（药物化学专业论文）两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究.pdf

两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 一 伽睨。 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 注! 垫超查墓丝噩要挂别岂明的! 奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：糯变每签字日期：o 年占月争日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：妇岛必。穆 签字日期：vf o 年6 月年日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字： 签字日期：励舒6 月扩日 电话： 邮编 中国海洋大学硕士学位论文：珊瑚共附生真菌的分离筛选及其次生代谢产物的研究 目录 a b b r e v i a t i o n i 摘要i i a b s t r a c t v i i i 前言1 一日青 第一章珊瑚共附生真菌的分离和天才菌株筛选3 第一节集成筛选模型的建立3 第二节珊瑚共附生真菌的分离及天才菌株筛选4 第三节讨论与小结7 第四节实验部分7 参考文献1 0 第二章天才菌株的发酵条件优化及活性次生代谢产物的分离1 1 第一节 曲霉a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rl c j 一5 _ 4 的发酵条件优化及产物分离1 1 第二节青霉p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 的发酵条件优化及产物分离1 5 第三节小结与讨论1 8 第四节实验部分1 9 第三章次生代谢产物的结构研究。2 0 第一节单体化合物的结构解析2 0 第二节小结与讨论4 0 第三节实验部分4 0 参考文献4 4 第四章化合物的细胞毒活性测试4 6 第一节细胞毒活性测试方法4 6 第二节化合物活性测试结果4 7 第三节小结与讨论5 2 第四节实验部分5 3 参考文献5 3 第五章综述一杂色曲霉a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o r 次生代谢产物研究进展5 4 结语与创新6 5 滕宪存：珊瑚共附生真菌的分离筛选及其次生代谢产物的研究 6 8 8 6 6 6 果 成 一 究 一 一 研 一 关 相 文 一 论谢图本致附 a b b r e v i a t i o n s a p o p t o s i s c o r r e l a t i o ns p e c t r o s o e o p y t w o - d i m e n s i o n a ln u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e d e m e t h y l s u l f o x i d e ， e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y 胎牛血清 f l o wc y t o m e t r y 1 h - d e t e c t e dh e t e r o n u c l e a rm u l t i p l eb o n dc o n n e c t i v i t y 1 h - d e t e c t e dh e t e r o n u c l e a rm u l t i p l eq u a n t u mc o n n e c t i v i t y h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m o t o g r a p h y h a l fi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n i n f r a r e d m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n m e l t i n gp 0 m t 3 ( 4 ，5 - d i m e t h y l - 2 - t h i a z o y l ) - 2 ，5 - d i p h e n y l - t e t r a z o l i u mb r o m i d e n e c r o s i s n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e p h o s p h m e - b u f f e r e ds a l i n e p r o d i u mi o d i d e s u l f o r h o d a m i n eb t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y u l t r a v i o l e t v a c u u ml i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i “5 f l u o r o - 2 ，4 d i n i t r o p h e n y l ) - i a l a n i n ea m i d e挑一一一一麟一一一酶m眦脚一鹏h咖哪w咖 滕宪存：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 摘要 珊瑚代谢产物种类繁多、结构新颖，是海洋天然产物三大来源之一。