（农药学专业论文）苯并噻二唑类植物抗病诱导剂的合成及其生物活性研究.pdf

摘要 论文综述了植物诱导抗病剂的作用机理，以及在植物病害防治上的研究进展。 苯并 1 ，2 ，3 噻二唑一7 一羧酸硫甲酯( 3 t h ) 是一类新型的植物诱导剂，此类物质出 现后受到了广泛的重视，在植物病害防治中取得了良好的效果。 本论文根据苯并噻二唑诱导剂的构效关系设计了新的苯并噻二唑的结构，并合成 了9 个未见文献报道的化合物，合成步骤如下： 采用2 一氯一3 ，5 - 二硝基苯甲酸为起始原料，苯环上的氯原子被叔丁基硫醇置换，羧 酸由溴乙烷酯化，硝基由铁粉还原，随后经重氮化关环生成苯并 1 ，2 ，3 噻二唑一7 一 羧酸乙酯( 中间体i ) 。中间体i 在低温一7 8 下经二异丁基氢化铝( d i b a l - h ) 还原制备了苯并 1 ，2 ，3 噻二唑一7 一甲醛，随后苯并 1 ，2 ，3 噻二唑一7 一甲醛经 w i t t i n g h o m e r 反应制各了目标产物0 刁苯并 1 ，2 ，3 1 噻二唑。7 一丙烯酸酯。所合成化合 物的结构已经通过1 h n m r 、i r 谱及元素分析的确认。 = 0 r 投 ( e ) _ 苯并 1 ，2 ，3 】噻二唑- 7 一丙烯酸酯 生测结果表明在活体上有一定生物诱导活性，而离体没有杀菌活性。 关键词：苯并噻二唑，合成，诱导抗病性，s a r ，生物活性 a b s t r a c t t h i sp a p e rs u r n m a r y sp l a n ti n d u c e r sm e c h a n i s ma n da p p l i c a t i o no np l a n td i s e a s e p r o t e c t i o n s - m e t h y lb e n z o d 1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l e 一7 一c a r b o t h i o a t e ( b t h ) a so n eo fan e w p l a n ti n d u c e r h a sb e e n w i d e l ys t u d i e dr e n c e n t l y ，a n dh a sb e e na l r e a d yu s e d a sp e s t i c i d ei n a g r i c u l t u r e i nt h i ss t u d y ，n e wb e n z o d i 1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l ed e r i v a t i v e sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt o r e l a t i o n s h i p o fs t m c t u r ea n de f f i c a c y t h e9n o v e lc o m p o u n d sw e r es y n s t h e s i z e dw i t h f o l l o w i n g r e a c t i o n s t h ec h l o r i n ea t o mi n2 - c h l o r o 一3 、5 - d i n i t r o - b e n z o i ca c i da sb e g i n n i n gr a wm a t e r i a lw a s s u b s t i t u t e d b y2 - m e t h y l p r o p a n e - 2 - t h i o l ，e s t e r i f i e dt h e n 试mb r o m o e t h a n e ，r e d u c e db y i r o np o w d e ra n dc y c l i z e dt oo b t a i ne t h y lb e n z o d 1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l e 一7 ( i n t e r m e d i a t ei ) a f t e r d i a z o n a t i o nr e a t i o n i n t e r m e d i a t e1w a sr e d u c e d a t 一7 8 b yd i b a l h t oo b t a i n b e n z o d 】【1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l e 一7 - c a r b a l d e h y d e ，a n db e n z o d 【1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l e 一7 - c