（生物化学与分子生物学专业论文）基于纳米微粒及hpa的免疫检测技术的研究.pdf

yi ：，：文 分类号q 7单位代码：1 0 0 0 5 学号：$ 2 0 0 7 1 5 0 0 3 密级：公开 北京工业大学硕士学位论文 题 目：基王绝苤邀蕉区塾坠鲍鱼瘗捡型堇苤的巫塞 英文并列 题目： ! 丛丛! 丛q & ￥! 垦h 丛! q 坠星基垦苎e h 壁曼e 坠盥盥q b 至! g 坠星墨 丛坠丛y 旦b l 坠l 至坠至! q 毯 p r o t e c t i o na s s a y 论文报告提交日期： 2 q ! q 生三日l q 臼 学位授予【j 期： 授下单位名称和地址：j 量宸工业人学北京市朝i ；f 1 区，f 乐园l o o 号 35川5 88胁7，ii0l删y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 强风 导师签名： 豸弛 同期： 摘要 摘要 抗原检测在微生物感染和重大疾病的诊断、疾病进展的监测、药物疗效观察 和耐药性监测以及食品卫生等领域中至关重要。荧光标记、酶标记和放射性同位 素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广 的常规抗原检测手段。但在微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够 的灵敏性。放射性同位素标记技术在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防 护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。 本课题研究一种免疫检测方法，用纳米金珠探针检测抗原，将免疫信号转化 成核酸信号，然后通过吖啶酯杂交保护实验检测d n a 的量从而获知抗原的水平。 本课题完成了以下研究内容： 1 制备了纳米金磁探针。纳米金磁微粒具有超顺磁性和金表面生物分子固 定化的性能，操作简单，而且，可以很好地解决生物大分子在微流控芯片微通道 中的操纵。每个纳米金磁可包被抗体2 3 个。根据e l i s a 的检测结果，包被到 纳米金磁上的抗体保留了免疫活性，为后续的抗原检测做好了准备。 2 制各了纳米金珠探针。利用纳米金珠标记抗体和报告d n a ，可以将免疫 信号转换为核酸分子信号，对提高检测的灵敏度起到了十分重要的作用。纳米金 珠包被抗体的蛋白用量为3 p “，即每个纳米金珠表面包被抗体1 2 个。免疫斑 点实验证明，经抗体和d n a 修饰后的纳米金珠，其表面抗体没有失去活性。 3 应用吖啶酯杂交保护实验( h p a ) 检测报告d n a 。应用化学发光标记物 吖啶酯( a e ) 标记寡核苷酸探针与基因转录产物靶序列杂交，并通过碱性水解 试剂消除未杂交探针的化学发光能力来达到分离的效果，通过碱性水解的方法， 6 分钟可以将背景信号降低3 个数量级，无需转移分离，简化了操作步骤，可以 检测达到a m o l 级寡核苷酸。基于纳米颗粒和吖啶酯杂交保护实验的抗原检测方 法，可以检测到3 2 0 p g m l 羊抗鼠i g g h r p 抗原。 本课题所研究的基于纳米微粒系统及吖啶酯杂交保护实验的抗原检测方法， 具有操作简单，便于自动化等优势，同时该方法也可用于其他疾病的免疫检测。 本课题制备的纳米金磁探针和纳米金珠探针为芯片实验室的建立奠定了基础。 关键词：免疫分析；纳米金磁；纳米会珠；杂交保护实验 北京工业大学理学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t d e t e c t i o no fa n t i g e ni s v e r yi m p o r t a n t i nt h ea l g ao fm i c r o b i a li n f e c t i o n , i m m u n o d i a g n o s i s ，d r u ge f f i c a c y , d r u gr e s i s t a n c em o n i t o r i n ga n df o o dh y g i e n e t h e t e c h n i q u eo fl a b e l i n g a n t i b o d i e sw i t hf l u o r e s c e n tm a r k e r s ，e n z y m em a r k e r so r r a d i o i s o t o p ei sw i d e l yu s e da so n eo ft h em o s tc o n v e n t i o n a lm e a n so fa n t i g e n d e t e c t i o n h o w e v e r , i nl o wa m o u n to fa n t i g e n ，t h ef l u o r e s c e n tl a b e l i n ga n de n z y m e m a r k e r sl a c ka d