（微生物学专业论文）乳酸乳球菌hdbr06产nisin高产菌株的选育.pdf

中文摘要 中文摘要 乳链菌肽( 简称n i s i n ) ，又称乳酸链球菌素或乳酸链球菌肽，是乳酸乳球菌 ( k c f d c d c c 淞肠c 廊) 产生的一种小分子多肽。它能抑制大部分革兰氏阳性菌及其 芽孢的是生长和繁殖，因而广泛应用于食品防腐中，是一种高效无毒的天然防腐 剂。随着应用研究的深入，n i s i n 应用范围目前已扩展到造纸、活性食品包装、农 业饲料、生殖避孕、医学移植等领域。由此可见，n i s i n 的开发和利用对促进我国 绿色食品和保障人民的食品安全具有重要意义。 本文主要对n i s i n 高产菌株进行选育并对其最佳发酵培养基进行了优化。首先 对乳酸乳球菌h d b r 0 6 进行紫外线诱变、n t g 诱变、d e s 诱变、以及d e s 和紫 外线复合诱变多次诱变处理，获得一株高产突变株d u l 0 1 ，n i s i n 效价由最初的 4 4 5 i u m l 提高到1 3 8 9 i u m l ，约是出发菌株h d b r 0 6 的3 1 2 倍。传代试验表明， 该菌株的遗传性能较稳定。 然后对高产突变株d u l0 1 的发酵培养基进行了优化。以m r s 培养基为基础 培养基进行单因素试验，确定葡萄糖和玉米浆分别为发酵培养基的碳源和氮源。 采用p 1 a c k e t t b u m a l l 设计对培养基中相关影响因素的效应进行评价，并筛选出了 对效价影响显著的因素葡萄糖和无水乙酸钠。然后采用中心组合设计和响应面分 析确定了最佳发酵培养基，并进行了验证试验。优化后的发酵培养基组成为：玉 米浆5 9 l ，葡萄糖6 5 7 9 l ，柠檬酸铵3 9 l ，k 2 h p 0 42 9 l ，无水乙酸钠7 1 1 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 l ，m n s 0 4 h 2 0o 0 5 9 几，吐温8 02 m l l 。在最优培养基中，发 酵液中n i s i n 效价达到1 5 6 4 i u m l ，比优化前提高了1 2 6 ，是出发菌株h d b r - 0 6 的3 5 1 倍。 关键词：乳链菌肽；诱变育种；响应面分析法：优化 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t n i s i ni sas m m lm o l e c u l a rp e p t i d ew h i c hi sp r o d u c e db y 肠f ，o c d c c 船肠c 佛i tc 柚 i i l l l i b i tm a n yg r a mp o s i t i v eb a c t 甜aa sw e l la st 1 1 e 伊o w t ha 1 1 dp r o d u c t i o no ft h e i rs p o r e s ni sw i d e l yu s e di nt l l e6 e l do ff o o dp r e s e a t i o na san a m r a lf o o dp r e s e r v a t i v ef o ri t s h i 曲一e 衢c i e n ta 1 1 dn o 印o i s o n o u sn 撒鹏n l ea p p l i c “o nf i e l do fn i s i l lh a sa l r e a d y e x p a n d e d t o p 印e rm a b n g ， f o o d p a c k i n g ，a g r i c u l t u r a lf e e d ，p r o c r e a t i o n a n d c o m r a c e 皿o n ，a i l dt h em e d i c a 】t r 锄s p i a n t a t i o nr e a l m s 1 1 1 ee x p i o i t a t i o no fn i s i n 晰i l p r o m o t e 也ed e v e l o p m e n t0 fg r e e nf o o di n d u s n 了a u l dg u a r a n t e en l ef o o ds a f e 够 i nt l l i sr e s e a r c h ，t h eh i g hy i e l d sn i s i n - p r o d u c i n gb a c t e r i aw a sb r e e d e d 锄ds c r e e n e d 、砌l ei t sc u l t i v a t i o na n dt h ef e 册e n t a t i o nm e d i 啪w 2 l so p t i m i z e d 1 1 1 eh i 曲l y n i s i n - p r o d u c i n gm u t 锄ts t r a i nd u l 0 1w a so b t a i n e d 舶mh d b l 0 0 6b ys e r i e so f n l u t a g e n e t i c 骶a 嘶e 她i e u vn t gd e s ，a i l dd