a r b a l d e h y d e t r e a t e dv i a w i t t i g - h o m e rr e a c t i o nt o ( 助一3 一( b e n z o d 【1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l 一7 一y 1 ) a c r y l i c a c i d e s t e r sa st a r g e tc o m p o u n d s a l lc o m p o u n d sw e r ec o n f i r m e db y1 h n m r , i ra n de l e m e n t a l a n a l y s i s o r l ( e ) - m e t h y l3 - ( b e n z o d 1 ，2 ，3 t h i a d i a z o l - 7 y 1 ) a c r y l a t ee s t e r s b i o a s s y r e s u r ss h o w e da l ln o v e lc o m p o u n d se x h i b i tc e r t a i nf u n g i c i d a la c t i v i t yi nv i t r o ， b u tn o f u n g i c i d a la c t i v i t yi nv i v o k e y w o r d s ：b e n z o t h i a d i a z o l e ，s y n t h e s i s ，s a r ，b i o l o g i c a la c t i v i t y n n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：z 妒矿年矽月乙日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名 导师签名： 锄多塘 锯 时间：加矽尹年6 月乙且 时阊t 亿卯年其? 乙日 引言 第一章文献综述 农作物高产、优质、高效生产的重要保证来源于作物病害防治。长期以来，农作物病害防治 主要依赖于化学农药、抗病品种和农艺栽培等措施。其中最为主要的手段是使用化学农药。但是， 由于现代社会对环境保护的日益重视以及对“绿色农业”的推崇，限制或减少高毒害、高残留化 学农药在农业上的使用已是大势所趋。因此，研究探索植物保护的新技术、新途径一直是世界范 围内农业科技工作者的努力方向之一。植物植物诱导抗病剂被认为是一个农药研究的新方向，受 到了广大科研工作者的重视，并且这个领域也越来显示出它的实用性。 1 。1 植物诱导抗病剂的研究进展 植物诱导抗病性物质的研究是当前国际上新兴的重要农业研究领域，并被认为是很有前景的 植物保护的新途径和新技术。这种技术的原理是利用外源性化学物质诱导植物体产生抗性反应， 通过自身广泛的生理机制防御机体免受病原体的侵染。这些机制可能是局部的或者是系统的，由 本身的或外界的诱导产生。对于影响植物病情发展的知识现在了解的还不是很多，在这个领域还 需要进行广泛的生化及基因方面的研究。在这些领域中一个特别的诱导系统反应被称作s y s t e m i c a c q u i r e dr e s i s t a n c e ( s a r ) “系统获得抗性”受到了广泛的重视。系统获得性抗性s a r 是一个 广泛的生理免疫，由植物体感染的某种病原体所诱导产生，另外系统获得抗性也能被某些天然或 合成的化学物质触发。 s a r 具有以下几个优点：抗菌谱广，一经诱导产生能抵抗多种病原细菌、真菌、病毒的侵害； 属于植物机体自身的生理代谢反应，对环境和人畜安全；抗病机制复杂，病原体不宜产生抗药性， 抗病时间欧等特点。由于以上这些特点，s a r 制剂的研究开发，具有广阔的市场前景将对植物 病害的治理带来深远影响。 1 1 1 历史回顾 在自然界，由病原体感染或者植物的免疫系统诱发的抗性首先由r a y 和b e a u v e r i e 于1 9 0 1 年发现。b e a u v e r i e 发现无繁殖能力葡萄孢菌h o t r y t i sc i n e r e a 的毒性可以通过外部的环境条 件如热、冷或耕作条件来改变，用这些毒性减弱的菌类来接种秋海棠，可以诱导秋海棠来产生s a r 。 接种的具体方法包括土壤接种或者在植物体上的多点注射病菌。经过这样的接种处理后，秋海棠 对随后感染的同样活性病原体都产生了抗性。1 9 3 2 年，c a r b o n n ek a l a l j e v 经过仔细的研究，在 证实了b e a u v e r i e 的实验结果的基础上又提出：获得性抗性依赖于某种合适的寄主”1 并详细描述 了这种由病原体侵染而诱导植物产生抗病性的现象。此后c h e s t e r 研究了关于植物获得生理免 疫的问题。认为这种诱导抗性将在植物保护过程中起到重要作用”。但是真正详细的分析s a r 现 象开始于2 0 世纪6 0 年代。 