其共附 生微生物可能是这些代谢产物的真正产生者。为了寻找新颖结构的活性化合物， 本论文采用化学与生物学相集成的筛选方法，开展了对珊瑚共附生真菌的筛选及 2 株共附生真菌的次生代谢产物的研究工作。内容包括：珊瑚共附生真菌的分离 与天才菌株的筛选；发酵菌株发酵条件的优化及细胞毒活性成分的追踪分离；单 体化合物的结构解析；单体化合物的细胞毒活性初步评价。 对采自海南陵水、三亚、临高、万宁港、广西涠洲、广东湛江的珊瑚样品中 分离获得1 9 8 株共附生真菌，运用集成化学和生物学的筛选方法最终确定5 株为 天才菌株，并选定其中的两株a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rl c j 一5 - 4 和p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 作为本论文的目标菌株。对这两株目标菌株发酵条件做了优化，确定了 优化培养基和培养条件并进行了大量发酵，得到发酵产物( 粗提物) ；采用薄层 色谱、硅胶柱色谱、s e p h a d e xl h 2 0 柱色谱、反相高效液相色谱等手段分离其中 的活性化合物；通过解析波谱数据并结合理化常数阐明了2 1 个化合物的结构。 其中从杂色曲霉a s p e r g i ! l u sv e r s i c o l o rl c j 5 4 的发酵产物中分离鉴定了1 6 个化 合物：v e r s i t i d e sa c ( 1 3 ) ，e o t t o q u i n a z o l i n e sb - d ( 4 6 ) ，g l y a n t r y p i n e ( 7 ) ，( z ) 一5 - ( 2 ，3 - d i h y d r o x y b u t y l i d e n e ) f u r a n - 2 ( 5 仞一o n e( 8 ) ，( e ) - 5 一( 2 ，3 - d i h y d r o x y b u t y l i d e n e ) f u r a n - 2 ( 5 h ) 一o n e ( 9 ) ，t e t r a o r c i n o l ( 1 0 ) ，d i o r c i n o l ( 1 1 ) ，e o r d y o lc ( 1 2 ) ，v e r s i c o l o r i nb ( 1 3 ) ， 1 ，3 ，6 ，8 - t e t r a h y d r o x y - 9 ，1 0 一a n t h r a q u i n o n e ( 1 4 ) ，v e r s i c o l ( 1 5 ) ，a v e r u f a n i n ( 1 6 ) ；从青霉 p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 的发酵产物分离鉴定了5 个化合物：s - 2 一( 2 - h y d r o x y p r o p a n a m i d o ) b e n z a m i d e ( 1 7 ) ，r ( + ) - c h r y s o g i n e ( 1 8 ) ，2 - p y r u v y l a m i n o b e n z a m i d e ( 1 9 ) ， n i c o t i n a m i d e ( 2 0 ) ，a n d2 ，3 一d i h y d r o s o r b i c i l l i n ( 2 1 ) 。其中9 个化合物( 1 - 6 、8 1 0 ) 为新化合物! 运用m t t 法对分离获得的单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价。结果 表明：菌株p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 的主产物化合物1 9 对两种癌细胞( h e l a 和 p 3 8 8 ) 都表现较弱的活性，i c 5 0 分别为1 0 6 和1 5 6 肛m 。 综上所述，本文采用集成筛选的方法获得5 株珊瑚共附生的天才菌株，从 其中2 株真菌的发酵产物中分离鉴定了2 1 个单体化合物，其中9 个为新化合物。 说明我们集成筛选寻找活性次生代谢产物的的方法是可行的，为抗肿瘤药物的研 究提供了新化合物及其资源菌株。 关键词：珊瑚，共附生真菌，集成筛选，次生代谢产物 滕宪查! 堕堡型塑茎堕生壅堕塑姿生垡塑兰竺竺壅 一 _ _ _ - _ _ 一一 t a b l e1 c o m p o u n d sf r o m 埘v e r s i c o l o rl c j 孓4a n dp e n i c l t l i u ms p w c l 3 1 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 5 h 3 。弋- - 7 2 9 c o t t o q u i n a z o l i n ec n e w c o t t o q u i n a z o l i n ed 6 3 1 n e w ,-3 f t 7 郫1 鞫三 g l y a n t r y p i n e o ( z ) - 5 - ( 2 ，3 - d i h y d r o x y 8 瓤。h b u t y l i d e n e ) f u r a n - 2 ( 5 啪一o n e n e w o h 9 。“0 ： ( e ) - 5 - ( 2 ，3 一d i h y d r o x y b u t y l i d e n e ) f u r a n - 2 ( 5 h ) 一o n e n e w 1 0 v 。