e q u a t es e n s i t i v i t y r a d i o i s o t o p el a b e l i n gt e c h n i q u eh a si t sw i d e a p p l i c a t i o nl i m i t si np r a c t i c ed u et ot h en e e do fs p e c i a le q u i p m e n ta n ds e c u r i t y w eh e r eh a v er e p o r t e dai m m u n o a s s a ym e t h o d ，w ed e t e c ta n t i g e nu s i n gg o l d n a n o p a r t i c l ep r o b e s ，t h ei n l i l l u n es i g n a lc a nb ec o n v e r t e dt on u c l e i ca c i dm o l e c u l e s s i g n a l s ，t h e nt h et a r g e tp r o t e i ni sd e t e c t e db yi d e n t i f y i n gt h eo l i g o n u c l e o t i d es e q u e n c e u s i n gh y b r i d i z a t i o np r o t e c t i o na s s a y w eh a v ec o m p l e t e dt h ef o l l o w i n gj o b s ： 1 p r e p a r a t i o no fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l ep r o b e s m a g n e t i cm i c r o p a r t i c l e sh a v ea s u p e r - p a r a m a g n e t i ca n ds l l l f a c ep r o p e r t i e so fi m m o b i l i z e db i o m o l e c u l e s ，s i m p l e o p e r a t i o n ，t h u sw ec a n s o l v et h ep r o b l e mo fc o n t r o l l i n gb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e si n m i c r o f l u i d i cc h i pm i c r o c h a n n e l s e a c hm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sc a nb ec o a t e dw i t h a n t i b o d y2 - 3 a c c o r d i n gt oe l i s at e s tr e s u l t s ，a n t i b o d y - c o a t e dw i t ht h em a g n e t i c n a n o p a r t i c l e si sn ol o s so fi m m u n o l o g i c a la c t i v i t y 2 p r e p a r a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l ep r o b e s u s i n gg o l dn a n o p a r t i c l e sl a b e l e d a n t i b o d i e sa n dr e p o r t i n gd n a ，t h ei m m u n es i g n a lc a nb ec o n v e r t e dt on u c l e i ca c i d m o l e c u l e ss i g n a l s ，w h i c hp l a y sav e r yi m p o r t a n tr o l e f o ri m p r o v i n gt h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t y t h ea m o u n to fa n t i b o d yc o a t e dw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e si s3 1 x g m 1 f o rt h e a n t i b o d i e sa n dd n am o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e s ，i m m u n o b l o te x p e r i m e