（植物学专业论文）红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究.pdf

中山大学博士论文 红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 专业： 博士生： 指导教师： 植物学 张志红 施苏华教授 摘要 海漆( e x c o e c a r i aa g a l l o c h a ) 隶属大戟科海漆属，是具有重大生态意义和经 济价值的药用红树植物，其枝、叶可提取抗肿瘤、抗h i v 活性物质。由于人口的 急剧增长和经济发展的压力，全球红树林面积锐减，其原生栖息地遭受严重破坏。 本研究采用i s s r 分子标记，对世界各主要分布区( 中国、泰国、新加坡、f _ ：f 本、 斯里兰卡、澳大利亚) 的2 6 个海漆居群4 3 7 个个体进行遗传多样性和遗传分化 的研究，探讨其亲缘地理格局形成机制，分析其种子传播方式、现代洋流、相关 地质历史事件、地理隔离、气候的选择作用等因素对其影响，揭示海漆的变异规 律和分化机制，以期为保护、开发和可持续利用海漆提供分子依据，为红树植物 遗传资源的保护和利用提供基本资料。主要研究结果如下： 1 通过对i s s r 反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验，建立了稳 定的适用于海漆居群遗传多样性研究的反应体系和反应程序。采用1 0 条引物对 全部2 6 个海漆居群4 3 7 个个体进行i s s r 扩增和分析，得出物种( s p e c i e s ) 水平 多态位点百分率( p ) 为9 7 1 ，期望杂合度( 凰) 为0 2 7 0 ，香农信息指数( ，) 为0 4 1 8 ；2 6 个居群( p o p u l a t i o n ) 的平均多态带百分率( 尸) 4 7 1 ，期望杂合 度( 胁) o 1 5 9 、香农信息指数( ，) 0 2 3 9 。表明海漆具有较高的遗传多样性，这 与海漆雌雄异株、术本、多年生等生物学特性及广泛的地理分布相符。 中山大学博士论文 红树植物海漆遗传多样t t g , k 其亲缘地理格局的研究 2 中心区和边缘区居群的比较研究表明：来自于分布中心区马来半岛海漆 居群的遗传变异水平最高，中国居群居中，而处于分布边缘区日本、澳大利亚、 斯暇兰卡居群的遗传多样性最低。经统计学检验，分布中心区居群的各遗传指标 j 边缘区居群的各相应遗传指标达到了显著差异( p o 0 5 ) 。显示泰国、新加坡 所处的马来半岛是海漆遗传多样性中心。支持处于边缘地带的居群由于受小居 群、隔离、遗传漂变的影响，遗传多样性有降低的趋势的观点。 3 分子方差分析( a m o v a ) 和遗传分化系数g s t 分析均表明，大部分遗传 变异存在于居群内。这与h a m r i c k 总结的“以异交为主的木本植物其遗传变异大 部分存在于居群内”相符。 4 遗传距离的u p g m a 聚类表明：以卵叶海漆为外类群，所有的海漆居群 聚在一起。来自南半球澳大利亚的海漆居群与北半球海漆居群各聚为一支。北半 球居群以位于印度洋的斯里兰卡居群最先分出，其次为位于西太平洋的日本居 群，毗邻安达曼海的马来半岛西海岸居群，马来半岛尖端的居群( p r p s ) 及马来 半岛东海岸居群( k r e t ) 、泰国曼谷( b k e t ) 与中国居群。马来半岛东海岸居 群与西海岸居群间的遗传距离大于其与中国居群间的遗传距离，这与海漆种子的 传播模式、南中国海现代洋流及其流向有关。台湾居群与日本居群问的分化较大， 主要是受地质历史事件、不同的洋流影响，遭受不同的选择压力。地理隔离、气 候等因素对海漆亲缘地理格局的形成也有着重要影响。 海漆自然居群的遗传多样性水平高，其遗传变异大部分存在于居群内。因此 应充分重视居群内不同个体的保存，防止其原生栖息地的进一步破坏，导致其遗 传多样性的丧失。 关键词：红树植物，海漆，i s s r ，遗传多样性，亲缘地理格局 中山大学博士论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 g e n e t i c d i v e r s i t ya n dp h y l o g e o g r a p h i c a lp a t t e r no f m i l k ym a n g r o v e ，e x c o e c a r i aa g a l i o c h a s p e c i a l i t y ：b o t a n y n a m e ：z h a n gz h i h o n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r s h is u h u a a b s t r a c t e x c o e c a r i a a g a l l o c h a i sa m e d i c i n a l l yi m p o r t a n tm a n g r o v es p e c i e s w i t h e c o l o g i c a lb e n e f i t sa n d e c o n o m i cv a l u e s an o v e lp h o r b o le s t e ra c t i n ga sa l la n t i h iv w a si