（微生物学专业论文）聚γ谷氨酸在枯草芽胞杆菌和大肠杆菌中的生物合成.pdf

摘要 b a c i l l u ss u b t i l i sc h u n g k o o k j a n g 是一株从韩国的传统食品中分离到的聚t 谷氨酸 ( p o l y - - r g l u t a m i ca c i d ，了一p g a ) 高产菌。该菌株具有产量高、分子量大、不含质粒 等特点。本课题以该菌株为出发菌株，利用从该菌株中克隆到的聚y 谷氨酸合成酶 基因构建大肠杆菌表达系统，通过高密度发酵，基因芯片分析和代谢通量分析等方 法显著提高了大肠杆菌基因工程菌合成聚y 谷氨酸的能力。 通过摇瓶发酵实验发现：且s u b t i l i sc h u n g k o o k j a n g 的最优液体发酵的配方为 3 2 9 l 葡萄糖；4 8 9 l 甘油；1 4 9 l n h 4 c i ；2 0 9 a _ 。谷氨酸：1 氯化钠；2 0 m l 的装液 量，5 接种量，初始p h 为7 2 ；培养温度3 7 。在此条件下，丫- p g a 的产量可达 8 2 9 l 。 p c r 扩增出该菌株的三个聚了谷氨酸合成酶基因( p g s l ，2 ，3 ) ，分别构建了t r c 诱导型表达质粒p m p g s l 2 3 和两个组成型表达质粒p c o p g s 和p g n t p g s 。将三个表达 质粒分别转入大肠杆菌受体菌x l l b l u e ，b l 2 1 ( d e 3 ) 、w 3 1 1 0 、f m j l 2 3 来检验不同 表达系统合成聚y 谷氨酸的能力。结果表明，b l 2 1 ( d e 3 ) 一p c o p g s 优于其它表达系 统，摇瓶发酵的产量为0 5 t g l 。 b l 2 1 ( d e 3 ) 一p c o p g s 的5 l 发酵罐高密度发酵实验表明，p h 恒化补料优于对数 补料，在r 2 + 0 8 5 9 l 谷氨酸培养基中，产量可达1 2 7 9 l 。 为迸一步提高产率，利用d n a - m i c r o a r r a y 技术分析了大肠杆菌的2 8 5 0 个基因 在合成聚t 谷氨酸时转录水平发生的变化：其中1 9 6 个基因的表达增强，2 1 7 个基 因的表达减弱。谷氨酸代谢相关基因的转录差异表明，大肠杆菌在合成聚y 谷氨酸 时，细胞处于氮源缺乏状态。在6 0 0 9 l 葡萄糖的补料培养基中添加4 0 9 l ( n h 4 ) 2 s 0 4 ， b l 2 1 ( d e 3 ) 一p c o p g s 在p h 恒化补料发酵中产量达到3 7 6 9 l 。代谢通量分析发现： d 酮戊二酸流向琥珀酰辅酶a 的碳通量大于流向谷氨酸的碳通量，这是造成大肠杆 菌合成聚1 r 谷氨酸能力弱的主要原因。 关键词：聚t 谷氨酸；枯草芽胞杆菌；大肠杆菌基因工程菌；高密度发酵；基 因芯片分析；代谢通量分析；菌种筛选 a b s t r a c t b a c i l l u ss u b t i l i s c h u n g k o o k j a n gi s ap o l y - 7 一g h t a m i ca c i d ( 7 - p g a ) p r o d u c e r s c r e e n e df r o mt r a d i t i o n a lk o r e a nf o o d ，w h i c hc a np r o d u c eh i g hm o l e c u l a rw e i g h t 丫一p g a a n dh a sn oa n yp l a s m i d i nt h ep r e s e n ts t u d y ，37 - p g ab i o s y n t h e s i sg e n e sw e r ec l o n e d a n de m p l o y e dt oc o n s t r u c te x p r e s s i o ns y s t e mi ne s c h e r i 幽ac o l i h i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e d n a - m i c r o a r r a y , m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i sw e r ep e r f o r m e dt 0o p t i m i z et h ey - p g a p r o d u c t i o ny i e l do ft h eg e n e t i ce n g i n e e r i n g e c o l is t r a i n s t h eh i g h e s t7 - p g ay i e l do fb a c i l l u ss u b t i l i sc h u n g k o o k j a n gw a sa c h i e v e di nt h e c o n d i t i o n st h a td e s c r i b e 勰f o l l o w i n g ：3 2 9 r lg l u c o s e ，4 8 9 i ng l y c e r o l ， 1 4 9 ln h 4 c i ； 2 0 9 ll - g l u t a m i ca c i d ；1 n a c i ，i n i t i a lp h7 2 ，t e m p e r a t u r e3 7 。