e s & u vt h ea c t i v 毋o fn i s i l lo f d u l 0 1w a s1 3 8 9 i u m l ，w b j c hw a s3 1 2t i m e sm o r et h a nt l l ei n i t i a l 蛐r a i l lh d b r 0 6 s u b c u l t u r et e s ti n d i c t e dt 1 1 a tm eh e r e d i t a 巧c h a r a c t e ro fd u101w a ss t a b l e 心e rs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sb a s e do nm r sf e m e m a t i o nm e d i 呦，c o ms t e e p l i q u o ra n d 舀u c o s ew e r ed e t e 疵n e da sc a r b o na 1 1 d 伍仃) g e ns o u r c e sr e s p e c t i v e l y t h e n 廿l ef e h n e n 缎i o nm e d i u m0 ft h em 我m ts t r a i nd u l0 1w a so p t i 商z e d f i r s t l y ， p 1 a c k e m b l l 珊a 1 1d e s i 驴w a su s e dt oe v a l u a t e t l l ei n n u e n c e so fa j lr e l a t e df a c t o r si n f e 珊e n t 撕o nm e d i u m t h er e s u l t ss h o 、v e dt h a tg l u c o s ea 1 1 dn a a c 、e r e 山em a i n 盛c t i n g 蠡l c t o r sw 1 1 i l et h eo t l l e ra d d i t i v e sh a dn os i 鲥f i c a n te 蜀f e c t s0 nt i t r eo fn i s i n t 1 1 e nt h eo p t i m u mf e r m e m a t i o nm e d i u mw a sd e t 锄i n e da c c o r d i n gt oc c d ( c e n t m l c o m p o s i td e s i g n ) a n dr e s p o n s es u 而c ea n a j y s i s 谢t 1 1s a ss o 炯，a r e t h eo p t i i i l m f e 衄e m a t i o nm e d i u mf o rn i s i i lp r o d u c t i o nw a s ：c o ms t e 印l i q u o r5 9 l ， g l u c o s e 6 5 7 9 几，c i t r i ca c i da i i 皿o n i 啪3 9 l ，k 2 h p 0 42 9 几，n a a c7 1 1 9 l ，m g s 0 4 。7 h 2 0 0 2 9 l ，m n s 0 4 h 2 00 0 5 9 l ，t w e e n8 02 m l l 。u n d e rt h j sf e l l l l e n t a t i o nm e d i u m 1 1 ab s t r a c t c o n d i t i o n ，廿1 ea c t i v i 哆o fn i s i no fd u1o1w a s15 6 4 i u m l ，w h i c hi s 3 51t i m e sm o r e t 1 1 a nt h ei n i t i a ls t r a i nh d b r 一0 6 k e yw o r d s ：n i s m ；m u t a t i o nb r e e d i n g ；r e s p o n s es u r f - a c ea n a l y s i s ；o p t i m i z a t i o n i 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉婆太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名： 准思以 l 签字日期：勰年易月易日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨虚婆太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕴婆太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名： 稚危忒 导师签名： 签字日期：删艿年? 月胁日签字日期：硼8 年多月房日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章前言 第1 章前言 食品的防腐保鲜在食品工业中一直是很重要的问题。为了防止食品腐败变质， 延长食品的保藏期，人们采取的主要方法是在加工过程中添加适量的防腐剂。