（内科学专业论文）蛋白激酶c在胰岛素抵抗骨骼肌细胞中的作用.pdf

iiiiiiilllllllllliiiiiiiiiillllllllilllllllllllul fy 18 9 2 5 2 0 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语6 三、论文主体 前言7刖青7 材料与方法8 结果1 1 讨论1 4 结论1 5 四、本研究创新性的自我评价1 6 五、参考文献1 7 六、附录 综述1 9 在学期间科研成绩3 0 致 射3 1 个人简介3 2 中文论著摘要 蛋白激酶c 在胰岛素抵抗骨骼肌细胞中的作用 - 上- j 一 刖吾 胰岛素抵抗( i n s u l i nr e s i s t a n c e , i r ) 是指外周靶组织对胰岛素的敏感性和反应 性降低，导致生理剂量的胰岛素产生低于正常的生理效应，长期瓜和高胰岛素血 症会引发一系列病理状态，如肥胖、尤其是内脏肥胖、糖调节受损、t 2 d m 、脂 肪肝、高血压、冠心病、脂质代谢紊乱等。瓜是葡萄糖耐量受损和t 2 d m 的主要 特征，而胰岛素受体信号转导缺陷是取发生的主要原因。在体内，胰岛素主要通 过i r s 1 p 1 3 k p k b ( m c t ) 信号途径促进葡萄糖转运。蛋白激酶b ( p r o t e i nk i n a s eb ， p k b a k t ) 位于磷脂酰肌醇3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e ，p 1 3 k ) 的下游， 是p 1 3 k 受体蛋白激酶的主要靶点，p k b 被p 1 3 k 激活后发生磷酸化，激活的p k b 可促进葡萄糖转运因子- 4 ( g l u c o s et r a n s p o r tf a c t o r - 4 ，g l u t - 4 ) 的转位和刺激葡萄 糖的摄取，调节胰岛素代谢反应，如调节糖原合成、糖酵解等。 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 是细胞内信号转导通路上的一个重要成 员，它的表达及激活与瓜和糖尿病的发生发展密切相关。体内脂质增加可通过p k c 影响胰岛素信号转导通路，然而具体的作用机理还不是十分清楚。骨骼肌是胰岛 素刺激的葡萄糖摄取的主要靶组织，也是瓜发生的主要部位。本研究从胰岛素信 号转导途径出发，探讨棕榈酸诱导骨骼肌细胞产生取的分子机制及p k c 在棕榈酸 诱导骨骼肌细胞瓜中的作用。 材料与方法 出生3 5 天s d 大鼠的骨骼肌细胞 d m e m 培养基优级胎牛血清 胰蛋白酶棕榈酸( p a l m i t i ca c i d ，p a ) 罗格列酮生物合成人胰岛素( 诺和灵r ) 葡萄糖检测试剂盒 白屈莱红碱( c h e l e r y t h r i n ec h l o r i d e ，c c ) a s a r c o m e t r i ca c t i n 单克隆抗体 罗丹明( t r i t c ) 标记的小鼠抗大鼠二抗 p k b 多克隆抗体 p s e r 4 7 3 p k b 多克隆抗体 碱性磷酸酶( a l p ) 标记的羊抗兔二抗 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 超低温冷冻冰箱 w e s t e r nb l o t t i n g 全：套设备 e c l 成像仪 g r a p h p a dp r i s m5 软件 采用胰蛋白酶和i 胶原酶联合消化、多次滤网过滤及差速贴壁法得到较高 纯度的骨骼肌细胞，免疫荧光方法鉴定原代大鼠骨骼肌细胞，p a 作用细胞后， 胰岛素刺激1 5 r a i n ，氧化酶过氧化物酶偶联法( g o d p o d 法) 检测培养液 中葡萄糖浓度。设立对照组、p a 组、罗格列酮组( r o s i g l i t a z o n e ，r o s 组) ， 每组一分为二，胰岛素刺激1 5 m i n 前，分别加与不加p k c 抑制剂c c 作用1 h ， w e s t e r nb l o t 方法检测p k b 蛋白及其磷酸化( p s e r 4 7 3p k b ) 水平。 结果 p a 组p s e r 4 7 3 p k b 的表达显著低于对照组和罗格列酮组。 p a 力h c c 组p s e r 4 7 3 p k b 表达与本组未加c c 相比显著升高。 对照组、p a 组及罗格列酮组的p k b 蛋白水平无明显变化。 结论 一定浓度的p a 可诱导骨骼肌细胞产生瓜；胰岛素增敏剂罗格列酮可减轻p a 诱 导的骨骼肌细胞i r ；在增加胰岛素敏感性方面，p k c 抑制剂c c 与罗格列酮有相似 的作用，二者均能改善p a 引起的瓜。 