n t r a t i o nc a nb ec o n t r o l l e dw i t h i nn a t u r a la n dp h y s i o l o g i c a l r a n g e g l u c o s eb i o s e n s o ri st h em a j o rt e c h n i q u ef o rg l u c o s ea n a l y s i si nc l i n i c a lp r a c t i c e ，f o r t h ea d v a n t a g e so fg l u c o s eb i o s e n s o r sa l eo b v i o u s ：h i g hs p e c i f i c i t y , s h o r tt i m e ，s i m p l i c i t ya n d l o wc o s to f a n a l y s i s ，e t c o n eo f t h ed e v e l o p m e n t so f g l u c o s eb i o s e n s o ri st h et h i r dg e n e r a t i o n a r n p e r o m e 仃i ce n z y m ee l e c t r o d ew i t hd i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r , w h i c hi sc o m m o i l l yp r e p a r e db y c o n d u c i n go r g a n i cs a l t sa n dc o n d u c t i n gp o l y m e r s a n o t h e rd e v e l o p m e n to fb i o s e n s o ri s m i n i a t u r i z a t i o na n di n t e g r a t i o n d e v e l o p m e n to fat h i r dg e n e r a t i o ne n z y m ee l e c t r o d ei so n eo f t h el o n g t e r mg o a l so fb i o s e n s o rp r o g r a mi nt h ew o r l d i ti sv e r yn e c e s s a r yt os e a r c hn e w m e t h o d st op r e p a r et h et h i r dg e n e r a t i o nb i o s e n s o r s i n c e c l a r ka n dl y o n sr e p o r t e dt h e i re n z y m ee l e c t r o d ef o rm e a s u r i n gg l u c o s ei n19 6 2 ，a n 5 - 山东师范大学硕士学位论文 e n o r m o u sa m o u n to fp a p e r sh a v e b e e np u b l i s h e dc o n c e r n i n ge n z y m e - b a s e db i o s e n s o r s g l u c o s ei sb yf a rt h em o s ts t u d i e da n a l y t ei nt h i sf i e l do fr e s e a r c h c u r r e n t l y ，v a r i o u ss t u d i e s w e r ec o n d u c t e dt oi m m o b i l i z et h eb i o l o g i c a l l ya c t i v ec o m p o n e n t so n t ot h et r a n s d u c i n gp a r to f t h eb i o s e n s o rd e v i c e i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m ei sv e r yp i v o t a lt op r e p a r eb i o s e