（植物学专业论文）桂花品种rapd分析及综合评价.pdf

河南大学2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 致 谢 值此论文完成之际，由衷地感谢我敬爱的导师尚富德副教授。三年来导师在学业上孜孜 不倦的教诲，生活上无微不至的关怀，让学生终生难忘。 江水长流，师恩永驻! 导师兢兢业 业的工作作风、科学严谨的治学态度以 及平易近人的优良 品质， 永远是我学习的楷模和奋发 的 动力， 在此向导师致以 最祟高的敬意! 本实验是在植物逆境生物学重点实验室完成的。宋纯鹏院长渊博的专业知识、求是的 科 学态度，在我耳濡目 染的同时也受益匪浅。董发才老师、安国勇老师、 江静老师、周云老师 以及王棚涛老师在实验开展过程中提供了大量帮助; 在实验研究过程中，苗雨晨老师、晃岳 恩老师、王子成老师、李玉阁老师以及王鹏程、杜艳同学等都给予了热心指导和无私帮助， 在此表示我最诚挚的谢意! 衷心感谢李锁平教授在三年里给我的关心、教导和帮助里 感谢肖 保林老师在论文排版及 图片处理过程中给予的帮助。 在三年的学习和生活中，李淑娟老师、李忠爱老师、祁静老师、 张霖老师、郭曙光老师等全院老师都给了我众多的 关怀和帮助， 在此一并表示感谢丈 特别感谢师兄马云峰在论文撰写过程中、董美芳和袁王俊同学在材料采集过程中以 及刘 萍和李永同学在论文校正过程中给予的热情帮助旦 感谢同学耿惠敏、杨惫娟、张文丽、王磊、许红星、宋玉伟、汤正辉、胡楠以 及老同学 赵伟、 关爱民在三年的 研究生就读期间给予我的关心、 理解和帮助! 感谢张国 增、 薛瑞丽、 夏 金蝉、薄惠以 及逆境生物学实验室的其他师弟师妹曾 经给予我的支持旦 另外，对遗传实验室 的代小华、张大乐、裴冬丽、高红云、苏亚蕊对我的帮助表示衷心的感谢! 特别感谢苗深博士在实验研究和论文修改、 完成过程中给予的大量指导， 最后， 我还向 所有关爱和帮助我的亲人和朋友致以 最深的谢意! 伊艳杰 2 0 0 4 年 5 月于河南大学 河南大学2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 英文缩写 ab b r e v i a t i o n s 英文全称英文 缩写 中文名称 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d c e ty l t r i e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o r n e t h a n e 2 - me t h i o n i n e e t h a n o l p o l y e t h y l e n e g l y c o l b a s e p a i r t r i s 一b o , - e d t a b u ff e r d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s p o l y m e r a s e c h a in r e a c t i o n r a n d o m a m p l i fi e d p o l y m o r p h i c d n a r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g th p o l y m o r p h i s m a m p l i fi e d f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m d n a a m p l i fi c a t i o n f i n g e r p r i n t i n g s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t i n t e r - s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s v a r i a b l e n u m b e r o f t a n d e m r e p e a t a r b i t r a ry p r im e r p c r s e q u e n c e - c h a r a c t e r i z e d a m p l i fi e d r e g i o n a n a l y t i c h i e r c h y p r o c e s s e dt a ct ab t r i s 2 - me p e g b y t be d nt p s p cr r ap d rf l p af l p daf s s r i s s r vnt r ap - p c r s car ahp 乙二胺四乙酸 十六烷基三甲基澳化按 三轻甲基氨基甲烷 0 一 疏基乙醇 聚乙二醇 碱基对 t r i s 及硼酸电泳缓冲液 脱氧 ( 核糖)核昔 三磷酸混合物 聚合酶链式反应 随即扩增多态性d n a 限制性片段长度多态性 扩增片段长度多态性 d n a扩增指纹 简单重复序列 间隔简单重复序列 可变数量串联重复 任意引物p c r 特殊序列扩增 层次分析法 河南大学2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 中文摘要 桂花是我国十大传统名花之一，原产我国，是木犀科木犀属植物。