c ，v o l u m el e v e l2 0m l ( 2 5 0m lf l a s k ) ，i n o c u l u ml e v e l5 t h ey i e l dw a s8 2 9 li nf l a s kc u l t u r e t h et r ci n d u c i b l ee x p r e s s i o nv e c t o rp m p g s l 2 3a n dt h et w oc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o n v e c t o r sp c o p g sa n dp g n t p g sw e r ec o n s t r u c t e dw i t ht h et h r e e7 - p g ab i o s y n t h e s i sg e n e s ( p g s l ，2 ，3 ) f r o mb a c i l l u ss u b t i l i sc h u n g k o o k j a n g t h e s et h r e ee x p r e s s i o np l a s m i dw e r e t r a n s f o r m e di n t oe c o l ih o s tc e l l sx l l - b l u e 、b l 2 1 ( d e 3 ) 、w 3 1 1 0 、f m j l 2 3 ，b l 2 1 ( d e 3 ) - v c o p g ss y s t e ma c h i e v e dt h eh i g h e s tp r o d u c t i o ny i e l do f0 5 1 9 li nf l a s kc u l t u r e 2 ，8 5 0o p e nr e a d i n gf r a m e s ( o r f s ) o fe c o l ii n c l u d i n ga l lf u n c t i o n a lk n o w ng e n e s w e r ea n a l y z e db yd n a - m i c r o a r r a y a m o n gt h e2 ，8 5 0s p o t t e dg e n e s ，1 9 6g e n e sw e r e f o u n dt ob eu p - r e g u l a t e db ya b o v et w 0 4 0 l dw h i l e2 1 7g e n e sw e r ed o w n - r e g u l a t e d t h e c o m p a r i s o nt r a n s c r i p tl e v e lo f1 8g e n e sr e l a t i v et ot h eg l u t a m i ca c i dm e t a b o l i cp a t h w a y s h o w e dt h a tt h ec e u sw e r eu n d e rt h en i t r o g e ns t a r v a t i o ns t a t ed u r i n gt h ep r o d u c t i o no f 7 - p g a 3 7 6 9 l7 - p g aw a sa c h i e v e d w h e n4 0 9 l ( n h 4 ) 2 s 0 4w a sa d d e di n t ot h e 6 0 0 9 lg l u c o s ef e e d i n gs o l u t i o no f t h ep h s t a tf e d - b a t c hc u l t u r eo fb l 2 1 ( d e 3 ) p c o p g s t h ef l u xd i s t r i b u t i o no fa k gt os u c c o aw a sl a r g e rt h a nt h ed i s t r i b u t i o nt o l - g l u t a m i ca c i d ，w h i c hm i g h tb et h ep r i m a r yl i m i t i n gf a c t o rf o ro p t i m i z a t i o no f p o l y - t - g l u t a m i ca c i dp r o d u c t i o ni nt h eg e n e t i ce n g i n e e r i n ge c o l i k e yw o r d s ：p o l y - 7 一g l u t a m i ca c i d ；b a c i l l u ss u b t i l i s ；g e n e