1 1 2 不同植物的s a r 现象 有关s a r 的研究工作的一个重要里程碑是f r a n ka r o s s 于1 9 6 1 年做的一个试验，他发现 并阐述了烟草在预先经烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i cv i r u s 简称m y ) 感染单片o l 子后，烟 草对随后感染的t h i v 抗性的有所提高。因此，他提出用s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ( s a r ) 来表示植物系统获得抗性“1 。随后c r u i c k s h a n km o n d r y k l a i 完成了大量的关于s a r 的工作，他发 现在烟草生长阶段注射蓝色霉菌( p o r o n o s p o r at a b a c i n a ) 悬浮液的时候，烟草获得抵抗蓝色 霉菌( p e r o m o s p o r at a b a c l n a ) 高水平的抗性”1 。c o h e n 和k u c 还研究发现这种抗性大约在3 周后得到，而那些经过热灭活的菌类孢子或病原菌经过这种方法对植物进行接种并不能使植物获 得s a r ”1 。这些用生物接种使植物体获得诱导抗性的效果在有些方面甚至超越了传统的金属类杀 菌剂”1 。 一些科研人员在随后的研究中发现，对烟草单片叶子接种菜一种病毒导致此叶子坏死后，烟 草的整个植株获得对其它病原体的抗性。如t 州t n v ( t o b a c c on e c r o s i sv i r u s ) 。令人奇怪的是 在根部接种并使之局部坏死并不能使系统产生s a r 。在用以上这些方法获得的s a r 能对一系列广 泛的由真茁、细菌、及病原体疾病产生抗性，但是对烟草蚜虫却没有效果。 关于生物诱导植物产生s a r 的现象在黄瓜、甜瓜和西瓜上得到了很好的验证“。对黄瓜局 部感染t n v ，p s e u d o m o n a $ l a c h r y m a n s 或者c o l l e t o t r i c h u ml a g e n a r i u m 都能诱导机体获得广 泛的系统抗性。在接种几天后产生的s a r 至少对1 3 种疾病包括真菌、细菌都有很好的效果。 除了以上这些种类，s a r 现象在红苜蓿、大豆、土豆、西红柿、紫花苜蓿也都能产生。 1 1 3 植物产生s a r 现象的机理 外界的致病真菌、细菌和病毒对植物进行感染时，植物的防御反应随之产生，基因的因素在 防御的过程中起到了很重要的作用“”“。尽管我们对一系列的由病原体诱发的反应已经有了一系 列的了解，但是相对于s a r 的机理我们还知之甚少，而一些关于植株产生s a r 后的生理现象逐渐 的被发现。7 0 年代科研人员发现经过病毒感染后，烟草能被诱导产生一种很稀少的蛋白积累，并 称这种蛋白为病程相关蛋白p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n ( p rp r o t e i n ) 。这些蛋白的具体生化 作用我们还不是很清楚，但是它们都具有抗病毒感染的活性，并被认为是植物获得抗性的一种标 志”3 “。2 0 世纪9 0 年代科研人员逐渐证明了在m p d q a 水平上至少有9 个相似的基因和诱导抗性相 互协同作用，这些基因现在被称做s a r 基因“。这些s a r 基因的产物直接有杀菌活性或者和一些 杀菌活性的蛋白有报密切的关系。在分子水平上不同的植物会产生一系列的基因表达，在烟草和 拟南芥上p r - 1 蛋自成为获得抗性的主要形式”，在黄瓜上几丁质酶是最主要的s a r 基因表达1 。 这些基因的不同，来源于进化的不同，因为不同种类抵抗不同病原体存在差异。 植物获得s a r 诱导抗性的过程基本上是外界病原感染植物机体，触发植物体内释放信号分 子，诱导植物s a r 基因产生一系列生化变化，抵御外界的感染。在避期的实验中，s a l i c y l i ca c i d ( 简称s a ) 作为s a r 的一种信号分子得到了很好的验证，但是问题在于s a 不能在植物体内长距 2 中国农业大学硕上论文 离传导，一些产生s a r 现象的植物体内也没有发现s a 的存在，说明其它的物质起到了信号分子 的作用。在这些植物体内准确的信号源分子还没有被确定同时电信号也没有被发现起到s a r 信 号的作用1 。 1 1 4 具有诱导植物产生s a r 的化学物质 近年来，人们在研究植物抗病激活剂的工作中发现，s l k r 并不仅限于为病原物所诱导。某些 化学物质也具有类似的功能，并称这类化学物质为植物激活剂( p l a n ta c t i v a t o r ) 。确切说应是 植物抗病诱导剂。植物诱导剂以诱导植物产生s a r 为基本原理，它本身并不具备杀菌活性却能诱 导植物对疾病产生抵抗防御作用，对于作物病情的控制这是一个全新的概念。植物激活剂的发展 可能会对农药的发展提供新的方向。