（水产养殖专业论文）黄鳝胰蛋白酶的纯化及动力学性质的研究.pdf

黄鳝胰蛋白酶的纯化及动力学性质的研究 水产养殖专业硕士研究生张美红 指导教师李英文副教授 摘要 胰蛋白酶是消化酶的一种，属于丝氨酸蛋白酶家族，对鱼类食物蛋白质的消化具有重要的生理 作用。胰蛋白酶来源于鱼类的胰脏、肠道和幽门盲囊。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于鱼类 胰脏中，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白 酶。黄鳍是我国主要的名优淡水鱼类养殖品种之一，其营养丰富、肉质鲜美，进行规模化养殖具有 广阔的发展前景。黄鳝胰蛋白酶的相关研究可为黄鳍饲养的饲料配给提供相关信息，也可为一直作 为下脚料的黄鳝内脏的合理回收利用提供理论基础。可是到目前为止，还未见黄鳝胰蛋白酶分离纯 化及其性质方面的研究报道。本研究主要是对黄鳝胰蛋白酶进行分离纯化，并对其动力学性质进行 了分析研究，具体研究如下； 1 黄鳝胰蛋白酶的纯化研究 将黄鳝在冰盘上解剖，取出肝胰脏，用预冷单蒸水淋洗。再用纱布将其沥干加入四倍体积的 p h 8 05 0 r a mt d s - h c i 缓冲液( 含o 0 2 叠氮化钠) 中，用搅拌机打碎成稀糊状灌。4 c 静置过夜后离 心( 1 5 0 0 0gx 4 0 m i n ) ，过滤取上清液。然后将胰蛋白酶粗提液在4 c 按饱和度3 0 、4 0 、5 0 、 6 0 、7 0 、1 0 0 逐步进行硫酸铵分级沉淀，确定出胰蛋白酶的最佳硫酸铵沉淀饱和度范围为3 0 6 0 。收集3 0 6 0 0 a 的硫酸铵沉淀，用适量的提取液溶解后，在同样的缓冲液中透析过夜。 离子交换填料采用a m c r s h a m 公司的d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w ，装入层析柱( 1 2 x 2 0 c m ) 中， 先用大约1 0 0 m l 的5 0 m m 、p h 7 0 tr i s h c l 缓冲液以8 1 0 m m i n 的速度平衡d e a e s e 曲a r o s f a s t f l o w 柱，然后将透析过夜后的酶液上柱一t - d e a e - s e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析柱，再用相同的缓 冲液冲洗掉未结合的蛋白质。用5 0 m m 、p h 7 0tr i s h c i 缓冲液c # o 1 m n a c i 、o 2 m n a c i 、o 3 m n a c i 、0 4 mn a c i 、0 5 m n a c i ) 分别进行洗脱，收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰，进行下一步纯化。 亲和层析采用的是5 m l h i t r a p b e n z a m i d i n e f f ( h i g hs u b ) 亲和预装柱。先用5 个柱床体积( 2 5 m 1 ) p h 8 0o ，0 5 m t d s - h c i 缓冲液( 含0 5 m n a c l ) 以2 m l m i n 的流速平衡。待基线为0 0 2 以下时，然后以 2 m l m i n 的流速上样。再用5 1 0 个柱床体积的平衡液冲洗，洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。经 实验研究，选择用p h 3 0 $ 0 m m 甘氨酸h c l 亲和洗脱液以5 m l m i n 的速度洗脱收集具有胰蛋白酶 活性的洗脱峰，每毫升加6 0 - 2 0 0 u lp h9 0i mt r i s - h c i 调节其p h 值，以保持酶的稳定。 用勰的浓缩胶和1 2 的分离胶进行s d s - f a g e 电泳，黄胰蛋白酶呈现出单一条带。并测得胰蛋白 酶的分子量约为2 6 8 k d a 。通过测定每一分离纯化步骤所得胰酶样品的活力及比活力( 以t a m e 为 底物) ，黄鳝胰蛋白酶的纯化倍数达到约9 0 0 倍，比活力为5 3 8u r a g ，晟终产率为1 4 6 。 西南大学硕士学位论文 中文摘要 2 黄鳝胰蛋白酶动力学性质的研究 以b a n p 为底物。测得黄鳝胰蛋白酶的动力学常数( k m ) 为0 2 2 m m 。取黄鳝胰蛋白酶纯品液， 在同一口h 值( 8 0 ) 条件下，设2 0 2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、 6 5 、7 d 、7 s 等1 2 个温度梯度，分剐以t a m e 为底窃测定胰蛋白酶的话性，铡得黄鳝胰蛋自 酶的最适反应温度为5 0 。在同一温度( 2 5 ) 条件下，设6 0 、6 5 、7 0 、7 , 5 、8 , 0 、8 5 、9 0 、9 5 、 1 0 0 、1 0 5 等l o 个p h 梯度分别以t a m e 为底物测胰蛋白酶的活性测得黄鳝胰蛋白酶的最适反 应p h 值为8 0 。 