cDNA和基因组文库DNA的构建.ppt

第九章,cDNA文库和基因组文库构建,基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。基因文库基因组文库cDNA文库,一、载体的种类和特征：,二、cDNA文库的构建,分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与噬菌体臂的连接,cDNA文库的构建,mRNA反转录cDNA(互补DNA）第二条DNA链,1：反转录酶催化合成cDNA第一链,1.1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)RNA(1g/l)10l寡核苷酸引物(1g/l)1l1mol/LTris-HCl(pH8.0,37)2.5l1mol/LKCl3.5l250mmol/LMgCl22ldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10l0.1mol/LDTT2lRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48l1.2.当所有反应组在0混合后，取出2.5l反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1l-32PdCTP（400Ci/mmol,10mCi/ml）。,1.3.大规模和小规模反应管都在37温育1h。1.4.温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1l0.25mol/LEDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70温育10min，然后转移至冰上。1.5.测定0.5l小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。1.6.按下述方法计算cDNA第一链的合成量掺入的活度值(cpm)/总活度值66(g)=合成的cDNA第一链(g)1.7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。,2：cDNA第二链的合成,2.1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、10mMol/Lmgcl270ul2mM/LTris-Hcl(PH7.4)5ul10mCi/ml-32PdCTP（400Ci/mmol）10l1mol/L(NH4)2SO41.5lRNaseH(1000单位/ml)1l大肠杆菌DNA聚合酶I(10000单位/ml)4.5l温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16温育24h。2.2.温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：-NAD(50mmol/L)1l大肠杆菌DNA连接酶(10004000单位/ml)1l室温温育15min。,2.3.温育结束，加入1l含有4种dNTP的混合物和2lT4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。2.4.取出3l反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。2.5.将5l0.5mol/LEDTA(pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90lTE(pH7.6)溶液中。2.6.将下列试剂加到DNA溶液中：10T4多核苷酸激酶缓冲液10lT4多核苷酸激酶（3000单位/ml）1l室温温育15分钟。2.7.测定从上面步骤4取出的3l反应物中放射性活度，测定1l第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。,2.8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)*(66g-xg)=cDNA第二链合成量/gx表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的7080%2.9.用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。2.10.SephadexG-50用含有10mmol/LNaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。,2.11.加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最大速度4离心15分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。2.12.用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。2.13.小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。2.14.如果需要用EcoRI甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80lTE(pH7.6)溶液中。另外，如果要将cDNA直接与NotI或SalI接头或寡核苷酸衔接子相连，可将cDNA悬浮在29lTE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。,3：cDNA的甲基化,3.1.在cDNA样品中加入以下试剂：2mol/LTris-HCl(pH8.0)5l5mol/LNaCl2l0.5mol/LEDTA(pH8.0)2l20mmol/LS-腺苷甲硫氨酸1l加H2O至96l3.2.取出两小份样品（各2l）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和2号，置于冰上。3.3.