v 。v 。v 洲 t e t r a o r e i n o l n e w 1 1 甲。v 洲 d i o r c i n o l c o r d y o lc 1 2 审。v 洲 v v - 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 2 ，3 - d i h y d r o s o r b i c i l l i 2 l h 净6 n 滕宪存：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s o ft w om a r i n ef u n g a ls t r a i n sa s s o c i a t e d w i t hc o r a l a b s t r a c t b e c a u s eo ft h es p e c i a ll i v i n ge n v i r o n m e n t , c o r a lp o s s e s sd i s t i n c ta n dc o m p l e x m e t a b o l i cc a p a b i l i t i e s ，r e s u l t i n gi n 谢d ed i v e r s i t yo ft h e i rs e c o n d a r ym e t a b o l i t e si n c h e m i c a ls t r u c t u r ea n db i o l o g i c a la c t i v i t y m o s to ft h e s es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa r e p o s s i b l yr e s u l t e df r o mt h e i rs y m b i o t i cm i c r o o r g a n i s m s t l l i st h e s i sd e s c r i b e s t h e s c r e e n i n go fs y m b i o t i cf u n g ia n ds t u d i e so nt h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o d u c e db y t w os e l e c t e dt a l e n t e df u n g a ls t r a i n sf r o mc o r a l s t u d i e si n c l u d ei s o l a t i o no fs y m b i o t i c f u n g if r o mc o r a ls a m p l e s ，s c r e e n i n go ft a l e n t e ds t r a i n s ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n , b i o a s s a y - g u i d e df r a c t i o n a t i o n ，s t r u c t u r a le l u c i d a t i o na n dc y t o t o x i c i t ye v a l u a t i o n f i v et a l e n t e ds t r a i n sw e r eo b t a i n e db yi n t e g r a t e d c y t o t o x i ca n dc h e m i c a l s c r e e n i n gm e t h o d sf r o m16 8f u n g ii s o l a t e df r o mc o r a l sc o l l e c t e df r o ml i n s h u i ，s a n y a , l i n g a o ，w a n n i n g g a n g ，w e i z h o u ，z h a n j i a n g ，c h i n a b e c a u s eo fc y t o t o x i c i t ya n da s e r i e sh p l cp e a k s 澌也s i m i l a ru va b s o r p t i o n ，a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rl c j - 5 - 4a n d p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6w e r es e l e c t e da sw o r k i n gs t r a i n sf o rf u r t h e rs t u d yo f s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s g u i d e db yb i o a c t i v i t y , t h ea c t i v ef r a c t i o n sw e r es u b j e c t e dt o c h r o m a t o g r a p h yo v e rs i l i c ag e l ，s e p h a d e xl h 一2 0a n dp r e p a r e dt l c ，a n dp r e p a r a t i v e h p l ct oa f f o r d16c o m p o u n d sf r