关键词 胰岛素抵抗；蛋白激酶c ；蛋白激酶b ；棕榈酸；骨骼肌细胞 2 英文论著摘要 t h er o l eo fp r o t e i nk i n a s eci ni s u l i nr e s i s t a n c eo f s k e l e t a lm u s c l ec e l l s o b j e c t i v e i n s u l i nr e s i s t a n c e ( i r ) i st h ed e s c e n d e n ts e n s i t i v i t ya n dr e s p o n s i v i t yo fp e r i p h t a r g e tt i s s u et oi n s u l i n ，a n dr e s u l tt h a tp h y s i o l o g i c a ld o s ei n s u l i np r o d u c e ss u b n o r m a l p h y s i o l o g i c a le f f e c t l o n gt e r mi ra n dh y p e r i n s u l i n e m i aw i l lc a u s eo b e s i t y , e s p e c i a l l y i n t e r n a lo r g a n , t o l e r a n c es u f f e r si n j u r y , t y p e2d i a b e t e sm e l l i t u s ，h e p a r a d i p o s u m ， h y p e r t e n s i o n , c o r o n a r yh e a r td i s e a s e ，l i p i d m e t a b o l i cd i s o r d e re t c t h ei n s u l i n r e s i s t a n c ei st h eg l u c o s et o l e r a n c es u f f e r si n j u r ya n d2d i a b e t e s c h i e ff e a t u r e s ，b u tt h e i n s u l i na c c e p t o rs i g n a lt r a n s d u c t i o nf l a wi st h ep r i m a r yc a u s ew h i c ht h e i n s u l i n r e s i s t a n c eo c c u r s i nv i v o ，i n s u l i np r o m o t es u g a rt r a n s p o r tm a i n l yt h r o u g hi r s 一1 p 1 3 - k e r d 3 ( a k t ) p a t h w a y p r o t e i n k i n a s e b ( p k b ) i s s i t u a t e di nd o w n s t r e a mo f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e ( p d - k ) ，a n dp k bi s ak e yt a r g e to fr e c e p t o rp r o t e i n k i n a s eo fp 1 3 一kw h i c h p k bi sa c t i v a t e db yp 1 3 一ka n dp h o s p h o r y l a t e d ，t h e nt h e a c t i v a t e dp k bc a np r o m o t eg l u c o s et r a n s p o r t - 4 ( g l u t - 4 ) t r a n s l o c a t i o na n ds t i m u l a t e g l u c o s eu p t a k e ，a n dr e g u l a t ei n s u l i n m e t a b o l i cr e a c t i o n ，s u c ha sg l y c o g e ns y n t h e s i sa n d g l u c o l y s i s p r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) i sai m p o r t a n tm e m b e ri ni n t r a - c e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o n p a t h ，w h o s ee x p r e s s i o na n da c t i v a t i o ni si n t i m a t e l ya s s o c i a t e dw i t l lo c c u r r e n c ea n d d e v e l o p m e n ti nh l s u l i i lr e s i s t a n c ea n dd i a b e t e sm e l l i t u s i nv i v o ，i n c r e a s e dl i p i dc a n a f f e c ti n s u l i nr e s i s t a n c