（物理化学专业论文）类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用.pdf

姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的廊用 ! 摘要 一类水滑石( l d h s ) 无机载体材料：合成、表征及其在制备生物传 感器中的应用 类水滑石化合物( l d h s ) ，又称为阴离子粘土，由于其独特的亲水性、溶胀 性和多孔性，成为一种新型的固定生物酶分子的无机载体材料。类水滑石层由共 边的m 1 ( o h ) 6 和m m ( o h ) 6 八面体构成，类似于水镁石的层状结构。阴离子粘土层 板带正电荷，层间充填有平衡电荷的阴离子，层问通道中的阴离子是可交换的。 我们通过共沉淀法合成了l d h s ( z n 3 - a 1 一c l 】) ，并用它有效地固定生物大分子， 提供了一种廉价、快速、简单的酶电极制备方法，是构制生物传感器的一种新型 材料。将酶粘土的混合悬浮液滴附在电极表面上，这种沉积方法最大可能的在 l d h s 膜中固定酶的量以及保持酶的生物活性。 二 基于以l d h s 为固定载体的安培型葡萄糖生物传感器 研究了采用一种新颖的载体材料阴离子粘土( l d h s ) 固定葡萄糖氧化酶 ( g o d ) 制备的电流型生物传感器。类水滑石用实验室共沉淀法合成，g o d 通过 静电作用固定在l d h s 的溶胶中制成生物膜。实验发现，该酶电极在o 6 v 下 ( v s s c e ) 对葡萄糖溶液表现出快速的电化学响应特性( 5 s ) ，宽广的线性检测范 围( 0 0 0 1 1 2 m m ) 以及良好的操作稳定性。传感器的表观米氏常数( k m a p p ) 为4 4 m m ，在信噪比为3 时，最低检测限可达0 1 x m 。人体血液中一些电活性物质的存 在( 除尿酸外) 对葡萄糖的检测没有干扰。此外，本文还系统地研究了该传感器 构建的最佳参数以及溶液p h 值、操作电位和系统温度等使用条件对酶传感器响应 电流的影响。 !姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 三基于甲醇二茂铁类水滑石杂化材料的葡萄糖生物传感器 提出了一种掺杂氧化还原媒介体的葡萄糖生物传感器，同时将电子传递介体 甲醇二茂铁( m e o h f c ) 和葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定在类水滑石膜上，制备第 二代酶电极生物传感器。m e o h f c 可以有效的在酶的电活性中心和电极间传递电 子，提高测定的灵敏度和准确性。这种l d h s ，m e o h f c g o d 酶电极表现出一些优 异的特性：、固定化酶对底物具有较大的亲合力( 表观米氏常数k m a p p 为2 2 5m m ) 、 高的灵敏度( 6 0 m a m 。c m 2 ) 、低的检测下限( 3 a m ，信噪比为3 ) 以及快速的电 化学响应( 5 s ) 。特别是甲醇二茂铁能够降低生物传感器的工作电位，在0 2 5v ( v s s c e ) 下对葡萄糖进行测定，从而避免了其他易发生氧化还原的电活性物质的干扰。 四基于人工合成类水滑石的胆碱氧化酶生物传感器 研究了类水滑石用于胆碱氧化酶( c h o l i n eo x i d a s e ，c h o x ) 的固定构建电流型 胆碱生物传感器。研究发现，该酶电极在0 5 v 下( v s s c e ) 对胆碱溶液表现出快 速的电化学响应特性( 5s ) ，宽广的线性检测范围( 3 7 1 0 - 6 6 3 1 0 4 m ) 以及良好 的操作稳定性。固定胆碱氧化酶传感器的表观米氏常数( k m 印9 ) 为1 3 8 m m ，酶催化 反应的表观活化能为2 6 6 9k j m o l ，灵敏度为9 5 1m a m o c m 。在较高的信噪比下， 最低检测限可达0 3l a m 。此外，本文还系统地研究了溶液p h 值、操作电位和系统 温度等使用条件对生物传感器响应电流的影响。 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用! a b s t r a c t 1 l a y e r e d d o u b l e h y d r o x i d e si n o r g a n i c m a t r i xm a t e r i a l s ： c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o nt ot h e d e s i g n o f a m p e r o m e t r i c b i o s e n s o r l a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s ( l d h s ) ，a l s o c a l l d a n i o n i c c l a y s ”，h a v eb e e n d e m o n s t r a t e da sa t t r a c t i v em a t e d a l sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e so n t o p h y s i c a lt r a n s d u c e r s ，d u et ot h e i rh y d r o p h i l i c ，s w e l l i n g ，a n dp o r o s i t yp r o p e r t i e s t h e l d h sc o n s i s to f m ”( o h ) 6a n dm “( o h ) 6e d g e s h a r i n go c t a h e d r a lf o r m i n gs h e e t ss i m i l a r t ot h o s eo fb r u c i t e n e tp o s i t i v ec h a r g e so ft h el a y e ra r eb a l a n c e db ye x c h a n g e a b l e a n i o n si n t e r c a l a t e db e t w e e nt h es h e e t s w es y n t h e s i z e dl d h s ( z n 3 一a i - c 】) v i at h e m e t h o do fc o p r e c i p i t a t i o n ，a n ds h o w e dt h a tt h ee n t r a p m e n to fb i o m o l e c u l e si n t h i s s y n t h e t i cl a m e l l a rm a t e r i a lc o n s t i t u t e sa ni n e x p e n s i v e ，f a s ta n de a s ym e t h o df o rt h e e l a b o r a t i o no fe n z y m e se l e c t r o d e s t h ep r o c e d u r ec o n s i s t so ft h ea d s o r p t i o no fa n e n z y m e c l a ya q u e o u sc o l l o i d m i x t u r eo n t ot h e e l e c t r o d es u r f a