将黄鳍胰蛋白酶在不同的温度条件下( 3 0 、4 0 、5 0 c ) 放置一段时间后，其活性都随着时 闯的增加而逐渐减少，其中3 0 0 c 条件下胰蛋白酶括性减少的趋势最慢，5 0 4 c 条件下胰蛋白酶括性 减少的趋势最快4 0 c 条件下胰蛋白酶活性减少的趋势居中。将黄鳝胰蛋白酶在不同的p h 条件下 ( 6 0 、7 0 、8 0 、9 0 ) 放置一段时间后，其中p h 7 0 的条件下胰蛋白酶活性几乎保持不变，p h 9 0 条件下胰蛋白酶活性减少的趋势较快，p h 8 0 条件下胰蛋白酶活性减少的趋势较慢，p h 6 0 条件下 胰蛋白酶活性减少的趋势最快。 在黄鳝胰蛋白酶液中分别加入不同浓度( 5 m m 、1 0 r a m 、1 5 m m 、2 0 r a m ) 的金属离子( k + 、 n a + 、c f + 、m 9 2 + 、c u 2 + ) 和e d t a 溶液。分别处理3 0 m i n 后。结果显示n a + 、c f + 对黄鳝胰蛋白 酶的活性并无影响；m 9 2 + 对黄鳝胰蛋白酶的活性有轻微的抑制作用；c u 2 + 和e d t a 对黄鳍胰蛋白酶 的活性有强烈的抑制作用，在c d 和e d t a 的浓度分别达到2 0 r a m 和1 5 m m 时，可使胰蛋白酶的 活性完全失去；k + 对黄鳝胰蛋白酶的活性先有激活作用，在k + 浓度达到1 5 m m 时，它却对黄鳝胰 蛋白酶的活性具有抑制作用。 关键词：黄鳗胰蛋白酶纯化动力学性质 h 西南大学硕士学位论文 英文摘要 p u r i f i c a t i o na n dk i n e t i cp r o p e r t i e so f t r y p s i n f r o mr i c ef i e l de e l ( m o n o p t e r u sa l b u s ) m a s t e ro f a q u a c u l t u r e m e i h o n g ，z h a n g s u p e r v i s o ra s s o c p r o f y i n g w e n ，l i a b s t r a c t t r y p s i ni sas o r to f d i g e s t i v ee n z y m e ，w h i c hb e l o n g st ot h ef a m i l yo f p r o t e a s e sa n dh a si m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a la c t i o ni np r o t e i n i ca s s i m i l a t i o no ff i s h sd i a e t t r y p s i nc o m e sf r o mp a n c r e a s ，i n t e s t i n e sa n d p y l o r i cc e c ao ff i s h t r y p s i ne x i s t si nf i s h sp a n c r e a sw i t hi n a c t i v ez y m o g e n ，w h i c h i sa c t i v a t e db y e n t e r o k i n a s eo rt r y p s i n ，a n di t sm o l e c u l a rs t r u c t u r eh a sc h a n g e df r o mt r y p s i n o g e nt ot r y p s i n t h i sr e s e a r c h i st op u f f 母a n dc h a r a c t e r i z et r y p s i nf r o mr i c ef i e l de e l ( m o n o p t e r a sa b u s ) ，d e t a i l e dr e s e a r c h sa r cs h o w e d ： b u tu pt on o w , t h e r ee r en or e p o r t sa b o u tt h ep u r i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e so ft r y p s i nf r o mr i c e f i e l de e i ( m o n o p t e r a sa l b u s ) r i c ef i e l de c l ( m o n o p t e r a sa l b u s ) i sa f r e s h w a t e rf i s h ，w h i c hi sn u t r i t i o u sa n d d e l i c i o u s ，s oi t sc u l t u r ei sw i d e l yd e v e l o p e d r e s e a r c ha b o u tt r y p s i nf r o mr i c ef i e l de e l ( m o