es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t ht h r o u g hp k c ，b u tt h e s p e c i f i c m e c h a n i s mo fa c t i o ni sn o tv e r yc l e a r t h es k e l e t a lm u s c l ei st h em a i nt a r g e t o r g a n i z a t i o nw h e r et h ei n s u l i ns t i m u l a t i o ng l u c o s eu p t a k e s ，a n dt h em a i ns p o tw h i c h t h ei n s u l i nr e s i s t a n c eo c c u r s t h i se x p e r i m e n ts t a r t sf r o mi n s u l i ns i g n a lt r a n s d u c t i o n p a t h w a y ，a p p r o a c h st h em o l e c u l em e c h a n i s m o fi ri n d u c e db yp a l m i t i ca c i di ns k e l e t a l m u s c l ec e l l sa n dt h et h er o l eo fp k ci ni ri n d u c e db yp a l m i t i ca c i di ns k e l e t a lm u s c l e c e l l s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s s k e l e t a lm u s c l ec e l l sw e r eo b t a i n e df i o m3 5d a y so l dr a t s d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m h i g h - q u a i l t yf e t a lb o v i n es e r u m t r y p s i n p a l m i t i ca c i d r o s i g l i t a z o n eb i o s y n t h e t i ch u m a ni n s u l i nh j e c t i o n g l u c o s ea s s a yk i t c h e l e r y t h r i n ec h l o r i d e a - s a r c o m e t r i ca c t i nm o n o c l o n a la n t i b o d y m i c ea n t i - r a ts e c o n da n t i b o d yl a b e l e dt e t r a m e t h y lr h o d a m i n ei s o t h i o c y a n a t e p k b p o l y c l o n a la n t i b o d y p - s e r 4 7 3 p k bp o l y c l o n a la n t i b o d y g o a ta n t i - r a b b i ts e c o n da n t i b o d yl a b e l e dw i n la l k a l i n ep h o s p h a t a s e c 0 2i n c u b a t o r i n v e r t e dm i c r o s c o p e u l t r al o wt e m p e r a t u r ef r e e z i n gr e f r i g e r a t o r w e s t e m b l o t t i n gf u l ls e t e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c ef o r m a t t e r g r a p h p a dp r i s m5s o f t w a r e u s i n gt h ec o m b i n ed i g e s t i o no ft r y p s i na n dt y p eic o l l a g e n a s e ，m u l t i p l es t r a i n e r f i l t e ra n dt h ed i f f e r e n t i a la d h e r e n c em e t h o dt oo b t a i n e dh i g h l yp u r es k e l e t a lm u s c l e s a t e l l i t ec e l l s t h e p r i m a r y r a ts k e l e t a lm u s c l ec e l l sw e r ei d e n t i f i