t i ce n g i n e e r i n ge s c h e r i c h a c o h ；d n a - m i c r o a r r a ya n a l y s i s ；m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ；s c r e e n i n g n 缩略语表 a c 乙酸 a c c o a乙酰辅酶a a k g a 酮戊二酸 c 1一碳化合物 c i t柠檬酸 e 4 p 4 磷酸赤藓糖 s u c c o a琥珀酰辅酶a f 6 p6 磷酸果糖 f a d h z还原型黄素单核苷酸 f u m延胡索酸 g 6 p6 磷酸葡萄糖 g l c葡萄糖 g 1 u谷氨酸 l a c 乳糖 n a d h还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 n a d p h还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 0 a草酰乙酸 o d光密度值 p e p磷酸烯醇式丙酮酸 p g 33 磷酸甘油酸 丫- p g a聚十谷氨酸 p y f 丙酮酸 r i b 5 p 5 磷酸核糖 s 7 p 7 磷酸景天庚酮糖 t 3 p 3 一磷酸甘油醛 x y l s v 5 。磷酸木酮糖 1 1 1 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：弘乙昊时间：跏7 年f月厂日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农, i v 大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供i i i 录检索和阅览服务，可以采) 1 1 影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可n a ) l l 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位敝作者始口量导师张纠 签名i ! t 期：枷7 年j 月y 日 签名日期： 0 1 年1 月，日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 第一章文献综述 刖舌 1 1 意义重大的生物材料 资源短缺、环境恶化是全人类必须面对的两个难题。资源和环境这两个非经济 性因素，关系到一个国家生存与发展的基础。寻找新能源、新材料是解决这两大难 题的必由之路。 生物材料来自于自然晃，也容易被自然界降解，它的生产和使用过程既节省能 源，又不污染环境，在近几十年中成为生物工程领域的研究热点。有些材料已经实 现工业化生产，有些还因为技术和成本的原因没有得到广泛的生产和应用。但是生 物材料注定会对人类未来的生活产生巨大的影响。 近年来被广泛应用和深入研究的生物高分子材料主要有以下几种： 表1 近年来被广泛应用和深入研究的生物材料 t a b l e1 b i o m a t e r i a l sw i t hw i d ea p p l i c a t i o na n d s t u d y i nr e c e n ty e a r s 聚酯 聚羟基脂肪酸 聚乳酸 蛋白 蛛丝 胶原蛋白明胶 弹性蛋白 节肢弹性蛋白 聚氨基酸 面筋粉 多糖 黄原胶 结冷胶 菌果聚糖 b 一葡聚糖 纤维素 真菌多糖 短梗霉多糖 植物多糖 淀粉 琼脂 果胶 葡甘聚糖 动物多糖 几丁质 透明质酸 鼠李糖脂 角蛋白 其他 紫腔树脂 聚y 谷氨酸 天然橡胶 生物材料可以通过不同的途径获得：生物合成或化学合成。随着基因工程、发 酵工程技术的迅速发展，利用微生物合成生物材料成为一种主要手段。美、日、欧 洲在这个领域投资最多，发展最快。两类生物材料是这些国家重点投资研究的对象： 一是能够在商业上代替塑料的可降解材料；二是可用于医药的生物材料。 聚羟基脂肪酸( p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e s ，简称p h a ) 是由微生物细胞，特别是细菌 细胞合成的一种高分子聚酯，熔点在5 0 1 5 0 c 。p h a 具有生物可降解性、生物相容 性、压电性和光学活性等。p h a 是细菌细胞在环境适宜的条件下合成的能量储备物 质，以便在环境恶劣的情况下分解，为细胞提供能量。其中的代表物质是聚羟基丁 酸( p i - i b ) ，这种物质是巴斯德研究所在1 9 2 7 年最先发现的，5 0 年代，w r g r a c e 最先实现了p h b 的商业化。目前已经发现有超过3 0 0 种不同的微生物可以合成p h a ， 有至少1 2 5 种不同的单体结构。根据单体结构或含量的不同，p h a 的性能可从坚硬 到柔软到弹性变化。 p h a 的应用：1 在组织工程方面，与其他的聚合物相比，由于p h a 家族中单 聚物、共聚物及共混物种类众多，因而适应更广范围的需要。p h a 能够满足多种人 体组织器官的需求，如：心血管系统、角膜胰腺、胃肠系统、肾脏、泌尿生殖系统、 肌肉骨骼各系统、神经系统、牙齿与口腔、皮肤等等。