o ma s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rl c j - 5 _ 4 b yt h es a m e p r o c e d u r e ，5c o m p o u n d sw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e df r o mp e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 b ym e a n so fs p e c t r o s c o p i ca n dc h e m i c a lm e t h o d s ，t h e i rs t r u c t u r e sw e r ee l u c i d a t e da s a s p e r t i d e s a c ( 1 3 ) ，c o t t o q u i n a z o l i n e s b d ( 4 6 ) ，g l y a n t r y p i n e ( 7 ) ， ( z ) - 5 - ( 2 ，3 一d i h y d r o x y b u t y l i d e n e ) f u r a n - 2 ( 5 h ) 一o d e ( 8 ) ，r e ) 一5 一( 2 , 3 - d i h y d r o x y b u t y l i d e n e ) f u r a n - 2 ( 5 h ) 一o n e ( 9 ) ，t e t r a o r c i n o l ( 1 0 ) ，d i o r c i n o l ( 1 1 ) ，c o r d y o lc ( 1 2 ) ，v e r s i c o l o r i nb ( 1 3 ) ，1 , 3 ，6 ，8 一t e t r a h y d r o x y 一9 ，1 0 一a n t h r a q u i n o n e ( 1 4 ) ，v e r s i c o l ( 1 5 ) ，a v e r u f a n i n ( 1 6 ) ； 双_ ) 2 一( 2 一h y d r o x y p r o p a n a m i d o ) b e n z a m i d e ( 1 7 ) ，r ( + ) 一c h r y s o g i n e ( 1 8 ) ，2 - p y r u v y l a m i n o b e n z a m i d e ( 1 9 ) ，n i c o t i n a m i d e ( 2 0 ) ，a n d2 ，3 - d i h y d r o s o r b i c i l l i n ( 2 1 ) 。a m o n g t h e m ，c o m p o u n d s1 - 6a n d8 1 0a r en e wc o m p o u n d s t h ec y t o t o x i c i t yo ft h e s ec o m p o u n d sa g a i n s tt w oc a n c e rc e l ll i n e sw a se v a l u a t e d v i i i 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 b ym t tm e t h o d c o m p o u n d1 9 ，o n eo ft h em a i nm e t a b o l i t e sf r o mp e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6e x h i b i t e dc y t o t o x i c i t ya g a i n s tp 3 8 8a n dh e l ac e l l sw i t hi c 5 0v a l u e so f10 6 州a n d 15 6i x m ，r e s p e c t i v e l y i na w o r d ，n i n en e wc o m p o u n d st o g e t h e rw i t ht w e l v ek n o w n o n e sw e r ei s o l a t e d a n di d e n t i f i e df r o mt h et w os y m b i o t i cf u n g iw i t hc o r a l s s t u d i e sm e n t i o n e da b o v e p r o v i d e n o v e ls t r u c t u r e sf o rs e a r c h i n gn e wl e a d i n gc o m p o u n d sa n d m i e r o b i a l r e s o u r c e sf o rf u r t h e rs t u d ya n di tp r o v e st h em e t h o dw eu s e di se 脏c t i v ei nf m d i n g n e wa c t i v ec o m p o u n d s k e yw o r d s ：c o r a l ；s y m b i o t i cf u n g i ；i n t e 伊a t e ds c r e e n i n g ；s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ； 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 i 上j l 一 刚青 天然产物是创新药物的重要源泉。