在余下的反应混合液中加入2lEcoRI甲基化酶（80000单位/ml），保存在0直至步骤4完成。3.4.再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2l）至0.5ml微量离心管中，分别编为3号和4号。,3.5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入100ng质粒DNA或500ng的噬菌体DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。3.6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37温育1h。3.7.于68加热15min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。3.8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，混匀后贮存于-20直至获得小样反应结果。,3.9.按下述方法分析4个小样对照反应：a.在每一对照反应中分别加入：0.1mol/LMgCl22l10EcoRI缓冲液2l加H2O至20lb.在2号和4号反应管中分别加入20单位EcoRI。c.四个对照样品于37温育1h，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。3.10.微量离心机以最大速度离心15min(4)以回收沉淀cDNA。弃上清，加入200l70%乙醇洗涤沉淀，重复离心。3.11.用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将DNA溶于29lTE（pH8.0）。3.12.尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。,4：接头或衔接子的连接,cDNA末端的削平4.1.cDNA样品于68加热5min。4.2.将cDNA溶液冷却至37并加入下列试剂：5T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液10ldNTP溶液，每种5mmol/L5l加H2O至50l4.3.加入12单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml），37温育15min。4.4.加入1l0.5mol/LEDTA(pH8.0)，以终止反应。,4.5.用酚：氯仿抽提，再通过SephadexG-50离心柱层析，除去未掺入的dNTP。4.6.在柱流出液中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇，样品于4至少放置15min。4.7.在微量离心机上以最大速度离心15min(4)，回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后溶于13l的10mmol/LTris-HCl(pH8.0).接头-衔接子与cDNA的连接,4.8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：10T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液2l8001000ng的磷酸化接头或衔接子2lT4噬菌体DNA连接酶（105Weiss单位/ml）1l10mmol/LATP2l混匀后，在16温育812h。4.9.从反应液中吸出0.5l贮存于4，其余反应液于68加热15min以灭活连接酶。,5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA,SepharoseCL-4B柱的制备5.1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。5.2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1mol/LNaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。,5.3.在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的SepharoseCL-4B，直至填充基质几乎充满吸管为止。5.4.将几倍柱床体积的含0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。依据大小分离回收DNA,5.5.用巴斯德吸管吸去柱中SepharoseCL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50l或更小），放开止血钳，使cDNA进入凝胶。用50lTE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。5.6.用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管2滴，直至将所有放射性洗脱出柱为止。5.7.用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。5.8.从每一管中取出一小份，以末端标记的已知大小（0.2kb5kb）的DNA片断作标准参照物，通过1%琼脂凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。,5.9.电泳后将凝胶移至一张Whatman3MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器上干燥。干燥过程前20min至30min于50加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥12h.5.10.置-70加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。5.11.在cDNA长度500bp的收集管中，加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇。于4放置至少15min使cDNA沉淀，用微量离心机于4以12000g离心15min，以回收沉淀的cDNA。,5.12.将DNA溶于总体积为20l的10mmol/LTris-HCl(pH7.6)中。5.13.测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于噬菌体臂相连接的DNA总量。选定组分的总活度值(cpm)/掺入到第二链的活度值(cpm)*2xgcDNA第二链合成量=可用于连接的cDNA,6：cDNA与噬菌体臂的连接,6.1.按下述方法建立4组连接-包装反应：连接A(l)B(l)C(l)D(l)噬菌体DNA(0.5g/l)1.01.01.01.010T4DNA连接酶缓冲液1.01.01.01.0cDNA0ng5ng10ng50ngT4噬菌体DNA连接酶（105Weiss单位/ml）0.10.10.10.110mmol/LATP1.01.01.01.0加H2O至10101010连接混合物于16培育416h。剩余的cDNA储存于-20。6.2.按包装提取物厂商提供的方法，从每组连接反应物中取5l包装到噬菌体颗粒中。6.3.包装反应完成后，在各反应混合物中加入0.5mlSM培养基。,6.4.预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物，包装混合物做100倍稀释，各取10l和100l涂板，于37或42培养812小时。6.5.计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑，连接反应A不应产生重组噬菌斑，而连接反应B、C和D应产生数目递增的重组噬菌斑。6.6.根据重组噬菌斑的数目，计算cDNA的克隆效率。6.7.挑取12个重组噬菌体空斑，小规模培养裂解物并制备DNA，以供适当的限制性内切核酸酶消化。6.8.通过1%琼脂凝胶电泳分析cDNA插入物的大小，用长度范围500bp5kb的DNA片段作为分子质量参照。,注意要点,cDNA双链合成的注意要点:所有合成cDNA第一条链的方法都要依赖于的聚合酶（反转录酶）来催化反应，合成中有两个关键因素，一个是m模板，一个是反转录酶,保证获得足够数量和高质量的起始模板m的质量直接影响到cDNA合成的效率，完成和均一是衡量m质量的两个标准反转录和反转录效率是关键中的关键,cDNA文库构建后期的注意要点,反转录后至包装噬菌体外壳蛋白之前的诸多步骤操作按部就班，但其中的cDNA层析柱分级很重要注重载体与cDNA的连接效率、连接产物转染或转化大肠杆菌的效率,三、基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。,1.基因组文库构建步骤,1.1载体DNA的制备：高分子量的外源DNA100-150kb1.2载体DNA酶切反应（常用BamHI）1.3载体臂的纯化（蔗糖密度梯度离心）1.4载体脱磷处理（碱性磷酸酶）载体：l噬菌体：48.5kb,插入型(最多可容纳9kb)、取代型(可容纳38-51kb，最适19-20kb)，EMBL,Charon粘性质粒(Cosmid)：4-6kb,质粒+噬菌体的性质，可容纳大片段的外源基因，最多可容纳46kb。酵母人工染色体克隆体系（YAC，YeastArtificialChromosomeCloningSystem）插入大小2001000kb,1.5连接和包装：外源片段与两臂之间的比例，包装蛋白感染宿主菌：选择合适的宿主菌，LE392,NM538,NM539,KW251等1.6克隆文库的保存和扩增：完整性和代表性测滴度，要在106fu以上;保存，氯仿4，7%DMSO-70,人类染色体3X109，平均插入片段大小17kb,生物芯片,生物芯片简单地说，生物芯片就是在一块指甲大小的玻片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品，然后由一种仪器收集信号，用计算机分析数据结果。目前制备芯片的固相材料有玻片、硅片、金属片、尼龙膜等。目前较为常用的支持材料是玻片，因为玻片适合多种合成方法，而且在制备芯片前对玻片的预处理也相对简单易行。,生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类：即基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。,进入二十一世纪，随着生物技术的迅速发展，电子技术和生物技术相结合诞生了半导体芯片的兄弟生物芯片，这将给我们的生活带来一场深刻的革命。这种革命对于我国，乃至全世界的可持续发展都会起到不可估量的贡献。,1.生物芯片的种类通常的生物化学反应过程包括三步，即样品的制备，生化反应、结果的检测和分析。可将这三步不同步骤集成为不同用途的生物芯片，所以据此可将生物芯片分为不同的类型。例如用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。现在，已经有不少的研究人员试图将整个生化检测分析过程缩微到芯片上，形成所谓的“芯片实验室”(Lab-on-chip)。“芯片实验室”通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程，从而极大地缩短的检测和分析时间，节省了实验材料。,样品制备芯片的目的是将通常需要在实验室进行的多个操作步骤集成于微芯片上。目前，样品制备芯片主要通过升温、变压脉冲以及化学裂解等方式对细胞进行破碎，通过微滤器、介电电泳等手段实现生物大分子的分离。生化反应芯片即在芯片上完成生物化学反应。与传统生化反应过程的区别主要在于它可以高效、快速地完成生物化学反应。例如，在芯片上进行PCR反应，可以节约实验试剂，提高反应速度，并可完成多个片段的扩增反应。当前，由于检测和分析的灵敏度所限，通常在对微量核酸样品进行检测时必需事先对其进行一定程度的扩增。所以用于PCR的芯片无疑为快速大量扩增样品多个DNA片段提供了有力的工具。,检测芯片顾名思义是用来检测生物样品的。例如用毛细管电泳芯片进行DNA突变的检测，用于表达谱检测、突变分析、多态性测定的DNA微点阵芯片（也称DNA芯片、基因芯片），用于大量不同蛋白检测和表位分析的蛋白或多肽微点阵芯片（也称蛋白或多肽芯片）。,芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。现在，已经有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的芯片。例如可以将样品的制备和PCR扩增反应同时完成于一块小小的芯片之上。再如GeneLogic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA，并对其进行荧光标记，然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用其自己开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积，所以可以灵敏地检测到稀有基因的变化。同时，由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用，所以可以加速杂交反应，缩短测试时间，从而降低了测试成本。综观生物芯片的发展，检测用生物芯片的发展最为迅猛。目前，检测用生物芯片主要为微点阵技术。,cDNAArray和MicroArraycDNAArray即cDNA列阵，或译作矩阵，由排列在96孔板大小的少到几十个，多至上万个不同基因的cDNA点组成。MicroArray被译作“基因芯片”，或译作“微矩阵”，这个矩阵由点在大如载玻片，小如指甲大小面积的固定介质表面的上百至数千个特定的基因组成。是cDNAArray的微型化。,MicroArray的工作原理是将欲研究细胞组织的RNA通过不同的方式转录成cDNA，转录过程中或之后给予荧光等标记，制成探针，然后在严格的条件下使该探针与微矩阵上的基因杂交，杂交后，把未杂交的基因洗脱，在一定的条件下，观察杂交结果，以了解某特定组织中基因转录的多寡和特征。如果两个组织的RNA用不同发光色彩的荧光标记，同时进行杂交，由于两个组织杂交后所激发的荧光色彩不同，微矩阵上与甲组织特有探针结合则产生甲探针的光色，与乙组织特有探针结合则产生乙探针的光色，两种探针同时结合则产生相兼色。这样在一块基因芯片上就可以方便、迅速、大规模地观察两个不同组织基因转录的异同。,在基因芯片问世的短短几年来，一些改进型的基因芯片技术陆续问世，并迅速形成产品。比如GeneChip。其特点为：1）容量大，每个芯片上可以达39000个基因，因此，单位时间内识别的基因多且快；2）在基因矩阵上每个点由上下两排更小的矩阵组成，每排由16-20个与某一mRNA不同区域对应的25个寡核苷酸组成。上下两行中，上行为正常基因序列，下行为中间有点突变的序列。这样在相同严格的杂交和洗脱条件下，上行基因16-20个点应该全部阳性反应，而下行基因因含有点突变，退火结合后不够稳定，会被洗脱。因而这样仅上行呈阳性的杂交才算有效。所以在避免假阳性方面具有别的芯片所无法比拟的优势。还如discoveryARRAY。该芯片把RFDD-PCR（限制性片段差异展示PCR）技术与MicroArray技术结合在一道。由于mRNA拷贝为PCR所放大，极大丰富地扩增了一些微量转录的mRNA，使之得以清晰地反映在Array上。我国也开始了基因芯片的研制和开发。,通过对现状的回顾，可以看出，当前的基因芯片技术还有以下一些问题：1要求专门设备，国内尚未普及。2研究成本高。3不是所有常用生物均有全RNA组芯片。4实验数据庞大。5大量的基因功能还不明朗。,虽然如此，基因芯片技术已展现出绚丽的前景：1已经出品了人类全套基因组芯片，使基因芯片完全实用。2当基因芯片生产技术趋于成熟，开始象轿车、家用电器生产的批量化、规模化，已经实现降低生产成本，降低售价，便于普及。3一旦类似高效的蛋白芯片技术的解决，与基因芯片的配套使用，将会对生命科学研究取得质的突破。4生物计算技术的发展，芯片结果自动化分析程度增加，将使人类更好、更快地驾驭基因芯片的海量信息。5不同基因功能研究的积累，以及基因功能研究技术的发展与普及，使基因芯片研究的后续工作得以有效的开展，基因芯片的学术价值将得到革命性的发展。6互联网海量生物信息开放和不断丰富，以及有关计算机辅助系统的发展与升级，使芯片结果的分析与深入研究空前的便利。,与基因芯片原理类似的有cDNAArray。CLONTECHLaboratories公司的AtlascDNAExpressionArrays是其代表。其cDNAArray的矩阵点由肉眼可见大小的cDNA点组成，点于96孔板大小的硝酸纤维素膜上。工作原理是，抽提组织的总RNA或进一步分离mRNA，用反转录酶和同位素反转录mRNA成cDNA探针，与膜上的cDNA杂交，放射自显影。不同的组织分别用一张膜。其放射自显影结果可以用肉眼识别。该公司还配套有分析软件，实验结果扫描后可以通过软件比较不同组织基因转录的差异。因此该Array的优点为1）不要求专用仪器设备，一般实验室均可以操作。2）实验结果肉眼可以识别，以便调整曝光时间，以获取最佳实验结果。3）配套有分析软件，可以借助普通扫描仪和计算机分析实验结果。,但是我们使用下来有以下一些缺点：1）一般组织绝大部分的RNA丰度不够，导致大多数杂交的重复性差。由此造成定量的困难和错误，给后续研究带来困难。2）制膜的技术性问题。比如小鼠Array的杂交背景高，影响到实验结果的分析。3）软件在消除背景方面的智能化技术尚不成熟，影响到结果的分析。,4）Array的基因数量少，约1200个。远远不能与一般组织大量转录的mRNA匹配。与此技术类似的Array，有单病种Array（如前面所介绍，也可以是MicroArray），但是制作在硝酸纤维膜上的Array以其价廉方便似乎更有优势。其原理是，通过对某一疾病基因谱改变的了解，依据若干不同基因谱变化的特征，设计出针对单病种的Array。这些Array上所含的基因有限，包含了某一病种不同基因谱的关键基因，因而成本低，适用于临床的辅助诊断。,中科院上海细胞研究所德国马普学会联合实验室曾开发cDNAArray，在96孔板大小的纤维素膜上点制成含16000个左右基因的Array。信息量大。由于基因点小而密，肉眼无法识别，要求专门设备阅读和分析。考虑到基因芯片要求有特殊的设备和专门的技术培训，在一些条件比较差的地区开展不易；而cDNAArray实验技术与So