m o r s d e v e l o p m e n to fn a n o m a t e r i a l sp r o v i d e sao p p o r t u n i t yf o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m ea n d m a k e st h ed e m a n d so fr e l i a b l em i n i a t u r es e n s o r sp o s s i b l e b e c a u s en a n o p a r t i e l e sa r ed i f f e r e n t f r o mb u l km a t e r i a l s t h es p e c i a lc o n s t r u c t i o no f t h en a n o p a r t i c l e sl e a d st of o u re f f e c t s ：s u r f a c e ， v o l u m e ，q u a n t u ms i z e ，a n dq u a n t u mt u n n e le f f e c t s t h e s ed e r i v em a n yu n i q u ep r o p e r t i e s s p e c i a lm e c h a n i c a l ，e l e c t r i c ，m a g n e t i c ，t h e r m a l ，o p t i c a la n dc h e m i c a la c t i v i t yp r o p e r t i e sa n ds o o n s om a n yi n v e s t i g a t o r sm a k et h em o s to ft h ep a r t i c l e sw i t ht h eu n i q u ep r o p e r t i e so fl a r g e r a t i oo fs u r f a c et ov o l u m e ，h i 曲s u r f a c er e a c t i o na c t i v i t y ，s u r f a c ea c t i v em u l t i e e n t e r s ，h i g h c a t a l y t i ce f f i c i e n c y ，a n ds t r o n ga d s o r p t i o na b i l i t y ，a n di n t r o d u c ev a r i o u sn a n o p a r t i e l e si n t o i m m o b i l i t yo f e n z y m e ，s u c h a sa u 、a g 、p t 、s i 0 2 、c a r b o nn a n o t u b e s 、c o n d u c t i v ep o l y m e r s a n dc o m p o s i t e s i nt h i sw o r k , w ei n t r o d u c ez n ow h i c ha r ep r e p a r e db y r e v e r s em i c e l l ea n da u n a n o p a r t i c l e sw i t hd i f f e r e n ts h a p e si n t og l u c o s eb i o s e n s o r s z n on a n o p a r t i c l ei s at y p i c a l s e m i c o n d u c t o re l e c t r i cc o n d u c t i v i t yo fw h i c hi sb e t w e e nt h a to fc o n d u c t o r sa n dt h a to f i n s u l a t o r s z n ob e h a v em a n yp a r t i c u l a rc h a r a c t e r sw h e ns i z eo f z n oi sm i n i s h e dt ol l a n ol e v e l g o l dn a n o p a