从 现在使用的防腐剂的组成看，主要是化学防腐剂，它对人体有或多或少的毒害作 用，对自然界的生态环境也会产生不利的影响，这些特点决定了其使用具有局限 性。随着人民生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念已经越来越被大众接 受，对高效、无毒的天然防腐剂的研究和应用越来越引起人们的重视。 乳链菌肽( 简称n i s i n ) 又称之为乳酸链球菌素或乳酸链球茵肽，是一种由乳 酸乳球菌( 上口c f d c d c c 螂肠c 协) 代谢产生的具有很强杀菌作用的细菌素，是国际上 允许商业化生产的食品防腐剂【j 】，而且是目前世界上公认的安全、高效、无毒的天 然食品防腐保鲜剂。它能有效抑制引起食品腐败的细菌和孢子，延长食品货架期； 同时又是一种食品品质改良剂，可降低食品灭菌温度，缩短食品灭菌时间，节省 能耗，从而降低生产成本，提高食品口感，使食品保持原有风味，减少营养破坏， 延长食品保藏时间；还可减少或部分取代某些化学合成防腐剂。并且随着应用研 究的深入，其应用范围目前已扩展到造纸【2 1 、活性食品包装【3 一、农业饲料【5 1 、生殖 避孕【6 、医学移植【8 1 等领域。因此，n i s i n 的广泛应用，对提高食品档次、保障食 品安全和人体健康具有重大作用，产生了良好的经济效益、社会效益和环境效益。 n i s i n 是由微生物发酵而产生的。目前国内对于n i s i n 的发酵生产【9 以1 j 以及理化 性质【1 2 0 4 】的研究较多。本文针对目前的研究成果，将从n i s i n 的基本性质、诱变育 种方法、发酵条件优化及其应用等方面进行介绍。 1 1n i s i n 简介 1 1 1n i s i n 的发现和研究概况 1 9 2 8 年，r o g e r s 和w 1 1 i t t i e r 首次发现乳酸乳球菌的代谢产物能够抑制其他乳 酸菌的生长f 1 5 ，1 6 1 。1 9 3 3 年在新西兰【1 7 1 、1 9 4 3 年在英格兰【1 8 】也发表了相似的报道， 黑龙江大学硕士学位论文 并且分离了这种物质，证明它是一种多肽。1 9 4 4 年，m a n i c k 和h i r s c h 证明该物质 可抑制许多革兰氏阳性菌，由于它是血清学n 群中的一些乳酸乳球菌所产生的具 有蛋白质性质的抑菌物质，所以将其命名为“g r o u pni 1 1 h i b i t o r ys u b s t a n c e ，即n 群抑菌物质，简称n i s i n 【1 9 】。 早期对于n i s i n 和其特性的研究主要集中在医用和兽用临床抗菌剂的应用。但 是由于它的抑菌谱范围较窄，在体液中的溶解度较低，在生理酸碱度( p h 值 7 肚7 5 ) 时不稳定以及胰凝乳蛋白酶对其活性的破坏作用，使n i s i n 作为药物应用 的潜力失去了基础| 2 0 】。 n i s i n 用于食品防腐剂最早是在1 9 5 1 年由h i r s c h 等人【2 1 】提出的。之后， m c c l i n t o c k 等人【2 2 】应用类似的方法进行加工奶酪的梭状芽孢杆菌控制实验，大大 减少了在加工过程中梭状芽孢杆菌引起的奶酪的损失。1 9 5 3 年，英国a p p l i n & b 黜t t 公司率先生产出具有高度活性的n i s i n 浓缩物“n i s a p i n ”，并首次以商品的 形式进行出售。1 9 6 9 年，f a 0 愚啊o 食品添加剂联合专家委员会批准n i s i n 作为一 种生物型防腐剂应用于食品工业【2 3 】。1 9 8 8 年美国食品和药物管理局( f d a ) 也正 式批准将n i s i n 应用于食品中。1 9 9 0 年3 月2 9 日中国卫生部将其列入g b 2 7 6 0 8 6 的1 9 9 0 年增补品种中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品。1 9 9 2 年3 月，我国卫生部在批准实施的文件中明确指出：“可以科学地认为n i s i n 作为 食品保藏剂是安全的。”。目前已有5 0 多个国家和地区批准n i s i n 可以作为一种纯 天然食品防腐剂使用【2 4 1 。 1 1 2n i s i n 的结构和性质 1 1 2 1n i s i n 的结构 早在1 9 7 1 年，g m s s 和m o r e l l 就己阐明n i s i n 分子的完整结构【2 5 1 。成熟的n i s i n 分子是由3 4 个氨基酸残基组成的多肽，分子式为c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 ，分子量为 3 5 l o d a ，属于羊毛硫细菌素( l a n t i b i o t i c s ) 。n i s i l l 分子结构有五个硫醚键形成的分 子内环，一个是羊毛硫氨酸，其他四个是b 一甲基羊毛硫氨酸【2 6 1 ，其活性分子多以 二聚体和四聚体的形式出现，相对分子量分别为7 0 0 0d a 和1 4 0 0 0d a 。n i s i i l 不含 第1 章前言 芳香族氨基酸，在2 8 0 胁无吸收峰。 n i s i n 天然状态下有三种形式，分别为n i s i na ，n i s i n z1 2 7 】a 1 1 dn i s i nq 【2 8 1 。