n o p t e r a sa l b u s ) w i l lo f f e rc o r r e l a t i v ei r e f o r m a t i o nt of e e dp r e p a r a t i o n 1 s t u d yo nt h ep u r i f i c a t i o no ft r y p s i nf r o mr i c ef i e l de e l ( m o n o p t e r a sa l b u s ) f r e s hr i c e f i e l de e l s ( m o n o p t e r a sa l b u s ) w e r ea n a t o m i z e do ni c et r a y , a n dt a k eo u th e p a t o p a n c r e a s ， t h e nw a s h e dw i t hd i s t i l l e dw a t e r , a n dc h o p p e da n dh o m o g e n i z e di nf o u r f o l d ( w v ) o f5 0 m mt r i s - h c i ， p h 8 0 ，c o n t a i n i n g0 0 2 s o d i u ma z i d ew i t ht i s s u eg r i n d e r t h em i x t u r ew a ss t i r r e do v e r n i g h ta t4 ca n d c e n t r i f u g e da t1 5 0 0 0g f o r4 0 m i na t4 。t h es u p c r u a t a n tw a sc o l l e c t e d 。t h ec r u d ee n z y m es o l u t i o nw a s s u b j e c t e dt o3 0 6 0 a m m o n i u ms u l f a t e ( a s ) f r a e t i o n a t i o n t h ea sf i n nw a sd i s s o l v e di na n a p p m p r i a t ea m o u n to f 5 0 m mt r i s - h c l ，p h 8 0 ，a n dd i a l y z e da g a i n s tt h es a m eb u f f e r i o ne x c h a n g es t u f f i n ga d o p t e dd e a e - s a p h a r o s e t mf a s tf l o w ，a n di n c a s e dt oc h r o m a t o g r a p h y c o l u m n ( 1 2 x 2 0 e m ) t h e d i a l y z a t e w a s l o a d e d o n t o a d e a e - s a p h a r o s e f a s t f l o wc o l u m n e q u i l i b r a t e d w i t h1 0 0 m l p h 7 05 0 r a m tr i s h c la tar a t e o f 8 一l o m v m i n u n a b s o r b e d p r o t e i n s w e r e w a s h e d w i t h t h ee q u i l i b r a t i o n b u f f e r t h e t r y p s i n l i k e e n z y m e w a s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n u s i n 9 5 0 m m tr i s h c i ，p h 7 0c o n t a i n i n g o i m n a c i 、o 2 m n a c i 、0 3 m n a c i 、o 4 m n a c i 、o 5 m n a c ir e s p e c t i v e l y ，t h e nc o l l e c t e d e l u c t e da p e xc o n t e i n i n gt r y p s i nf o r t h en e x tp u r i f y i n gs t e p a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya d o p t e d5 m lh i t r a pb a n z a m i d i n ef f ( h i g hs u b ) a f f i n i t ye q u i p p e dc o l u m n t h ed i a l y z a t ew a sl o a d e do n t oa f f i n i t ye q u i p p e dc o l u m nu n t