天然产物结构的复杂和多样性是任何化 学家无法想象的，而海洋天然产物是天然产物的研究热点。由于丰富的海洋生物 资源( 占地球物种的8 0 以上) 、特殊的生境( 高压，高盐，寡营养，高竞争) 造就了其丰富的代谢产物类型，再加上海洋天然产物与陆地天然产物相对研究较 少，所以从海洋天然产物中寻找药用活性先导化合物成为药物开发的研究热点。 但制约海洋药物发展的一个瓶颈是药源问题，由于海洋天然产物一般都含量微 少，结构复杂又难以合成，严重影响着其成药性的研究。有研究表明：从海洋动 植物中获得的结构独特的活性天然产物，其真正来源可能是与之共生、附生的海 洋微生物产生的【”】。微生物繁殖速度快，能够人工条件下大规模发酵培养，对 生态环境破坏小，再加上其具有共生性，海洋微生物已经成为海洋药物开发的热 点。来源于海洋的天然产物已有2 万个，海绵、微生物、珊瑚是这些天然产物的 三大来源【4 】。海绵共生微生物研究较早，已从海绵共生微生物中发现了多种类型 的化合物包括含氮化合物、内酯类、醌类、酮类、聚醚类、萜烯类及甾体等多种 化合物1 5 1 。而珊瑚共附生微生物研究却很少，现在还主要集中在生态学的研究1 6 】， 对珊瑚共附生微生物次生代谢产物的研究几乎没有报道。从珊瑚中分离的化合物 类型多样，其中不少结构新颖应具有强烈生物活性1 7 j 。因此，我们开展了珊瑚共 附生微生物的分离、天才菌株的筛选及其次生代谢产物的研究。 本文从采白海南陵水、三亚、临高、万宁港，广西涠洲以及广东湛江的珊 瑚样品中分离纯化了1 6 8 株共附生真菌；运用集成化学( t l c ，瑚? l c ) 和生物学 ( 形态，活性) 筛选方法，筛选获得5 株天才菌株i 印】，其中菌株a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o r l c j 一5 - 4 和p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 对生物碱特征显色剂d r a g o n d o r f f 均反应为阳 性、在h p l c 指纹图谱中存在一系列紫外吸收相似的色谱峰。由于5 0 的上市药 物中含有氮元素，而新化合物存在于系列结构类似物中，本论文选定菌株 a s p e r g i l l u sv e r s i c o l o rl c j 一5 - 4 与p e n i c i l l i u ms p g x w z 4 0 6 作为目标菌株进行大量发 酵，并应用现代分离手段和波谱学方法对其代谢产物进行活性追踪分离及结构鉴 定，评价单体化合物对肿瘤细胞的增殖抑制活性，获得具有细胞毒活性的新化合 物。 滕宪查! 堕堡型塑茎堕竺塞堕箜姿竺垡塑兰望塑壅 i _ - - - _ i - - _ - _ - - _ i - _ _ _ _ - - - _ _ - _ l - - _ _ _ _ _ _ 一一 一 一 参考文献 【1 】l u e s c hh ，m o o r er e ，p a u lv j i s o l a t i o no f d o l a s t a t i n10f r o mt h em a l i n ee y a n o b a e t e r i u m s y m p l o c as p e c i e sv p 6 4 2 a n dt o t a ls t e r e o c h e m i s t r ya n db i o l o g i c a le v a l u a t i o no f i t sa n a l o g u e s y m p l o s t a t i n l 【j 】j n a tp r o d , 2 0 0 1 ，6 4 ：9 0 7 - _ 9 l o 【2 】s e h u p pp ，e d e rc ，p r o k s c hp s t a u r e s p o r i n e d e r i v a t i v e sf r o mt h ea s c i d i e a ne u d i s t o m a t o e a l e n s i sa n di t sp r e d a t o r yf l a t w o r mp s e u d o c e r e ss p 【j 】d n a tp r o d , 1 9 9 9 ，6 2 ：9 5 9 - 9 6 2 【3 】u n s o nm d ，f a u l k n e rd j c y a n o b a e t e r i a ls y m b i o n tb i o s y n t h e s i so f c h l o r i n a t e dm e t a b o l i t e s f r o md y s ，d e ah e r b a c e a ( p o r i f e r a ) 【j 】e x p e r i e n t i a , 1 9 9 3 ，4 9 ：3 4 9 - 3 5 3 【4 】j o h nw b l u n t ；b r e n tr c o p p ；w a n - p i n g h ue ta 1 m a r i n en a t u r a lp r o d u c t s j 】胍p r o d r e p , 2 0 0 9 ：1 7 0 5 1 张敏等海绵共附生微生物次级代谢产物的研究进展【j 】冲国海洋大学学报2 0 0 7 年5 b 3 7 ( 3 ) ：3 7 7 , - - - 3 8 4 【6 】m e r c u r i o ，p ；b u r n s ，k a ；n e g r i ，a t e s t i n gt h ee c o t o x i c o l o g y o fv e g e t a b l ev e r s u sm i n e r a l 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 第一章珊瑚共附生真菌的分离和天才菌株筛选 第一节集成筛选方法的建立 l 、薄层色谱( t l c ) 筛选 1 1 菌株排重 首先根据形态学分组，将形态上相似的菌株分成一组。