r t i c l e sh a v ea t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o ni nt h ep a s tf e wy e a r so w i n gt ot h e i r 6 山东师范大学碗士学位论文 p a r t i c u l a rp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nm a n yf i e l d ss u c ha s e l e c t r o n i c s ，c a t a l y s t , m a g n e t i cm a t e r i a l sa n dm e d i c a m e n tt r a n s f e ra n ds oo n , c o m p a r e dw i t h b u l kg o l d a m o n gt h e m b i o s e n s o ri so n eo f t h em o s tu s e f u ls e c t i o n s n ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o wt h a tz n on a n o p a r t i c l e sa n da un a n o p a r t i c l e sw i t hd i f f e r e n ts h a p e sc a ns i g n i f i c a n t l y e n h a n c et h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z a t i o ne n z y m ea n dt h ee l e c t r o d eh a sav e r yg o o d r e s p o n s et ot h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s es o l u t i o n ，s ot h e s er e s u l t sp r o v i d ea l la c a d e m i c f o u n d a t i o nf o ra p p l i c a t i o no f b i o s e n s o r si nf u t u r e k e y w o r d ：g l u c o s eb i o s e n s o r s ，a o t z n on a n o p a r t i c l e s ，a un a n o p a r t i c l e s ，i m m o b i l i z a t i o n e n z y m e - ，- 山东师范大学硕士学位论文 第1 章前言 1 1 文献综述 糖尿病是世界性的多发病和常见病，随着经济的快速发展、人们生活水平的提高和 老年人口的增多，其发病率呈明显上升趋势。糖尿病已经成为现代疾病中的第二杀手， 其对人体的危害仅次于癌症。专家估计，中国大陆的糖尿病患者已有二千五百万名。若 加上潜在人群，受糖尿病威胁的总数达到四千万人，并且每年以百分之一的速度增长， 每年消耗的社会资源约五百亿元人民币。我国发病率已达n 2 5 3 ，十分接近欧美发 达国家的2 5 。全世界约有两亿多病人，已成为全球性的卫生保健问题，因此，糖尿病 的诊断和治疗是科学界、医学界所面临的重大课题。 长期的研究工作己充分表明【l 】，如果葡萄糖浓度能够严格控制在正常生理范围内， 那么糖尿病综合症就可以得到控制。由此产生了一系列适于测量体内、外生理溶液中葡 萄糖浓度的葡萄糖检测装置。这些传感器大多数根据电化学原理并使用酶作为分子识别 和生物成分。近来一些其它技术和方法也应用于葡萄糖检测【2 】。然而电化学生物传感器 仍然是众多研究的焦点 3 1 。葡萄糖生物传感器可以简单、快速地测量人体内葡萄糖的含 量，而且它的制作简单，灵敏度高，响应时间短，不需专业的技术人员来操作，所以葡 萄糖生物传感器的研制显得尤为重要。 为了满足临床医学研究所需要的自动、迅速和精确葡萄糖浓度测量的要求，当前有 许多方法用于葡萄糖鉴定和浓度检测分析【2 】【4 1 。