i lt h ee f f l u e n th a dn od e t e c t a b l ea b s o r p t i o na t 1 1 i 西南大学硕士学位论文 英文摘要 2 8 0n m ，a n de q u i l i b r a t e dw i t h2 5 m lp h 8 00 0 5 mt i s - h c ic o n t a i n i n go 5 mn a c ia tar a t eo f2m l m i n u n a b s o r b e dp r o t e i n sw e r ew a s h e dw i t ht h ee q u i l i b r a t i o nb u f f e r t h et r y p s i nw a se l u t e df r o mt h ec o l u m n u s i n g5 0 m mp h 3 05 0 r a mg l y - h c ia tar a t eo f 5m l m i n ，a n da c c o m m o d a t e di t sp hv a l u eb yp h9 0i m t r i s h c if o rh o l d i n gt r y p s i na c t i v i t y s o d i u md o d e e y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c l r o p h o r e s i s ( s d s - p a g e ) w a sp e r f o r m e du n d e r r e d u c i n gc o n d i t i o n su t i l i z i n gf l5 s t a c k i n gg e la n dal2 s e p a r a t i n gg e l ，t r y p s i nf r o mr i c ef i e l d e e l ( m o n o p t e r a sa l b u s ) s h o was i n g l eb a n d a l s o ，t h em o l e c u l a rw e i g h to ft r y p s i nw e r ed e t e r m i n e db y u s i n gt h i sm e t h o d ，i t sm o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t2 6 8 k d a t h r o u l g hd e t e r m i n ea c t i v i t i e so ft r y p s i nb y t a m eo ne a c hs t e p ，t r y p s i nw a sa b o u t9 0 0 f o l dp u r i f i e d ，w i t ht h es p e c i f i ca c t i v i t yo f5 3 8 u r a ga n d r e c o v e r yo f1 4 6 2 s t u d yo nt h ek i n e t i cp r o p e r t i e so ft r y p s i nf r o mr i c ef i e l de e l ( m o n o p t e r a sa l b u s ) u s i n gb a p n aa ss u b s t r a t e ，t h em i c h a e l i sc o n s t a n t ( k m ) o ft r y p s i nf r o md e ef i e l de e l ( m o n o p t e r a s a l b u s ) i so 2 2 m m a tat e m p e r a t u r eo f 2 5 c ，a c t i v i t yo f t r y p s i nw a sm e a s u r e di nb u f f e r so f d i f f e r e n tp h v a l u e i ti n d i c a t e dt h a t ：t r y p s i ne x h i b i t e do p t i m a la c t i v i t ya tap ho f8 0 a tap hv a l u eo f8 0 ，a c t i v i t yo f g tw a sm e a s u r e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e u s i n gt a m e s u b s t r a t e i ti n d i c a t e dt h a t ：t r y p s i ne x h i b i t e d o p t i m a la c t i v i t y a t a t e m p e r a t u r e o f 5 0 c u s i n g t a m e s u b s t r a t e