2 p h a 可用于农业上包裹 肥料或农药的载体，使被包裹的物质在p h a 的降解过程中缓慢释放出来，从而保持 长期的肥效或药效，同时减少用药量，延长作用时间，保护耕地的长期可种植性。 黄原胶是一种细菌产生的复杂的聚合物，它的单体是糖类的物质。人们最先利 用野油菜黄单胞菌进行基因工程的改造来合成黄原胶。利用基因工程菌进行发酵， 含量可以到干重的5 0 。由于黄原胶具有不同寻常的物理和机械特性，因而被广泛 应用于造纸、食品、医药、和化妆品领域。目前全世界的年产量为1 0 0 0 0 至2 0 0 0 0 t 。 a d m 和m e r k 公司都曾经公布过黄原胶的生产工艺。全世界6 0 的黄原胶用于食品 行业，其余的用于工业用途。食品级的黄原胶的价格大约为8 1 0 美元磅。 常用的聚乳酸产品有聚内消旋乳酸( p o l y d ，l - l a c t i d e ，p d u 瑚和聚左旋乳酸 ( p o l y l - l a c t i d e ，p u 枷两种，p d l l a 是无定形高分子，p u a 是结晶性高分子；在 降解方面p l l a 比p d u a 慢，在生物相容性方面p l l a 比p d l l a 差。聚乳酸作为 可完全生物降解性塑料，越来越受到人们重视。美国的c a r g i l l 公司已将p l a 制成 纤维用于农用药膜等许多领域。 聚三亚甲基对苯二酸酯( p o l y t r i m e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ，唧是由对苯二甲酸和 1 ，3 - 丙二醇经缩聚反应而合成的芳香类聚酯，是一种热塑性塑料，在人工纤维领域 有着广泛的应用，比如在地毯制造行业，p 1 盯纤维比尼龙地毯具有更加柔软，不易 退色，有更好的拉伸性能，抗污能力强，易于清洗并很快干燥等突出的优点。d u p o n t 公司正与g e n e n c o r e 公司合作开发用微生物发酵的方法以玉米葡萄糖为原料通过生 物合成生产p 1 广r 。目前p t t 的商业化正处在市场开发阶段，s h e l l 公司正在计划中的 2 北美工厂将达到9 5 万t 的年产量。预计到2 0 1 0 年p 1 r 的市场需求将达到1 0 0 万 t ，s h e l l 公司和d u p o n t 公司都计划在未来几年内实现p t t 的大规模生产。 1 2 聚1 ，谷氨酸的研究现状 1 2 1 聚丫谷氨酸的物理和化学特性 聚丫谷氨酸是微生物分泌到细胞外的高分子化合物，具有良好的水溶性，吸水 性和生物可降解性，具有广泛的应用领域。这些优良的特性与它特殊的分子结构密 不可分。聚1 ，谷氨酸由d 型和l 型谷氨酸通过丫羧基连接而成，平均分子量从加，0 0 0 到1 0 ，0 0 0 ，0 0 0 d a ( m a t s u k a w ae ta 1 1 9 9 7 ；g r o s se ta 1 1 9 9 5 ；i t oe ta 1 1 9 9 6 ；c r o m w i c k a n dg r o s s1 9 9 5 a , b ，b i e re ta 1 1 9 9 4 ) 。分子问存在大量氢键，使之具有良好的水溶性。 c o o h 。 图1 聚丫谷氨酸的分子结构式 f i g 1s t r u c t u r eo fp o l y q - g l u t a m i ca d d 聚1 ，谷氨酸在不同的p h 条件下具有不同的物化特性：在中性或碱性条件下，聚 丫谷氨酸的侧链带负电荷，星伸展状：在酸性条件下带正电，构象呈紧密的球状 ( c r e s c e n z i ee ta 1 1 9 9 6 ) 。在c a “存在的条件下，聚y 谷氨酸在中性环境中也可呈紧密 的球状构象。聚丫谷氨酸在不同的p h 条件下也具有不同的缓冲能力，在p h 4 6 间具 有最好的缓冲能力。 聚t 谷氨酸中大量的游离羧基使之能够与不同的阳离子( h + ，n h 4 + ，n a + ，m 9 2 + ， c a 2 + ，c u “等) 结合( k u b o t a ，e t a l 1 9 9 3 ，1 9 9 5 ) ，对金属离子具有良好的吸附性。同时 羧基也是酯化反应的活性位点( b o r b e r ye ta 1 1 9 9 4 ) ，利用乙二醇缩水甘油醚和聚乙二 醇缩水甘油醚等交联剂在适当的条件下可以将聚t 谷氨酸交联成网状结构( 张新民 等，2 0 0 3 ) 。聚丫谷氨酸的交联也可以通过射线辐照的方法制备( k u n i o k a 甜a 1 2 0 0 3 ) 。 1 2 2 聚y 谷氨酸的应用 聚丫谷氨酸及其衍生物是一种环保型生物高分子，不但具有良好的水溶性，而 且能彻底被生物降解，对人无毒害，因而在农业、食品、医药、化妆品，纤维轻化 工等领域具有广阔的应用前景。 在农业领域的应用：我国是世界上荒漠化危害最严重的国家之一。荒漠化遍及 全国1 3 个省市自治区，荒漠化土地面积达2 6 2 2 万k m 2 ，占国土面积的2 7 3 ，是 3 全国耕地面积的两倍多。因此，研制高吸水性，可生物降解的保水剂，在我国具有 巨大的实际意义。聚t 谷氨酸经过交联可以吸收3 0 0 0 倍的水分，具有超强的吸水能 力。可以预见，聚丫谷氨酸在沙漠化改造中具有极大的应用价值。