所有方法必须具有如下特性： 1 ) 响应迅速，葡萄糖浓度变化必须在1 5 分钟内检测出来； 2 ) 精确，葡萄糖浓度测量中由于干扰物质或生理参数变化所引起的误差必须很小( 最 大偏差不应超过1 0 m g d l ) ； 3 ) 灵敏度高、信噪比大，可以检n n j i d , 的葡萄糖浓度变化( o 1 m m 或近2 m g d l ) ； 4 ) 测量范围宽，能够测量生理和病理范围( 2 0 6 0 0 m g d l ) 的葡萄糖浓度； 5 ) 稳定性好，在测量仪器的操作时间内葡萄糖产生的信号偏差不超过5 ； 6 ) 使用寿命足够长，应该满足其应用领域的要求。 1 2 葡萄糖浓度的测量方法 根据病人机体与所使用的葡萄糖分析装置问的相互作用，葡萄糖测量方法可分为两 类主要方法：介入性和非介入性方法p j 。 山东师范大学硕士学位论文 介入技术中，装置的检测部分与生物组织或体液发生紧密机械接触。非介入测量则 利用分析物( 葡萄糖) 的可远距离检测的特征信号( 光谱、光、热、电、电磁等) 不经过机 械插入，而直接获得信息。两种检测技术所采用的方法如表1 1 所示。 表1 1 常用的葡萄糖浓度检测方法 葡萄糖检测方法分类研究方式 特点 非近红外光谱 生物分子的特征吸收 迅速但灵敏度低 介 入 法光谱分析 技 无损透皮取利用药物使体液从皮对仪器要求高 术 检 样肤析出检测 测 方 生理体液检唾液、尿液、汗液、受浓度影响较大 法 测泪液等 介 透皮取血抽取血样，体外仪器增加病人痛苦、 入 技 测量容易引发感染、 术 损伤 检 测植入检测仪器植入体内对稳定性的要求 方 法 非常高，更换麻 烦 非介入方法可以减少糖尿病人日常检测血糖的复杂程度和对机体组织的伤害，提高病 人的生活质量，但是对仪器要求高，受浓度影响较大；而介入测量目前是较流行的、主 要的临床和家庭葡萄糖检测方法，也是本论文中所采用的方法。 1 3 葡萄糖生物传感器 1 3 1 葡萄糖生物传感器基本结构及工作原理 葡萄糖生物传感器酶电极的基本结构单元是由物质识别元件( 葡萄糖氧化酶膜) 和 信号转换器( p t 丝基体电极) 组成。当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由基 体电极对其响应。基体电极的作用是使化学信号转变为电信号，从而加以检测。检测原 理如图 6 11 1 所示。 山东师范大学硕士学位论文 图1 1 生物传感器的工作原理示意图 当葡萄糖氧化酶电极浸入被测溶液中时，待测底物进入酶层的内部并参与反应，产 生或者消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质的浓度可以由电 位或者电流模式进行测定。因此，葡萄糖生物传感器可以分为电位型和电流型两类。 电位型生物传感器是指酶电极与参比电极间输出的电位信号与被测物质之间服从能 斯特关系。而电流型生物传感器是以酶促反应所引起的物质量的变化转变成电流信号输 出，输出电流大小直接与底物浓度有关。与电位型传感器相比，电流型生物传感器具有 更简单、直观的效果，且灵敏度较高。 1 3 2 葡萄糖生物传感器的分类 生物传感器可按照生物特异性授予机制或信号转换模式分类。按被选生物化学受体 的不同，可将生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器、细 胞传感器等。按生物传感器与底物作用机理的不同，又可将传感器分为生物催化型传感 器和生物亲和型传感器。生物催化型传感器包括酶传感器、组织传感器、微生物传感器 等；而生物亲和型传感器包括免疫传感器和d n a 传感器等。根据生物反应产生信息的物理 或化学性质，换能器通常采用电化学、光谱、热、压电及表面声波等技术与之相匹配， 而由此衍生出电化学生物传感器、光生物传感器、半导体生物传感器、热生物传感器， 压电晶体生物传感器等。本文主要研究葡萄糖电化学传感器。 电化学传感器是基于电化学换能器的一类生物传感器，电化学换能器具有较高的灵 山东师范大学硕士学位论文 敏度，易微型化，能在浑浊的溶液中操作等优势，并且所需的仪器简单、便宜，因而被 广泛应用于传感器的制备中。电化学传感器中，电信号是一些发生在换能器分析物界面 的( 化学) 过程的一个直接的结果。人们主要研究了葡萄糖在贵金属电极上直接电氧化的 电催化传感器【刀和结合葡萄糖特异性酶的生物传感器嘲。根据电化学检测的模式不同，又 可具体分为安培型、电势型、表面电荷场致效应晶体管( f e t s ) 型和电导型电化学生物 传感器。电化学传感器虽然具有长期稳定性，但由于它们对分析物选择性较差而存在很 大的问题。