s o l a t e df r o mt h el e a v e sa n ds t e m so fea g a l l o c h a d u et ot h ep r e s s u r e so f i n c r e a s i n gp o p u l a t i o n ，c o a s t a l i n d u s t r i a l i z a t i o na n du r b a n i z a t i o n ，m a n g r o v ef o r e s t s h a v ed e c l i n e d s i g n i f i c a n t l yt h r o u g h o u t t h e w o r l d ，a n db e c o m ea m o n gt h e m o s t t h r e a t e n e dh a b i t a t se s p e c i a l l yi na s i a ，t h e r e f o r e ，t h ec o n s e r v a t i o na n dm a n a g e m e n to f m a n g r o v er e s o u r c e s h a v eb e c o m ea l l u r g e n tt a s k k n o w l e d g eo ft h e a m o u n ta n d p a t t e r n s o fg e n e t i cv a r i a t i o nw i t h i na n da m o n gp o p u l a t i o n so fm a n g r o v et r e e si s r e q u i r e df o rt h ed e s i g no fs u s t a i n a b l eu t i l i z a t i o na n dc o n s e r v a t i o ns t r a t e g i e s g e n e t i c d i v e r s i t ya n dp h y l o g e o g r a p h i c a lp a t t e r no f e a g a l l o c h a a c r o s st h es p e c i e sd i s t r i b u t i o n r a n g ew e r ee x a m i n e dw i t hi n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a to s s r ) a n a l y s i s t h em a i n r e s u l t sa r eh i g h l i g h t e di nt h ef o l l o w i n g 1 at o t a lo f4 3 7i n d i v i d u a l sr e p r e s e n t i n g2 6n a t u r a lp o p u l a t i o n sw e r es a m p l e d ， 中山大学博士论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 o fw h i c h1l p o p u l a t i o n sw a sf r o m t h es o u t h e r nc h i n a ，5f r o mt h a i l a n d ，4f r o m j a p a n ， 3f r o ms r i l a n k a ，2f r o ma u s t r a l i a ，a n d1f r o m s i n g a p o r e 1 0p r i m e r ss c r e e n e d o u tf r o m 10 0i s s rp r i m e r s p r o d u c e d 17 2b a n d s a tt h e s p e c i e sl e v e l ，t h ep e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i cl o c i ( 尸) w a s9 7 1 ，t h ee x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t y ( h e ) w a s0 2 7 0 ，a n dt h e s h a n n o n si n f o r m a t i o ni n d e xf ，) w a so 4 18 a tp o p u l a t i o nl e v e l ，h o w e v e r ，t h em e a n so f t h et h r e ei n d e x e sw e r e4 7 1 ，0 15 9 ，a n d0 2 3 9 ，r e s p e c t i v e l y t h el i f e h i s t o r y c h a r a c t e r i s t i c so f 巨a g a l l o c h a ( al o n g l i v e d ，w o o d y ，d i o e c i o u s ，l a r g eg e o g r a p h i