在研究开发这些化学制剂的时候，k e s s m a n n 等人在以往利用 生物制剂诱导植物产生s a r 现象的基础上提出了化学激活剂所应满足的几个条件。”1 ： ( a ) 化合物本身及其代谢产物没有直接的杀菌活性。 ( b ) 诱导所获得的抗菌谱与生物诱导的抗菌谱应一致。 ( c ) 诱导产生的s a r 与病原激发的s a r 应具有相同的标志基因表达。 到目前为止科研人员发现的具备这三个条件的植物激活剂只有水杨酸( s a l i c y l i ca c i d 简 称s a ) 。2 。6 一异烟酸( 2 ，6 - d i c h l o r o i s o n i c t i n i c 简称i n a ) ，苯并喹二唑( b e n z o t h i a d i a z o l e 简 称b t h ) ，其它化合物都不符合这个标准。不过研究这些化合物的结构及作用对于开发新型植物抗 病激活剂仍有一定的参考意义。 水杨酸s a l i c y l i ca c i d ( s a ) 在植物感染外界病原体产生s a r 现象时，对下s a r 信号的传导s a 扮演了一个关键的角色， 并被认为是一个诱导植物p r 蛋白的积累产生抗性的外部诱导剂“。s a 和t m v 能诱导烟草产生相 同的s a r ，以及相同的s a r 基因表达。水杨酸对植物抗病诱导的报道涉及的植物还包括番茄、黄 瓜、水稻、人蒜、大豆、甜菜、拟南芥等。水杨酸不仅参与因病毒感染而发生的系统获得性抗性， 还涉及细菌性和真菌性病原所引发的系统获得抗性。水杨酸被认为是植物内源的s a r 信号分子， 触发病理相关蛋白的基因表达。“。同时s a 也没有明显的直接杀菌活性，所以s a 符合植物激活剂 所具备的三个标准。那么人们要问为什么不利用s a 作为外源性s a r 激活剂呢? 因为在使用s a 的 时候还存在一些问题。首先它不是s a r 反应的长距离信号分子，它只能对直接接触的植物组织有 效，在生物化学的基础上被证实，外源性的s a 在植物体内被快速的转化，大多数转化为 3 - g l u c o s i d e s ”“。这样在植物韧皮部就缺乏可移动的s a ，另外一个现象是s a 对一些植物的药害问 题，这些问题的存在限制了s a 作为实际植物疾病控制的解决方案。 2 ，6 二氯异烟酸i n a 2 6 一二氯异烟酸和它的甲酯都被称作i n a ，被发现用来作为稳定的诱导植物产生抗性的化学 物质”。i n a 能有效的使黄瓜、水稻、和其它一些种类的植物产生s a r 现象，使植物免受真菌和 细菌的感染。分子水平的研究表明在烟草上用t m v 接种和用i n a 治疗能诱发相同的9 个基因体系 表达“。这种现象在其它的一些物种上也得到了证实。i n a 模拟了生物诱导抗性产生的一些特点， 敏化植物组织产生对外界病原体产生防御反应。但是这种预处理的敏化机理仍然不清楚。i n a 已 经商品化但是它和s a 一样对某些植物有一定的药害，使用不太安全，使它的使用范围受到限 3 第一章文献综述 制。 苯并噻二唑b t h 苯并噻z i 唑类诱导抗病性物质的生物活性首先由w a l t e rk u n z 发现，此类化合物能够激发植 物机体产生s a r ”“。现在 1 ，2 ，3 】苯并噻二唑一7 一碳酸硫甲酯( b t h ) 作为一个商品化的试剂( 商品 为b i o n ) 已经应用于农业作物疾病的防治。1 9 9 6 年文献报道了b t h 对小麦白粉病和烟草病害的防 治作用”。后来人们在黄瓜、拟南芥等植物上的研究取得了很好的病害防治效果。在烟草和拟南 芥上外源的应用b t h ，可诱导与植物抗病防御有关基因的表达及p r 蛋白的产生，有激活植物防御 系统的作用。这一途径与人们发现的病原物诱导系统获得抗性( s a r ) 类似”“。一些强有力的证据 表明，b t h 不需要水杨酸、茉莉酸或乙烯的参与就能诱导s a r 。因此，b t h 作为第二信号分子活化 s a r ，其信号传导途径与其他分子信号积累无关”。b t h 在欧洲已进行了登记，用于防治大麦、小 麦白粉病等。在离体条件下测定b t h 对许多不同种类的植物病原菌的生物活性。这些病原菌包括 灰霉菌、交链孢菌、黄色镰刀菌、黑粉菌、颖枯菌和丝核菌等，结果未检测出b t h 有任何杀菌活 性。这足以证明，b t h 不是常用的那类杀菌剂，本身无杀菌活性，但却能诱导植物内部的免疫机 制，起到抗病、防病的作用。将b t h 施用于包括烟草和拟南芥在内的多种双子叶作物上，能保护 它们免遭由各种病毒、细菌和真菌引起的病害。此外，用b t h 处理，也能保护单子叶作物免遭病 害。例如，经b t h 处理后的水稻幼苗，可在整个生长季节不受枯死病菌的侵害。施用于小麦，对 小麦白粉病具有持久的抗性：在小麦拔节期处理小麦，可有效地保护小麦在整个生长季节不受白 粉病侵害。此外，还可有效地防止叶锈菌和叶枯菌对小麦的侵染。因此，就保护植物及抵抗病原 物种类的多样性蔼言。b 偶是一种广谱的植物保护荆。 