然后通过t l c 排重： 把每组若干菌的浸膏点到一块板上，通过通用显色剂香草醛浓硫酸显色。对显 色一致的菌，挑选一株产量大的菌，排除掉重复的。 1 - 2 代谢物种类分析 将排重后的菌株进行t l c 特征显色剂的显色，分析代谢产物的化学多样性。 特征显色剂主要为：生物碱特征显色剂d r a g o n d o r f f ；酚醌特征显色剂f e c l 3 ；大 环内酯特征显色剂l e g a l 显色剂。将具有较好显色分析的菌株做出标记。 2 、肿瘤细胞毒活性筛选 2 1 活性筛选：采用小鼠白血病细胞p 3 8 8 。细胞用含1 0 f b s 的r p m i 1 6 4 0 培 养基，在3 7 、通入5 - - 氧化碳的细胞培养箱中继代培养。 2 2 细胞镜检：取对数生长期的p 3 8 8 细胞，用含1 0 f b s 的新鲜r p m i 1 6 4 0 培 养基配制成2 x1 0 5 个m l 的细胞悬液，接种到2 4 孔板中，每孔0 5m l 。各孔再 加5j c f l 样品溶液，留复孔空白对照。在3 7 c 细胞培养箱中培养1 7 小时后，在倒 置显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡 或细胞坏死的形态学特征，记录样品的活性结果。 2 3s r b 染色【1 】 每孔细胞中加入8 0 - - 氯醋酸5 0 此，置于4 。c 固定1h ，用水冲洗5 次并空 气干燥。每孔加入o 4 s r b 的醋酸溶液5 0 此并在室温静置3 0m i n 。用l 醋 酸水清洗4 次，除去未结合的游离s r b 染料。每孔加入1 5 0 此 i r i s 缓冲液( 1 0 m m o l l ，p h1 0 5 ) 溶解蛋白结合染料并利用m d 公司产s p e c t r am a x p l u s 型 酶标仪测定每孔在5 2 0a m 处的光密度( o d ) 值。具体的活性测试过程如图f i g 1 - 1 所示。 3 、高效液相色谱( h p l c ) 指纹图谱筛选 将具有较好特征显色并同时具有较好细胞毒活性的发酵产物进行高效液相 色谱( h p l c ) 指纹图谱分析，进一步检测菌株发酵产物的化学多样性，观察是 滕宪存：两株珊瑚共附生宾菌的次生代谢产物研究 否存在紫外吸收相似的系列吸收峰。 综合以上分析，发现具有较好生物活性、并能产生系列化合物的目标菌株， 即所谓天才菌株( t f l e m e ds t r a i n s ) 1 2 , 3 。 p 3 8 8c e l ll i n e o b s e r v e du n d e ral i g h t j c e n t d f u g a t c d ( 4 摄氏度。 3 0 0 0 r p m ，3 m in ) 上 上 ( 4 摄氏度，3 0 m in ) i a n a l y z e db yu m s 1 1 t h es c r e e n i n gp r o c e d u r ef o rp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o no np 3 8 8c e l l l i n e s 第二节珊瑚共附生真菌的分离及天才菌株筛选 l 、样品来源 珊瑚样品采自海南陵水、三亚、临高、万宁港，广西涠洲，广东湛江。 2 、分离方法 p d a 培养基、蒸馏水、试验用镊子、刀片于1 2 0 。c 、1 0 5k g c m - 2 - f 列i 2 0m i n 。 无菌状态下取样品，用无菌水冲洗2 3 遍。将组织切块，置于p d a 培养基平板中， 2 8 c 恒温培养。待菌丝长出后，挑取尖端菌丝移至新的培养基上，几次纯化后得 到真菌并转接到试管斜面上4 c 冰箱保藏备用。 4 丫 斟勰 谶l鞣j 嘲囟 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 3 、筛选样品的准备 将冰箱保藏的菌株接于原斜面培养基上，于2 8 c 培养箱中活化培养5 至9 天 后，从固体斜面培养基取适量接种到内装5m l 真菌2 号液体培养基的试管中，分 别在2 8 。( 2 、2 4 0r m i n 的条件下于试管摇床中培养9 天。在发酵物中以1 5 ：8 5 的比 例加入甲醇和乙酸乙酯共1 0m l ，将菌体超声破碎，静置一夜，取上清液真空低 温浓缩至干。干燥物除盐后称重加适量甲醇溶解，供测活性、t l c 和h p l c 指纹 图谱分析。 4 、集成化学筛选结果 4 1 菌株排重 从1 9 8 株菌中排掉4 0 株，还剩1 6 8 株。 4 2 t l c 分析 对剩余1 6 8 株菌进行t l c 通用显色和特征显色分析。其中发现3 3 株代谢产 物丰富或具有特征显色。 4 3 肿瘤细胞毒活性筛选 对排重后的1 6 8 株菌进行小鼠白血病细胞p 3 8 8 的活性筛选，共有6 1 株在终 浓度1 0 0 z g m l 时对p 3 8 8 细胞显示了不同程度的细胞毒活性( 抑制率 3 0 ) ， 其中，1 0 株菌株显示较强的活性( 抑制率 5 0 ) 。 4 4 高效液相色谱i - i p l c 指纹图谱分析 结合t l c 化学组成分析和肿瘤细胞筛选得到1 0 株候选菌株。