n t ss h o w e d t h a ti m m u n o l o g i c aa c t i v i t yo fa n t i b o d i e sd i dn o tl o s e 3 w eu s eah o m o g e n e o u sh y b r i d i z a t i o na s s a yf o r m a tf o rd e t e c t i n gd n at a r g e t s e q u e n c e s w e u s ea h o m o g e n e o u sh y b r i d i z a t i o np r o t e c t i o na s s a yf o r m a tf o rd e t e c t i n g d n at a r g e ts e q u e n c e s t h i sm e t h o di sb a s e do ns e l e c t i v ec h e m i c a ld e g r a d a t i o no ft h e a c r i d u n i u me s t e rl a b e ls u c ht h a tc h e m i l u m i n e s c e n c ea s s o c i a t e dw i t hu n h y b i r i d i z e d p r o b ei sr a p i d l yl o s t ，w h e r e a sc h e m i l u m i n e s c e n c ea s s o c i a t e dw i t hh y b r i d i z e dp r o b ei s m i n i m a l l ya f f e c t e d b ya l k a l i n eh y d r o l y s i sm e t h o d ，b a c k g r o u n ds i g n a lc a n b er e d u c e d 3o r d e r so fm a g n i t u d ei ns i xm i n u t e s n ot r a n s f e rs e p a r a t i o ns i m p l i f i e st h eo p e r a t i o n ， a sl o wa s1a m o lc a nb ed e t e c t e d b a s e do nn a n o p a r t i c l e sa n dh y b r i d i z a t i o np r o t e c t i o n e x p e r i m e n to fa n t i g e nd e t e c t i o n ，3 2 0 p g m la n t i g e nc a n b ed e t e c t e d t h es u b j e c tb a s e do nn a n o p a r t i c l e sa n da c r i d i n ee s t e rh y b r i d i z a t i o na s s a yf o r m a t ， i ss i m p l e ，e a s ya u t o m a t i o n ，w h i l et h em e t h o dc a na l s ob eu s e df o r o t h e r d i s e a s e s m a g n e t i cn a n o p a r t i c l ep r o b e sa n dg o l dn a n o p a r t i c l ep r o b e sa r eu s e f u l lf o rt h e e s t a b l i s h m e n to fl a b o r a t o r i e sf o rt h ec h i p s k e yw o r d s ：i m m u n o a s s a y ；m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ；h y b r i d i z a t i o n p r o t e c t i o na s s a y 北京工业大学理学硕士学位论文 目录 目录 摘要1 a b s t r a c t iii 第1 章绪论1 1 1纳米颗粒在生物检测中的研究进展1 1 1 1 纳米金珠2 1 1 2 纳米磁性颗粒5 1 2化学发光免疫分析的发展7 1 3本课题的研究内容及意义1 0 第2 章实验材料与方法13 2 1 实验材料13 2 2 实验方法16 2 2 1 纳米金磁探针的制备1 6 2 2 2 纳米金珠探针的制备1 9 2 2 3 应用h p a 检测报告d n a 2 2 2 3 4 抗原的检测2 4 第3 章纳米金磁探针的制备2 7 3 1 金磁粒子数的计算2 7 3 2 纳米金磁探针的制备与偶联容量的检测2 7 3 3 纳米金磁包被抗体的检测2 9 3 4 本章小结。