既是优良的园林绿化 树种，也是著名的香花植物。桂花在长期的演化过程中， 在自 然选择和人工选择的双重作用 下，形成了丰富的变异类型。但其系统学研究还不够深入，品种分类工作相当滞后，而且主 要跟据其形态学和生理学特征进行分类。 仅依此对桂花品 种进行分类，难以作出客观的结论。 本文利用 r a p d技术分析河南省和桂林市的桂花品种间的亲缘关系，旨 在从基因组水平 为桂花品种分类提供合理依据。运用层次分析法综合评价河南省的桂花品种，为今后河南省 桂花品种的 评选、鉴定以 及进一步开发利用提供了 一定的参考。主要研究结果如下: 对 影响r a p d反 应的 主 要因 素( 诸 如m 窗 + 浓 度 、 d n t p 浓 度 、 d n a模 板 浓 度以 及 退 火温度等) ， 通过设浓度梯度进行了优化， 获得了一个重复性高、 稳定性好的r a p d反应休系. 利用r a p d技术对桂林市2 3 个桂花品种的基因组多态性进行研究。2 0 个随机引物共 检测到 1 8 6 个位点， 其中多态位点1 3 5 个，占7 2 .6 。 每个引物扩增带数从5 到1 4 条不等， 扩增片段大小 从4 0 0 到3 0 0 0 b p ， 每个品 种都有其独 特的 标 记与 其他品 种相区 别. 根据由r a p d 扩增结果构建的系统树状聚类图， 将这些品 种划分为四个品种群。此项研究表明，以 基因型 而不是以 表现型为基础区分桂花品种是可能的。该技术为解决桂林市的桂花品种分类问题提 供了 重要线索，同时也为下一步r a p d 分析河南省的桂花品 种奠定了 一定的实验技能基础。 在对河南省的 桂花品种进行详尽调查的基础上， 选定1 7 个桂花标准株进行定点观察， 认真记录了 它们的详细形态特征;并利用 3 0 个引物对其进行 r a p d 分析。 共产生2 4 7 条带， 其中1 6 9 条为多态性带， 占总带数的6 8 . 4 %， 显示出 桂花品种内 丰富的遗传多样性。 平均每个 引物扩增的带数为8 . 0 7 条， 多态性d n a 的带数为5 . 8 条。 从基于r a p d标记建立起来的 树状 图分析， 所有供试材料的遗传距离都大于零，又都能够聚类在一起， 这表明桂花品种之间既 有相同 遗传背景，但相互之间又存在一定差异。 r a p d分析结果与传统分类学结果基本相符， 首次从基因组水平为河南省的桂花品种分类提供合理依据。 运用层次分析法对河南省的 1 7个桂花品种进行了生产加工应用和园 林观赏方面的综 合评价。 分析评价中就花色、花香、花期早晚、花期长短、花径、花量、采花难易、枝条形 杰、 树形、叶片色泽、生长势、叶 稀有度等1 2 个因子对其进行综合评价，按评分标准计算出 ?7 ra a k 2 0 0 4 a 1 q t 4f ， . 生 a s r 3 e a 每一品种的综合分值，根据得分将 1 7 个桂花品种品种划分为四个等级。其中演川金桂、大花 金桂、 朱砂丹桂、大叶黄银桂品种得分较高，与实地调查结果基本一致。总体评价表明，四 季桂的品种得分相对较低， 金桂品种群和丹桂品种群的大部分桂花品种在生产加工利用和园 林观赏方面有着较高的利用价值，得分也较高。 最后， 在对河南省的 桂花品种进行详尽地调查、 r a p d分析及综合评价的基础上， 对目 前 河南省在桂花品种资源利用及开发方面所存在的不足提出了几点建议，期望通过本研究能加 速我省桂花品种资源的开发和利用。 关键词:桂花:品 种分类;亲缘关系:r a p d :层次分析 河南大学 2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 ab s t r a c t o s m a n t h u s f r a g r a n s l o u r . o n 乡 n a t e d fr o m c h i n a b e l o n g s t o o s m a n t h u s . a s o n e o f t e n t o p t r a d i t i o n a l fl o w e r s i n c h i n a , o . f r a g r a n s i s a n e x c e l l e n t g r e e n t r e e a n d i s a l s o f a m o u s f o r fr a g r a n c e . d u r in g t h e lo n g t im e o f e v o lu t io n , it c o m e s o u t a b u n d a n t v a r i a t i o n t y p e s u n d e r in fl u e n c e s o f n a t u r a l a n d a r t i f i c a l s e l e c t s . t h e p h y l o g e n e t i c s t u d y is i n s u ff i c i e n t a b o u t o