其 中n i s i i a 和n i s i n z 两者差别在于氨基酸顺序中的第2 7 位氨基酸不同，在n i s i n a 【2 9 】 ( 图1 1 ) 中的是组氨酸，在n i s i n z 中的是天冬氨酸。而n i s i n q 与n i s i n a 有四个 氨基酸不同，1 5 位由缬氨酸代替了丙氨酸，2 1 位由亮氨酸代替了甲硫氨酸，2 7 位 天冬氨酸代替了组氨酸，3 0 位由缬氨酸代替了异亮氨酸【3 0 1 。在同样浓度下，n i s i i 亿 的溶解度和抑菌能力比n i s i n a 要强。 x ，h ，h 图1 1n i s i n a 的分子结构( n i s i n z2 7 位为天冬氨酸) 【2 9 】 f 味1 1s 仃u c t u r eo f n i s i na ( n ep o s i t i o n2 7o f n i s i n zi sa s p a 孵i n e ) l 2 列 r m a b a = 氨基丁酸d h a ；脱氢丙氨基d h b = p 甲基脱氢丙氨酸 a l a - s a l a = 羊毛硫氨酸a b a s - a l a 兰b 一甲基羊毛硫氨酸 1 1 2 2n i s i n 的溶解性 n i s i l l 是一种灰白色或略带黄色的易流动的粉末，由于其具有亲水和疏水两重 性，即在n 末端存在大量的疏水残基，在c 一末端存在着亲水基团，易溶于极性溶 剂中。n i s i n 的溶解度一般随p h 值下降而提高，p h 值2 5 时溶解度为1 2 ，p h 值 5 o 时溶解度下降到4 ，在中性及碱性条件下几乎不溶解【3 1 1 。 1 1 2 3n i s i n 的稳定性 n i s i n 的稳定性主要取决于p h 值和温度。n i s i n 在酸性条件下具有极高的稳定 黑龙江大学硕士学位论文 性，随着p h 的升高其稳定性降低。n i s i n 在p h 值3 的稀盐酸中经1 2 1 加热1 5 m i n 高温灭菌仍能保持1 0 0 的活性。当p h 值超过4 时，特别是在加热条件下，它在 水溶液中迅速失去活性，其抑茵效果的最佳范围是p h 值6 5 6 8 ，但在这个范围 的稳定性最差f 3 2 】。在一定温度范围内，随着温度的升高，它的活性丧失增加。当 n i s i n 加入到食品中，则受到介质的保护，一些大分子食物如牛奶，肉汤等可使其 稳定性大大增强【3 3 】。另外，n i s i n 的稳定性还与热处理时间、食品保藏的温度及时 间等有关。 1 1 2 4n i s i n 的生物学特性 研究表明，n i s i n 对c 【凝乳蛋白酶、胰腺酶、消化酶、唾液酶等很敏感，但对 粗制凝乳蛋白酶、脂酶、淀粉酶不敏感。酸性条件下，1 0 0 ，1 0 m i n ，对链霉蛋白 酶不敏感，抗菌素交叉抗性研究表明n i s i l l 与其他抗菌素如青霉素、链霉素、红霉 素等无交叉抗性f 3 4 】。 1 1 2 5n i s i n 的安全性 n i s i n 是一种多肽，可被人体内的胰凝乳蛋白酶降解成氨基酸，因而不会在体 内残留，也不会改变肠道正常茵群或造成体内致病菌的抗药性。目前对n i s i n 已进 行的生物学特性研究包括毒性、致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、 脑功能、应激反应及动物器官病毒学等，都证明n i s i n 是安全的【3 5 】。 1 1 2 6n i s i n 的抑菌活性 n i s i n 的抑菌谱较窄，它对许多革兰氏阳性菌及其芽孢有强烈的抑制作用【3 6 1 。 早期的研究认为n i s i n 对革兰氏阴性茵无抑制作用，但近期研究表明，在螯合剂如 e d t a 存在下可以抑制沙门氏菌( 勋7 所d 船p ，肠印s p p ) ，大肠杆菌( b c 办仃七厅缸c d z f ) 和铜绿假单胞菌( a p 甜如坍d 嬲口口p ，醒锄d - 馏) 等革兰氏阴性菌f 3 7 1 。新型的食品冷冻 防腐技术如经超高流体静压力( u l 仃ah i 曲h y d r o s t a t i cp r e s s u r e ，u h p ) 和脉冲电场 ( p u l s e de l e c t r i c 蠡e l d ，e p ) 技术也可以使大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌对n i s i n 敏感 【3 8 1 。n i s i n 对霉菌、酵母没有抑制作用，但对利用酵母代谢产物的细菌却有很好的 抑制作用。 第1 章前言 1 1 3n i s i n 的抑菌机理 研究表明n i s i n 作用的起始靶位点是在敏感菌的细胞膜上，n i s i n 与细菌膜相 互作用，通过结合、插入、孔道形成等多步过程形成孔道复合物【3 9 1 ，耗散质子动 力( p t o t o nm o t i v ef o r c e ，p m f ) 成分。质子动力包括化学组分( p h ) 和电子组分 ( 膜势、| ，) 。n i s i n 导致的质子动力耗散会中止细胞的一系列能量依赖反应、导致 细胞内小分子溶质( 筒r p ，氢基酸、离子等小分子) 迅速渗漏1 4 0 1 ，p h 和、i ，完 全分散，使生物合成快速停止。