c a l r a n g e ) m a y c o n t r i b u t et ot h em a i n t e n a n c eo f h i g hl e v e l so f g e n e t i cd i v e r s i t y 2 t h el e v e l so fg e n e t i cd i v e r s i t yo ft h o s ep o p u l a t i o n sf r o mm a l a yp e n i n s u l a w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ef r o mo t h e rr e g i o n s ，a n dt h u sm a l a yp e n i n s u l a a p p e a r e dt ob et h ec e n t e ro fg e n e t i cd i v e r s i t yo fe a g a l l o e h a o u r r e s u l t ss u p p o r tt h e h y p o t h e s i s t h a tp o p u l a t i o n sn e a rt h ec e n t e ro fas p e c i e s r a n g ea r ec o n t i g u o u sa n d g e n e t i c a l l yd i v e r s e ，w h e r e a sm a r g i n a lp o p u l a t i o n s a r ei s o l a t e da n dl e s sg e n e t i c a l l y v a r j a h l e 3 a n a l y s e so f m o l e c u l a rv a r i a n c e ( a m o v a ) a n dg s zv a l u e sr e v e a l e dt h a tm o s t v a r i a t i o nw a sw i t l l i np o p u l a t i o n s t h a tp a r t i t i o no fg e n e t i cv a r i a n c ef o rea g a h o e h a w a sg r e a t e rw i t h i nt h a na m o n gp o p u l a t i o n si sc o n s i s t e n tw i t ho b s e r v a t i o nw h i c h m o s t v a r i a t i o ni se x h i b i t e dw i t h i np o p u l a t i o nf o rm a n yp r e d o m i n a n t l yo u t c r o s s i n gw o o d y p l a n t s 4 u n w e i g h t e dp a i r g r o u pm e t h o du s i n ga r i t h m e t i ca v e r a g e ( u p g m a ) a n a l y s i s o fg e n e t i cd i s t a n c e s i n d i c a t e dac l u s t e r i n ga m o n gt h ep o p u l a t i o n so fea g a h o c h a a c r o s st h ed i s t r i b u t i o nr a n g e ，w h i l et h eo u t g r o u pp o p u l a t i o no f eo v a l i sw a sc l e a r l y s e p a r a t e d t h en o r t h e mh e m i s p h e r e a n dt h es o u t h e r nh e m i s p h e r ep o p u l a t i o n so f e 中山大学博士论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 a g a l l o c h a f e l li n t ot w od i s t i n c tc l u s t e r s i nt h en o r t h e r nh e m i s p h e r ec l u s t e r ，t h e s r i l a n k a p o p u l a t i o n s w e r ef i r s t s e p a r a t e d ，t h e nj a p a n ，t h e w e s tc o a s to fm a l a y p e n i n s u l a ，p r p s ( s i n g a p o r e ) a n dk r e t ( t h ee a s tc o a s to fm a l a yp e n i n s u l a ) ，b k e t ( f r o mb a n g k o k ，t h a i l a n d ) a n dc h i n ap o p u l