s m a n t h u s f r a g r a m l o u r . t h e w o r k o f c u l t i v a r c l a s s i fi c a t i o n m a i n l y a c c o r d s t o m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r s , a n d i t c a n t p r o d u c e s u b j e c t c o n c l u s i o n s . t o o ff e r m o re r e a s o n a b l e e v i d e n c e s f o r c u l t i v a r c l a s s i fi c a t i o n , w e a p p l i e d r a p d t o a n a l y z e 仅户 a g r a n s c u lt i v a r s i n h e n a n p r o v i n c e a n d g u i l i n c i t y . i n a d d i t i o n , a h p w a s a p p l i e d t o a p p r a i s e o . 户 a g r a n s c u lt i v a r s i n o u r s t u d y t o o ff e r re f e re n c e s f o r i d e n t i斤 吨 a n d e x p lo r i n g o . f r a g r a n s c u lt iv a rs in h e n a n p r o v in c e . t h e m a i n re s u lt s a re s h o w e d a s f o l l o w s : a r e p e a t a b l e a n d s ta b le r e a c t i o n s y s te m w a s o b t a in e d t h r o u g h o p t im iz i n g i n fl u e n t i a l f a c t o rs . 3 0 b e tt e r p r i m e rs s e l e c t e d fr o m 1 0 0 a r b i t r a ry p r i m e rs w e re a p p l i e d t o a m p l i f y g e n o m i c d n a o f 0 . 户 a g r a n s c u lt iv a r s . 2 3 o . f r a g r a n s c u lt iv a r s c o l le c t e d fr o m g u i lin c it y w e re a n a ly z e d勿 r a p d m a r k e r s . a m o n g t h e t o t a l 1 8 6 f r a g m e n t s g e n e r a t e d b y 加p r i m e r s , 1 3 5 a p p e a r e d t o b e p o l y m o r p h i c ( 7 2 . 6 % ) . a d e n d ro g r a r n s h o w i n g g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s a m o n g t h e m w a s c o n s t r u c t e d a c c o r d i n g t o r a p d re s u l t s . g e n e t i c s i m i l a r iy c o e ff i c i e n t s r a n g e d fr o m 0 . 5 1 7 1 -0 . 9 4 2 8 , w i t h t h e m e a n o f 0 . 7 6 1 9 . t h e s e c u l t iv a r s w e r e d i v i d e d i n t o f o u r c u l t i v a r g ro u p s . r a p d m a r k e rs o ff e r i m p o r t a n t c l u e s i n s o lv i n g t a x o n o m i c p ro b l e m o f o . 夕 a g r a n s c u l t i v a r s i n g u i l i n c it y a n d a l s o o p e n u p a p a t h f o r a n a l y s i s o f o . f r a g r a n s c u l t iv a r s i n h e n a n p r o v i n c e . 