目前已经有研究 单位在干旱地区进行利用聚1 ，谷氨酸改造沙漠的尝试。 聚 r 谷氨酸还可以制成水胶垫，在鲜花包装、运输过程中用来给鲜花提供水分； 做为果实光亮剂，聚t 谷氨酸能够在新鲜水果表面形成可食性保护膜，调节水果呼 吸、减少水果水分损耗，防腐保鲜。 聚y 谷氨酸不易被自然界中的蛋白酶降解，相对降解速率较低，因此，聚y 谷 氨酸是一种优良的缓释剂，可以节省肥料和农药的施用量和次数。聚t 谷氨酸的大 量游离a 一羧基对二价金属离子、氨基酸等物质具有螯合富集作用，并有效供给动植 物利用。施用经聚t 谷氨酸富集的c a “、m 9 2 + 等二价阳离子，植物可以更有效利用。 饲料中添加0 1 3 0 的聚1 r 谷氨酸，可以降低家禽和家畜的脂肪积累。 在食品工业上的应用：纳豆( n a t t o ) 是一种传统的日本食品，由枯草芽胞杆菌发 酵大豆制成。聚y 谷氨酸就是纳豆中粘性物质的主要成分。k o n n o 等( 1 9 8 9 ) 发现： 聚y 谷氨酸具有增加面包弹性，使面包、蛋糕的颗粒更加细致增强面条韧性的功效。 m i t s u i k z i 等在1 9 9 8 年发现：分子量低于2 0 0 k d 的聚t 谷氨酸具有比葡萄糖更 好的抗冻性，可被广泛应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷冻 保藏。聚丫谷氨酸还有助于人体对矿质元素的吸收：与酪蛋白磷酸肽( c p p ) 相比， 因其具有优良的水溶性，效果更佳；而且聚y 谷氨酸可以掩盖高浓度矿质元素所带 来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题，尤其适用于补钙和补铁的保健品。 在医药方面的应用：聚y 谷氨酸可做为包埋药物的聚合物，可被包埋的药物包 括：抗癌药物。中枢神经药物，循环系统的药物等，这些药物被吸附在疏水性物质上 进行传输。以聚y 谷氨酸骨架为桥梁，抗原呈递细胞和特定药物结合形成共轭体， 将输送至靶位点，可大幅度降低药物的使用量，这样不仅降低了药物的使用成本， 同时降低药物对人体的毒害。该方案主要用于治疗红斑狼疮、风湿性关节炎和i 型 糖尿病等。由明胶和聚y 谷氨酸组成的水凝胶与水溶性的碳化二亚氨交联后可做为 软组织的生物胶。 其他用途：由聚y 谷氨酸和氨基葡聚糖( a m i n a t e dg l u c o - p o l y s a c c h a f i d e s ) 组成的 基质能够包埋并保护细胞等一些对酸碱度，温度，离子强度敏感的物质。c h o i 和 k u n i o k a ( 1 9 9 5 ) 利用射线照射制备了一种聚1 ，谷氨酸水凝胶，这种水凝胶可以吸收 相当于其自重2 0 0 - 3 5 0 0 倍的水，而且这种水凝胶对酸碱度和温度敏感，可用于酶的 提纯或培养基、酶、细胞、组织等的固定。聚y 谷氨酸经过交联或酯化后，能用于 制备吸水剂，应用于卫生用品( 尿布、妇女卫生巾等) ，农业生产资料( 土壤保水 剂、秧苗薄膜等) ，食品材料( 食品保鲜剂、脱水剂) ，以及建筑材料等。聚y 谷 氨酸和表面活性剂的混合物还可被制成新型的洗涤剂。 4 1 2 3 利用微生物合成聚1 ，谷氨酸 自然界中能够合成聚y 谷氨酸的生物很多，最早对聚丫谷氨酸的系统研究是 t h r o n e 做出的( t h r o n ee ta 1 1 9 5 3 ，1 9 5 4 ，1 9 5 8 ，1 9 5 9 ) 。目前，聚y 谷氨酸的生物合成 主要通过芽胞杆菌属的地衣芽胞杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 和枯草芽胞杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 发酵来获得产物。 聚7 谷氨酸的微生物发酵是一个复杂的过程，受到很多因素的影响，不同的菌 种，甚至同二菌种的不同菌株的调控因素都不相同，表现出极大的差异。由于产物 复杂，实验操作和检测难度较大，导致不同研究者对同一菌株的研究结论也不同。 综合众多的研究资料，结合聚t 谷氨酸自身的组成和结构特征我们大体可以理出以 下思路：对于微生物发酵合成的聚1 ，谷氨酸来说，我们主要关注产量( 产率) ，分 子量，d l 谷氨酸单体的组成比例这三个主要指标。需要特别说明的是：我们对于 聚丫谷氨酸合成机理的理解都是基于地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌这两种主要生产 菌。对于地衣芽胞杆菌的研究主要集中在菌株a t c c 9 9 4 5 a ，这个菌种在适宜的条件 下可以高产，突出的缺点是菌种极其不稳定，很容易失活。有的研究者认为失活是 在固体平板上传代造成的，但是根据我们的实验经验和研究结果来看，并非只是在 固体平板上传代才造成失活，但具体原因还不清楚。相比于地衣芽胞杆菌，枯草芽 胞杆菌要稳定的多，不必象操作前者那样在每次接种培养前都需要划线分离。 1 2 3 1 影响产量的因素 通过对文献资料的总结可以看出：影响产量的因素集中在谷氨酸、碳源和氮源。 对聚t 谷氨酸产生菌的常用分类方法是根据对单体谷氨酸的需求来划分的：第 一类：在发酵过程中，不需要在培养基中加入谷氨酸，比如枯草芽胞杆菌5 e ，枯草 芽胞杆菌t a m 4 和地衣芽胞杆菌a 3 5 。