t r y p s i nw a si n c u b a t e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ( 3 0 、4 0 、5 0 ) f o rs o m et i m e i ti n d i c a t e dt h a t ： a c t i v i t i e s o f t r y p s i n a l l d e c r e a s e dc o n t i n u o u s l y i t d e c r e a s e d t h e m o s ts l o w l y a t t h e t e m p e r a t u r eo f 3 0 c a n d d e c r e a s e dt h em o s tq u i c k l ya tt h et e m p e r a t u r eo f5 0 c t r y p s i nw a si n c u b a t e di nb u f f e r so fd i f f e r e n tp h v a l u e ( 6 0 、7 0 、8 0 、9 o ) f o rs o m e t i m e i t i n d i c a t e d t h a t ：a c t i v i t i e s o f t r y p s i nk e e p o ns a m ea t t h e p h v a l u e o f6 0 i td e c r e a s e dm o r cq u i c k l ya tt h ep hv a l u eo f8 0 i td e c r e a s e dt h em o s ts l o w l ya n dd e c r e a s e dt h e m o s tq u i c k l ya tt h ep hv a l u eo f 9 0 w h e n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n ( 5 m m 、1 0 m m 、2 0 r a m ) m e t a l i o n sa n d e d t a w e r ea d d e d i n t r y p s i n f o r3 0m i n u t e s ，i ti n d i c a t e dt h a t ：n + 、c a 2 + d i d n ta c t i v a t et h ee n z y m e ；m 9 2 + s l i g h t l yi n h i b i t e dt h ee n z y m e a c t i v i t y ；c u 2 + 、e d t as t r o n g l yi n h i b i t e de n z y m ea c t i v i t y ；b u tk + a c t i v a t et r y p s i nf i r s t l ya n di n h i b i t e di ta t t h ec o n c e n t r a t i o no f1 5 m ma f t e r w a r d s k e yw o r d s ：r i c ef i e l de e l t r y p s i n p u r i f i c a t i o nk i n e t i cp r o p e r t i e s 独创性声明 x 9 3 7 5 4 5 学位论文题目：黄鲢臆蛋自醛鲍纯毡丞叠左堂性厦盟珏究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 、， 学位论文作者：“关红签字日期：2 6 年f 月曰日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：；坛类f 二 导师签名： 签字日期：p 秭年歹月，f 日签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 0 1 f 年月歹日 电话：(2 邮编： 西南大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 1 黄鳝的研究概况 第1 章文献综述 黄鳝( m o n o p t e r a sa l b u s ) 俗称鳝鱼、长鱼、罗鳝、田鳗、无鳞公主等。在分类学上隶属于鱼纲、 辐鳍亚纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝亚科。黄鳝为温热带的淡水底栖生活鱼类广泛分布于全国各地 的湖泊、河流、水库、池沼、沟渠等水体中。除西北高原地区外，各地区均有记录，特别是珠江流 域和长江流域，更是盛产黄鳝的地区。在国外，主要分布于泰国、印度尼西亚、菲律宾等地，印度、 日本、朝鲜也产黄鳝。黄鳝是我国主要的名优淡水鱼类养殖品种之一，其营养丰富、肉质鲜美，进 行规模化养殖具有广阔的发展前景。由于黄鳍在现今市场上处于供不应求的状态，而其集约化养殖 尚还存在着诸多问题。