1 7 s t a n d a r d o . f r a g r a n s c u l t i v a r s w e re f i x e d t h ro u g h t h o ro u g h l y i n v e s t i g a t i n g t h e m i n h e n a n p ro v i n c e . t h e i r g e n o m i c d n a w e re e x t r a c t e d a n d a m p l i f i e d b y 3 0 p r i m e rs . t o t a 1 2 4 7 b a n d s w e r e p ro d u c e d , w it h 1 6 9 b a n d s w e re p o l y m o r p h i c ( 6 8 . 4 % ) . 4 - 1 2 p o l y m o r p h i c b a n d s c o u l d b e a m p l i f i e d fr o m p e r p r i m e r , w it h a n a v e r a g e o f 8 .0 7 b a n d s . i t s h o w e d t h e re w a s a b u n d a n t g e n o m i c p o l y m o r p h i s m i n o . 户a n g r a n s c u l t iv a r s . r e s u lt s fr o m r a p d w e re c o n s i s t e n t w i t h t r a d i t i o n a l 3 j w aaw 2 0 0 4l za tf s e = e a l e t i p 3 t c u l t i v a r c l a s s l i f i c a t i o n . a h p w a s u s e d t o a p p r a is e 1 7 o . fr a g r a n s c u lt iv a r s in h e n a n p r o v i n c e a b o u t t h e a p p l i c a t i o n o f l a n d s c a p e a n d p r o d u c ti v i t y . c o l o r , p e r f u m , t i m e o f b l o o m i n g , d i a m e t e r o f t h e fl o w e r a n d o t h e r n i n e f a c t o r s h a d b e e n u s e d i n t h e a n a l y s i s . a l l c u l ti v a r s g o t m a r k s a c c o r d i n g t o t h e c r i t e r i a . s o m e c u l t i v a r s g o t h i g h e r m a r k s , f o r e x a m p l e s , o . fr a g r a n s h u a n g c h u a n j i n g u i , o . 户 a g r a n s d a h u a j i n g u i ，o . 户7g r a n s z h u s h a d a n g u i a n d o . 户 a g r a n s d a y e h u a n g yin g u i . r e s u l t s o f a p p r a i s a l s h o w e d m o s t o f o . fr a g r a n s c u l ti v a r s i n t h u n b e r g i i g r o u p a n d a u r a n ti a c u s g r o u p o b t a i n e d h i g h e r m a r k s . t h e y w e r e w e l l u s e d i n t h e a p p l i c a t i o n o f l a n d s c a p e a n d p r o d u c t i v i t y . i n t h e e n d , w e p r o p o s e d s o m e s u g g e s ti o n s a b o u t t h e e x p l o r a ti o n a n d a p p l i c a t i o n o f o c u l ti v a r s i n h e n a n p r o v i n c e a n d h o p e d t o a c c e l e r a t e t h e p a c e o f e x p l o r i n g t h e mo u r s t u d y . k e y w o r d s : o s m a n t h u s f r a g r a n s l o u r: c u l t i v a r c l a s s i f i c a t i o n ; g e n e t i c r e l a t i o n s h i p ; r a p d ; a n a l y t i c h i e r c h y p r o c e s s 河南大学 2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 1前言 1 . 