例如，用微分脉冲伏安法检测葡萄糖浓度【9 】，以铂丝作为工作电极构成三电 极系统，检测的线性范围可达) u 1 2 5 m m o l l ，灵敏度约为6 0 n a ( m m o l l ) ，但生理物质的 干扰很大。用于获得高选择性的有效方法是根据分子识别原理，将生物活性成分( 酶、抗 体、细胞、组织或微器官) 和物理换能器联系起来，就可以充分利用酶的选择性和电化学 系统的多样性和简单性。 1 3 3 电化学葡萄糖生物传感器 1 3 3 1 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶具有相对低廉的价格和较高的稳定性，这使得葡萄糖葡萄糖氧化酶体 系为生物传感器领域中的方法探索提供了非常方便的模型。除少量报道利用葡萄糖脱氢 酶制各酶电极外，葡萄糖生物传感器都是以葡萄糖氧化酶作为生物识别成分。 葡萄糖氧化酶的来源很多，分子量为1 4 9 ，0 0 0 1 5 6 ，0 0 0 ，对b d 葡萄糖具有高度专一 的催化氧化作用。主要的两种来源是黑曲霉菌( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和灰绿青霉菌 ( p e n i e i l l i u mg l a u c u m ) 【1 0 】。 从青霉素的变体中可清楚的观察到葡萄糖氧化酶( 如图1 2 ) 结合在葡萄糖较深处 f a d 是此氧化反应的辅助因子，图中红色所指部位，葡萄糖结合的活性位点在f a d 的上 面，处于较深的立体结构中，图中星号位置所示。葡萄糖氧化酶像很多在细胞外发挥作 用的蛋白质一样，表面被糖链覆盖，图中用绿色表示糖链。 山东师范大学硕士学位论文 图1 2 葡萄糖氧化酶不意图 ( h 位p 1 l m v w b i o ! p a i s l e y a t u k m a r c o e n z y m e _ e l e c t r o d e ) 葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 分子包括两个肽链，1 主t 5 8 3 个氨基酸组成， 在肽链的前段，存在一个2 2 个氨基酸的前导序列。它的晶体结构 及氨基酸组成已经由x 光衍射和蛋白序列分析得到 j 。从组成上看，g o d q b 碳水化合物 的含量为1 6 ，由酶蛋白( 氨基酸部分) 和两个辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸( f l a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ，f a d ) 构成，f a d 是其活性中心，其结构如图i 3 。f a d 在酶促反应中的变 化方程式为【1 2 】： f a d f a d h 2 ( 1 - l a ) f a d h 24 h y d r o p e r o x yf a d f a d ( 1 - l b ) 山东师范大学硕士学位论文 图1 3f a d 结构及其分子式 o l t t p ：w w w b i o l p a i s t e y u w m a r c m e n z y m e _ e e c t r o d e 0 f a d 在g o d 中起到稳定酶三维结构的作用，同时，在总的酶促反应中传递氢原子。 g o d 分子的三维尺寸为6 0 a x5 2 a 7 7 a 。分子表面存在一个活性中心，其二维尺寸为 1 0 a 1 0 a 。等电点约为p h = 4 2 ，其活性保留的p h 范围为2 0 8 0 ，活性最高时p h i 6 o 6 5 。活性保留的温度范围为o 3 8 ，最佳温度范围为2 0 2 5 。 分子氧催化氧化d d 葡萄糖产生葡萄糖酸内酯和过氧化氢【13 1 ，它是g o d 这类氧化酶 典型的两步酶反应过程。这个过程包括酶引起的葡萄糖氧化，辅酶黄素腺嘌呤二核菅酸 ( f a d ) 还原成f a d h 2 ( 反应1 2 ) ，然后辅酶被分子氧氧化( 生物催化剂的再生) 并产 生过氧化氢( 反应1 3 ) ： p d g l u c o s e + g o d ( f a d ) 一g l u c o s e - 6 一l a c t o n e + g o d f f a d h 2 ) ( 卜2 ) g o d ( f a d h 2 ) + 0 2 一g o d ( f a d ) + h 2 0 2( 卜3 ) g l u c o n o 一5 一l a c t o n e + h 2 0 一g l u c o n i cacid(1-4) 反应( 1 - 2 ) 产生的葡萄糖酸内酯在水媒质中水解为葡萄糖酸( 1 - 4 ) ，所以总反应通常 表示为： p d g l u c o s e + 0 2 + h 2 0 一g l u c o r t i ca c i d + h 2 0 2( 卜5 ) 在g o d 传感器的设计上，大多数学者均采用电流计型设计相应的传感器，其基本构 成包括酶电极和a g a g c l 电极，二者分别为阳极和阴极。