e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o d ，a f t e rt h ec e l l st r e a t e dw i t hp a l m i t i ca c i d ，i n s u l i n s t i m u l a t ef o r15m i n u t e s ，t h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw e r em e a s u r e db yg o d p o d m e t h o d c o n t r o lg r o u p ，p a l m i t i ca c i dg r o u pa n dr o s i g l i t a z o n eg r o u pw e r es e t ，e a c h g r o u pw a sd i v i d e di n t ot w o ，b e f o r ei n s u l i ns t i m u l a t e dt h ec e l l sf o r15m i n u t e s ，e a c hw i l l s a d d e di nt h ep k ci n h i b i t o rc ca n dc o m m o nc u l t u r es o l u t i o nf o ro n eh o u r r e s p e c t i v e l y l e v e l so fp k ba n di t sp h o s p h o r y l a t e df o r m ( p s e r 4 7 3 p k b ) w e r ed e t e r m i n e db y w e s t e r nb l o t r e s u l t s t h el e v e lo fp - s e r 4 7 3 p k bi np ag r o u pd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dt o c o n t r o lg r o u p sa n dr o s i g l i t a z o n eg r o u p s t h el e v e lo fp s e r 4 7 3 p k bi np ag r o u pw i t hc ce l e v a t e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d t ot h ep ag r o u pw i t h o u tc c 4 t h et o t a lp r o t e i nl e v e lo fp k bi ne v e r y g r o u pi sn o tm a r k e dc h a n g e c o n c l u s i o n s p aw i t has u i t a b l ec o n c e n t r a t i o nc a ni n d u c es k e l e t a lm u s c l ec e l l sf o ri n s u l i n r e s i s t a n c e a n dr o s i g l i t a z o n e ，ae u g l y c e m i ca g e n t ，c a nr e l i e v et h ei r c h e l e r y t h r i n e c h l o r i d e , t h es u p p r e s s a n to fp k c ，h a sas e m b l a b l es e m b l a b l ew i t hr o s i g l i t a z o n ei n a u g m e n ti n s u l i ns e n s i t i v i t y k e y w o r d s i n s u l i nr e s i s t a n c e ；p r o t e i nk i n a s ec ；p r o t e i nk i n a s eb ；p a l m i t i ca c i d ；s k e l e t a l m u s c l ec e l l s 5 英文缩写 6 论文 蛋白激酶c 在胰岛素抵抗骨骼肌细胞中的作用 上- j l - 刖吾 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，d m ) 是因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织、 细胞对胰岛素的敏感性降低，而引起的糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代 谢紊乱。t 2 d m 确切的发生机制尚不清楚，但几乎所有t 2 d m 病人都存在取。m 主 要发生在胰岛素信号转导通路中胰岛素受体及受体后环节。胰岛素受体为a 2 1 3 2 异 二聚体构成的跨膜蛋白，它保持内在的酪氨酸酶的活性。