1桂花及其品种分类研究现状 桂花是木犀科木犀属植物，为我国 特产， 其栽培历史长达2 5 0 0 年以 上， 是我国 十大名花 之一，素以香花著称。花有白 色、橙黄色、金黄色、淡黄色等珍贵色泽的不同品种。 花虽不 甚美，但香味幽远，深得广大人民和骚人墨客的赏识。它寿命长、病虫害少、适应性广，是 常绿阔叶树种中较耐寒的一种，在园林风景和庭院的绿化、美化、香化及盆栽装饰中均有其 独 特的 地位; 也在香料、 药 材、 食品 工 业等方面 开发利用的 潜力也很大1 1 , 2 1 。 桂花种质资 源相 当丰富，原产于我国的西南、华南及华东地区， 现四川、云南、贵州、广东、广西、 湖南、 湖北、浙江等地均有野生资源，尤以成都、武汉、南京、桂林、杭州、苏州等城市栽培最为 集中3 1 桂花在长期的演化过程中，在自 然选择和人工选择的双重作用下，形成了丰富的 变异类 型。对桂花品种演化与亲缘关系的研究，是桂花遗传多样性研究的基础，也是桂花研究中最 重要的基础领域;不但具有重要的学术意义， 而且对桂花的栽培、 育种以及园林应用具有重 要的指导意义。同梅花、 牡丹、菊花等传统名花相比，桂花的品种分类难度更大，因此， 理 论上的研究也相对滞后。 其主要原因在于:一方面，桂花花朵较小，花结构简单， 花型演化 也不明显，重瓣型、台阁等花卉品种演化中的高级花型极少出现，使得桂花品种间的差异相 对较小;另一方面，历史上虽然多有桂花的记载， 但多见于诗词歌赋中， 缺少阶段性系统总 结的 专著， 后人很难从历史的 角度把 握桂花品 种演化的 进程4 1 。 二十世纪初，日 本学者m a k i n o 和n a k a i 等人根据其各自 的研究分别给予桂花变种和种的 等 级， 即 金 桂o s m a n th u s f r a g r a n s v a r . t h u n b e r g ii m a k in o ; 银 桂o s m a n th u s f r a g r o n s v a r . l a t if o li u s m a k i n o ;丹桂o s m a n th u s f r a g r a n s v a r . a u r a n t ia c u s m a k i n o ; p . s . g r e e n ls l 认 为m a k i n o 等 人 定 名的 银桂、 金桂变种( 种) 实际上就是桂 花原变种， 而丹桂为一变型， 并 将之定 名为o . 夕 a g r a m fa u r a n t i a c u s p s . gr e e n e 行 全面 系 统的 研究 i l l . : - 十 世纪5 0 由 于资料、资源等因素的限 制， 他们均未能对桂花品 种进 年代以来， 我国学者对此项工作做了更加全面深入的调查、 研究 6 - 1 11 。 刘玉 莲 u 首 先 提出 桂 花品 种按 花期、 花 色等 分为 四 大 类， 以 后 经不 断 完善 提出 了 一 个比 较合理和自 然的五 级分类体系。 鲁涤非和朱长山 p . ” 等 人也分别提出 桂花分 类系统。 南京 河 y 钾 口 冤 翅 卜2 00 4月 祠 目 创 匕 花 开 究 生 月 r- 亡 之 y 仑 j 忆 林业大学桂花研究中 心对中国 桂花品 种进行了 初步 整理1 2 1 ， 共记 载6 2 个品 种， 分 属两类4 个 品 种群:四 季桂类 ( f r a g r a n s d i v i s i o n ) : 仅一个品 种群，即四 季桂品 种群 ( f r a g r a n s g r o u p ) 1 2 个品 种: 秋桂类 ( a u tu m n d iv is i o n ) : 包括3 个品 种群:即 银桂品 种群 ( l a t i f o l i u s g r o u p ) 1 1 个品 种; 金 桂品 种 群( t h u n b e 匆i g r o u p ) 2 5 个品 种: 丹 桂品 种 群( a u r a n t ia c u s g r o u p ) 1 4 个品种。 桂花品种分类工作正在不断加深，但从目 前来看，品种和杂交种鉴定仍极为困难，桂花 品种分类鉴定主要根据形态学、园艺学和生理学特征进行，而对这些特征的描述常受到栽培 环 境、 人为因 素的限 制， 难以 做出 客观的 结论 11 1采用同 工 酶 技 术1 3 . 14 1 ，由 于 其 所 提供的 信 息量的限制， 对表型相似的品种仍缺乏鉴别力。 近年来对桂花品种分类已 上升到分子水平， 赵小 兰等p 3 .通过采用r a p d技术分析湖北省的 部分桂花品 种，已 将分子标记成功地应用于 桂 花品种的鉴定。 1 .2植物系统分类研究中分子标记的选择 1 .2 . 