a t i o n s t h ee a s tc o a s tp o p u l a t i o n so f m a l a y p e n i n s u l a ( i n c l u d i n gs i n g a p o r ep o p u l a t i o n ) w e r e m o r eg e n e t i c a l l ys i m i l a rt ot h e p o p u l a t i o n sf r o mc h i n at h a nt h o s ef r o mt h ew e s t e r nc o a s t l i n eo fm a l a yp e n i n s u l a f u r t h e r m o r e ，i ti si n t e r e s t i n gt h a tb k e t ( b a n g k o k ) p o p u l a t i o n f r o mt h ee a s t e r nc o a s t w a sg e n e t i c a l l ym o r er e l a t e dt oc h i n ar a t h e rt h a no t h e rp o p u l a t i o n sf r o mt h a i l a n d t h e s n t cp o p u l a t i o nf r o mt h ew e s tc o a s to ft a i w a ni sg e n e t i c a l l ym o r ed i s t i n c tf r o m j a p a np o p u l a t i o n st h a nc h i n ap o p u l a t i o n st h o u g hi t i s g e o g r a p h i c a l l yn e a r e s t t ot h e j a p a np o p u l a t i o n s t h e s er e s u l t ss u g g e s t t h a tl o n g d i s t a n c ed i s p e r s a lo f b u o y a n ts e e d s ， o c e a nc u r r e n t s ，p a s th i s t o r y ，l a n db a r r i e r s ，a n dc l i m a t i cf a c t o r sp l a yi m p o r t a n tr o l ei n p h y l o g e o g r a p h i c a lp a a e m o fe a g a h o c h a s i n c eea g a l l o c h ac o n t a i n sh i g hg e n e t i cd i v e r s i t ya n dm o s to ft h ev a r i a t i o n w i t h i np o p u l a t i o n ，c o n s e r v i n gm a n g r o v eh a b i t a ti st h eb e s tw a yt op r e v e n tt h el o s so f t h e g e n e t i cr e s o u r c e s 。 k e y w o r d s ：m a n g r o v e ，e x c o e c a r i aa g a l l o c h a ，i s s r ，g e n e t i cd i v e r s i t y , p h y l o g e o g r a p h i c a lp a t t e r n 申山大学博士学位论文 红树植物海漆遗传多样性及其亲缘 地理格局的研究 张志红 导师：施苏华教授 专业：植物学 答辩委员会 ? 、 主席：笏缎 辅肥卅祀萋呻c ：f 穆 学位授予单位：中山大学研究生院，广州 二00 四年五月 中山大学博士学位论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 第一章前言 1 1红树植物及其遗传多样性研究进展 1 1 1 红树植物分布与起源 红树植物( m a n g r o v e ) 是生长在热带、亚热带低能海岸潮间带，受周期性海 水浸淹的本本植物。部分植物具有胎萌、气生根、支柱根、泌盐组织和高渗透压 等适应特征。我国学者一般认同红树植物仅指红树林内的木本植物，而不包括草 本、藤本和附生植物，并把红树植物区分为真红树( t r u em a n g r o v e ) 和半红树 ( s e m i m a n g r o v e ) ( 张宏达，1 9 9 5 ) 。真红树植物是指专一性生长在潮间带的木本 植物，它们只能在潮阃带生长繁殖，在陆地环境不能够正常繁殖。半红树是指既 可生长存红树林中或边缘的，同时又可在陆地生长的两牺木本植物，但不具有胎 萌、根系多样性、泌盐、高渗透压等特殊特征( 张宏达，1 9 9 5 ) 。由于各国学者 对红树植物的概念和理解不同，全球究竟哪些植物属红树植物，它们究竟拥有多 少科、属、秭没有很确切的答案。c h a p m a n ( 1 9 7 6 ) 认为全世界真正的红树植物 只有1 1 科1 6 属5 5 种。