在g o d 存在下，葡萄糖氧化的 监测可通过反应物氧的消耗和葡萄糖酸及h 2 0 2 的生成来达到，相应的电极反应分别为： 山东师范大学硕士学位论文 氧电极：1 20 2 + 2 1 - 1 + + 2 e h 2 0标准电压：e = i 2 2 9 v 过氧化氢电极：2 h 2 0 2 一0 2 + 2 h + + 2 e 标准电压：e = 0 6 9 v 对酶反应生成的h 2 0 2 进行测定是较为成熟的方法。本文即采用过氧化氢电极，利用 高灵敏度的电流计来检测h 2 0 2 分解产生的电流，从而检测葡萄糖氧化反应的进行。 1 3 3 2 电流型葡萄糖生物传感器的发展历程 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 首先提出使用含酶的膜将葡萄糖转变为产物，使用p h 或氧电 极来检测【1 4 】1 。后来在1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 把含有葡萄糖氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶膜 固定到氧电极上制备了第一支葡萄糖传感器【l5 1 ，这一工作对生物分析来说具有里程碑意 义，在这以前的电化学传感器只能检测阴、阳离子，当与生物识别物质结合以后，许多 其他物质都可以检测了，而以前这些物质的检测均需经过漫长、繁琐的步骤。这样一种 新型的传感器一生物传感器就诞生了。随后许多其它的生物组分和换能器相继应用到生 物传感器中。1 9 7 7 年，k a r u b e 等利用微生物作为生物传感元件制备了第一支微生物传感 器【1 6 】。在八十年代，以抗体为识别已经元件的免役传感器开始使用。近些年来，d n a 、 r n a 、甚至人工识别元件都先后应用于生物传感器中。同时，换能器的质量也不断提高， 新型的光学检测转换元件如表面等离子体共振( s p r ) 等也广泛用于生物传感器的研制 1 1 7 。 本文主要研究酶电极的电流型生物传感器，该电极大致经历了三次革新：( 一) 第一 代电流型生物传感器 第一代电流型葡萄糖生物传感器也称作经典的电流型葡萄糖生物传感器，它对葡萄 糖响应的机理为：0 2 在葡萄糖氧化酶催化下氧化葡萄糖，生成h 2 0 2 ，反应方程式如( 1 2 ) 、 ( 1 3 ) 所示。反应原理如图1 4 1 s l 所示。 圈 刊l - - 嗣 图1 4 第一代葡萄糖生物传感器测量原理图 山东师范大学硕士学位论文 在上面的反应式中，c , o d ( f a d ) 是葡萄糖氧化酶的氧化态，g o d ( f a d h 2 ) 是葡萄糖 氧化酶的还原态。由于葡萄糖还原葡萄糖氧化酶氧化态g o d ( f a d ) 后，产生的还原态葡 萄糖氧化酶的氧化还原活性中一g , ( f a d h 2 ) 在酶分子内部，受蛋白质的包围，不易直接与常 规电极交换电子，因而也得不到可测量的电信号。基于上述反应原理，可以用两种方法f l 州 获得电信号： a ) 测量反应物0 2 的减少。葡萄糖将氧化态葡萄糖氧化酶c o d ( f a d ) 还原成还原态葡 萄糖氧化酶g o d ( f a d h 2 ) 后，溶液中的溶解氧再将g o d ( f a d h u ) 氧化成g o d ( f a d ) ，使得 葡萄糖氧化酶得以循环使用，而0 2 本身则被还原成h 2 0 2 ，所以可以用氧电极测量溶液中 溶解氧的变化，间接地测出试样中葡萄糖含量； b ) 测量反应产物h 2 0 2 的产生量。c l a r k 1 2 】采用两个金属铂( p t ) 圆盘电极做工作电极， 其中一个电极表面为酶膜所覆盖，通过差示电流，扣除空白并消除干扰后可以较准确地测 定h 2 0 2 的产生量，从而间接测定葡萄糖的含量。 生物传感器的缺点是大气中氧气分压的变化会导致溶液中溶解氧浓度的变化，从而 影响测定的准确性。