3 0 第4 章纳米金珠探针的制备3 1 4 1 纳米金珠包被抗体和d n a 31 4 2 包被抗体浓度的确定3 2 4 3 纳米金表面抗体的检测3 4 4 4 纳米金珠表面d n a 的检测3 4 4 5 本章小结。3 5 第5 章应用h p a 检测报告d n a 3 7 5 1h p a 技术的研究3 7 5 2h p a 的分析灵敏度3 7 5 3h p a 的条件研究4 0 5 4 抗原的检测4 0 5 5 本章小结4 0 结论4 1 北京工业大学理学硕士学位论文 参考文献4 3 攻读硕士学位期间所发表的学术论文4 7 致谢4 9 第1 章绪论 皇曼鼍曼量曼皇曼曼! 曼曼曼曼蔓曼皇曼曼曼曼曼鼍曼舅t 一i ；i l l 皇曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼蔓曼曼曼鼍曼皇皇曼曼量曼曼鼍曼曼 第1 章绪论 免疫学检测在食品安全、环境卫生及临床检测领域中应用十分广泛。免疫学 检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的 细胞因子的实验方法，其基本原理是抗原抗体反应。由于具有常规理化分析技术 无可比拟的选择性和很高的灵敏度，非常适用于复杂基质中痕量组分的分析，如 动物组织中药物残留的分离与检测。但近年来，药物的种类和应用规模剧增，化 学结构日益复杂，并日趋高效或低剂量化，特别是人们对长期摄入低水平药物及 其他化学污染物所致的各种慢性和远期效应的关注，以及国际间贸易等原因，使 分析对象、样本数量和测定难度大大增加。因此，发展简便、快速和灵敏的分析 技术越来越迫切。 环境监测是测定代表环境质量的各种指标数据的过程。它包括环境分析、物 理测定和生物监测。所谓生物监测就是利用生物对环境污染所发生的各种信息作 为判断环境污染状况的种手段。生物长期生活在自然界中，不仅可反映多种因 子污染的综合效应，而且还能反映环境污染的历史状况。故生物监测可弥补物理、 化学分析测试的不足，特别是微生物具有得天独厚的特点，与环境关系极为密切。 微生物的检测包括多种方法，免疫学检测就是其中的一种。但随着工业高度发展， 人口急剧增长，环境污染同益严重，人类环境保护意识在逐步增强，就迫切需要 我们研究和采用一些新技术、新方法，加强对环境的监测。 在对微生物抗生素日益耐药的时代，为了对疾病进行准确的识别和诊断，并 随之及时交付处理，利用微生物病原体本身独特的d n a 和蛋白质指纹图谱来对 其进行检测是最为重要的。因此，为了对人类疾病进行预防、诊断和治疗，我们 需要对复杂的生物过程进行深入的研究，而这一研究依赖于人们对复杂体系中的 多种目标分子进行灵敏的、高选择性检测的能力。 荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化 学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度。 但在微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏性。放射性同位 素标记技术在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护，因此限制了它在实际 过程中的广泛应用。 本课题拟集纳米颗粒系统与免疫技术为一体，研究一种免疫检测方法。下面 将对纳米颗粒在医学检测领域中的应用以及化学发光技术等研究进展做些综述。 1 1纳米颗粒在生物检测中的研究进展 本节仅就其中运用在本课题中的纳米颗粒研究进展做些综述。 北京工业大学理学硕士学位论文 纳米材料是2 0 世纪8 0 年代刚刚发展起来的新材料，从其一诞生，就因广泛 的商业前景而被美国材料学会誉为“2 1 世纪最有前途的材料 【l 】。纳米材料由 于其极大的比表面而产生一系列效应：小尺寸效应、界面效应、量子效应和量子 隧道效应等，使其具有许多新异的特性。纳米金是近些年来炙手可热的纳米材料， 它具有优良的电学、光学【2 1 、磁学上的特殊性质，将其结合到生物分子( 如蛋白质 【3 】、核酸f 4 】、肽) 表面上，产生的生物共扼物种由于尺寸和生物大分子相似，很适 合用在分子识别和标记、d n a 传感器【5 】和生物芯片【6 j 中，因而具有广阔的应用前 景 7 - 9 1 。 1 1 1 纳米金珠 纳米金珠由氯金酸通过化学还原法制成，也称胶体金，是指分散相粒子直径 在1 1 5 0 n m 之间的金溶胶。由于电子密度高，最早用于电镜检测，进行抗原的准 确定位。当金颗粒的尺寸降低到纳米量级时，表现出独特的光学和电学性质。纳 米金的颜色依直径大小而呈红色至紫色，其鲜明的色彩在4 0 0 年前就引起了科学 家的关注，逐渐地在生物学领域将其作为微观物质的标记物【l 0 1 。 纳米金珠标记蛋白质的原理一般认为是由于蛋白质溶液在其p h 值等于或 稍高于该蛋白质的等电点时呈现电中性。此时蛋白质分子与纳米金珠相互间的静 电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易 吸附于金颗粒表面。