胰岛素与细胞外的a 亚单 位结合后，受体通过构象变化导致胞浆区p 亚单位特殊酪氨酸残基自动磷酸化，刺 激受体酪氨酸激酶催化活性。磷脂酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 是胰岛素受体的一个作用 靶点，它磷酸化4 ，5 - - 磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) 形成3 ，4 ，5 - - - 磷酸磷脂酰肌醇( p i p 3 ) 。 p i p 3 进而激活磷脂酰肌醇依赖激酶1 ( p d k - 1 ) ，p d k - 1 属丝氨酸苏氨酸激酶，它激 活p k b ( a k t ) 和非典型蛋白激酶c ( a p k c s ) 同工酶p k c - ( 和p k c 以，p k b 和 a p k c s 可介导葡萄糖转运载体- 4 ( g l u t 4 ) 从胞质转移至胞膜，g l u t - 4 易位至细胞膜 后将葡萄糖转运到细胞内，对葡萄糖代谢进行调节州( 图1 ) 。通路中任何一个 环节受损都会影响胰岛素信号的传导，诱发瓜的发生。 7 f a 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 属丝氨酸苏氨酸家族，是细胞内信号传导 通路上的一个重要成员，p k c 作为一种与糖代谢相关的重要胰岛素信号转导因子， 可能在t 2 d m 的发生中起着重要作用，并与胰岛素受体下调有关。研究显示游离 脂肪酸( f f a ) 升高可致肌细胞内d a g 含量增加，d a g 是激活p k c 的主要胞内物 质，它可直接激活p k c ，激活的p k c 可使多种蛋白的丝氨酸、苏氨酸发生磷酸化， 如催化i r s 1 的丝苏氨酸位点磷酸化，i r s 1 的丝氨酸磷酸化将降低其对p 1 3 k 的 激活，最终导致胰岛素刺激的g u l t - 4 活性降低和葡萄糖摄取减少，从而引起骨骼肌 胰岛素信号通路和葡萄糖转换的缺陷删。然而，f a r e s e 等研究发现，p k ca 缺乏 促进d m 和心血管疾病的发生阻1 。 因此，我们以大鼠骨骼肌细胞为实验对象，采用棕榈酸( p a l m i t i c a c i d ，p a ) 诱导骨骼肌细胞产生瓜后，分别设立对照组，p a 组及罗格列酮组( r o s i g l i t a z o n e ， r o s 组) ，每组一分为二，分别加与不j j n p k c 抑制剂c c 处理1 h ，胰岛素刺激1 5 m i n 后，w e s t e r nb l o t 检测p k b 蛋白及其磷酸化( p s e r 4 7 3 p k b ) 的表达，从而研究p a 诱导的骨骼肌细胞i r 的分子机制及蛋白激酶c 在瓜骨骼肌细胞中的作用，为临床寻 找有效的预防和治疗t 2 d m 靶点奠定理论基础和实验依据。 材料与方法 一、材料 ( 一) 试验用鼠及细胞培养试剂 新生3 5 天大鼠( 沈阳博尔美公司) ，d m e m 培养液( h y c l o n e 公司) ，优级 胎牛血清( 天津灏洋) ，胰蛋白酶( 沈阳宝泰克) 。 ( 二) 实验药品 棕榈酸( 中国医药) ，罗格列酮( r o s i g l i t a z o n e ，r o s ) ( c a y m a nc h e m i c a l 公 司) ，白屈莱红碱( c h e l e r y t h r i n ec h l o r i d e ，c c ) ( s i g m a l 公司) ，生物合成人胰 岛素诺和灵r ( 诺和诺德公司免费提供) 。 ( 三) 试剂盒及试验用抗体 葡萄糖检测试剂盒( 上海荣升) ， ( t r i t c ) 标记的抗体( 北京中衫) ， a s a r c o m e t r i ca c t i n 单克隆抗体和罗丹明 p k b 多克隆抗体及碱性磷酸酶( a l p ) 标 8 记的羊抗兔抗体( b i o w o r l d 公司) ，p s e r 4 7 3 p k b 多克隆抗体( s a b 公司) 。 ( 四) 主要用化学试剂 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，t r i t i o nx - 1 0 0 ，s d s ，t e m e d ，过硫酸铵，蛋白裂解液， 蛋白酶抑制剂( p m s f ) ，t r i s h e l ，p v d f 膜，e c l 发光液。 ( 五) 试验用仪器及设备 c 0 2 培养箱，超净工作台，8 0 冰箱，倒置相差显微镜，荧光显微镜，低速 离心机，低温高速离心机，纯水器，分光光度仪，w e s t e r nb l o t 全套设备，e c l 发 光设备。 二、方法 ( 一) 骨骼肌细胞原代培养 取新生3 5 天s d 大鼠，断头处死，浸泡在7 5 乙醇中消毒1 5 m i n ，无菌滤纸拭 干；超净台内去皮、剪下四肢、去爪；尽量去除脂肪、肌腱等结缔组织，p b s 洗3 次，将肌肉组织剪成1r a i n 3 左右的碎块，p b s 洗3 次。