p m f 的破坏诱导了细菌素活性，敏感菌细胞需能 反应休止而死亡。 n i s i l l 可通过两种方式形成孔道，一种是n i s i l l 在微摩尔级浓度下形成无靶目 标( 即无1 i p i di i ) 介导的孔道；另一种是n i s i n 在纳摩尔级浓度下通过细菌细胞膜 上的1 i p i di i 介导形成孔道，同时n i s i n 与l i p i di i 的结合抑制肽聚糖的生物合成【4 。 1 1 3 1 无靶目标的子l 道形成模型 目前关于n i s i n 形成无靶目标的孔道机制主要有桶板模型( b 雠1 姗em o d e l ) 和楔入模型( w e d g em o d e l ) 。两种模式都认为n i s i n 最初通过一定程度的静电相互 作用与靶细胞膜结合，不同处在于n i s i n 分子插入目标质膜的模式，即质子动力 ( p m f ) 的成分( 、l ，或卸h ) 增强插入作用( 桶板模式) 或介导插入作用( 楔入模式) 。 在两种模式中多个n i s 证分子排列在孔道的周围，n i s i l l 的疏水的侧面朝向脂质膜， n i s i n 的亲水侧面均朝向孔道的内腔，如图1 2 所示【4 2 1 。 ( 1 ) 桶板模型( b a r r e l s t a v em o d e l ) 该模型认为n i s i n 分子的c 端通过静电引力与磷脂结合，n 一端插入膜脂，整 个分子呈现相对于膜表面几乎平行的方位，而n i s i n 的出现引起了该区域磷脂局部 转移，导致细胞膜明显变薄，以膜电势依赖方式插入脂质膜，通过多个分子与膜 作用聚集而形成孔道，此时v 决定了n i s i l l 分子采用的跨膜方向。 ( 2 ) 楔入模型( w e d g em o d e i ) 该模式认为n i s i l l 担当阴离子载体( i o n o p h o r e ) ，粘附于膜的表面，引起磷脂 分子极性基团的紊乱，通过p 的成分( v 或p h ) 改变n i s i n 分子相对于膜平 黑龙江大学硕士学位论文 面的方向，从而插入到膜中，形成多n i s i n 分子的楔形孔道【4 3 】。目前对n i s i n 与膜 的相互作用还未完全了解，磷脂是否是孔道的活性成分仍未研究清楚，而且这些 模型还未考虑n i s i n 与膜上全部成分的结合。 a 注：( a ) 桶板孔道；( b ) 、( c ) 孔道形成的常规模型。第1 步：n i s i n 分子的c 端与膜结合。第2 步：n i s i n 分子插入膜中。第3 步：楔形孔道。( b ) 与( c ) 分别表示最初由c 端或n 端移位的孔 道形成。第4 步：n i s i n 分子移位到膜的内侧。 图1 2n i s i n 无靶目标的孔道形成模型耳j j f i g 1 2m o d e lo fn o n t a 唱e t e dp o r ef o 册a t i o nb yi l i s i n 【4 3 】 1 1 3 2l i p i di l 介导的孔道形成模型 在膜模型试验中，n i s i n 的作用浓度为微摩尔级，而在使用完整的细菌细胞时， n i s i n 的最低抑制浓度( m i c ) 却是纳摩尔级，这是由于n i s i n 运用“p i di i ( 细菌 萜醇焦磷酸- n 乙酰胞壁酸一五肽- n 乙酰葡萄糖胺，u 1 1 d e c 印r e n y l p y r o p h o s p h o r y l m u r n a c 一( p e n t a p 印t i d e ) 一g l c n a c ) 作为孔道形成的锚定部位而造 成的【4 4 1 。通过l i p i di i 作为靶目标介导孔道形成，阻止了l i p i di i 参与肽聚糖的生 物合成，从而抑制了细菌细胞壁的生物合成，也使n i s i n 的m i c 从微摩尔级降到 纳摩尔级，增加了n i s i n 的活性。 在该模型中n i s i n 的n 一端首先与l i p i di i 朝向外侧的糖类部分以1 ：1 的比例结 合；然后n i s i n 的c 端由于铰链区的作用发生弯曲而插入膜中，从而进行跨膜，而 此时n i s i n l i p i di i 复合物部分也随之进入膜中从而形成孔道，如图1 3 所示【4 5 】。 图1 3l i p i di i 介导的孔道形成模型 f i g 1 3t h el i p i di im o d e l f o rt h en i s i np o r e f - o 册i n 一4 5 l 1 1 4n i s i n 的生物合成 1 1 4 1n i s i n 生物合成基因簇 早期的研究认为编码n i s i n 生物合成的基因位于质粒上【4 6 ，4 刀，但随着研究的深 入，研究者发现与n i s i i l 生物合成有关的基因是以基因簇的形式存在于与染色体可 接合的约7 0 k b 的转座子上【4 引。 n i s i n 生物合成基因簇由1 1 个基因组成，位于转座子中一段1 3 1 5 k b 的d n a 片段上，以刀垃4 仞b 砌p ，z 捌，和，2 栅的顺序排列，如图1 4 所示【4 9 1 。 