1 选择分子标记的 标准 常用的 遗传标记 ( g e n e t ic m a r k e r s )大体上可分为四大类:形态标记 ( m o r p h o lo g ic a l m a r k e r s ) 、细胞标记 ( c y to l o g ic a l m a r k e r s ) 、生化标记 ( b i o c h e m ic a l m a r k e r s ) 和分子标记 ( m o le c u la r m a r k e r s ) 。 分子标 记是随分子克隆 和重组d n a技术的 发展而产生的 一类遗传标记， 近几十年来，在人类基因 组研究计划的推动下， 分子标记的研究和应用得到了迅速的发展。 与上述三种标记相比， 分子标记具有以 下优越性 1 6 1 . 直 接以d n a的形 式表现， 在植 物体 的各个组织、各发育时期均可检测到。 数量极高，遍及整个基因组。 多态性高。 表 现为中性，即不影响目 标性状的表达。 有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出 纯合基 因型与基因型， 提供完整的 遗传信息。 d n a水平上的分子标记大体上可分为两类:即以 分子 杂交为 基 础的r f l p ( r e s t r ic ti o n f r a g m e n t l e n g t h p o ly m o r p h i s m ， 限 制 性片 段长 度多 态 性 ) 和以 p c r为基础的标记 1 7 1 一个 理想的 分子标记应该符合以 下的 标准1 16 1 :多态性高， 共显 性遗传， 在二倍体的 生物 中能区分纯合与杂合状态;在基因组中频繁出 现，甚至贯穿分布于整个基因组;选择中性; 容易获得:容易操作:自 动化程度高; 重复性好;所得数据可在实验室之间交流与比较。在 河南大学2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 实验研究工作中， 研究者遇到一个首要的问 题就是:如何选择合适的分子标记p 而i t s r d n a等的d n a序列分析更适用于物种水平以上类群之间差异的 研究，这是由 于这些 序列片段相对保守，在个体间很少发生变化。而这些不同的测定位点和分子标记的选取之间 的界限又很难确定， 所以 要根据具体的研究对象、遗传背景及研究目 的来决定，同时也要考 虑到分析d n a片段或p c r扩增产物的流程，并进行效率和实验室的财力物力费用等的比 较 策略分析。 对于种群水平的研究，一方面需要了解其中的多样性水平及其种群间的 相互关系， 同时利于种群的遗传结构、 等位基因以 及种群间的 遗传分化研究等，并要求便于统计分析。 1 . 2 . 2分子标记技术的比 较 应用于遗传多样性研究和系统学研究的分子标记主要有: r f l p , v n t r , r a p d , s c a r , s s r , i s s r， a f l p , s n p 等。 各种 分子 标记 技术 之间的比 较 许多 学 者 进 行了 综 翅18 -3 4 及 研究 i3 s -6 s i ， 认为 各有优势与不 足。 如: r f l p 结 果稳定可靠、 重现性好、 共显性， 但 其实验 流程 长、 耗资大、 信息量小: v n t r具有r f l p 的优点外， 信息量较高， 但同样具有r f l p的 其他不足; r a p id及其相近的标记 a p - p c r ( a r b itr a ry p r i m e r p c r ，任意引物 p c r) 、d a f ( e )n a a m p l i f ic a t io n f in g e r p r in t i n g , d n a 扩 增 指 蜘 等 具 有 简 便 快 速、 成 本 低、 信 息 量 较大 、 引 物 通 用、 可以 不用放射性同 位素等优点， 但其为显性标记，对实验条件一致性要求严格，否则可 靠性与重现性就低;由r a p d转化而来的s c a r ( s e q u e n c e c h a r a c t e r i z e d a m p l i f i e d r e g io n , 特征序列扩增区段) 可以克服其缺陷， 但成本略有提高。 a f l p 除具有r f l p 优点外， 信息量 大， 可提供无限标记数目 ， 但其操作繁琐， 成本较高;s s r又称微卫星 ( m i c r o s a t e ll i t e )为共 显性标记，稳定可靠，信息量大，快速，可不用同位素，成本不是太高，但在其前期研究费 9 s a o r j c m 2 0 0 4居 s d -tf 9 t y .0 y i 2 表 1 - 现有检测遗传变异分子标记的特点比较 t a b l e l - i c o m p a ri s o n o n c h a r a c t e r s o f s o m e m o l e c u l a r m a r k e r s u s e d o f m e a s u r i n g g e n e t i c v a r i a t i o n o 分 子 标 记 流程准备及实 验用时 适合基 因组 种群结构分析技术难 易程度 d n a 用量 经费 消耗 等 位 酶 提取、电泳、 遗传分析 2 - -4周 两天 动物 植物 对种群遗传变异 和等位基因分析 较好 中等较高 rf l p提取，酶切， 电泳，点杂 交， 多态分析 1 - y 4月 2 - 4周 动物 植物 良好高陀 一 n g 高 小 卫 星 提取，酶切， 电泳 ，点杂 交， 多态分析 1 个月 2 - -4 周 动物 植物 相对多态性估计 良好:对研究等 位基因不易 中等嗯 . . 