纳米金珠对蛋白质等生物大分子有很强的吸附作用，而且这 种吸附作用不会使其变性【l l 1 2 】。d n a 在纳米金珠上的固定是纳米金珠d n a 探 针的制备中的关键步骤，常用的方法有共价键合法、生物素亲和素法、自组装 法等。基于分子的自组装作用，d n a 在纳米金珠上的固定主要利用a u s 键：将 d n a 链一端巯基化，在通过s h 在金表面的自组装作用制备纳米金珠d n a 探针 【1 3 ，1 4 】 o 1 蛋白质标记的纳米金珠的发展与应用 纳米金珠作为免疫电镜的标记物始于1 9 7 1 年，f a u l k 等首次将这种免疫纳米 金用于沙门菌表面抗原的检测。纳米金珠球形的外观和它较高的电子密度可以在 电镜图谱中与抗体的图像分辨开来，所以胶体金最初的和当今最为广泛的应用是 在电子显微学中，尤其是在扫描电镜的应用最为广泛。胶体金颗粒在电镜下大小 颗粒清晰可辨，且不影响对原有超微结构的观察。通过计量被检部分的纳米金珠， 可以对被检抗原或抗体进行免疫定量研究。采用不同直径的会标抗体进行免疫多 重标记染色，能够在一张电镜图片上同时显示多种被检物质的超微结构。 如今实验室广泛应用的胶体金免疫渗透法和胶体金免疫层析法都是以免疫 胶体金为检测基础的。胶体金免疫渗透法始于1 9 8 5 年，美国的v a l k i r s 等运用斑 第1 章绪论 曼i i：- - ：_ 1 , i i i 皇曼曼曼皇曼皇曼蔓舅舅鼍曼皇曼曼 点免疫酶渗透法检测了人绒毛促性腺激素。胶体金免疫层析法始于1 9 9 0 年， o s k i o w i c z 等人用硒作为标记物建立了免疫层析法，其后一般都采用胶体金实验。 这两种方法的基本原理都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检 标本后，经毛细管作用或渗透作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗 原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。这两种方法是目前卫生检验中 主要应用的免疫胶体金快速诊断技术。 免疫胶体金技术在医学检验中的应用主要是应用免疫胶体金试剂条进行快 速定性检测，由于该方法使用简单快速，尤其适合基层卫生检验工作。 2 寡核苷酸标记的纳米金珠的发展和应用 a 基于纳米金珠光学性质的检测 1 9 9 6 年，m i r k i n 1 5 】等利用寡核苷酸功能化的纳米金珠具有随距离变化的光 学性质用于d n a 检测。两种寡核苷酸功能化的纳米金珠表面分别带有序列不同 且不互补的单链d n a ，分别与目标d n a 的两端杂交，可以形成一个由红色到紫 色的变化。纳米金珠在不同的聚集状态呈现不同颜色改变，可用比色仪测定。 e l g h a n i a n 1 6 】等人对这种新的纳米金珠探针进行深入的研究，在2 6 0 n t o 处测定吸 光度，寡核苷酸标记的纳米金珠探针从吸光度开始增加到最大值只用了4 。c ， 而对于对照组未包被在纳米金珠上的双链d n a 从吸光度开始增加到最大值用了 1 2 。c 。相应的，在相同的温度下，寡核苷酸标记的纳米金珠探针在6 2 0 n m 和 7 0 0 n m 处的吸光度值陡然下降。由于d n a 在6 2 0 n m 和7 0 0 n m 处没有光吸收， 所以这个变化是由纳米金珠本身的光学性质导致的。表明寡核苷酸标记的纳米金 珠探针与互补的d n a 杂交后，具有很窄的溶解温度。s t o r h o t 簪1 1 7 】等人利用纳米金 珠探针的这个特点设计了一系列实验，当寡核苷酸标记的纳米金珠探针与具有单 个碱基缺陷的d n a 序列杂交时，它的溶解曲线会发生变化。表明寡核苷酸标记 的纳米金珠探针能检测出具有单个碱基缺陷的d n a 序列，而且与碱基缺陷的位 置无关。这种利用颜色的变化来进行检测的方法具有简单，廉价的特点，而且基 于这种窄的溶解温度使得检测方法比传统的荧光检测方法具有高的选择性。 b 对d n a 芯片的检测 2 0 0 0 年，t a t o n 6 】等人利用寡核苷酸标记的纳米金珠探针对d n a 芯片进行了 检测。基于夹心法，将d n a “俘获”序列以微阵列的形式共价结合在玻璃片上， 用于识别目标d n a 序列，目标d n a 序列的另一端则与寡核苷酸标记的纳米金 珠探针结合。利用寡核苷酸标记的纳米金珠探针与目标d n a 序列杂交，具有窄 的溶解温度这一特性，这种方法的选择性比传统的荧光标记法提高了3 倍。将银 显影液加到芯片表面，由于纳米金珠探针可以促进银离子还原为银金属，在金颗 粒表面形成色泽更深的黑色层，信号得以放大，得到的结果可以用肉眼直接观测， 并且用普通的平板扫描仪可以记录。这种检测方法在未优化的情况下，灵敏度可 北京工业大学理学硕士学位论文 达到5 0 f m ，比传统的荧光标记法提高了1 0 0 倍。s t o r h o 傅1 8 】等人利用这种方法， 与c y 3 标记的荧光检测方法相比较，灵敏度提高了1 0 0 0 倍。重要的是，在d n a 不需要扩增的基础上，能够检测到2 0 0 f m 的人类基因组d n a ，并且降低了实验 的复杂性。