t o m l i n s o n ( 1 9 8 6 ) 认为全世界现有红树植物约1 6 科2 0 属5 4 种；d u k e ( 1 9 9 2 ) 认为有1 9 科2 7 属7 0 余种；我国学者( 王伯荪，2 0 0 3 b ) 认为全借界共有红树植物1 6 科2 4 属8 4 种( 含1 2 变种) ，其中真红树为l l 科1 6 属7 0 种( 含1 2 变种) ，半红树为5 科8 属1 4 种。林鹏( 1 9 9 7 ) 则认为全世界真 红树植物共2 0 科2 7 属7 0 种。 气候、土壤、海水盐度和洋流等是影响红树林分布和生长的环境因子( 林鹏， 1 9 9 7 ) 。其中海平面温度和降雨是红树植物生长和分布最主要的限制性因素 ( d u k e ，1 9 9 2 ) 。世界红树植物大致分布于南、北回归线之间，由于暖流的影响， 最北可达北纬3 2 。n ，最南可达南纬3 3 0 s 。但以马来半岛及其附近岛屿的生长最 为繁茂，而且种类也最为丰富( e l l i s o n ，2 0 0 2 ) 。世界红树植物分为两大类群，即 中山大学博士学位论文 红树植物海漆遗传多样性及其录缘地理格局的研究 东方类群和两方类群( d u k e ，1 9 9 2 ；张宏达，1 9 9 5 ) 。东方类群包括非洲东岸、 业洲沿岸与东太平洋群岛、大洋州沿岸；西方类群包括美洲西岸、美洲东岸和非 洲西岸。它们在外貌和生态关系大体上类似，但前者的红树种类丰富。据王伯荪 ( 2 0 0 3 b ) 报道，东方类群有1 4 科1 8 属7 4 种( 含1 2 变种) ，西方类群有5 科6 属1 0 种。我国的红树林属东方群系，有1 2 科1 5 属2 6 种( 含1 变种) 。 红树植物的起源是多元性的，它们分属于不同的纲、目、科、属，并不是单 以某科描种类入海后再繁衍分化发展而来的( 林鹏，1 9 9 7 ) 。红树植物是一个古 老的一个类群，化石和花粉研究证实，几个现代属出现于早第三纪( e a r l y t e r t i a r y ) ， 例如，白骨壤属( a v i c i n n i a ) ，海桑属( s o n n e r a t i a ) ，红树属( r h i z o p h o r a ) ，和海 漆属( e x c o e c a r i a ) 等；在晚自垩纪地层中发现水椰n y p a 的化石( t h a n i k a i m o n i ， 1 9 8 7 ) 。王开发等报道了我国南海沿岸第四纪地层孢粉学分析结果，发现从第四 纪早期的更新世( 距今约2 4 0 万年前) 即有红树植物的分布，且红树科植物占木 本植物花粉总数的1 5 4 ，所占比例最大，可见当时红树植物的繁盛。 红树林是最具特色的湿地生态系统，兼具陆地生态和海洋生态特性，占据于 海洋生态关键区( e c o l o g i c a lc r i t i c a la r e a ) ，不仅在维护海岸生态平衡、防风减灾、 护堤保岸、净化环境等方面发挥重要作用，同时也蕴藏着可以适应这种咸淡水交 迭环境生存、生长的动植物、微生物基因库。红树林生境的破坏，不仅导致这种 重要自然资源的丧失，而且导致物种遗传多样性的缺失。 1 1 2 红树植物遗传多样性研究进展 多样性是生命最突出的特征之一。有机体的种类、形态，有机体之间的相互 依存与对抗都是生物多样性的具体表现，而蛋白质及核酸的多样性和多态性则是 生物多样性的物质基础。生物从各个高级分类阶层到种，乃至同一物种的不同居 群、同一居群的不同个体，都各有特征，互不相同，形成了自身的独特性。独特 性组成多样性，多样性是独特性之和。 中山大学博士学位论丈红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 任何一个物种都有其独特的基因库和遗传结构，同时在不同的个体间往往也 存在着丰富的遗传变异，这些统统构成了生物的遗传多样性。因此，遗传多样性 是生物界所有遗传变异的总和。狭义地况，遗传多样性是指种内基因的变化，包 括种内不同居群恻和同居群内的遗传变异( 马克平，1 9 9 3 ) ，亦称基因多样性。 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种多样性和生态系统多样性的基 础。 通常遗传变异最直接的表达形式就是遗传变异水平的高低。然而，对任何一 个物种来况，个体的生命很短暂，而由个体组成的居群或居群系统( 亚种、种) 才在时间上连绵不断，才是进化的基本单位。这些居群或居群系统在自然界有其 特定的分布格式，故遗传多样性不仅包括遗传变异的高低，也包括遗传变异的分 布格式，即居群的遗传结构( h a m r i c k ，1 9 8 7 ) 。 对遗传多样性的研究具有重要的理论价值和实际意义。首先，物种或居群的 遗传多样性是长期进化的结果，是其生存和发展的前提。一个物种或居群的遗传 变异越丰富，遗传多样性越高，往往对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展 其分布范围和开拓新的环境。理论推导和实验结果表明，生物遗传变异度的大小 _ = j 进化速率成正比。因此，对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史 ( 起源的时间、地点和方式) ，为进步分析其进化潜力与前景提供重要的资料。 其次，遗传多样性是保护生物学的核心研究内容之一。