因此，许多学者己对黄鳍繁殖技术、性逆转现象、年龄与生长、食性、人工 养殖、消化酶等方面进行了深入的研究和探讨，以求发现更多的理论用于指导实践，推动黄鳝养殖 的发展。 1 1 1 黄鳞繁殖生物学的研究 黄鳝的人工繁殖技术研究是近年来的研究重点，黄鳝繁殖成功与否，直接关系到黄鳝的养殖规 模大小。为弄清黄鳝在繁殖方面的生物学表现，迄今为止我国学者已对黄鳝繁殖生物学方面进行了 以下研究。如肖皿梅等”1 研究了黄鳝生殖腺和早期发育及其结构变化，结果表明，黄鳝生殖腺初始 发生时是两条独立的生殖腺。随着发育两条生殖腺系膜的合并形成一条生殖腺囊，共同偏移于身体 一侧，但是生殖腺囊内的两条生殖褶在功能和形态上是独立而且分离的。王浩等口1 研究表明雌性特 异蛋白质复合物能促进黄鳝性腺发育，提高孵化率。陶豫雄等p “j 研究了外源激素对雌性黄鳝血清 类固醇激素主要是雌二醇的影响，对雄性黄鳝性类固醇激素主要是睾酮分泌的影响。周定刚等 1 运用常规染色法、组织化学法和扫描电镜对黄鳝卵巢和精巢的发生、发育和周期变化规律进行了研 究。发现黄鳝卵子卵黄的发生具有较明显的阶段性，处于发育早期的卵母细胞的总数和面积逐渐减 少，而发育较晚的卵母细胞则逐渐增多。观察发现到精原细胞可分为两种类型：初级精原细胞和次 级精原细胞，精子鞭毛轴丝由外周9 组微管和两根中央徽管构成；间质细胞分布有广泛的滑面内质 网和具小管的线粒体。并报道了h c g 诱导排卵期间黄鳝血浆6 酮一前列腺素f 1 含量的变化，以及 d a 的拮抗物( d o m p e r i d o n e ) 和消竭剂( r e s e r p i n e ) 对l h r h - a 诱导黄鲳排卵产生的影响j 。认为黄鳝 对外源激素的敏感性低于鲤科鱼类，注射剂量大，效应时间长。还研究了催产时卵磷酸酶活性的变 化【8 i 、性类固醇激素的变化p l ，发现卵磷酸酶活性增强与卵母细胞成熟、捧放有直接关系，为研究 探索排卵机制提供资料。尹绍武”w 通过对繁殖季节黄鳝孵卵所吐出的泡沫的特性和生化成分分析 证实了黄鳝繁殖季节所产的孵卵泡为大分子的糖蛋白类，在对提高受精卵孵化率、仔苗成活率、增 加溶氧量、促使卵膜正常破裂、抗水霉病等方面具有独特的生理功能。 此外，董元凯等j 、陈德英【i “、胡宝林i l “等对黄鳝的人工繁殖进行了研究，为我国开展黄鳝的 繁殖工作提供了理论依据。黄鳝人工繁殖现在存在的问题主要是由于黄鳝的个体较小，怀卵量少， 嚣南太学硕士学位论文第l 章文献综述 性成熟不一致，繁殖季节长，且体表滑不易操作进行人工催产和人工授精十分麻烦，很难一次性 的获得大批量的苗种而采用自然受精的方法，要求黄鳝的放养密度要合理，每平方米放养量若超 过0 2 5 k g ，会抑制黄鳝的繁殖，这就要求黄鳝的繁殖产卵池的面积要大，这也造成一次性获得大批 量的黄鳝苗种比较困难。因此黄鳝的人工繁殖技术还没有完全的攻克，有待进一步进行深入的研究。 1 1 2 黄鳝性逆转现象的研究 黄鳝是前半生为雌性后半生为雄性，其中间转变阶段叫雌雄间体这种由雌到雄的转变叫做性 逆转现象。自1 9 4 2 年，伍献文、刘健康发现黄鳝有性逆转现象以来，许多学者对黄鳝的性逆转又 进行了大量而深刻的报道。如性逆转产生的机理、性逆转过程中黄鳝的性腺变化、性逆转与体长体 重的关系、性逆转过程中某些蛋白的变化规律、以及外源激素和环境条件对黄鳝性逆转的影响。 刘修业等【1 ”研究黄鳝性逆转时生殖腺的组织学与超微结构的变化，发现黄鳝由雌性转化为雄性 是卵巢的逐渐退化、精巢的渐进形成过程。大、小卵母细胞退化后所腾出的空间，由新生的精细胞 与曲细精管填充。最后生殖腺腔全部为盘曲的曲细精管及发育不同阶段的精细胞所填满，这时卵巢 也就被精巢取代。肖亚梅等i l 也研究发现黄鳝雄性性成熟产卵后。卵细胞败育，卵巢逐渐退化。同 时，分布于生殖褶上的原始精原细胞开始生长发育，形成精小囊。并将黄鳍生殖腺发育程序描述为： 雌性发育阶段问性发育阶段一雄性发育阶段，并且生殖腺的这一发育过程是单方向进行的， 即发生性变化后，不可能再由雄性个体逆返为雌性个体。 有关黄鳝性逆转的体长起点。不同作者研究所得出的结论相差较大。如刘建康等0 9 4 4 ) 报道8 5 尾2 0 c m 以下的个体中没有一尾雄性。l i e m ”l 发观1 9 3 尾黄鳝体长1 6 e m 以下黄鳝全部为雌性只 有1 6 e m 以上的个体中才有雄性。王良臣1 1 7 1 发现4 0 尾4 0 e m 以下的个体中没有雄性个体。这些研究 结果所存在的差异，可能与不同的研究者所研究的黄鳍处于不同的地区有关。刘建康等人所研究的 黄鳝取自于我国四川省，属于南方的黄鳝群体，l i e m 研究的为产于印度尼西亚个体，属于东南亚 的黄鳝群体，而王良臣研究的为产于我国北方地区的个体。由于处于南方和东南亚等热带地区的黄 鳝性腺成熟早，故其性逆转的时间也提前，则其性逆转的体长起点小一些，丽北方寒冷地区的黄鳝 性成熟迟故性逆转的时间也推迟，则其性逆转的体长起点会长一些。 在黄鳍性逆转过程中，其性腺蛋白、血清蛋白会发生明显的变化，而且外源激素和环境条件对 黄鳝的性逆转有一定的影响，可以推迟或加快黄鲳的性转变。宋平等【l ”采用聚丙烯酰胺梯度胶电泳 方法对2 6 2 尾黄鳝的性腺蛋白进行了分析，结果表明雌性黄鳝随着性腺的成熟性腺蛋白组分有 所增多，相反雄性黄鳝随着性腺的成熟其性腺蛋白组分有所减少；兼性期性腺蛋白组分明显增加， 这表明了性逆转时精巢的组建可能与蛋白的调节有关。