雌 高 微卫 星 引物筛选与 设计，测序; 然后提取 ， p c r ，电 泳， 多态性分析 2 - -6月 1 周 动物 植物 研 究 多态 性 良 好:位点少，对 等位墓因、杂和 度分析效果好 中等n g p g 高 af l p提取，酶切， 连接人工接 头，选引物， p c r ，电泳， 多态性分析 2 - 4周 1 周 微生物 动物 植物 研究多态性高， 对等位基因分析 不易 高 n g p g 高 rap d 提取，p c r , 电泳， 多态性 分析 1 - - 2周 两天 动物 植物 研 究 多态 性 良 好，对等位基因 分析不易 中等n g p g 中 dna 测序 提取， 模板制 备，p c r ，电 泳， 多态分析 2 - - 6 周 1 周 动物 植物 系统演化研究 好;种群分析繁 琐 高n g一 p g 高 时费力，代价昂贵， 简单重复序列) 有 非 一 般 实 验 室 所 能 够 做 到 的 ; i s s r ( i n t e r - s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s ， 间 隔 s s r的优点， 且费用较s s r 低。各种标记技术的相互结合， 可产生许多新 标记技术，目 前已 有几十种，且各有其特点。 研究者可根据研究的对象、目 的及研究深度加 以 选择。 在系统学研究上，多数研究者看中质体 d n a标记 ( 或基因序列) ， 但是生物进化包 河南大学2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 含核、 质两个基因组的共同 进化， 且核基因组对生物的影响更大， 因而核d n a标记的 研究 对 系统学研究更具意义。 1 .3 r a p d标记的原理及应用 1 . 3 . 1 r a p d技术简介 r a p d技 术 是由w i l l a m s 16 6 等 和w e ls h 6 7 1 等 两个 研究 小组 儿 乎同时 独立 发 展 起 来的 一 种 新的d n a分子 标记技术。 它以p c r ( p o ly m e r a s e c h a in r e a c ti o n , 聚合酶链式反应) 技术为 基 础， 由 一系列人工随机合 成的 寡核普酸单 链( 一般为1 0 饰) 为引物， 以 所 研究的基因 组d n a 为模板进行p c r扩增。如果引物与某一片段的 模板d n a具有互补的核昔酸序列，该引物就 会结合到单链模板d n a上。引物结合位点若在模板d n a的两条链上有互补的位置，且引物 3 端 相 距 在 一 定 长 度 范 围 内( 约2 0 0 0 b p ) , 就 能 以2 n 方 式( n为 循 环 次 数) 扩 增 出d n a 片 段6 8 r a p d的机理: 对于 任意特定的引物，它同基因组d n a序列有其特定的结合位点， 如果 基因组在这些区域产生d n a片段的 缺失、 插入或碱基突变就可导致这些特定结合位点发生相 应的变化，导致扩增产物长度变化或产物的出 现或消失， 表现为有或无特定的扩增条带， 提 供不同 个体间d n a多态性分析的依据， 因 此通过p c r产物的 检测就可检侧出基因 组d n a在 这些区域的多态性。 r a p d技术的 特点: 无须知道受试机体基因组d n a序列， 因而适用于所有生物; 只 需极少量的基因组 d n a ，且无需借助于有伤害性的同 位素: r a p d操作简单、方便、 快 速，它可以 直接对生物基因组d n a进行多态性分析; 相对于其他分子标记， r a p d费用 低廉， 能 迅速提供重建系统 发育史 所需要的 大量遗传标记6 9 r a p d引物与常规p c r的己知序列引物不同， 其碱基序列是随机的， 但对一个特定的引 物，它在基因组上有其特定的 结合位点，只要该位点在基因组某些区域的分布符合p c r扩增 条件，就可扩增出相应的d n a片段，虽单一引物检测基因组d n a多态性区域有限，但一系 列引物可以 扩大检测区域，甚至整个基因组范围。 r a p d技术由于效率高、 样品用量少、 灵敏度高、 检测容易、费用低廉、事先无需知道相 关序列及其引物通用性等优点，己广泛地应用于遗传多样性、突变体监测、遗传图谱构建、 1 1 w 7 tr p- * 2 0 0 4月 -x 2 -v f 究 生 学 位 i 仑 文 标记辅助选择、品种鉴定、系 谱分析、 基因 定位及系统学等诸多领域6 8 1 。 但值得注意的是: r a p d标记是显性标记，因此杂合体与显性纯合体不能被区分。同时r a p i d 对实验条件的一 致性要求较严格而导致的重复性及显性表达等问题， 对其在系统学研究中的应用带来了一定 局限 性， 一般多 应用于种下等级或居群 ( p o p u la t io n ) 遗传多样性研究。 