用0 1 的胶原酶( i 型) 和 0 2 5 胰蛋白酶置于3 7 培养箱内联合消化3 0m i n ；然后加入含1 5 胎牛血清的 d m e m 生长培养基终止消化，1 0 0 0r m i n ，离心1 0m i n ；吸出并保留上清液，重复 消化2 3 次，集合所得上清液，反复吹打，依次滤过1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 目的筛网n 0 1 ， 1 0 0 0r r a i n ，离心1 0m i n ；弃上清，用含1 0 胎牛血清的d m e m 培养液悬浮细胞， 并以l x l 0 5 孔的密度接种于l 多聚赖氨酸铺底的培养板中，3 7 c 、5 c 0 2 培养箱 培养，l h 后将上清液重新接种，重复接种2 次，每2 3 天换液，5 7 天后传代即可获 得原代培养的骨骼肌细胞。 ( - - ) 细胞传代及纯化 当细胞增殖至7 0 8 0 密度时，将培养液吸出，p b s 洗2 次，用0 2 5 胰蛋白 酶消化细胞1 3 m i n 。显微镜下控制过程，约9 0 细胞变圆或脱壁时，生长培养基 终止消化；吸管吹打制成细胞悬液，转移至离心管中1 0 0 0 r m i n ，离心5 1 0 m i n ；弃 上清，生长培养基重新悬浮细胞，以1 ：2 或者1 ：3 传代。若消化前细胞不纯，扁 平的成纤维细胞较多，可以在转移后再次采用差速贴壁1 h ，重新接种，显微镜下 观察细胞生长状态。 9 ( 三) 成肌细胞的免疫荧光鉴定 取培养至第2 代的细胞，胰蛋白酶消化后制成悬液，以l x l 0 5 孔接种于放有盖 玻片的6 孔培养板中，加入生长培养基3 7 、5 c 0 2 培养箱培养。待细胞分裂、 增殖至7 0 8 0 密度后，改用分化培养基( 含3 胎牛血清的d m e m ) 进行培养。 2 3 天后取出盖玻片，p b s 洗5m i n ，3 次；丙酮室温固定2 0m i l l ，p b s 洗5m i n ，3 次； d a p i ( i ：1 0 0 0 ) 染核1 5 m i n ( 避光) ，p b s 洗5 r a i n ，3 次。0 5 t r i t o n x1 0 0 ( 1 ：1 0 0 0 ) 透膜2 0 m i n ，p b s 洗5r a i n ，3 次；5 b s a 封闭2h ( 3 7 ) ，加入小鼠抗大鼠q s a r c o m e t r i c a c t i n 的一抗，4 过夜；p b s 洗5 m i n ，3 次，滴加山羊抗小g ( t r i t c 标记) 二抗 ( 1 ：1 0 0 ) ，室温孵育2 h ( 避光) ；p b s 洗5r a i n ，3 次；去离子水洗3 m i n ，2 次，荧 光显微下观察并照相。 ( 四) g o d p o d 法测定葡萄糖浓度 细胞以1 x 1 0 4 m l 接种于4 8 孔板，分化培养为成熟的肌管后，每6 孔一组，分别 加入正常培养液( 对照组) 、0 6m m o l lp a 的培养液( p a 组) ，于6 h 、1 2 h 、2 4 h 时间点加入胰岛素刺激1 5 m i n ，g o d p o d 法( 按说明书进行) 测定每孔培养液中 葡萄糖浓度。 ( 五) 实验分组 正常组、p a 组( 0 6 m m o l lp a 作用2 4 h ) 、p a + r o s ( 0 6 m m o l lp a 作用2 4 h + 2 0 1 m a o l l 罗格列酮作用2 4 h ) ，根据加与不j j h p k c 抑制剂白屈莱红碱( c h e l e r y t h r i n e c h l o r i d e ，c c ) ，分为对照( + ) 、对照( ) ；p a ( + ) 、p a ( ) ；r o s ( + ) 、 r o s ( ) ；各组一分为二，1 h 后胰岛素( 1 x l f f 7 m o l l ) 作用1 5 m i n ，收集细胞( 注： 其中+ ”表示该组加入c c ，”表示该组未加入c c ) 。 ( 六) w e s t e r nb l o t 检测p k b 及p s e r 4 7 3p k b 水平 将收集的细胞用p b s 洗2 次，蛋白裂解液( r i p a ) 和蛋白酶抑制剂( p m s f ) 冰上裂解3 0 m i n ，考马斯亮蓝法( 比色法) 测定蛋白浓度。每组上样蛋白1 5 0 u g ， 1 0 s d s p a g e 凝胶电泳，湿法电转移至p v d f 膜上( 电转3 h ) ；5 脱脂奶粉封 闭，4 c 过夜。弃去封闭液，用0 1 t w e e n 2 0 的t b s t 洗膜，1 0v a i n ，3 次。将膜 置于塑料袋内，分别加入0 1 t w e e n 一2 0 的t b s t 稀释的抗p k b ( 1 ：6 0 0 ) 抗p s e r 4 7 3 1 0 p k b ( 1 ：6 0 0 ) 及d - a c t i n ( 1 ：1 5 0 0 ) 一抗，室温孵育2 h 。t b s t 洗膜，1 0 m i n ，3 次； 然后用辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗( 1 ：1 5 0 0 0 ) ，室温孵育1 5 h , t b s t 洗膜，1 0 m i n ， 3 次，进行e c l 发光。