邹记兴1 1 采用类似的方法对2 7 尾黄鳝的血 清蛋白进行了分析，结果表明，血清蛋白区带雌鳝卵巢i i 期为8 l l 条，雄鳝糟巢l - - i v 期为 l l 1 4 条，雌雄间体鳍为1 7 - - 2 0 条经双波长色谱扫描发现雌雄间体鳝有较多的吸收峰。雄缱比 雌鳍多的血清蛋白是大分子的糖脂蛋白推断出黄鳝性逆转可能与这种蛋白的增加有关。 赵云芳等用甲基睾丸酮、乙烯雌酚诱导黄鳝性转化。结果表明，甲基睾丸酮1 2 5 m g 处理胚 后期的黄鳝，一年后有的幼鳝的卵巢已完全转变为精巢，精子多而且活动激烈2 5 m g 处理胚后期， 饲养4 个月有幼鳝转变为雄鳝，大大缩短了雄鳝的性成熟年龄。乙烯雌酚可使产卵后的雌鳝推迟性 逆转期，使未产卵的雌鳝生长加快、体重增加，增加怀卵量、多产鳝苗。张小雪等口l l 用不同剂量外 源雄性激素一甲基睾丸酮对不同大小的幼鳝进行处理。结果发现注射激素组的幼鳝，其性腺组织结 2 西南大学硕士学位论文 第1 章文献综述 构发生显著变化，即性腺由大量结缔组织样结构组成，推测是幼鳝性腺向精巢变化发育之先兆。这 都证明了黄鳝和其它鱼类一样注入外源雄激素后可诱导其性转化。 滕道明口2 l 报道了水温、水深、酸碱度，声音、光照、性别比例以及饲养管理等环境因子对黄鳝 性逆转的影响。石琼等日w 研究了饥饿对黄鳝性腺发育的影响，结果表明，6 周饥饿促进黄鳝性转变 并推论出饥饿促进黄鳝性转变可能是通过提高血清褪黑激素水平来实现的。井报道了外源褪黑激素 对黄鳝性腺发育及性腺激素分泌的影响，结果表明。处于不同性腺发育时期的黄鳝对外源褪黑激素 的反应存在季节性差异。徐晋麟等 2 4 1 对黄鳝性逆转过程中同工酶的分析研究，表明l d h 。e s t 在两 性中有差异表达。 i i 3 黄鳝年龄与生长的研究 有关黄鳝的年龄与生长的研究比较多。据研究表明，黄鳝年龄可以用耳石、脊椎骨、舌骨、上 耳骨等进行鉴定。尤其是黄鳝的舌较发达，在其舌骨上有明显的生长带和年轮标志。是鉴定黄鳝年 龄的最好的材料。陈慧脚j 用黄鳝的耳石、脊椎骨和舌骨三种材料相对照，对其年龄进行了鉴定，认 为舌骨是黄鳍年龄鉴定比较理想的材料，低龄黄鳝的不需要加工处理可直接放在解剖镜下观察到 耳石上清晰的年轮。高龄黄鳝的只需稍微加工也可清楚地见到年轮：并首次提出尾舌骨也可以作为 年龄鉴定的材料。杨明生| 2 6 - 2 8 在研究黄鳝的年龄与种群的年龄结构时，首次提出用基舌骨和上舌骨 作为年龄鉴定的材料，并发现舌骨是鉴定黄鳝年龄的较好材料。 黄鳝的生长速度在野生条件下较慢，要达到体重5 0 9 以上，一般需要3 年以上，但不同的地区 其生长存在差异以南方地区生长速度快，华中地区生长速度适中，而以北方地区的生长速度最慢。 这种差异造成的原因可能是由于不同地区的温度不同，黄鲳的每年的生长时间以及体内的物质合成 和代谢的速度等不同所至。杨代勤等口町对人工繁殖取得的黄鳝苗种进行了人工养殖条件下的生长研 究，发现人工饲养条件下，黄鳝的生长速度要比野生条件下的要快。当年6 月孵化出的黄鳝苗经 过5 个月的养殖，至越冬时体长可达到1 6 0 c m ，体重达到1 3 0 9 ，经过第二年的养殖到年底其体 长可达3 0 0 c m ，体重8 0 0 9 ，较野生黄鳝的生长速度要快2 3 倍。比野生黄鳝生长速度快的原因可 能是人工养殖条件下黄鳝食物充足，投喂均匀，而野生的黄鳝食物不足，摄食不均所至。 王良臣等i l 和杨代勤等口i 还对黄鳢的生长规律进行了研究，表明黄鳝的体长和体重生长呈幂函 数关系。王良臣研究得出黄鳍雌性个体的体长和体重的关系为：w = o 0 0 0 0 0 1 2 7 9 1 3 2 8 5 ，雄性个体为： w = 0 0 0 0 0 0 0 2 9 7 1 l 5 2 。杨代勤得出其体长与体重关系为w = i 9 1 1 0 x 1 0 - 6 x ( l ) m m l ”，这表明黄鲳 的体长和体重关系接近呈立方关系。 i i 4 黄鳕消化酶的研究 关于黄鳝消化酶的研究，国内重点集中在对黄鳝韵消化道及消化腺体的消化酶种类、消化酶活 性分布、环境因子及饵料对消化酶活性的影响方面。戴贤军等1 3 0 1 研究了黄鳝不同生长阶段消化器官 及其消化酶的变化，结果显示，成鳝与幼鳝、稚鳝不同器官消化酶的活力出现明显差异，并且高于 幼鳟、稚鳝的消化酶活力，说明黄鳝对蛋白质、脂肪和淀粉的消化能力随体重的增加而提高。伍莉 等 3n , 3 2 1 研究了p h 值和温度对黄鳝肠邀和肝胰脏主要消化酶活力的影响。结果表明，肠道和肝胰脏 中消化酶活力的最适p h 值均在中性略偏碱性范围，比较得出黄鳝肠道内蛋白酶活力显著高于淀粉 酶活力，而淀粉酶活力又显著高于脂肪酶活力。黄鳝消化酶的最适温度在4 0 0 c 左右，并根据不同 3 西南大学硕士学位论文 第l 章文献综述 器官同种消化酶活力的比较得出黄鳍对蛋白质和淀粉的消化主要在前肠而对脂肪的消化则主要 集中在后肠。李瑾等p m 主要对幼鳝在摄食不同蛋白含量的人工饵料情况下其消化器官胃、前肠、后 肠、肝胰脏的淀粉酶活性作了初步研究，结果显示，摄食不同饵料后幼鳝各消化器官淀粉酶活性随 着饵料中淀粉含量的增加而呈显著的增长趋势，而饵料中蛋白质和脂肪含量与淀粉酶活性之间呈现 显著的负相关关系，即随着饵料中蛋白质和脂肪含量的升高，幼鳝各消化器官淀粉酶活性呈显著下 降的趋势。