另外，h 2 0 2 直接电化学测试的葡萄糖生物传感器对h 2 0 2 的氧化电位 较高，容易造成抗坏血酸等物质的干扰，因而它的选择性和灵敏度较差。 ( 二) 第二代电流型生物传感器 第二代电流型生物传感器即基于电子传递介体的生物传感器。对于葡萄糖氧化酶修 饰电极而言，电子传递介体( m 删) 的作用就是，氧化葡萄糖氧化酶还原态g o d ( f a d h 2 ) ， 使之再生后循环使用，同时m 。d 本身被还原，还原态m 。d 又在电极上被氧化，其响应第一步 反应如式( 1 2 ) ，接着会发生如下反应： g o d ( f a d h 2 ) + 2 m o x g o d ( f a d ) + 2 m 。d + 2 h +( 1 6 ) 2 m f c d - 2 e 一2 m 。( 在电极上)( 1 - 7 ) 测量原理如图1 5 i l s l 所示。在上述反应式中，m 。和m 。d 分别为电子传递介体的氧化态和还 原态。从上述原理可知，电子传递介体后，既不涉及0 2 ，也不涉及h 2 0 2 ，而是利用具有较低 氧化电位的m 删在电极上产生的氧化电流对葡萄糖进行测定，从而避免了其它电活性物 质的干扰，提高了测定的灵敏度和准确性。 山东师范大学硕士学位论文 图1 5 介体型葡萄糖生物传感器测量原理图 理想的电子媒介体应具备如下性质： ( a ) 可与酶的氧化还原辅基快速反应；( b ) 能吸附或滞留在电极表面；( c ) 呈现可逆的电 极反应动力学；( d ) 具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关；( e ) 氧化还原形式能稳定存在； ( f ) 对氧惰性或非反应活性；q ) 无毒或毒性很低。 目前，所采用的电子传递介体按其固定方法分为三种类型： - a ) 简单的电子传递介体。它们在应用中以单体的形式存在，包括氧化还原电对和有机 导体盐。如二茂铁及其衍生物2 0 , 2 ”、1 ，4 - 萘醌 2 2 1 、六氰高铁酸( 三价) 盐、苯醌及其衍生 物【2 3 之5 1 等。 b ) 与酶进行化学键合的电子传递介体。为了防止电子传递介体因溶解等原因而离开 电极表面，可以将电子传递介体与酶进行化学键合。键合后不仅可以更好地固定电子传递 介体，而且还可以使酶的氧化还原活性中心和电子传递介体更紧密接触，更有利于电子传 递。但是，酶经化学修饰后其催化活性降低，这又会使生物传感器的灵敏度降低。 c ) 与聚合物共价键合的电子传递介体。为了既能防止电子传递介体的流失，又能克服 介体与酶键合后使酶的活性降低的缺点，最近几年来，将电子传递介体与合适的聚合物键 合的研究取得很大的进展。比较典型的例子就是把二茂铁及其衍生物键合到硅氧烷聚合 物上伫6 之9 】，还可以将其键合到聚吡咯【3 0 】和聚吡啶【3 1 】等聚合物上。电子传递媒介体与聚合 物共价键合后，媒介体不溶于水，也不易扩散而离开电极表面，用它制成的生物传感器在 测定时，既不污染样品溶液，又可以提高生物传感器的稳定性，延长生物传感器的使用寿 命。 但此生物传感器的缺点也是很明显的，共价键合的电子介体使得酶活性降低，聚合 山东师范大学硕士学位论文 物的存在也阻碍了底物向电极表面扩散和产物向溶液的扩散，从而使得生物传感器的灵 敏度大大降低。 ( 三) 第三代电流型生物传感器 第三代电流型生物传感器是基于直接电子传递的电流型生物传感器，其测量原理图 如图1 6 所示。直接电子传递是前几年才取得成功的一种电子传递方式，其反应方程式如 下： g o d ( f a d ) + 3 - d g l u c o s e g l u c o s e 8 一l a e t o n e + g o d ( f a d h 2 ) ( 卜2 ) g o d ( f a d h 2 ) - - g o d ( f a d ) + 2 e 。 ( 1 8 ) 圈v 凰人 图1 6 第三代生物传感器测量原理图 电活性物质在电极上的反应速率显著依赖于电子隧道距离，随着电子隧道距离的增大反 应速率成指数下降，可用方程描述【3 2 】： k r = 1 0 1 3 p 一肛3 6 g 。+ 砷4 栅 ( 1 9 ) 其中，k e t 代表电子传递速率，b 对于给定的氧化还原体系为常数，d 表示电子供体与受 体之间的距离，即电子隧道距离，a g o 是驱动能， 代表m a r c u s 重组能。理论计算和实 验证明，d 的最大允许值约为1 t i n ，大于此值，电子传递速率慢至无法观测。 