其它一些能诱导植物产生抗性的物质 许多化学物质被发现能够使植物产生抗病性，虽然这些物质都没有符合上面我们说提到的 s a r 诱导剂的三条标准，但是研究这些物质的抗病机理对s a r 的研究还是有一些借鉴意义。 2 2 一二氯一3 3 一二甲基环丙羧酸( 简称d c p ) 最初用来防治水稻瘟病。在植物体外d c p 只有 弱的杀菌活性，但是d c p 能诱导植物体内过氧化酶的活性的增强，因此起到抗病作用”。用d c p 处理过的植物在感染病毒后能积累比没有处理过的植物更多的植物防御素( m o n i l a c t o n e ) 。d c p 主要的诱导抗病性来源于植物感染了病毒以后的数据，而且用d c p 处理黄瓜后没有使黄瓜产生几 丁质酶( c h i t i n a s e ) ，而几丁质酶是黄瓜获得s a r 的标志。一些证据表明d c p 的使用可能是抑制 黑色素的生物合成。从而影响一些病毒体附着侵染植物。具体的机理有待进一步研究。 烯丙基异噻唑( p r o b e n a z o l e ) 被用来成功的防治稻瘟病。但是此类化合物的离体杀菌活性 非常弱。在植物体内它能诱导植物产生一些具有杀菌活性的不饱和脂肪酸，病程相关蛋白的积累， 及提高与抗病性有关的一些酶的活性。被p r o b e n a z o l e 处理过的水稻，对于外界真菌的侵染相对 于没有处理过的水稻表现出很高的防卫反应。但是p r o b e n a z o l e 没有诱导水稻产生 1 i p o x y g e n a s e ，而1 i p o x y g e n a s e 是水稻获得s a r 的关键分子标志。因此p r o b e n a z o l e 缺乏一些 和s a r 相关的具体生物标记，尽管它具有保护水稻免受稻瘟病的例子，也不能被看成s a r 激活剂。 能够释放乙烯的物质乙烯利( e t h e p h o n ) 虽然能显著的诱导p r 蛋白的积累( 一种系统获得 抗性的标志) ，但是也没有能够诱导烟草抵抗t m v 病毒，这说明它也不能被看成是s a r 激活剂。 4 最近一些研究表明乙烯利诱导s a r 基因的表达以s a 为信号韵通道。但在拟南芥上使用乙烯利s a r 诱导抗性没有得到体现。 茉莉酸( j a s m o n i ca c i d 简称j a ) 及其甲酯被报道诱导西红柿产生了对p h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s 的抗性“。在使用j a 的作物上没有发现s a r 基因的标记分子的产生积累，一些文献报 道了j a 对一些病毒的杀菌活性。通过这些说明j a 及其甲酯也不符合s a r 激活剂的标准。 d l - 3 一氨基丁酸的使用能使西红柿、马铃薯和烟草对一些病毒产生抗性。同时d l 一3 一氨基丁 酸的离体杀菌活性也很低，在西红柿上能够诱导产生p r 蛋白，但是诱导却没有产生对一些病原 菌整个s a r 基因的表达”。 除了以上这些物质，一些无机盐、硅粉、草酸盐、磷酸盐、不饱和脂肪酸等物质也能诱导植 物产生对病原体侵入的抗性。大多数情况下，这些化合物都是引起植物表皮局部坏死，从而激发 依赖于s a 的途径产生s a r ，并不是它们本身诱导s a r 起作用的结果另外也不排除这些物质的直 接杀菌活性。 综上所述，植物诱导抗病性的利用在病害综合防治方面的应用前景十分广阔。开发新型高效 的s a r 诱导抗病剂，并把运用诱导抗病制剂和植物病害防治的其它技术方法有机结合，将可能有 效提高现有综合防治技术水平。可以预见随着对植物诱导抗病机理的深入研究将会有更多的诱导 抗病剂出现诱导抗病性可以成为病害综合防治的重要内容之一，对于解决传统农药的弊端将起 到巨大作用。 第二章论文设计思想 2 1 苯并噻二唑类植物诱导抗病剂的构效关系研究 在对苯并噻二唑类及其相关分子的构效关系研究中，w a l t e rk u n z 等“”设想对苯井噻二 唑基团的三个结构组分进行化学上的探讨，分别改变苯并噻二唑上7 位的取代基团，变换苯并 噻二唑上苯环的取代基，以及改变苯并噻二唑中五元杂环。 经过在黄瓜上的进行的瓜类炭疽病的抗性诱导作用的活体测试。以及进行防治小麦白粉病、 水稻稻瘟病和烟草霜霉病的田间实验。结果表明如下： n 苯并 1 2 ，3 噻二唑一7 一碳酸硫甲酯( b t h ) 非取代苯并噻二唑及其7 一甲基衍生物( 如下图) 均无生物活性。 6 5 7 q 4 气 矿 n ( 2 苯环上羧基的取代位置对生物活性甚为关键与先导化合物7 一羧酸相反，以下儿个化合物 均没有生物活性。 6 。旺 ”u n 在一取代的苯并 1 ，2 ，3 噻二唑类中，7 一羧酸衍生物( a e ) 显示了很高的抗性诱 导活性，其中酯a 、硫羟酸酯b 和酰肼e 优于酰胺d ，并且随着取代基r 的分子量增大，活性降 低：7 位具磺酸f 、磺酰胺g 、或次磷酸h 等基团的化台物及硝基化合物i 贝0 无活性；同类的羧 酸化合物j 亦无活性，而具稀键的衍生物k 有中等活性。 甚 h c 、”、。 q “ m 。