采用g r a p h p a dp r i s m5 软件进行w e s t c 胍b l o t 灰度值分析。 ( 七) 统计学处理 用s p s s1 3 0 软件进行统计学分析，数据以x - t ：s 表示，组问比较使用配对t 检验，p 0 0 5 差异有统计学意义，p o 0 5 ) ；2 4 h 后，p a 组培养液中葡萄糖浓度较正常组显著升 高，差异有极显著统计学意义( p 0 0 1 ) ，即p 埘胰岛素刺激的糖转运产生抑制 蚴( 见表1 ) 。 表l ，胰岛素刺激不同时间点培养液中剩余葡萄糖浓度测定 注：峨n = 6 ，m m o l l ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pp o 0 5 ) ( 图4 ) 。p - s e r 4 7 3p k b 水 平在p a ( - + ) 组显著低于对照( - + ) 组和r o s ( + ) 组，差异有显著统计学意义 ( p 0 0 1 ) 。p k c 抑制剂c c 作用1 h ，p a ( + ) 组与p a ( ) 组相比，p s e r 4 7 3 p k b 水 平显著增加，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ( 图5 ) 。 髓舔鬻瀚瞩溺沥阌 # # ” ”7 ” p 鬣t i n 朔舅嗍 口旒 耐矬砖纛挂昭糙 1 8 0 1 7 0 1 6 0 1 5 0 对照p a 对照p ar o sr o s ( )( - )( + ) ( + )( - )( + ) 图4 ，胰岛素作用1 5 m i n ，各组p k b 的蛋白表达。 t 一爹黧f 曩髫润 卜1 攀4 一y q 一) ( ”+ ) t - )t + 1 3 2 2 0 2 0 0 1 8 0 1 6 0 1 4 0 对照p a 对照p ar o sr o s ( 一)( ) ( + ) ( + ) ( )( + ) 图5 ，胰岛素作用1 5 m i n ，各组p s e r 4 7 3p k b 的表达 注：事幸p a ( ) 组及p a ( + ) 组p s e r 4 7 3p k b 水平与其余各组相比显著下降； 与p a ( ) 相比，p a ( + ) 组p s e r 4 7 3p k b 水平显著增加。 讨论 目前，m 的发病机制尚不完全清楚，骨骼肌是机体利用葡萄糖的主要器官之 一，8 0 的葡萄糖在骨骼肌内代谢，也是瓜发生的主要部位。胰岛素主要通过i r s 1 p 1 3 一k p r 0 3 ( a k t ) 途径促进葡萄糖转运。p k b 是p 1 3 k 信号通路下游受体蛋白激酶 的主要靶点，也是胰岛素信号通路下游的关键分子之一，它由p 1 3 k 激活后其结构 发生变化导致其两个调节位点t h r 3 0 8 和s e r 4 7 3 磷酸化。在多数情况下，s e t - 4 7 3 位 点磷酸化水平可以代表p k b 的磷酸化程度n 3 q 柏，磷酸化的p k b 能刺激葡萄糖摄取和 g l u t - 4 转位，调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖酵解等胰岛素代谢反应n 钉。蛋白激 酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 是1 9 7 7 年由n i s h i z u k a 在鼠脑的胞质成分中发现的一种 依赖磷脂和钙的蛋白激酶，由多种亚型构成，目前发现其包括0 【、p 、6 、丫、t i 、 t t 、q 、0 等1 2 种亚型n 6 1 。p k c 亚型的表达及其激活与瓜和d m 的发生发展密切相关。 本实验中p a 组p s e r 4 7 3p k b 的水平低于对照组，表明p a 诱导骨骼肌细胞产生 i r 与p k b 活性降低有关n 幻，p k b 在i r 中起重要作用。p a 组加用c c 与本组未加c c 相 比，p s e r 4 7 3p k b 的水平是升高的，表明p k c 抑制剂可能通过抑制p k c 活性进而 使i r 中p s e r 4 7 3p k b 的表达增加，即p k c 可能通过某种途径抑带i j p k b 的活性而影 响胰岛素信号的下传。有研究显示，c 2 c 1 2 细胞中p k c 6 激活可使i r s 1 的s e r 3 5 7 位点发生磷酸化，从而降低胰岛素介导的i r s 1 的酪氨酸磷酸化，进一步使p k b 的 1 4 激活减少，即p k c 6 激活对胰岛素信号起负性调节作用n l1 8 。k i m 等报道p k c e 失 活可明显减少i r s 1 降解并增加胰岛素诱导的i r s 1 酪氨酸磷酸化和与p 8 5 相关的 i r s 1 和p 1 3 k 的磷酸化n 们。c i p o k 发现选择性的抑制p k c 吨可改变i r s 1 水平最终使 通路中p k b 活性增加啪1 。因此，p k c 可能通过作用于胰岛素信号传导通路某个环节 对其进行负调节。