虽然这些菌株在发酵过程中虽然不需要谷 氨酸，但也有其特殊的营养需求，如：b a c i l l u ss u b f i l 妇5 e 需要p r o l i n e ( m u r o ae t4 z 1 9 6 9 ，1 9 7 1 ，s a w ae ta 1 1 9 7 1 ) ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa 3 5 需要葡萄糖和氯化铵 ( c h e n ge ta 1 1 9 8 9 ) ；b a c i l l u ss u b t i l i st a m 4 需要铵盐和蔗糖( i t o e ta 1 1 9 6 9 ) 。第二 类：在发酵过程过需要在培养基中加入一定量的谷氨酸，b a c i l l u ss u b t i l i si f 0 3 3 3 5 ( g o t oa n dk u n i o k a1 9 9 2 ；k u n i o k a ，m 1 9 9 5 ) 和b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa t c c 9 9 4 5 a ( i e m n a r d ，c g 1 9 5 8 ；c r o m w i c ka n dg r o s s1 9 9 4 ，c r o m o w i c ke ta 1 1 9 9 5 ) 。这样的分类 只是划分了对谷氨酸的需求，但是没有体现出谷氨酸的作用：谷氨酸究竟是在聚，r 谷氨酸的合成过程中做为底物呢，还是起调控作用? 进一步的研究表明，对谷氨酸的需求极有可能存在着两种不同的方式。对地衣 芽胞杆菌s 1 7 3 的研究表明：指数生长期的前期加入，会完全抑制p g a 的合成。当 谷氨酸在指数生长期的后期加入也会抑制p g a 的合成，但是当谷氨酸在稳定期加入 时，它将减少p g a 的最后生成量。k u n i o k a 等对b s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 需要高浓度乙一 5 谷氨酸( 3 0 9 l ) ，柠檬酸( 2 0 9 l ) 和硫酸铵作为碳源来合成聚y 谷氨酸( g o t oa n d k u n i o k a , 1 9 9 2 ) ，产量达到2 0 9 l 。后来k u n i o k a 于1 9 9 5 年发现：低浓度的谷氨酰胺 可以代替l _ 谷氨酸。t h o m e 等( 1 9 5 4 ) 磊j 究表明，当培养基中缺失谷氨酸时，7 - p g a 产量下降不明显，但是当只有谷氨酸而无柠檬酸和甘油时，产量大大降低，并且在 9 6 h 的发酵过程中谷氨酸由1 8 9 l 减至1 0 9 l ，甘油由8 0 9 l 减至4 5 9 l ，柠檬酸 由1 2 9 l 减至1 9 l ，这表明他们所用的枯草芽胞杆菌主要利用甘油和柠檬酸而不是 谷氨酸来合成p g a 。c r o m w i c k 和g r o s s ( 1 9 9 5 ) 用同位素标记法证明在且l i c h e n 和r m i s a t c c 9 9 4 5 a 中，柠檬酸确实是7 - p g a 合成的前体。k o 等( 1 9 9 8 ) 发现：利用葡萄 糖作为主要碳源，在少量的柠檬酸和谷氨酸( o 5g l ) 的情况下置l i c h e n i f o r m i s a t c c 9 9 4 5 a 也得到了较高的产量。以上这些结论都支持这样一个论点：至少在最 l i c h e n i f o r m i sa t c c 9 9 4 5 a 和b s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 中，l 谷氨酸很可能都是作为诱导成 分，而不是t - p g a 的主要合成底物。 但又确实存在不需要谷氨酸就能大量合成7 - p g a 的菌株，如地衣芽胞杆菌a 3 5 、 枯草芽胞杆菌t a m 4 等；在枯草芽胞杆菌( n a t t o ) 中，通过1 4 c 示踪分析研究表明， 培养基中的l 谷氨酸确实被用来合成产物。 由此我们可以推测：在聚t 谷氨酸的主要产生菌中存在三种不同的合成系统： 以单体谷氨酸为重要的诱导物的合成系统、主要以外源单体谷氨酸为底物的合成系 统和依靠葡萄糖、柠檬酸等碳水化合物经t c a 循环产生的谷氨酸为底物的合成系 统。 碳源和氮源对产量的影响主要是微生物对不同碳水化合物的利用率，体现为生 物量的增加和对谷氨酸的转化率。k o 等于1 9 9 8 年发现：利用葡萄糖和甘油的混合 碳源，可以提高聚t 谷氨酸的产量( k oe t a l 1 9 9 8 ) 尽管葡萄糖是比甘油更有利 于细胞生长的碳源，同时菌体细胞对葡萄糖的利用也比甘油、柠檬酸、谷氨酸快。 但是葡萄糖浓度高也会使地农芽胞杆菌产生大量多糖类副产物。d o 等将葡萄糖的浓 度控制在1 - 5 9 l 在5 升发酵罐的发酵条件下，聚7 谷氨酸的产量达到5 9 9 几并且 没有副产物的生成( d o j e ta 1 2 0 0 1 ) 。