随着人口的快速增长和人 类经济活动加剧，人类赖以生存的基础一生物多样性受到严重的威胁，很多物种 濒临灭绝。不了解物种内遗传变异的大小、时空分前i 及其与环境条件的关系，就 无法采取科学、有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源( 基因) 。正如f a l k 所言“对于我们不了解的对象，我们是无法保护的”。再次，对遗传多样性的认 识是生物各分支学科重要的背景资料。古老的分类学或系统学几百年来都在不断 的探索、描述和解释生物界的多样性，并试图建立一个能反映自然或系统关系的 阶层系统及一个便利而实用的资料存取或查询系统( h e y w o o d ，1 9 9 1 ) 。对遗传多 样性的研究有助于人们更清楚的认识生物多样性的起源和进化，尤其能加深人们 中山大学博士学位论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 对微观进化的认识，为动植物的分类、进化研究提供有益的资料，进而为动植物 育利t 和遗传改良奠定基础。 由于人类活动的干扰和破坏，野生动植物栖息地碎裂、隔离化的问题越来越 严重，但牺息地碎裂、隔离对动植物居群的遗传多样性会产生何种影响仍然不十 分清楚，这是目前保护生物学研究的热点之一。碎裂、隔离使居群的分布出现了 叶i 心区、边缘区。有关中心区和边缘区居群的遗传多样性有两种对立的观点。第 种观点认为，由于边缘区有几个共同特点：小居群、受隔离、栖息地处于适宜 生态环境的边缘地带，且由于受近交、遗传漂变的影响，边缘区的居群遗传多样 性有降低的趋势。另一种观点则认为，边缘居群多处于强大的环境压力下，经历 不同的自然选择，强大的选择压力可能增大这些居群的遗传多样性。如p e t i t e t ( 1 9 9 8 ) 研究了分布在摩洛哥的一种树( a r g a n i d s p i n o s a ) 的遗传多样性后发现， 边缘区居群的遗传多样性高、低的情况比较复杂；如果边缘区居群小，遗传多样 性也较低，但较大的边缘区居群保存了较高的遗传多样性。 随着生物科学技术的进步和边缘学科的发展，遗传多样性的研究经历了一个 从简单到复杂、从宏观到微观、从表型到本质的过程。遗传多样性的研究通常从 4 个水平进行：形态学水平；细胞学一染色体水平；蛋白质水平：分子一d n a 水 平。前三种水平都是基因表达型的标记，可利用的多态位点较少，不能满足遗传 分析的需要。1 9 8 0 年d n a 限制性酶切片段长度多态性( r f l p ) 开创了直接应用 d n a 多态性研究遗传多样性的新阶段，遗传多样性的研究进入了分子水平。随着 p c r 技术的出现，许多新型的研究手段如随机扩增多态d n a ( r a p d ) 、扩增片 段长度多念性( a f l p ) 、简单重复区间序列( i s s r ) 、d n a 序列的直接测定等相 继出现。分子标记技术的飞速发展为遗传多样性的检测和研究提供了更为丰富的 手段。 由于红树植物特殊的环境适应性和生态作用，国内外学者对其形态解剖、生 理、生态、群落结构及分子系统学等方面做了大量的工作，但其遗传多样性和遗 传结构的研究则相对缺乏，相对于其他类型的植物也起步较晚。m c m i l l a n ( 1 9 8 6 ) 4 中山大学博士学位论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 川等位酶方法研究了来自墨西哥、加勒比海和太平洋巴拿马海湾的萌芽白骨壤( 彳 g e r m i n a n s ) 居群间的遗传结构。之后b a b ae ta l ( 1 9 8 9 ) 利用等位酶方法对日本 冲绳岛和西表岛的红海榄( r h i z o p h o r as t y l o s a ) 、秋茄( k a n d e l i ac a n d e l ) 、白骨壤 m a r i a ) 、榄李( l u m n i t z e r ar a c e m o s a ) 等6 种红树植物的遗传多样性作了报道。 d u k e 等( 1 9 9 5 ) 通过对印度西太平洋( i n d o w e s t p a c i f i c ) 白骨壤属居群遗传分 化的研究，修正了印度西太平洋地区红树林分布记录，并认为该属是西冈瓦那起 源，并通过南大陆板块片段移动而导致几个辐射分布的分类单位形成。国内对红 树植物居群遗传分化研究最早的是黄生，1 9 9 4 年他利用等位酶对来自台湾北部秋 煽居群进行研究，发现生长在沼泽区内较干燥地带的秋茄和长在潮湿地带的秋茄 遗传l 的分化程度很低( f s t = o 0 4 3 ) ，可能是因为区内的基因流很顺畅，抵消了 可能发生的居群分化。而后s u nm e i ( 1 9 9 8 ) 、葛学军( 1 9 9 9 ) 、葛菁萍( 2 0 0 0 ) 、 黎中盅( 2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 等分别对中国华南沿海的秋茄、木榄( b r u g u i e r a g y m n o r r h i z a ) 、 桐花树和白骨壤等红树植物的居群遗传多样性和遗传分化进行了初步研究。 除了蛋白质标记方面的工作，d n a 分子标记近年来开始被大量用于红树植物 遗传多样性的研究。