o h 领 7 位上对应的醛及其缩醛，和相应的烯丙基甲醇及其0 一酰基或0 一烷基衍生物比羧 7 ，一。r西，岛 第二章论文设计思想 酸或者s 一甲酯化合物活性低。 苯环的4 ，5 或6 位上增加取代基后。往往会使化合物的活性降低。 由其它苯并五元杂环代替苯并 1 ，2 ，3 噻二唑中的噻二唑环时均无活性，即使是相 应的苯并 2 ，i ，3 噻二唑7 一羧酸衍生物也没有生物活性。 a o h 2 2 目标化合物的确定 0 c o ” n s 。j ： 一r n 苯并噻二唑类物质能够诱导植物产生抗病性，对于它的衍生物构效关系w a l t e rk u n z ”等 人做了很多报道，近年来国内有许多科技人员。”1 对苯并噻二二唑类诱导抗病剂的结构进行了改 造，并合成了许多具有一定生物活性的化合物。 对于苯并噻二唑7 位置上取代基为丙烯酸酯结构的化合物还没有文献报道合成，根据前人 所做的构效关系试验，预测这类化合物应该具有很好的生物活性。本论文将设计合成这类新化 合物并对其进行生物活性的研究。 目标化合物结构如下面所示： r = m e ，e t ，i - p r 等 8 n 。 第三章苯并噻二唑- 7 - 丙烯酸酯的合成研究 3 1 目标化合物的合成路线设计 考虑到我们目标化合物的结构特点，拟采用苯并 1 ，2 ，3 噻二唑一7 一羧酸衍生物进行还原，制 得相应的醛，进行缩合反应制得丙烯酸酯，然后碱性水解并酸化，制得一系列的酯。合成路线如 下所示： 瞍c o o r 一扳 ，ohh 该合成路线有两个关键点，一是找到合适的方法制得苯并 1 ，2 ，3 噻二唑一7 一羧酸衍生物，二 是找到合适的制各醛的方法。 9 r 矿 呱 。 0 h ， _ ， c l c ，l _ ， p sf扳 一 喾 弋。 i 洲_ l p s扳 第三章苯并噻二唑一7 一丙烯酸酯的合成研究 3 2 苯并噻二唑一7 一取代羧酸衍生物的合成 3 2 1 文献合成方法 关于苯并噻二唑7 位取代羧酸的合成方法，已经有多篇文献报到。 目前主要有以下几种合成 路线。 1 以2 一氯一3 一硝基苯甲酸为起始原料合成”3 c h 3 0 h h 2 s 0 4 号 苯并噻二唑一7 一羧酸最早由2 - 氯一3 一硝基苯甲酸经酯化成相应的甲酯，再由苄硫醇取代氯化得 中间体，然后在四氢呋哺中还原得3 一氨基- 2 一苯甲巯基苯甲酸甲酯。最后通过重氮化后环化得苯并 噻二唑一7 一羧酸甲酯。 这条路线实验条件温和。收率良好，但是由于起始原料2 一氯一3 一硝基苯甲酸不能由选择性硝 化制得，市场上没有相应的工业品出售，试剂级2 一氯一3 一硝基苯甲酸价钱比较昂贵使得这条台成 路线的应用受到了一定限制。 1 0 一舌l峪 。 2 以2 一氯- 3 。5 _ = 硝基苯甲酸为尚始原料合成o ” c l n 0 2 爿h 2 0 + f c h j k j c 0 3 o = n 该合成路线由2 氯一3 ，5 - 二硝基苯甲酸为起始原料，经一锅法反应制得2 一苯甲巯基一3 ，5 - 二 氨基苯甲酸甲酯，然后进行环化，用次亚磷酸还原5 一位上的重氮基，再经水解得目标物苯并噻二 唑一7 一羧酸甲酯。 3 以2 。3 二氯硝基苯为原料 & c i 二尝c i 了赤占c i 了 一n l 删( p p h 3 ) 4 。段c n 了会拉c n o 4 r t o h i_ 该合成路线以2 3 一二氯硝基苯为原料，2 位的氯被异丙硫醇取代后得中间体，再经还原得3 一 氯2 一异丙基巯基苯胺。3 一位上的氯可在镍催化剂存在下由氰基取代制得腈，随后环化制得苯 并噻二唑一7 一腈，最后经水解得到苯并噻二唑一7 一羧酸衍生物。 擘 lii叫l_ 压： n 第三章苯并噻二唑一7 一丙烯酸酯的台成研究 从合成的角度来考虑第一条路线是一条非常好的路线，实验条件简单，收率较高，但是由于原 料来源难以解决，只好放弃。第二条路线为第条路线的改进型解决了原料的问题，但是从文 献上来看，2 一苯甲巯基一3 ，5 - 二氨基苯甲酸甲酯，制备噻唑环那一步收率不是很理想，开始没有 采用这条路线。第三条路线的原料非常易得，是工业上的副产品，除去整个路线来看条件比较温 和，但是芳卤氰基置换这一步要用到催化剂，或者使用高压斧氰基置换，增加了整个试验的困难。 考虑到原料米源的难易，以及苯并噻二唑一7 一羧酸衍生物制备醛的延续性，由于以2 ，3 一二氯硝 基苯为原料可以合成7 位上为氰基的苯并噻二唑，而由腈制备醛是比较容易的。因此我们起初 采用2 ，3 - 二氯硝基苯为原料经一系列反应合成苯并噻二唑一7 一腈，再由腈直接还原成醛。起初我 们拟采用第三条路线。 3 z 2 本论文采用的合成方法 3 2 2 1 以2 ，3 - 二氯硝基苯为原科合成苯并噻二唑 1 合成路线 s r 竺呈型叟g h c i n h 2 c o o h h 矿c h 2 实验结果及出现的问题 n s r h 2 n i n 0 2 s s n c b 萨一 n r = t e r t - b u t y j s r n h 2 k c n n i ( p p h a ) 3 5 i n ( 1 ) 2 - 氯一6 一硝基苯基叔丁基硫醚的合成 在2 5 0 m l 三口烧瓶中加入2 5 2 9 无水k 2 c 0 。