i t o 等在1 9 9 6 年发现：葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗 糖比乳糖，半乳糖和甘油更适合b a c i l l u ss u b t i l i st a m 4 合成聚t 谷氨酸，在适合条 件下，该菌株最高可产生2 2 1 9 l 聚y 谷氨酸。b s u b t i l i sf - 2 - 0 1 在牛肉浸膏，谷氨 酸和葡萄糖的培养基中可产生4 8 9 l 的聚y 谷氨酸( k u b o t ae t 口1 9 9 3 ) 。b s u b t i l i s ( n a t t o ) 在含麦芽糖，豆油，和甘油的m s g 培养基中可产生3 5 9 i , 聚y 谷氨酸( o g a w a e fa 1 1 9 9 7 ) 。 1 2 3 2 分子量的影响因素 影响分子量的因素很多，有物理因素比如培养过程中过度搅拌造成的剪切力的 破坏，低p h 值对聚y 谷氨酸的降解；也有生理因素，在发酵后期自身产生的水解 6 酶对聚t 谷氨酸的降解作用。培养基的离子强度也会对t - p g a 的分子量产生影响。 e 培养基中n a c l 的浓度从0 提高到4 使地衣芽胞杆菌9 9 4 5 a 产生的7 - p g a 的分 子量从1 2 0 0 k d 增加到2 2 0 0 k d ( g r o s se t a l ，1 9 9 5 ；b i r r e r e t a l ，1 9 9 4 ) 。 1 2 - 3 3d l 谷氢酸比例的影响因素 影响d l 谷氨酸比例的因素主要有两个：产生菌和m n 2 + 浓度。 枯草芽胞杆菌n a r o 所产生的y p g a i ：b 例为d 型占5 0 8 0 ，l 型占 2 0 一5 0 ( a s h i u c h ie za 1 1 9 9 8 ) ；t a n a k a ，t e ta 1 1 9 9 7 ；i t oe ta 1 1 9 9 6 ；k u b o t ae ta 1 1 9 9 3 ；k u n i o k a e t a l 1 9 9 7 ) 。地衣芽胞杆菌所产生的t - p g a 的d l 比例不同，在 1 0 一1 0 0 之间( t r o y1 9 7 3 a , b ；p e a r e z - c a m e l o ，e ta 1 1 9 9 9 ) 。b a c i l l u sm e g a t e r i u m 合 成的t p g a 的d 儿比例为5 0 ( t o d i1 9 5 6 ) b a d l l u sa l k a l o p h i l i c 可以合成聚l 谷氨酸 ( a o n o1 9 8 7 ) 。转入基因的大肠杆菌所合成的d l 比例为d 型1 0 ，l 型9 0 。 c r o w w i c k 和g r o s s ( 1 9 9 5 ) 的研究发现：产物y p g a 中l 谷氨酸的含量与培养 基中m n s 0 4 的浓度成反相关，当m n 2 + 的浓度在0 6 1 5p m o l l 时，t - p g a d p i , - 谷氨酸的 含量在5 9 - 1 0 。在地衣芽胞杆菌n c i m b l l 7 0 9 中，m n 2 + 浓度在0 1 2 3 0 m q l l 废化 时，d 型谷氨酸的比例在1 0 - 9 0 。地衣芽胞杆菌a 3 5 所产t p g a 中的功l 型谷氨 酸的比例也收到m n 2 + 的影响，d 谷氨酸的比例随m n + 浓度的变化在5 0 8 0 之间 ( c h e n g e t a l 1 9 8 9 ) 。 1 2 4 与聚1 ，谷氨酸的合成相关的基因和酶 多年来，地衣芽胞杆菌a t c c 9 9 4 5 a 和一些枯草芽胞杆菌中与聚y 谷氨酸合成相 关的酶和基因研究的比较深入。目前，能够被大家广泛接受的聚t 谷氨酸的合成途 径最早是由k u n i o k a ( 1 9 9 7 ) 提出来的( 见图2 ) 。这个代谢图只能帮助研究者大体了 解聚t 谷氨酸合成的过程，并不能完全解释不同菌种的独特性和合成过程中的细节 问题。 7 d 柏m l n e 闭g i “b 删e 2 噜哟卿嘲甜6 睁 嘲蝴咐拍伽呻艄相啪呻呻 渤g i t q a m i e es 岬h e g s ) 1 4 ) l - g i 城 r 增c 抽瓣：p u 咖蒯喇哪翱硝嗣 国 j a n j n e 喝鼬厢硝e i 田d m l a m i ca c i d ：p 蛐懈嘲自峨_ 黼- m p 从”t 口 图2 枯草芽胞杆菌i f o3 3 3 5 丫- p g a 合成可能途径示意图 ( 引自s i f t ha n dv a n , 2 0 0 1 ) f i 班p r o p o s e dp a t h w a yo f f - p g as y n t h e s i si nb s u b t i l i si f o 3 3 3 5 ( q u o t e df r o ms h i ha n dv a n 2 0 0 1 ) 地衣芽胞杆菌的膜合成酶复合物已经被证明具有活化l _ 谷氨酸，发生聚合反应， 以及外消旋作用。在羟氨的参与下，中间产物转化为谷氨酰羟氨，接下来连接酶以 两个谷氨酰羟氨为底物，将它们连接起来形成聚t 谷氨酸。