这意味着寡核苷酸标记的纳米金珠探针可以应用于疾病诊断，而且快 速，成本低。 2 0 0 2 年八月，c a o t 8 】等人将拉曼染料和寡核苷酸标记在纳米金珠上，建立了 一种可以在芯片上进行多路传输的检测方法。通过采用不同的拉曼染料和寡核苷 酸对纳米金功能化，设计合成了6 种d n a 探针和2 种r n a 探针，根据每种拉 曼染料的不同拉曼光谱分析可以灵敏的、快速的、高选择性的检测不同的目标。 与传统的荧光标记检测方法相比，具有更高的灵敏度和选择性。而且可获得的拉 曼标记物的数量比荧光标记物的多。更有力的证明了纳米金颗粒有可能成为生物 诊断中重要的标记技术。 2 0 0 3 年，m i r k i n 1 9 】等人利用纳米微粒在以d n a 片段或抗体为组装分子的引 导下形成超分子结构的特点，建立了用纳米微粒标记寡核苷酸探针检测特定蛋白 或核酸的新方法。这种方法包括了纳米技术，聚合酶链式反应( p c r ) ，以及传统 的免疫检测方法。他们首先在磁性微球表面联接具有生物活性的单克隆抗体，另 外制备一无磁性纳米金珠用来联接多克隆抗体和通用的d n a 片断，然后通过双 抗体夹心法用纳米d n a 探针检测抗原。通过对纳米金珠探针上的d n a 片断进 行p c r 扩增，进行信号放大，通过检测d n a 的量，从而获知超微量蛋白质水平， 使现行的抗原检测方法的灵敏度大大提高。这种方法被称为生物条码检测方法 ( b c a ) 2 0 , 2 1 】，比传统的检测方法提高了6 个数量级。 g e o r g a n o p o u l o u 2 2 】等人利用b c a 的方法检测了脑脊液标记物，克服了传统 方法在早期诊断灵敏度不高的缺点，为纳米金标记的检测方法应用于临床诊断奠 定了基础。s t o e v a 2 3 】等人利用基于不同报告d n a 的序列不同，检测了血清中的 三种蛋白质，进一步证明了b c a 方法的高灵敏度和高选择性。 2 0 0 4 年，n a m t 2 4 】等用b c a 的方法检测了d n a ，达到了像p c r 一样的灵敏 度。他们将与目标d n a 两端互补的寡核苷酸序列分别标记到纳米磁珠和纳米金 珠上，将大量报告d n a 包被在纳米金珠上，利用纳米磁珠易于分离，纳米金珠 将信号放大，再应用基于芯片的方法来检测报告d n a ，通过银染增强，其灵敏 度达到了1 0 之m 。 c 电学检测 2 0 0 2 年2 月，p a r k z s 】等人基于寡核苷酸标记的纳米金珠探针对d n a 芯片的 检测方法，利用寡核苷酸标记的纳米金珠探针与目标d n a 序列杂交时，会引起 电导率的变化的特点，建立了通过电信号的强弱检测d n a 的方法。在具有微电 极缝隙的芯片中，有目标序列存在时，俘获序列目标序列纳米金珠探针在缝隙 第1 章绪论 中进行杂交，产生银显影，就会导致缝隙内的电阻降低，电导率增加，随之产生 电信号。重要的是，与采用严格的热洗涤相比，在室温下用不同的盐浓度的缓冲 液进行洗涤对去除错配的目标效果更好。完全互补所产生的信号与单个碱基错配 的信号比达到1 0 0 0 0 0 ：1 ，前者的信号比是1 l ：1 。而且，不需要严格控制温度，降 低了对仪器的要求，有利于实验的推广。 d 芯片中的生物检测 2 0 0 6 年，g o l u c h 2 6 】等人将b c a 的方法应用到芯片上进行生物检测。由于 b c a 是不用经过p c r 等方法放大，就能检测到1 0 以8 m o l 蛋白的方法。利用这种 高灵敏度可以缩小反应体系，在很少量的样品中就能够进行微量检测。并且由于 这种方法的高选择性，减少了操作的复杂性。应用这种芯片检测p s a ，灵敏度达 到了5 0 0 a m ，比传统的e l i s a 方法提高了四倍。 纳米金珠探针用于生物检测具有高灵敏度和高选择性的特点，而且能够同时 进行多种目标分子的检测，重要的是，能够在微流控芯片上完成检测，这就有可 能实现生物检测的高通量，高自动化。但这些研究只停留在实验室阶段，对于纳 米金的生物生物安全性，以及临床诊断上还有待进一步完善。目前，已经开始将 生物条码检测方法应用于临床检测p s a 实验，改写了传统方法无法检测p s a 的 历史【27 。因此，有理由相信，纳米金珠探针将成为早期诊断的有力工具之一。 1 1 2 纳米磁性颗粒 纳米免疫磁性颗粒是以磁性材料( 主要为f e 3 0 4 、y2 f e 2 0 3 等) 为固相载体， 在其表面引入活性基团( 氨基、羧基、羟基、醛基等) ，通过偶联反应将抗体、 酶等物质结合在载体上，既保留了大分子的生物学活性，在外加磁场作用下又可 定向移动，在细胞、蛋白质、核酸的分离；微生物检测、肿瘤诊断、药物靶向治 疗中发挥了重大作用。由于这种磁性颗粒处于纳米尺度，扩展了其应用领域。 1 免疫磁性微球 免疫磁性微球( i m m u n o m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ，i m m s ) ，是表面结合有单克 隆抗体的磁性微球。