pi rpp i l - 施弦狻寥埔隘嘲睨励劾栏岁_ 舢睁删哪 膪a腑8偾丁旆c 蒯脚黼黼，舻椎腑g 赫am a 蕾艇酬蜘h n 岫nm “i 描瞳幻n 矾f 翻i r i j 峥翻吲峨瞄净增胡山岫- _ 删m 哼 图1 - 4n i s i n 生物合成基因簇【4 9 】 f i g 1 - 4b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e ro f n i s i n l 4 9 】 在这些基因中，刀旭馏作为n i s i n 前体结构基因编码一个5 7 个氨基酸残基的 多肽，其前导肽部分为2 3 个氨基酸残基【5 0 】。刀括b 和刀括c 编码有关于翻译后修饰 的膜结合蛋白，将丝氨酸和苏氨酸脱水加工成脱氢丙氨酸和脱氢丁氨酸，从而形 成5 个脱水残基与半胱氨酸结合形成( b 甲基) 羊毛硫氨酸环的硫醚键【5 1 1 。，z 括丁 黑龙江大学硕士学位论文 编码与a b c ( a r p b i n d i n gc a s s e t t e ) 输出蛋白有同源性的转运蛋白，从而将修饰的 n i s i n 前体转运到细胞膜外【5 2 】。，2 翘p 编码一个类似s u b t i l i s i n 的胞外具有水解活性的 蛋白酶。在n i s i n 前体跨膜转运到胞外，类似s u b t i l i s i n 的蛋白酶将前导肽切除从而 形成成熟的n i s i n 。栅汀和，z 西砸g 编码的产物使n i s i n 具有两种免疫机制。，2 甜编 码一种脂蛋白，与n i s i n 分子结合使它们不与脂质双分子层接触；”括尼g 编码类 似a b c 的转运蛋白清除侵入膜中的n i s i n 分子使它们重新返回胞外。终纽r 和行括k 作为双组分调节基因，分别编码一个相应调节蛋白和组氨酸激酶【5 3 1 。 1 1 4 2n i s i n 生物合成途径 在n i s i n 的生物合成过程中，首先位于细胞膜上的组氨酸激酶( n i s k ) 感应到 胞外信号n i s i n 分子进行自我磷酸化；之后将磷酸基团转移给相应调节蛋白 ( n i s r ) ，激活1 1 i s z 启动子转录，导致下游基因表达，从而在核糖体上合成未经 修饰的n i s i n 前体：接着n i s b 和n i s c 对n i s i n 前体进行脱水而形成硫醚键；经翻 译后修饰的n i s i n 前体在a b c 输出蛋白n i s t 水解a t p 提供能量的条件下而被跨 膜转运到胞外；最后n i s p 切去n i s i l l 前体的前导肽，形成有活性的成熟的n i s i n 分 子【5 4 】，如图1 5 所示【5 5 1 。 图1 5n i s i n 生物合成途径【5 5 】 f i g 1 5b i o s y n t h e t i ca p p t - o a c ho fn i s i n 【5 5 】 一8 一 第1 章前言 1 1 5n i s i n 的检测方法 n i s i n 的检测方法主要分为液体检测法和固体检测法。最初研究者采用甲基蓝 还原法测定n i s i n 活性，后来又逐渐发明了生长延迟期法、比浊法【5 6 】和试管稀释法 垆刁等液体检测法。虽然这些方法能够快速得到结果，但由于操作繁琐，条件不易 控制，结果不够稳定，而被逐步淘汰。 固体检测法，亦称琼脂扩散法，是目前n i s i n 活性的主要检测方法。其原理是 利用琼脂表面检测菌的生长显示出抑菌效果，为消除干扰因素的影响，常使n i s i n 标准液与未知样品在同一平板上扩散，并由它们的抑菌圈直径及标准液效价换算 出未知液的效价该方法是由t r 锄e r 等人1 5 8 】建立起来，由于其特别适合于测定食 品中n i s i n 含量而倍受国内外学者的关注。w r o l f l 5 9 1 等人对此法进行了改进，采用藤 黄微球菌( 蚴c m c c 螂胁f p 螂) 为指示菌，琼脂浓度为o 7 5 ，检测培养基加l n a 2 h p 0 4 ，提高了分析灵敏性和精确度。 国内许多学者对n i s i i l 效价测定的最适条件也进行了研究，研究发现采用琼脂 扩散法过程中，琼脂浓度、培养温度、指示菌液浓度、吐温2 0 添加等方面对的 n i s i n 效价测定均有较大影响。伊守亮等人唧】对管碟法测定n i s i n 效价的条件进行 了研究，考察了几个参数的影响，得出了n i s i l l 测定的最佳条件：9 0 m m 培养皿中 培养基加量为1 5 n 1 l ，n a 2 h p 0 4 质量浓度1 9 d l ，菌悬液浓度1 0 9 c f u m l ，琼脂质 量浓度1 9 也，培养基p h 值7 o ，牛津杯中样品加液量1 0 0 此。张国只等人【6 1 ，6 2 1 对 影响琼脂扩散法测定n i s i n 效价的四个主要因素研究表明，0 7 5 琼脂的效价检测 培养基、0 5 1 - w e e n 2 0 的添加以及3 0 培养条件，可提高n i s i n 效价测定的灵敏度 和精确性；4 预培养有利于n i s i n 在琼脂中的扩散。吴琼【6 3 】对菌液效价测定的影 响进行了研究，发现菌悬液浓度在1 07 c 舢m l ( 或o d 6 0 0 值在0 1 6 2 附近) 时，抑 菌圈出现早，最容易观察和测量。而焦世耀等人畔j 采用黄色微球菌为检测菌株， 菌悬液的o d 6 0 0 值为0 0 8 时准确度和灵敏度最高。