，2 8 8 92 ，3 - 二氯硝基苯。1 0 0 m ld m f 。搅拌 1 2 升温至6 5 6 c ，l h 内滴加1 9 m l 叔丁基硫醇，保持温度在7 0 cl h ，然后升温至l o o 保持4 h ，冷 却至室温，加入2 0 0 m l 水，真空抽滤，产品用水冲洗，干燥得3 4 5 9 ，含量9 9 ，收率9 2 。 ( 2 ) 2 - 叔丁巯基一3 一氯苯胺的合成 在高压釜中加入3 0 92 - 叔丁巯基一3 一氯硝基苯，2 5 0 m l 甲醇，4 9 r a n e y 镍，1 0 a r mh 。，温度 6 0 ，反应6 h 结束，过滤，旋转蒸发除去甲醇，得产品2 5 8 9 纯度9 8 ，收率9 6 。 ( 3 ) 3 - 氨基一2 一叔丁巯基苯甲腈的合成 3 一氨基z 一叔丁巯基苯甲腈的合成是这条路线的关键步，我们采用了氰化亚铜法与三苯膦 镍催化法两种方法进行该化合物的合成，均未得到理想的结果。 氰化亚铜法“”6 3 c u c n - - - - - - - - - - - - 1 8 0 c 6 0 一9 0 据文献报道，氯苯与氰化亚铜生成苯甲腈的反应可采用各种高沸点极性溶剂d m f 、d m a c 、吡 啶、n 一甲基毗咯烷酮等作为反应溶剂，均能取锝较为理想的结果。 我们采用多种溶剂( d m f 、d m a c 、吡啶、n 一甲基吡咯烷酮) 在高压釜中和氰化亚铜反应， 温度1 8 0 - - 2 2 0 ，反应1 8 小时，g c - k l s 未检测到3 - 氨基一2 一叔丁巯基苯甲腈的生成。该法未得 到目标物的原因是由于苯环上存在巯基和胺基。它们的会增加苯环上电子云的密度，使碳氯键更 加牢靠，卤原子难以被氰基取代。 考虑到胺基上面有活泼的氢，我们先把胺基衍生化生成乙酰胺，再进行氰基取代，在高压斧 中以d m f 为溶剂和氰化亚铜于1 8 0 2 2 反应6 小时，经由g c m s 检测生成苯并噻唑环。 三苯膦镍催化法 c u c n o + 点d m f 8 0 0 c n c h 气 萨一 n 6 第三章苯并噻二唑一7 一丙烯酸酯的台成研究 x n i p ( p h ) 3 3 n a c n x = c i ，b r i 据文献报道，芳烃上的卤原子，在三苯膦镍的催化下，在极性溶剂中和氰化钠反应生成相应 的腈”7 ”1 。结果如下： 表1 部分芳氯经催化氰化后的收率 反应物产事反应物产率 毋“ 9 0 0 了。 9 0 。 8 4 8 3 h 叮。u 。 c 一 呲 8 6 “ 8 5 9 6 三苯臃镍催化齐jn i c l 2 ( c 6 h 5 ) 3 p 】2 的制备。” n i c l 26 h 2 0 + ( c s h s ) 3 p ln i c l 2 【( c 8 h 5 ) 3 p 】2 m n n i c l 2 【( c 6 h 5 ) 3 p 】2 。- n i p ( c 6 h 5 ) 3 】3 n 2 5 9 三苯基膦溶解在4 0 m l 无水乙醇中，后向其滴加2 5 9 六水舍氯化镍的3 0 m l 乙醇溶液， 同流0 5 h ，然后冷却至室温，出现紫色晶体，过滤并用乙醚冲洗，得3 3 克产物。在使用前再 由锰粉还原n i c l 2 ( c 6 h 5 ) 3 p 2 制备n i p ( p h ) ， 3 。 三苯肼镰催化法合成3 一氨基2 _ 叔丁巯基苯甲腑 n i p ( p h ) 3 h n a c n 1 4 s r n h 2 在氮气保护下，n i c l 2 ( c 6 h 5 ) 3 p 1 2 溶解在溶剂中，加入金属锰粉还原制各三苯基膦镍，溶液迅 速变红，在氮气保护下继续搅拌2 小时依次加入等摩尔的2 一叔丁巯基一3 一氯苯胺和干燥的氰化 钠，温度升至5 0 。c 搅拌2 4 h ，反应液水洗后用甲苯萃取。最后得到产物lg 产率3 0 。 我们的研究表明：采用这种方法合成3 一氨基一2 一叔丁巯基苯甲腈时，溶剂对反应结果的影响很大， 以d m f 、叔丁醇、异丙醇为溶剂时，该反应不能进行，当以c h a c n 为溶剂时，可以得到目标物， 但产率不理想，仅有3 0 。 我们分析三苯麟镍催化法合成3 一氨基_ 2 叔丁巯基苯甲腈的结果不理想可能是由于三苯基 膦镍为自制的，活性不是很高，如果采用市售成品收率会有所提高 而且原料苯环上含有的巯基 可能会使催化剂三苯膦镍活性大大降低，据文献报道，原料分子苯环上含有的氨基，也会影响到 催化剂活性”“。另外三苯基膦镍对于空气比较敏感，长时间反应应考虑保证严格的无水无氧条件， 并且和氰化钠反应时，必须保证充分搅拌。由于市售成品价钱比较昂贵，并且在该反应中催化剂 的使用量比较大，约1 0 左右。当采用该方法大量制各产物时不是很理想，而且费用较高，因此 我们放弃了这个方案。 