微球与抗体的连接有吸附结合与共价结合两种形式，吸附结 合依靠微球表面对抗体的非特异吸附力，而共价结合依靠微球表面的活性基团与 抗体共价反应。吸附结合只有在微球具有非常大的表面积时才有可能比较牢固， 这样，对于表面比较平整的微球，就要通过对其表面进行处理来提高它的抗体结 合力，以保证i m m s 表面有足够的抗体。经过表面处理的磁性微球与单抗在适当 的缓冲液中培养，抗体通过物理吸附很快地与磁性微球结合，如果微球表面有活 性基团，则接下来就会通过较慢的化学反应共价结合在磁性微球的表面【2 引。 2 免疫磁性微球的应用 北京工业大学理学硕士学位论文 a 细胞分离 免疫磁性微球主要用于细胞分离等方面。i m m 与细胞的结合可以采取两种方 法，直接法和间接法。直接法是指抗体直接连在磁性微球上，然后与靶细胞结合。 间接法是指先将细胞与特异抗体混合培养，使特异抗体结合在细胞表面，然后加 入预先用抗鼠i g g ( 二抗) 处理的磁性微球。使磁性微球间接地与靶细胞结合。 直接法可以减少洗涤和培养步骤，但对i g m 单抗很少能使用。间接法与直接法相 比，除适当范围广外，还可以使用一组单克隆抗体，因而会获得更好的细胞清除 效果。但要经过多次的洗涤步骤，特异性也会有所降低【2 9 】。 针对单核细胞的单克隆抗体的发展使得分离带有特异表面标记的细胞成为 可能。一般有3 类不同的方法，即流式细胞仪技术( p a c s ) 、表面联上二抗的异 体红细胞花环技术、将抗体被动吸附在聚苯乙烯组织养板d 2 的p a n n i n g 技术。这 些技术都有各自的缺点。f a c s 价格昂贵，技术复杂，经常会被所分选细胞的容 量、活性、无菌度等问题所困扰；红细胞花环技术无法处理大量的细胞，另外， 至今尚无一成熟、简便的方法能够将抗体偶联至红细胞膜上；p a n n i n g 技术也有 很多局限性，它难与放大操作，步骤烦琐，不能定量，靶细胞经常混杂着非特异 抗体吸附在培养板底部的其他细胞【3 0 】。相对而言，免疫磁性微球具有操作简便、 分离迅速完全、细胞纯度高等优点，尤其在操作简便省时方面，其他分离方法很 难比拟。 b 在体内磁共振成像中作为对比剂 由于纳米颗粒具有尺寸依赖效应，大小与生物大分子相似，又能与特异的靶 分子结合，非常适于在体内磁共振成像中作为对比剂。例如，w e i s s l e d e rr 等将 铟1 1 1 单晶氧化铁纳米颗粒( m i o n ) 作为淋巴结磁共振成像的对比剂，将其注 入大鼠静脉内、动脉内和皮下，观察光学剂量和脉冲序列，以此来检测是发生了 淋巴结转移的恶性肿瘤，还是淋巴结的良性增生【3 。m s 3 2 5 是一种与白蛋白具 有高度结合力的含钆的磁共振成像( m r i ) 血管造影剂，它能提供比其他试剂更 强的血管信号，既能提高结合动力，又能增强磁共振( m r ) 血管造影的稳定性。 一，a n n e x i nv 可识别凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸，并能通过二硫键与功能化的超顺磁 性的交联氧化铁( c r o s s l i n k e di r o no x i d e ，c l i o ) 纳米颗粒结合，后者是靶特异 性磁共振成像所必需的。通过m r i ，即使c l i o 在极低浓度下，a n n e x i nv - c l i o 也可识别悬浮液中的凋亡细胞，通过磁性分离柱后，凋亡细胞的清除率达9 9 以 卜【3 2 】 l0 c 超导量子干涉装置( s u p e r c o n d u c t i n gq u a n t u mi n t e r f e r e n c ed e v i c e ，s q u i d ) 这种方法是将y f e 2 0 3 标记上抗体用来检测抗原，s q u i d 显微镜用于检测 邻近样品产生的磁通量。将超顺磁性纳米颗粒与s q u i d 显微镜结合，可对生物 靶分子进行特异、敏感、快速、定量检测。s q u i d 置于冷却至7 7 k 的真空密闭 第1 章绪论 环境中，将结合有靶分子的聚脂薄膜置于f l 三s q u i d 4 0l am 左右处，带有抗体的 磁性纳米颗粒悬浮液加入到反应池的混合物中，脉冲场方向与s q u i d 平行。当 磁场存在时，纳米颗粒净磁化，磁场关闭时磁性弛豫。未结合的纳米颗粒通过 b r o w n i a n 旋转而快速弛豫，产生不可测量的信号。而与靶分子结合的纳米颗粒被 固定，发生n e e l 弛豫，产生衰减缓慢的剩磁，磁通量可被s q u i d 探测到。这种 区分结合与未结合标记物的能力，可进行类似物分析，不必分离和去除未结合的 磁性颗粒。由于结合的与未结合的纳米颗粒具有不同的磁性弛豫时间，可采用 s q u i d 高分辨测量技术一磁性弛豫分析( m a g n e t i cr e l a x a t i o ni m m u n o a s s a y s ， m a r i a ) 检测生化结合反应。它省去了洗脱步骤，可在短时间内进行高通量检 测，同时又能穿过不透光的介质，所以可用于体内探测。 综上所述，纳米金、纳米免疫磁性颗粒等纳米颗粒在生物检测方面有着广泛 的应用及研究前景。 