由于生物酶分子活性中心深埋在分子内部，使得酶与常规电极之间直接电子传递较 为困难。虽然基于直接电子传递的生物传感器已经研制成功，但是，所报道的生物传感器 都不太理想，存在许多问题，主要是电子传递速率不高，对于直接电子传递系统还有待进 一步研究。 1 3 4 酶的固定化研究 山东师范大学硕士学位论文 如前所述，酶敏感膜是生物传感器的基础和关键部分。为得到性能优良的酶传感器， 酶的固定化技术是研究和改进生物传感器性能的重要技术背景。酶的固定化是指利用化 学或物理的手段将游离的酶定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种 基本技术p 3 1 。与游离酶相比较，固定化酶具有一系列的优点：( 1 ) 热稳定性提高；( 2 ) 可重 复使用；( 3 ) 反应后不需要进行催化物质与反应物质的分离。 酶固定化的传统方法常见的有以下几种 3 4 1 ( 如图1 7 所示) ： 蓖彦酶餐 l ob础 j l j l j l 囫囫 囫回 广 厂 厂_ 吸附法共价键法交联法包埋法 图1 7 酶的固定方法示意图 2 s l 1 ) 吸附法：吸附法分为物理吸附法和化学吸附法。吸附法操作简单、易于在许多材 料上进行。它是一种较为温和的蛋白质固定方法，能有效地保留蛋白质活性。但这种方 法的酶负载量较低，这就意味着灵敏度较低，同时吸附一般是可逆过程，因而随着时间 的延长，解吸也会减少灵敏度。 2 ) 共价键合法：将酶与聚合物载体共价键结合的固定化方法。此法的优点是酶与载 体的结合较为牢固，酶不易脱落。可提供非常高的不可逆负载，而且这些键合的蛋白质 在通常的操作条件下比较稳定。通常用的载体有纤维素及其衍生物、多孔玻璃、石墨等。 由于反应条件较为剧烈，这种方法比其它的固定方法条件更恶劣，制备的酶电极灵敏度 较低，某些共价固定法稳定性也并不突出。这可能是由于非共价键合、基底降解、蛋白 质水解降解和键的溶解引起的1 3 5 l 。一些实验结果表明，非共价键结合蛋白的解吸是固定 化酶渗漏的最主要的原因【3 5 ，”。 3 ) 包埋法：蛋白质的包埋法是将酶包埋于格子( l a t t i c e ) 内，格子的结构可以防止 蛋白质渗出，但是底物仍能渗入到格子内与酶相接触。此方法较为简便，酶分子仅仅是 被包埋起来，而未参加化学反应。蛋白质不是经化学键，而是由膜保留下来。 山东师范大学硕士学位论文 m i c h a c l i s m e n t e n 动力学表明，信号与检测元件附近的活性酶的数量成正比。包埋法可以 保留大量的活性酶，因而电极的响应较高。但包埋膜通常很脆弱，易于破裂而使酶渗漏， 这样就会大幅度地减小装置的灵敏度和精确性。已见文献报道的高分子聚合物有琼脂 【3 刀、海藻酸钙【3 8 】、明胶【3 9 】、聚乙烯醇1 4 0 等。 4 ) 交联法：此法是借助双官能团试剂使蛋白质结合到惰性载体上或蛋白质分子彼此 交联成网状结构。双官能团试剂具有两个功能基团，能与蛋白质中赖氨酸的8 一氨基，n 一末端的a 一氨基、酪氨酸的酚基或半胱氨酸的- - s h 发生共价交联，可供交联的双功能 试剂有戊二醛、双偶氮苯、无水丁烯二酸一乙烯共聚物等。文献报道的用交联法制备的 酶膜有戊二醛、牛血清蛋白、g o d 酶膜4 “、戊二醛明胶酶膜 4 2 1 等。各种酶固定化方法的 比较如表1 2 所示。 为了平衡传统单一固定化方法使用中的优缺点，人们对联合固定法进行了较多研究。 研究出了包埋一交联法、吸附一交联法、包埋一吸附法等新方法。 表1 2 各种酶固定化方法的比较 吸附法 共价键合法 包埋法交联法 制备易 难 较难较难 结合程度较弱强 强强 活力回收较高低高中等 再生可能不可能 不可能不可能 费用低高低中等 专一性不变 不变 不变可变 除了上述几种常见的传统方法，近年来发展的酶固定化常用的方法还有以下几种： 1 ) 电化学聚合法：此方法是靠电荷平衡作用，在电聚合过程中酶作为掺杂阴离子， 与带正电荷的聚合物骨架相作用，把酶掺杂在聚合物膜中，而直接固定到电极表面上， 称为聚合物包埋技术。这种方法具有快速、一步且全电化学程序的特点，固定的酶分布 能立体可控，所形成的聚合物的膜厚和膜致密程度都可通过控制沉积过程的电荷等来控 制，尤其适用于生物传感器的微型化构造。但是用固定化方法固定的酶量可能比较小， 背景电流较大，且大量的酶被浪费在电聚合的溶液中。另外，基于该方法所构造的生物 传感器的稳定性和贮藏寿命有待于进一步的提高。目前最常用于固定化的聚合物