杨代勤等l 并j 进行了黄鳝喜食的天然动物性饵料蚯蚓、鲢肉和配合饲料对黄鳝消化酶活性 影响的比较研究，结果表明，黄鳝摄取不同的饲料其组织中蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的 活性变化幅度不一样。摄取蚯蚓时蛋白酶的增加幅度最大，摄取鲢肉时胰蛋白酶和脂肪酶的活性增 加最大，而摄取配合饲料时则淀粉酶的活性增加最大，这可能与不同饲料的营养组成、性质有关， 食物中的不同营养物质会刺激黄鳝消化器官分泌相应的消化酶，蚍便更好地消化所摄取的食物。 1 1 5 黄缱食性的研究 黄鳝在自然生态条件下，摄食多种动物性饵料，也食植物性饵料，故黄鳍应为杂食性鱼类，且 是以动物性饵料为主的杂食性鱼类。黄鳍营穴居生活。视觉退化眼很小且蒙有皮膜，又多在夜间 活动，因此自然条件下其摄食主要靠前后鼻孔内发达的嗅觉小褶和触角来感受水流传过来的饵料生 物发出的特殊气味和振动，遇食物较大时，黄鳝会咬住食物旋转身子将食物咬断而吞下。在黄鳝繁 殖季节，有不少成鳝个体摄食鳢卵和稚幼鳢，在食物缺乏和环境条件恶化情况下，这个比例还会增 加，表明黄鳝种内有自相残食的习性。 杨代勤等”1 通过对不同产地的2 7 1 尾野生黄鳍的食性研究表明，全长小于l o o m m 的稚鱼，其 食性随着全长的生长而变化稚鱼前期以摄食轮虫，枝角类为主，后期则以木生寡毛类、摇蚊幼虫 为主。而全长1 0 1 m m - 2 0 0 m m 的幼鳝及全长大于2 0 0 r a m 的成鳝的食性，随全长变化相对稳定。且 幼鳝和成鳝的食谱基本相同，其主要食物组成均包括摇蚊幼虫木生寡毛类、蚯蚓、昆虫幼虫、枝 角共和桡足类等。黄鳝无论稚鱼期，还是幼鱼期、成鱼期，其肠内含物中均有一定比例的浮游植物、 着生藻类及腐屑说明黄鳝除摄取动物性饵料外，还部分摄取植物性饵料，表明人工饲养黄鳝，用 配合饲料投喂是可行的。 黄鳝的摄食特性有季节性交化即其肠内含物中的饵料生物种类，含量均存在季节变化。杨代 勤等p ”观察发现，每年4 1 0 月份，黄鳝均持续摄食，成鳍在繁殖季节也不例外，且肠管充塞度大 多在4 5 级， 可见其摄食强度是相当高的。按季节划分，春末( 4 月下旬) 、整个夏季5 7 月) 及初秋 ( 8 月) 摄食量最大，肠管充塞度达4 5 级的个体占7 8 ：秋季中后期( 9 i o y j ) 次之。肠管充塞度达4 s 级的个体占6 2 i 春季中末期( 4 月上中旬) 的个体肠管充塞度达4 5 级的占3 7 。而在冬季和早 春( 1 1 月至翌年3 月上、中旬) ，在水温低于1 2 5 1 2 左右时，黄鲻基本停止摄食，肠管内极少有充塞物。 1 1 。6 黄鳞人工彝殖的研究 我国人工养殖黄鳝的历史较短，对黄鳝较全面的研究近两年才开始，现已逐渐将传统的零星单 池小生产经营改变为连片集约化规模养殖形式。8 0 年代初，关于黄鳝的基础理论方面的许多问题和 诸多关键性措施还未能得到解决，黄鳝的养殖方法在当时均以水泥池静水养殖为主。使得黄鳝的养 殖环境易恶化，黄鳝容易受伤、病害多。直到9 0 年代初开始，以江浙、湖南、湖北、四川等地才 探索了水泥池流水养鳝、蚓合养鳝鳖鲑生态循环养殖、稻田养鳝、稻田网箱养殖、湖泊水库网箱 4 西南大学砸士学位论文第1 章文献综述 养鳝。这种养殖方式解决了黄鳝养殖过程中水质易变坏等问题，从而提高了成活率。 国内进行黄鳝人工养殖技术的研究工作开展的比较多。彭秀真等1 3 6 1 采用微型网箱进行了黄鳝养 殖技术研究 凌志勇 y q 樊祥国等1 3 s l 进行了稻田养殖黄鳝技术探索；李廉等1 3 9 1 、彭秀真等【4 0 1 等对黄 鳝进行池塘及无土流水饲养技术研究：凌天慧等【4 i l 对黄鳝常见m j m 病的病理学进行了研究。这些研 究工作为我国开展黄鳝的人工养殖奠定了基础。而关于黄鳝养殖饲料的研究，国内才刚刚起步。杨 代勤等p ”用人工配合饲料饲养黄鳝发现黄鳝除摄取动物性饲料外，还部分摄取植物性饲料，表明 了用配合饲料饲养黄鳍是可行的，还报道了黄鳝的食性及幼鳝的营养需要及最适能量蛋白比。 目前，黄鳝的人工养殖中存在以下一些问题。规模盲目贪大、购进苗种把关不严、驯食工作不 彻底、饲料投喂不科学、水质调节不重视以及病害防治不及时等等。在今后应加大投入科研力度， 进行苗种批量化生产，实现黄鳝的规模集约化养殖和绿色化生产养殖，保证黄鳝养殖业能健康、快 速、稳定的发展。 1 2 胰蛋白酶的研究概况 1 2 1 胰蛋白酶分离纯化的研究 在哺乳动物中许多动物都已经分离出了胰蛋白酶以及胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶，例如有鼠、 狗、牛、猪及人类。有关鱼类消化酶的研究也有大量的报道，关于鱼类胰蛋白酶的研究，国外要比 国内开展得早而且多。迄今为止，已研究报道了鲤鱼1 4 “、柳叶鱼h ”、鲶鱼i “1 、格陵兰鳕h ”、凤尾 鱼h “、大西洋鳕1 4 ”、虹鳟”、鲻鱼h ”、大西洋鲑唧1 、马苏大麻哈鱼i ”l 、笛鲷f 5 2 l 等胰蛋白酶的纯化。