为了消除标准品和样品所产生 差异对测定的影响，辛宇等【6 5 】对二剂量法的主要影响因素进行了研究，确定了效 价计算的c + + 运算程序，提高了测定n i s m 效价的准确性。但运用该法检测所需时 黑龙江大学硕士学位论文 间超过2 0 h 的培养才能观察到清晰的抑菌圈从而得到准确的结果。 为了解决琼脂扩散法测定n i s i n 效价时间长的问题，引进了分光光度测定法。 吴兆亮等人【删利用藤黄微球菌作为指示菌，在6 0 0 n h l 波长下测定吸光度值，通过 乳链菌肽浓度与检测菌吸光度之间的函数关系准确测量n i s i n 的效价，重复性较好。 随着技术的发展，人们也应用了许多其它的方法来检测n i s i n 的含量，包括9 6 孔聚乙烯板浊度法( t u r b i d o m e t r i cb i o a s s a y s ) f 6 7 】，血细胞计数法( f l o wc y t o m e 仃y ) 【6 8 】，毛细管区带电泳法( c a p i l l 叫z o n a le l e c 仃o p h o r e s i s ) 【6 9 】，免疫测定法 ( i m m u n o a s s a y s ) 【7 0 7 2 】以及基于n i s i n 自诱导作用的生物发光法( b i o a s s a y s b a s e d o nn i s i n i n d u c i b l eb i o l u m i n e s c e n c e ) 【7 3 】或荧光法( f l u o r e s c e n c e ) 【7 4 ，7 5 1 。 1 2 诱变育种及其在n i s i n 生产中的应用 1 2 1 诱变育种 诱变育种是用不同的诱变剂处理微生物的细胞群体，以诱发各种遗传突变， 然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中筛选出所需要的突变株。从方法上 讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种方 法上，杂交、转化、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地 发展，但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。 在人工的物理化学诱变因素作用下，菌株的突变率得以大大提高，诱发基因 突变，并使突变率提高到超过自发突变水平的物理或化学因子称为诱变剂。一般 来说，诱变剂可分为物理诱变剂和化学诱变剂，前者包括紫外线、x 射线、丫一射线、 快中子、激光、超声波、离子注入等；后者包括烷化剂、碱基类似物、吖啶类化 合物等。 1 2 1 1 物理诱变剂 ( 1 ) 紫外线 紫外线是一种最常用的简便而有效的物理诱变剂，它能诱发微生物突变的有 效波长范围是2 0 0 3 0 0 姗，其最有效作用的波长为2 5 3 7 姗。紫外诱变的作用机制 主要是紫外线使得d n a 分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，并可能引起突 第1 覃前言 变或死亡。另外嘧啶二聚体的形成，还会妨碍双链的解开，因而影响d n a 的复制 和转录【7 6 】。利用紫外诱变的方法可选育出大量产量高、活性强的优良微生物菌种。 刘仁春等人【7 7 】对产脂肪酶的u 4 4 粗壮假丝酵母经连续两次紫外诱变，成功地得到 酶活分别提高了1 2 6 、1 5 0 的突变株z 6 和z 8 。赵琼等人【7 8 】对木醋杆菌c 5 进行 紫外诱变，经过筛选获得1 株细菌纤维素高产菌株a x y l i n u m c 5 4 4 ，该突变株的产 量是原始菌株的1 5 倍。 ( 2 ) x 射线、丫射线、快中子 x 一射线、丫一射线、快中子是电磁波，能产生电离作用，使被照射物质分子或原 子发生电子跳动，使内层失去或获得电子，从而直接或间接地改变d n a 结构。其 直接作用是物理作用，指染色体吸收辐射能量后发生畸变；间接作用是化学作用， 指辐射作用于染色体周围的水分子，这些水分子经辐射作用产生了各种活性基团， 这些活性基团与细胞中的溶质分子发生化学变化，造成d n a 损伤而引起突变【7 9 】。 ( 3 ) 激光 激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射能量密度和持续时间越强，热 效应越大。热效应所产生的组织损伤尤其是d n a 结构的损伤，引起细胞d n a 、 r n a 、质粒、染色体畸变效应；酶的激活或钝化；细胞分裂和细胞代谢活动的改 变等。激光作为一种新的诱变剂，以其高亮度、高方向性、高相干性以及单色性， 在微生物育种领域已得到广泛应用。章文贤等入【8 0 1 对产低温脂肪酶的罗伦隐球酵 母进行y a g 激光诱变育种，获得酶活为3 5 6 u m l 突变株y - 1 1 ，比原始菌株提出 来高了1 5 倍。张燕等人【8 1 】利用h e - n e 激光选育螺旋霉素产生菌生二素链霉菌， 得到一株发酵效价比对照提高了3 8 6 的高产菌株。 ( 4 ) 微波 微波是一种电磁波，具有较强生物效应的频率范围在3 0 0 m h z 3 0 0 g h z ，能引 起水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子转动，最终引起d n a 分子 结构发生变化，导致遗传变异。