在本课题中，我们拟利用纳米颗粒建立了新型抗原检测平台。在该检测系统 中，我们采用纳米金磁标记抗体，解决了生物大分子在芯片试验室中的微通道中 的可控性；同时利用纳米金颗粒标记抗体和核酸，将免疫信号转化为核酸信号， 有利于灵敏度的提高。 1 2 化学发光免疫分析的发展 化学发光是伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质在进行化学 反应时吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物从分子状态激发到电子激 发态。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时产生辐射，多 余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光【3 3 1 。 化学发光免疫分析的原理与酶联免疫方法相似，是把化学发光物质与免疫学 反应结合起来，用光反应表现被测的免疫成分浓度。即把高灵敏的光反应与特异 性的免疫学反应相结合，用的发光强度来对抗原、抗体等物质进行定量分析的方 法。与e l i s a 主要区别在于标记物不同。e l i s a 是由免疫系统和显色系统组成， 而c l i a 是由免疫系统和发光系统所组成的【3 4 】。 在生物学领域常用的化学发光剂有酰肼类化合物、咪哗类化合物、吖啶盐类 化合物及草酸盐类化合物等。本课题将采用吖啶酯作为发光剂进行试验。 吖啶酯化学发光试剂以光泽精的研究和应用最有代表性，1 9 3 5 年g l u e 和 p e t s c h 首次发现了光泽精的化学发光特性，现在已经成为研究和应用最广泛的化 学发光试剂之一。光泽精自身在碱性介质中产生微弱的化学发光，而且当加入过 氧化氢时，化学发光强度大大增强。根据此现象，再结合对反应产物的分析，人 们提出了光泽精的化学发光反应机理，认为光泽精在过氧化氢的作用下，产生激 北京工业大学理学硕士学位论文 发态的n 甲基吖啶酮【3 5 】。 后来又发现了许多吖啶类化合物具有化学发光特性，其中研究最多的是吖啶 酯化合物。这类化合物只要在过氧化氢存在的条件下就能迅速产生化学发光，具 有很高的化学发光效率。1 9 8 3 年w e e k s 等合成了用于标记蛋白质的吖啶酯试剂 4 一( 2 琥珀酰亚氨基羧基) 苯基1 0 甲基吖啶9 羧酸酯氟磺酸盐( a c r i d i n i u mc 2 n h se s t e r ) 3 6 】，其发光效率高、背景小、可在中性或碱性条件下标记多肽、抗体 或抗原，偶联物的发光量子产率和生物活性几乎不损失，成为性能优良的化学发 光免疫分析标记试剂。 吖啶酯是目前临床检测主要采用的化学发光剂之一。首先，因为无需催化剂， 简化了反应。发光反应迅速，增加了计数的充分性，背景低。而且这种标记的试 剂极其稳定，并因其独特的形式2 甲基吖啶酯而使有效期长达一年甚至更久。化 学发光快速，在1 s 内光子散射达到高峰，整个过程在2 s 内完成。吖啶酯还具有 高特异活性，它反应的高度有效性极大的缩短了读数时间。1 s 内直接发光的光 子强度可比1 2 5 i 发光计数所获光子数多1 0 万倍。这意味着用增强的光子无需等 待自由衰变。这种光子爆炸常为1 s 直接发光，强烈的直接化学发光显示着两个 重要的实验特征：简单和快趔3 7 3 8 】。 吖啶酯的化学发光机理是：在碱性条件下h 2 0 2 与吖啶环的9 位碳原子发生 加成，加成产物在碱性条件下形成的过氧负离子亲核进攻羰基碳，离去基团( 均 离去并进一步形成不稳定的四元环中间体，开环后形成吖啶酮，在它由激发态 回到基态的过程中，释放光子【3 9 】。最重要的是用吖啶酯标记d n a 探针来检测 d n a 不但可以区分d n a 单个碱基的多态性，提高了检验的准确性，而且最小检 出值可达l o 。1 8m o f l 4 0 4 3 1 。 杂交保护实验( h p a ) 主要2 = - - 部分组成：a 吖啶酯探针的合成；b 液相杂 交和碱性水解；c 化学发光检测。h p a 技术中的探针设计，只能根据己知序列设 计，不能够检测未知序列。采用人工合成的方法制各与靶序列保守区互补的寡核 苷酸探针，并在合成过程中引进烷基胺连接臂，经活化与吖啶酯连接，成为完整 的化学发光核酸探针。h p a 技术既可以检测d n a ，也可以检测r n a ，并且能够 区分仅有一个碱基不同的两个相似靶序列，利用寡核苷酸这个特点可以检测单碱 基的错配。 h p a 的技术原理：当a e 标记的d n a 探针与靶寡核苷酸杂交后，形成的双 螺旋结构能给a e 提供最大的保护，免于被水解，因此保护了它的发光性能。而 未杂交的a e 探针则在水解缓冲液下被降解，失去了发光性能。利用这个原理， 可以检测靶寡核苷酸的量，具有背景小的特点。而且，如果探针与靶序列只要有 一对碱基不配对，双螺旋的空间构象就会受到影响，使吖啶酯的水解位点暴露， 易于破坏，从而失去发光活性。 第1 章绪论 c h 3 c h 3 o r f h 3 o h - - - - - - - - - - -