但许多 证据 证明 其可 以用于研究种间关系，现也已较多地应用于植物属下等级的分类及系统进化研究，如:山茶 属 ( c a m e ll i a l . ) 、大豆属 ( g ly d n e w i l ld . ) 、慈 姑属 ( s a g itt a r ia l . ) ,葱属 ( a l l i u m l . ) 、山 羊 草属 ( a e g i lo p s l . ) , 芸苔属( b r a s s ic a l .) 、 委陵菜属( p o t e n t f l la l .) .核 桃属 ( j u g l a n s l . ) 、金 发 醉 属p o ly t r ic h a m h e d w .) 等 ( 16 1 ， 并 在 不 断 增 加 ; 也 有 用 于 属 间 关 系 研 究 的 报 道一 些 学 者 对r a p d标记的同 源性和可靠性提出了 看法， 但研究表明只要优化确定了p c r扩增的 最佳条 件 并 使之 保 持 一致， r a p d的 重 现性、同 源 性、 可靠 性是 有保障的 7 0 . 7 11 。 不 过在 研究 亲 缘关 系较远的物种关系时应谨慎。 1 . 3 . 2 r a p i d 标记在观赏植物分类中的 研究进展 观赏植物的分类与植物学意义上的植物分类是有区别的。植物分类一般只需到种、 变种 和变型， 而观赏植物由于生产和应用上的需要往往要鉴定到品 种。而有些物种， 例如菊、 梅 等在长期的人工栽培和自 然选择条件下形成了大量的品种，有时需要将它们系统地进行分类， 研究它们之间的 进化和亲缘关系， 单纯依靠形态是不够的 圈。 随着分子标记的 兴起， 它 越来 越多地被用来解决观赏植物品种分类中的难题。通过形态特征无法辩认的品种用分子标记就 可解决，为观赏植物的起源、品种鉴定、判定品种纯度以 及阻止侵犯新品种专利提供有利证 据。 绝大多数观赏植物，包括最重要的切花和盆栽植物在基因水平上还研究甚少。分子标记 在观赏植物中的 应用深度与广度与大田 作物相比还很有限。 r a p d与等位酶已 应用于品种鉴 定、 遗传关系分析以及种质多样性方面的研究。 有的对不同标记在植物育种上的有效性进行 了探讨，并对寻找与目 的荃因连锁的分子标记的连锁进行了研究。 近年来 r a p i d技术己 较多 应用于观赏植物的遗传多 样性分析与品 种鉴定7 3 1 r a p i d 技术从1 9 9 。 年推出至今已广泛应用于花卉品种分类与遗传多样性研究。 n o b u o等用随机引物 e d o- k i r s h i m a 系9 个品种和 o p k - 1 9或 o p k - 2 0就能清晰鉴别杜鹃花 ( r h o d o d e n d ro n .l) 系的1 4 个品种， 1 2 这两个引物还能区分k o u z a n 及其芽变品 河南大学2 0 0 4 届硕士研究生学位论文 种l c nw 2 0 0 4月 不 目 t a f 9 c . a p c dq 3 : 2 0 a 1 的反 应体系中， 我们对d n t p 浓度 ( 0 .2 , 0 . 1 5 , 0 . 1 , 0 .0 5 m m o u l ) , m g + 浓度 ( 2 .5 , 2 .2 5 , 2 .0 , 1 .7 5 , 1 .5、 1 .0 m m o 四、模板浓度 ( 8 0 , 7 0 , 6 0 , 5 0 , 4 0 , 3 0 n g ) 、 引物、 t a q 酶、 b u ff e r 进行了浓度梯度筛选。在反应程序中，以退火温度及时间影响最大。我们分别采用 3 5 0c , 3 6 和3 7 三种退火温度和l m i n , 2 m i n 两种退火时间， 最后选定用3 7 0 c , l m i n 作为 退 火 温 度 及 时 间 。 通 过 多 次 预 试， 最 终 我 们 采 用了 总 反 应 体 积2 0 11 1 : 1 0 x b u ff e r 2 u l , mgcl2 2 .2 5 m m o n d n t p 0 .2 m m o l/ l p r i m e r 0 .2 u m o l/ l d n a约5 0 n g , t a q 酶1 .0 u 的反应体系。 从预实验结果看，只要采用优化的反应条件， 注意无菌操作时的规范性，并尽量采用同一批 次的试剂， r a p d扩增结果的重复性良 好。 工 1 . 2 引物筛选 通过对购自 上海生物工程公司的1 0 0 个随即引物的 初选和复选，结果共获得7 8 个引物有 扩增条带， 其中3 0个引 物 ( 见表 3 - 1 )的扩增结果重复性好， 有稳定的多态性条带而且比 较 清晰适宜。 表3 - 1 适宜的3 0 个随机引物及碱基序列 t a b l e 3 - 1 3 0 引物编号 pr i me r no . 核昔酸序列 ( 5 - 3 ) r a n d o m p r i m e rs a n d 弓 i ek 编 -k pri me r no . s 7 s 4 3 s 4 8 s 5 5 s 9 2 51 2 7 s1 6 6 51 9 3 s 2 5 2 5 3 8 5 5 4 0 8 s 5 1 3 s1 0 7 0 s1 0 9 4 s飞