3 2 2 2 以2 一氯一3 ，5 一二硝基苯甲酸为原料合成苯并噻二唑 1 合成路线 吣，0 hr 叫众：乏生k 2 c 0 3 d m f l h f e h 2 n o - r , ，o c 2 h s q 沁一o c 2 h 5 s 、 十n n c h 3 c h 2 b r k 2 c 0 3 o z n h 2 0 h 3 p 0 2 以2 一氯一3 。5 一二硝基苯甲酸为起始原料，先与叔丁基硫醇反应，然后用溴乙烷酯化，用 铁粉将硝基还原为氨基后，再重氮化关环生成噻二唑环，最后用次磷酸消除5 位上重氮基制得了 苯并i 鏖二唑一7 一羧酸乙酯。 1 5 硭 。l 第三章苯并噻二唑7 一丙烯酸酯的合成研究 2 结果讨论 关于羧酸酯化的反应，文献采用碘甲烷进行酯化，但由于碘甲烷比较昂贵，大量制各不易采 用，我们用溴乙烷代替，取得了良好的效果。 关于硝基还原成胺基的反应，我们最初用氢气均相催化还原。加入催化量的r a n e y 镍，经液 谱监测反应总是不能很好的进行到底，即使延长时间，提高反应温度也不能使反应进行到底，需 要重新加入r a n e y 镍才能使原料反应完全。经过分析认为，原料苯环上含有巯基。它的存在将使 催化剂中毒失活。考虑这种情况，我们采用铁粉还原，取得了良好的效果。 重氮化关环时，起初作小试时放热不是很严重，做到1 0 克数量级时，单靠冰盐浴已经不能达 到控温要求，采用低温浴槽降温- - 3 0 度，控温在一5 度左右。这条路线总的产率不是很高，最后 一步所得苯并噻二唑7 一羧酸酯为混合物，重结晶纯化效果差，需用柱色谱分离，这增加了箍 个试验操作的工作量。 总的来说这条路线原料比较易得，对于前三步反应收率较高，但是由2 一叔丁巯基一3 ，5 - 二胺基 苯甲酸乙酯关环制备噻二唑环时收率较低，制得的苯并噻二唑一7 一羧酸乙酯分离纯化也比较繁 琐。 3 3 苯并噻二唑- 7 - 丙烯酸酯合成 3 3 1 苯并噻二唑一7 甲醛的合成 我们采用2 一氯一3 ，5 - 二硝基苯甲酸合成的是苯并噻二唑一7 一羧酸乙酯，这样我们就需要从酯 或其它羧酸衍生物制备相应的醛，为此我们查阅了大量的文献。目前，醛主要由羧酸或羧酸衍生 物还原制得。 3 3 1 1 由羧酸衍生物还原制备醛的文献方法 1 、酰氯的还原 ( 1 ) 酰氯的氢化还原( r o s e m u n d 还原) “ o h ：【l 。pdbas04 r c i i h 酰氯的氢化还原一般采用吸附在硫酸钡上的钯作为催化剂。该反应一般在液相中进行，待 理论量的氯化氢放出即可，由于醛可以继续还原成醇，常加入“控制剂”以降低催化荆的活性， 1 6 c 0 i i c r 加入的控制剂有甲基硫代脲、喹啉硫等“，对于脂肪族以及芳香酰氯都能得到较好的效果。但是 由于催化剂活性难于确定，控制剂的加入多少不易精确控制，而且我们原料反应物中所含有的硫 原子也可能会使催化剂中毒， 因此我们不采用该法合成苯并噻二唑一7 一甲醛。 ( 2 ) 酰氯被化学试剂还原 r c o c l + l i a i h o c ( c h 3 ) 3 3 导r c h o + l i c i + a i o c ( c h 3 ) 3 + 3 + - 7 8 d i g l y m e c h 2 c h 2 0 c h 3 2 o 、c h 2 c h 2 0 c h 3 酰氯也可由化学试剂还原成醛1 ，三烷氧基氢化铝锂“还原芳基酰氯成相应的醛时一般 能够得到满意的结果，对于酰氯中带有一c n 、- - n 0 2 、- - c o o r 等易受还原的试剂也不受影响， 对于芳醛的产率较好7 0 一9 0 ，脂肪醛较差3 0 一6 0 ”“。但是对于邻位有取代基收率火为 下降，收率不是很高，所_ j 到的氢化铝锂比较昂贵，不适宜大量制各醛。 表2 一些酰氯被l i a i h o c ( c 地) ： 还原成醛的产率 目 、 6 1 、l 8 l 目 ao 。c p 6 l 占k a 4 1 目 酽a 2 7 饥。o 钆a 6 7 0 0 2 “p 8 8 2 、羧馥的还原 ( 1 ) 由还原试剂直接还原”6 1 7 第三章苯并噻二唑一7 一丙烯酸酯的合成研究 c i 扩h 3 r c o o h + c 司 hc i c h 3 0 h c 、n m e 2 c i 扩h 3 c 酞 h c i c h 3 0 rcho+ c i i h 7 “n m e 2 该反应相当于把羧酸上的活泼氢原子，用氯化试剂保护起来以后，在低温下由烷氧带氢化 铝锂还原，对于脂肪烃羧酸以及芳香羧酸还原成醛，收率都还可以。 表3 部分羧酸还原成醛的收率“6 p l l c 0 。h 8 1 9 洲 7 8 n c h 3 ( c h 2 ) 5 c 0 0 h 9 0 。d 湖“ 7 9 8 3 m 。d 。0 0 ” 7 0 p h n c o o h c 0 0 h 8 4 仃” 7 0 u r 扛c o o h 8 2 9 洲 5 5 u ( 2 ) 羧酸经修饰后由氢气催化还原“” o r 八o h + o m e n 瓜n c l 八n 人o m e c i h ，p d 虻 - - - - - - - - - - - - - - o m er t 1a t m d m e r t 1 8 o