赵萌莉、林鹏( 2 0 0 0 ) 采用r a p d 分子标记技术，对分布于 我国海南、广东、广西、福建和浙江等5 地9 个不同纬度的秋茄的遗传变异进行 了分析，总遗传多样性8 4 5 来自于居群内部，1 5 5 来自于居群间。l a k s h m i 等 ( 2 0 0 0 ) 运用r f l p 和r a p d 研究了印度沿岸7 个海漆( ea g a l l o c h a ) 居群，发 现其有较高的遗传多样性，物种水平r a p d 的多态位点百分数为7 4 ，r f l p 为 6 2 2 ，雄株和雌株显示相同的变异水平。p a r a n i 等( 1 9 9 7 a ) 运用r a p d 和r f l p 方法对印度不同地区白骨壤居群及白骨壤属其它一些物种的种内和种问变化的 研究，发现其居群聚类分析结果并不依赖于地理距离，而是更多地决定于其土壤 环境的适应性和抗污染性。最近，d o d d ( 2 0 0 2 ) 运用a f l p 技术对来自中美洲地 峡部太平洋东岸、大西洋西岸和4 0 0 0 多公里外大西洋东岸的1 4 个萌芽白骨壤居 群的遗传分化进行研究，发现中美洲地峡对其居群的遗传分化有显著影响。位于 中美洲地峡部两岸间居群的遗传距离大于大西洋东西两岸居群间的遗传距离，表 中山大学博士学位论丈红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 明陆地对其基因交换起阻隔作用，而海洋是开放的。并显示遗传距离与地理距离 ， i 相关。微卫星分子标记也已经成功应用于红树植物白骨壤居群遗传资源和白骨 壤幅的研究( m a g u i r e e ta l ，2 0 0 0 a ，2 0 0 0 b ) 。 i s s r 标记用于红树植物居群遗传多样性研究日前仅见于桐花树、角果木、银 叶树等居群的遗传多样性研究( g e a n ds u n ，1 9 9 9 ，2 0 0 1 ；简曙光，2 0 0 3 ) 。 1 2i s s r 分子标记及其在植物遗传研究中的应用 分了标记分为两大类：蛋白质标记和d n a 分子标记。蛋白质标记主要是指 等位酶。2 0 世纪6 0 一7 0 年代以来，等位酶作为一种基因的直接产物而被广泛用作 遗传标记。迄今为止，应用等位酶技术研究遗传变异已积累了丰富的资料。具有 较稳定、简便、迅速等优点，但随着等位酶水平上研究的大量开展和深入，其弱 点和局限逐渐为人们所认识。比如，酶电泳只能检测编码酶蛋白的基因位点，而 对非结构基因则无能为力；并且所检测的位点数目不可能很多( 一般常用2 0 3 0 个) ，尽管目前可分析的基因座位超过1 0 0 个，但对整个基因组来讲只是很小的 部分。因此酶电泳可能会低估遗传变异水平( m e l t e l l ，t 9 8 1 ) 。 1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r i c k 提出了d n a 分子结构的双螺旋模型，宣布了分子 遗传学时代的到来。1 9 7 4 年，g r o d z i c k e r 等首次提出d n a 限制性片段长度多念 性( r f l p ) 可以作为遗传标记，开创了直接应用d n a 多态性作为遗传标记的新 阶段。特别是随着大量限制性核酸内切酶成功分离和提纯，限制性片段长度多态 性( r f l p ) 技术受到密切关注，并被广泛用于遗传作图、基因标记、系统与进化 等研究领域。1 9 8 5 年m u l l i s 等发明了聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ， p c r ) ，使直接扩增d n a 的多态性成为可能。d n a 分子标记是基于研究d n a 分 子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短不一的重复序列等机制而 产生的多态性，是d n a 水平上遗传变异的直接反映。 简单重复问序列( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 标记，是近几年人们 6 中山大学博士学位论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 发展的一种新的d n a 分子标记。真核生物基因组中普遍存在着有1 4 个碱基组 成的简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ，并且进化速度很快，同一类 s s r 寡聚d n a 可以分布在整个基因组的不同位置，而且由于重复次数及程度的 小同而形成每个座位的多态性。i s s r 技术就是根据s s r 的特点，由z i e t k i e w i c z 于1 9 9 4 年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性的分子标记技术。无需知道 基因组的任何信息就可进行标记，因而既方便又快捷。用于i s s r 扩增的引物通 常为1 6 18 个碱基序列，由1 4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基 组成，从而保证了引物与基因组d n a 中的s s r 的5 或3 末端结合，导致位于 反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行扩增。