另外，微波引起的分子强烈的热运动所产生的瞬 时强烈效应，易引起酶失活，从而引起生理生化变异8 2 】，因而也被用于各个领域 的诱变育种。张凤英等人i 翻利用微波诱变技术对产糖化酶米根霉菌f 6 进行诱变， 1 1 黑龙江大学硕士学位论文 结果筛选到一株糖化酶高产菌株f 6 2 0 d ，糖化酶活力提高了3 7 倍。张贺迎等人【州 采用微波诱变糖化酶生产菌株，用经筛选得到突变株9 1 ，比出发菌株糖化酶耐热 性提高1 5 2 0 。 ( 5 ) 离子注入 离子注入是2 0 世纪8 0 年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面 的改性。1 9 8 6 年以来逐渐用于农作物育种，近年来在微生物育种中逐渐引入该技 术。所谓离子注入诱变，就是利用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性 状的变异，从而达到育种的目的。离子束对生物体有能量沉积和质量沉积双重作 用。能量沉积是指注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量， 而生物大分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子被击出位、生物大分子留下断 键或缺陷的过程；质量沉积是指注入的离子与生物大分子形成新的分子。通过这 两种作用使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使d n a 分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应【8 5 】。因此，离子注入诱变可得到较高的突 变率，且突变谱广，死亡率低，正突变率高，性状稳定。赵彩艳等人【跚采用低能 氮离子( n + ) 注入对出发黑曲霉( 爿印p 曙f 刀螂刀袒，) 菌株y 2 4 4 9 进行诱变，获得 高产菌株s d l 6 产b 葡聚糖酶酶活提高到4 9 3 2 4u m l ，产量提高到亲株的7 倍。 张莉等人8 刀用离子注入对美伐他汀产生菌c 0 1 5 进行诱变后，再用制霉菌素抗性平 板筛选出产量提高3 5 的高产菌株c p 一1 1 6 。张宁等人8 8 1 通过1 0 ke v 氮离子( 盯) 注入p 胡萝卜素生产菌三孢布拉霉，筛选得到2 株产量比出发菌株提高2 0 的高 产菌株。 1 2 1 2 化学诱变剂 ( 1 ) 烷化剂 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。烷化剂是极为重要的一类化学 诱变剂，种类很多。这类化合物中有一个或多个活性烷基，能与核苷酸分子中的 磷酸基、嘌呤、嘧啶等碱基起烷化作用或与d n a 分子作用而造成d n a 的损伤。 烷化剂主要包括硫芥、氮芥类、环氧衍生物、乙烯亚胺、硫酸酯和磺酸酯、重氮 烷和亚硝基类等化合物。亚硝基胍( n t g ) 有超诱变剂之称，能使细胞发生一次 1 2 第1 罩前吾 或多次突变，诱变效果好。亚硝基胍还能使多基因发生突变，在复制叉附近一个 基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变。黄洁等人【8 9 】采用亚硝基胍辅以鼠 李糖对铜绿假单胞茵m i g l 4 6 菌株进行诱变育种，获得了鼠李糖脂产量达2 1 2 7 0 g l 且遗传性质稳定的菌株，产量比原菌株提高3 6 1 o 。付学琴等人郾】对南昌霉 素产生菌南昌链霉菌8 0 5 3 1 1 6 菌株的孢子进行n t g 诱变处理，经过筛选获得高 产南昌霉素菌株1 1 6 5 8 6 4 ，其所活性单位高达9 5 7 1 4m 舢，比出发菌株提高了 1 1 6 7 。另外烷化剂中硫酸二乙酯( d e s ) 也是应用较为广泛的诱变剂。王淑嫒 等人【9 l 】通过2 d e s 和超声波复合因子对海洋真菌t s 6 7 菌株进行诱变，获得1 株 高产菌株u d 7 7 ，其抑菌活性比原始菌株提高了3 7 5 。 ( 2 ) 碱基类似物 碱基类似物能在d n a 复制过程中渗入d n a 而不损坏它的复制能力，但是它 们的氢原子的分布与正常碱基不同，比正常的具有更大的不正确的配对倾向，从 而引起误义突变。例如5 溴尿嘧啶、2 氨基嘌呤，5 一氨基尿嘧啶、8 氮鸟嘌呤等。 程世清f 钩用5 一溴尿嘧啶对产色素菌分枝杆菌t 1 7 2 3 9 细胞进行诱变，生物量平均 提高2 2 5 ( 3 ) 吖啶类 这类诱变剂使d n a 分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下 全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。吖啶类染料包括原黄素、吖啶黄、吖啶 橙和q 一氨基吖啶等。顾真荣等【9 3 1 用吖啶橙对枯草芽孢杆菌g 3 进行诱变处理，获 得一株抗菌活性最强的突变株g a l ，其抗真菌活性是原始菌株g 3 的3 倍左右。 1 2 2 诱变育种在n i s i n 生产中的应用 在n i s i n 的生产中，主要是以乳酸乳球菌作为生产菌，通过诱变方法获得高产 菌株，并通过改变培养基配方从而进一步提高产量。国内通过对配方、最佳工艺 条件的摸索，已将n i s