同时，p a 组p s c r 4 7 3p k b 的水平显著低于罗格列酮组( 加c c 和不9 1 c c ) ，提示胰岛素增敏剂罗格列酮可增加瓜肌组织中p k b 的磷酸化水平， 而p k c 抑n 齐1 c c 与罗格列酮存在相似性的作用，二者均可以改善p a 诱导的骨骼肌 的瓜。此外，各组的p k b 蛋白总体水平并没有发生变化，可见在瓜状态下，p k b 的总蛋白水平并不减少，只是活性降低，而罗格列酮和c c 并不增加p k b 蛋白的表 达，只是使其活性增加。 综上所述，在p a 诱导的骨骼肌细胞瓜方面p k c 起重要作用，它能抑制p k b 活 性并减少葡萄糖利用，p k c 抑制剂c c 与罗格列酮一样具有改善p a 引起的瓜的作 用。p k c 抑铝, j n c c 增加p k b 的磷酸化可能是通过减少了p k c 的过度激活，而减少 其对p k b 的抑制，从而对胰岛素信号转导起正调节。当然，我们的后续研究会研 究p k c 各亚型的功能，从而了解p k c 在承中的全面作用，为t 2 d m 的治疗提供新的 靶点。 结论 一定浓度的p a 可诱导骨骼肌细胞产生瓜，胰岛素增敏剂罗格列酮可减轻p a 诱 导的骨骼肌细胞的瓜，在增加胰岛素敏感性方面，p k c 抑制剂c c 与罗格列酮有相 似的作用，二者均能改善p a 引起的瓜。 1 5 本研究创新性的自我评价 1 以往国内研究的取模型多是肝细胞和脂肪细胞，骨骼肌细胞研究极少，本 实验采用p a 诱导骨骼肌细胞的产生瓜，骨骼肌是机体利用葡萄糖的主要外周组 织，这将对更好的认识和了解瓜机理有重要意义。 2 首次将p k c 抑制剂c c 与胰岛素增敏剂罗格列酮作比较，从而证实p k c 抑制 剂和罗格列酮在增加胰岛素敏感性方面有相似的效应，为研发以p k c 为靶点的d m 的治疗药物有重要意义。 1 6 参考文献 l t r e m b l a yf ，l a v i g n ec ，j 戤：q u 鹳h ，e ta 1 d i e t a r yc o dp r o t e i nr e s t o r e si n s u l i n - i n d u c e d a c t i v a t i o no fp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e a k ta n dg l u t - 4t r a n s l o c a t i o nt ot h et - t u b u l e si n s k e l e t a lm u s c l eo fh i g h - f a t f e do b e s er a t s j 1 d i a b e t e s ，2 0 0 3 ，5 2 ( 1 ) ：2 9 - 3 7 2s i l v i et i m m e r ss , p a t r i c ks c h r a u w e np , v o g e lj d m u s c u l a rd i a e y l g l y c e r o lm e t a b o l i s ma n d i n s u l i nr e s i s t a n c e jp h y s i o l o g y & b e h a v i o r2 0 0 8 9 4 ：2 4 2 - 2 51 3b h a t t a c h a r y as ，d e yd ，r o ys s m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fi n s u l i nr e s i s t a n c e j b i o s c i 2 0 0 7 ，3 2 ：4 0 5 4 13 4 张敬芳，王光浩，吴勇胰岛素信号传导与2 型糖尿病 j 】中国现代医学杂志，2 0 0 7 ，1 7 ( 6 ) ： 6 9 3 - 6 9 6 5 窦梅，马爱国胰岛素抵抗主要原因及机制的研究进展【j 】国外医学卫生学分册，2 0 0 9 ，3 6 ( 3 ) ：1 7 3 1 7 9 6i t a n is lr u d e r m a nn b ，s c h m i e d e rf ，e ta 1 l i p i d - i n d u c e di n s u l i nr e s i s t a n c e 丽mc h a n g e si n d i a c y l g l y c e r o l ，p r o t e i n k i n a s e ca n d i k a p p a b - a l p h a 【j 】d i a b e t e s ，2 0 0 2 ，5 1 ( 7 ) ：2 0 0 5 - 2 0 1 1 7t i m m e r ss ，s c h r a u w e np ，v o g e lj p m u s c u l a rd i a c y l g l y c e r o lm e t a b o l i s ma n di n s u l i n r e s i s t a n c e 【j 】p h y s i o l o g y & b e h a v i o r , 2 0 0 8 ，9 4 ( 2 ) ：2 4 2 - 2 51 8i d r