由于s s r 在真核生 物中的普遍存在及其变异进化速度非常快，因而锚定引物的i s s r p c r 扩增能够 检测基因组许多位点的差异，揭示遗传上的差异。 i s s r 分子标记运行与r a p d 类似，具有r a p d 的简单，但由于有更长的引 物序列和较高的退火温度，因此其稳定性和重复性好。而且i s s r 标记可以揭示 整个基因组的一些特征，并呈孟德尔式遗传，是非常理想的分子标记。因此该技 术一问世就用于遗传多样性分析、绘制d n a 指纹图谱、和品质鉴定等许多领域。 遗传多样性与进化 j o s h i 等应用i s s r 标汜分析了稻属( o r y z a ) 物种的遗传多样性和系统发育关 系，研究材料包括稻属的1 7 个野生种和2 个栽培种( 即弧洲栽培稻和非洲栽培 稻) ，基于i s s r 带纹数据的严格一致树显示稻属是多途径进化的，因此i s s r 标 记在研究稻属植物进化关系中非常有用。h u a n g 和s u n ( 2 0 0 0 ) 根据i s s r 标记和 c p d n a 限制酶图谱分析，对番薯属( 1 p o m o e a ) 进行了研究，发现i s s r 标记可 产生丰富的多态位点，从而揭示种问、种内遗传变异情况，分别用这两种标记构 建的番薯属系统树具有相似的拓扑结构，并且i s s r 标记的高多态性可以更好的 区分种f 分类群间的关系。j i a n ( 2 0 0 3 ) 等应用i s s r 技术研究了中国、泰国、澳 中山大学博士学位论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 大利亚1 6 自然居群红树植物银叶树( h e r i t i e r al i t t o r a l i s ) 的遗传多样性，采用1l 条i s s r 引物共检测出1 6 8 个位点，其中多态位点1 5 4 个，多念位点百分率为 9 1 6 7 ，基因多样性指数( h ) 为o 2 2 7 ，遗传分化系数为o 3 1 9 。表明银叶树在 物种水平有较高的遗传变异水平，大部分遗传变异存在于居群内。g e 和s u n ( 1 9 9 9 ) 用i s s r 研究了另一红树植物桐花树( a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ) 的遗传多 样性，结果表明桐花树的遗传多样性水平很低，多态位点百分率为1 6 1 8 ，大部 分遗传变异存在于居群内，居群内的遗传变异占总遗传变异的8 2 2 ，居群闽仅 l l1 7 8 。 种质资源鉴定 i s s r 技术可以比r f l p 、s s r 、r a p d 等技术更多的揭示基因组中的多态性， 是一种很好的d n a 指纹标记。因此，该技术在种质资源鉴定方面显示出比其他 方法更高的优越性( 王建波，2 0 0 2 ) 。目前涉及到的植物包括玉米、小麦、马铃 薯、柑橘、水稻、葡萄等。p r e v o s t ( 1 9 9 8 ) 等应用4 个引物即可对马铃薯3 4 个 品种进行鉴别，其中有2 个引物单独使用即可区分出所有品种，4 个引物中任何 2 个引物组合，扩增结果也呈现出品种特异性，并且全部检测工作可以在9 小时 内完成，因此，i s s r 技术是一种快速、准确、可以产生足够多态位点的方法，可 用于大规模d n a 指纹分析，在植物种质资源鉴别中将发挥越来越大的作用。 遗传图谱的构建和抗性基因的标记 m 前用于基因的分子标记主要有r f l p 、r a p d 、s s r 、a f l p 等，在农业基 础与应用研究领域，特别是构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面应用这些 技术取得很大进展。许多科研工作者已利用i s s r 这一新的分子标记技术进行遗 传图谱的构建及抗性基因标记研究。从k 0 j i m a ( 1 9 9 8 ) 等首先利用i s s r 标记技 术完善了一粒小麦的遗传图谱，目前已用于桃、大麦、欧洲和日本落叶松、欧洲 中山大学博士学位论文红树植物海漆遗传多样性及其亲缘地理格局的研究 栗、欧洲草莓、柑橘等的遗传作图。 1 3 海漆的生物学特性、分布及其研究概况 海漆属( e x c o e c a r i a ) 属大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) ，约4 0 种，主要分布于亚 洲、非洲和大洋洲热带地区。我国有6 种和1 变种，产西南部经南部至台湾。该 属有两种为红树林成分，海漆( ea g a l l o c h al i n n ) 和卵叶海漆( eo v a l i se n d l ) 。 我国仅有海漆一种。 海漆( ea g a l l o c h al i z m ) 1 7 5 9 年由l i n n e a n 命名。常绿乔术或灌木，可达 l5 米高，全株有白色乳液。乳汁有毒，具腐蚀性，触及皮肤会发炎，入眼可引起 暂时失明，严蕈的可导致永久失明。因此又名“牛奶树”( m i l k ym a n g r o v e ) 或“弄 盲你的眼”( b l i n dy o u re y e ) 。叶互生，厚，近革质，叶片椭园形或阔椭园形，长 6 8 厘米，宽3 - 4 厘米，顶端短尖，尖头钝，基部钝圆，边有不明显的疏细齿。叶 柄粗壮，顶端有2 圆形腺体；花单性，雌雄异株，雄花蕖荑花序，雌花怨状花序。 蒴果