简单的描述这一过程就是： 在地衣芽胞杆菌中，聚y 谷氨酸是以两个谷氨酸为单位逐次连接起来的。而a s h i u c h i 等人的研究( a s h i u c h i e t a l ，2 0 0 1 ) 发现：在枯草芽胞杆菌中，聚y 谷氨酸是一个一个 连接起来的，他给出的模式如下图： 8 阳鐾o h 堡己l 乜衅星。p 吗习+ 。p 螬p g a 。+ p t 图3 p g s b c a 系统在依赖谷氨酸a t p 酶作用下的反应动力学分析 f i g 3 k i n e t i ca n a l y s i s o f e a c hc o m p o n e n t o f t h e p g s b c as y s t e m o n g l u t a m a t e - d e p e n d e n ta t p a s er e a c t i o n 这就意味着在地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌中，聚t 谷氨酸合成酶体系是以不 同的方式工作的。为了寻找与聚y 谷氨酸的合成直接相关的基因，人们做了大量的 工作：h a r a 和u e d a 在1 9 8 2 年报道，认为枯草芽胞杆菌中聚y 谷氨酸的合成与一个 大质粒相关( h a t a , t ，a n du e d a ，s ，1 9 8 2 ) 。1 0 年后，h a r a 克隆并测序了一个基因， 推测该基因编码y 谷氨酰氨转移酶( g g t ) ，后来又认为该基因产物是聚谷氨酸合成 的刺激因子。但是n a g a e t a l 在1 9 9 4 年，通过严密的实验证实，曾报道的大质粒不 编码任何与聚谷氨酸合成相关的基因( n a g a ie ta 1 1 9 9 7 ) 。1 9 9 5 年，v i e t r ie ta l 首次 报道炭疽芽胞杆菌的聚t 谷氨酸相关合成基因存在于大质粒上。n a g a ie ta l 发现，枯 草芽胞杆菌( n a t t o ) 的聚谷氨酸合成酶基因存在于染色体基因组。a s h i u c h ie t 口p ( 1 9 9 9 ) 在ec o l i 中首先克隆表达了且s u b t i l i si f 0 3 3 3 6 的聚t 谷氨酸合成酶基因 p g s b c a ，u r u s h i b a t ae ta l ( 2 0 0 2 ) 也分别克隆表达了且s u b t i l i si f 0 1 6 4 4 9 和只s u b t i l i s c h u n g k o o k j a n g 的聚丫谷氨酸合成酶基因，以上报道的聚7 谷氨酸合成酶基因序列具 有极高的同源性。此外，a s h i u c h ie t a l ( 1 9 9 9 ) 报道了和d 谷氨酸合成有关的且 s u b t i l i si f 0 3 3 3 6 菌株的谷氨酸消旋酶性质及其基因表达。比较枯草芽胞杆菌的聚谷 氨酸合成酶基因序列发现：该基因在枯草芽胞杆菌中普遍存在，但只有极少数的枯 草芽胞杆菌可以合成聚7 谷氨酸。m a r g a r i t a 等也在2 0 0 0 年证实缺失g g t 的枯草芽 胞杆菌菌株同样可以大量产生聚谷氨酸( m a r g a r i t ak ，e ta 1 2 0 0 0 ) 。胞外g g t 的 活性与聚y 谷氨酸的生成量之间的相关性极低，并且枯草芽胞杆菌$ 3 1 7 在没有的 g g t 活性的情况下大量合成聚1 ，谷氨酸。这些证据表明，g g t 与聚1 ，谷氨酸的合成 无关。y u j i u r u s h i b a t a e t a l ( 2 0 0 2 ) 在b s u b t i l i s i f 0 1 6 4 4 9 中克隆出两个基因y w s c 和y w t a ，发现它们在聚y 谷氨酸合成中起主导作用。 a s h i u c h i 等对聚t 谷氨酸合成酶基因的结构与功能作出详尽的研究工作，三个 基因连锁在染色体上，p g s b ，c ，a 三个基因的长度分别为1 1 8 2 、4 4 9 和1 1 4 3 个碱基。 三个基因的蛋白产物都是膜蛋白，p g s b 从结构上分析具有氨基连接酶的活性，p g s a 据推测具有将p g a 运输到细胞外的功能。三个蛋自在细胞膜上组成了一个合成并运 输p g a 的多酶复合体( a s h i u c h ie ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 大肠杆菌的分子生物学 大肠杆菌是目前研究的最为透彻的微生物，而且繁殖迅速，是当前最为常用的 9 基因工程宿主菌，经过合理的改造，可以大量合成外源蛋白和其他种类的代谢物。 外源基因在大肠杆菌中的表达可能会遇到以下困难：不溶性包涵体的形成导致 蛋白失活；产物有细胞毒性、翻译出来的蛋白不稳定、翻译后修饰不合适，以及无 效翻译等。 要克服以上问题，必须寻找适合的培养条件和表达条件。影响基因表达的因素： 首先是密码子的偏向性，即在大肠杆菌细胞中只有很少的t r n a 用于稀有密码子的 翻译。当目的基因中含有稀有密码子时，通常会造成以下问题：1 、降低m r n a 的 稳定性；2 、成熟前即终止转录或翻译；3 、造