对这1 0 株菌 的浸膏进行h p l c 指纹图谱分析，发现5 株具有紫外吸收相似的系列吸收峰，如 f i g1 - 2 所示。 编号 指纹图谱；产量；香一浓显色；抑制率( 1 0 a g m l ) 5 5；i 0 ：! l _ l ；i 1 ，：! j o 。： 瓣 ；，：ji ：；：_ ，：，：i j ：，。：。二 2 l ；ii i l ；手霉攀擎 一_ ? ，j 量：o ；。点，一+ 曼4 j ? 。：二1 j 二。二一缵 滕宪存：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 9 1 产量：2 7 m g 5 m l 抑制率：3 1 3 8 辍 缟 张 缡臻一：凸k c 。“p ：k ，谢l 萋；：囊羹 ，_ 露 。i o ，tt*#p堑譬g馨tli， 暑爱遵罩奠妒 ! i s赫 ； 中国海洋大学硕士学位论文：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 第三节讨论与小节 本章采用集成化学与细胞毒活性相结合的筛选方法进行天才菌株的筛选。天 才菌株( t f l e m e ds t r a i n s ) 是指产量高、活性好、代谢产物结构类型丰富的菌株 1 2 翔。仅凭活性或者化学特征单方面筛选很难发现天才菌株，必须采用化学与生 物学相集成的筛选方法。 化学筛选是借助于其发酵产物的t l c 行为，去除重复菌株；通过特征显色 剂的分析( 生物碱特征显色剂d r a g o n d o r f f , 酚醌特征显色剂f e c l 3 、大环内酯特 征显色剂l e 9 2 i l 显色剂) ，对微生物菌株产生化合物类型进行考察：再通过h p l c 指纹图谱对其代谢产物的化学多样性进一步判断。生物学筛选采用微生物形态观 察去除重复菌株( 与t l c 相结合) ，再通过活性测试( 本论文为细胞毒活性) ， 获得对小鼠白血病细胞p 3 8 8 具有细胞增殖抑制活性的菌株；化学与细胞毒活性 相结合的集成筛选模型从化学组成分析及细胞毒活性分析两个角度同时出发进 行天才菌株的筛选，成本低廉，测试样品用量少，可筛样本数大，可以扩大筛选 面、加快筛选速度，故可通过大规模筛选，快速排除绝大多数无活性的和次生代 谢产物贫乏的菌株，具有十分显著的优越性。这种集成筛选模型是两种筛选方法 有机结合，从不同角度对筛选菌株进行了综合评价，容易筛到天才菌株。 我们利用集成化学( t l c ，h p l c ) 和细胞毒活性的集成筛选方法，对采白海 南陵水、三亚、临高、万宁港以及广西涠洲、广东湛江的珊瑚样品的共附生真菌 1 9 8 株进行了集成筛选，其中通过t l c 排重4 0 株剩余1 6 8 株，对剩余1 6 8 株菌 进行t l c 通用显色和特征显色分析。其中发现3 3 株代谢产物丰富或具有特征显 色。对排重后的1 6 8 株菌进行小鼠白血病细胞p 3 8 8 的活性筛选，共有6 l 株在终 浓度1 0 0 鲈1 1 l 时对p 3 8 8 细胞显示了不同程度的细胞毒活性( 抑制率 3 0 ) ， 其中，1 0 株菌株显示较强的活性( 抑制率 5 0 ) 。把t l c 化学特征和活性结合 选定十株为候选菌株，进一步h p l c 分析，最终确定5 株为“天才菌株 。 第四节实验部分 1 、实验仪器 高压灭菌锅m l s 3 7 5 0s a n y o 高速离心机b e c k m a n 滕宪存：两株珊瑚共附生真菌的次生代谢产物研究 超声仪 v c 7 5 0s o n i c s 冰箱 b c d - - 2 6 8h a i e r 电热恒温水浴锅h h s y i1 - n i 北京长风仪器仪表公司 试管式振动培养箱t c c 一1 0 0 r 高崎科学器械株式会社t i c 旋转式振动培养箱t c c 一1 0 0 r 高崎科学器械株式会社t i c 恒温培养箱m i r - - 2 5 3s a n y o 洁净工作台 a i rt e c h 苏州安泰空气技术有限公司 流式细胞仪f a c sv a n t a g e 型( 美国b e c t o nd i c i n s o n 公司) 冷冻离心机b i o f u g ef r e s c o 型和b i o f u g ep r i m o 型( h e r a e u s 公司) 相差倒置显微镜c k 4 0 ( o l y m p u s 公司) 二氧化碳培养箱m c 0 1 7 5 ( s a n y o 公司) 超净工作台m c v - 1 3 1 b n f ( t ) ( s a n y o 公司) 电动吸引机y b d x 2 3 b ( 上海医疗器械工业集团公司) 真空浓缩仪s c 2 5 0 d d a ( s a v a n t 公司) 2 、实验材料及试剂 小鼠白血病p 3 8 8 细胞株；胎牛血清f i b s ) 和r p m i 1 6 4 0 细胞培养基分别 为h y e l o n e 公司( c a t n o s t f 7 2 1 ) 和g i b c o b r l 公司产品；碘化丙啶 p r o p i d i u mi o d i d e ( p 1 ) 和t r i t o nx 1 0 0 均为s i g m a 公司产品。乙醇、柠檬酸钠等 为分析纯。分离培养及发酵采用的培养基成分均为市售分析纯试剂。 3 、溶液的配置 细胞培养液：取r p m im e d i u m1 6 4 0 ，按标示量( n e tw t1 0 4 9 p k g 1 ) 加入双 蒸水ll ，用磁力搅拌器搅拌至全部溶解后，用已高压灭菌的蔡氏( z e i s s ) 滤器经 o 2