c e t h i sm e t h o do f d e p o s i t i o no f f e r st h ep o s s i b i l i t yo fe n t r a p p i n gal a r g ea n dw e l l k n o w na m o u n to f c 1 1 z y m ei n t ot h ec l a yf i l m 2 a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n o fg l u c o s ew i t hg l u c o s e o x i d a s e i m m o b i l i z e di nl a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s an o v e lc h e a pa n ds i m p l ea m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r ，b a s e do nt h ei m m o b i l i z a t i o no f g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i n t oa n i o n i cc l a y ；l a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s ( l d h s ) z n 3 一a 1 - c 1 】 i sp r e s e n t e d g o dc a nb ee n t r a p p e di nt h el d h sg e lv i ae l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fg l u c o s ew i t h a nu n m e d i a t e ds e n s o ra t0 6 v ( v s s c e ) r e s u l t si nar a p i dr e s p o n s e ( 5 s ) ，aw i d el i n e a rr a n g eo f0 0 0 1 1 2 m m ，a sw e l la sg o o d 4 姚文娟：类水滑彳i 的合成、表征及其在生物传感器中的应用 o p e r a t i o n a ls t a b i l i t y t h e l o wd e t e c t i o nl i m i tw a so 1 u ma t3o t h ea p p a r e m m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( k m 印9 ) i s4 4m m t h eg e n e r a li n t e r f e r e n c e st h a tc o e x i s t e d i nb l o o ds e n l md on o ta f f e c tg l u c o s ed e t e r m i n a t i o n ，e x c e p tf o ru r i ca c i d i na d d i t i o n ， o p t i m i z a t i o no f t h eb i o s e n s o rc o n s t r u c t i o na n dt h ee f f e c t so f t h ea p p l i e dp o t e n t i a lo nt h e a m p e r o m e t r i cr e s p o n s eo f t h es e n s o rw e r ei n v e s t i g a t e da n dd i s c u s s e dh e r e i n 3 e l e c t r o c h e m i c a l s t u d yo ff e r r o e e n e m e t h a n o lm o d i f i e dl a y e r e d d o u b l eh y d r o x i d e sc o m p o s i t em a t r i x ：p o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h e d e v e l o p m e n to fa m p e r o m e t r i eb i o s e n s o r s w i t ht h ea t t e m p to fa m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rd e v e l o p m e n t ，am e d i a t e dg l u c o s e b i o s e n s o rw i t hs i m u l t a n e o u si m m o b i l i z a t i o no fb o t hf e r r o c e n e m e t h a n o l ( m e o h f c ) m e d i a t o ra n dg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i nt h el a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s ( l d h s ) w a s i n i t i a l l yi n v e s t i g a t e d m e o h f cp l a y e de f f e c t i v e l yt h er o l eo fa ne l e c t r o ns h u t t l eb e t w e e n t h er e d o xs i t eo fe n z y m ea n dt h ee l e c t r o d e t h eb i o s e n s o r ( l d h s m e o h f c g o d ) e l e c t r o d es h o w e dg o o ds e n s i t i v i t y ( 6 0m am 。1c m 之) w i t hag o o dd e t e c t i o nl i m i to f3 p ma t3 0 ，s m a l lm i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t ( 2 2 5m m ) a n dv e r yf a s tr e s p o n s et i m eo f a p p r o x i m a t e l y5 s i na d d i t i o n ，t h ee n t r a p p e dm e o h f cm e d i a t o rp e r m i t t e d s e n s o r o p e r a t i o na t 0 2 5 v ( v s s c e ) ，t h e r e b yr e d u c i n gs u s c e p t i b i l i t yt o w a r dc o m m o n e n d o g e n o u s ，e a s i l yo x i d i z a b l ei n t e r f e r e n c e s 4 a m p e r o m e t r i e d e t e c t i o no fc h o l i n ew i t hc h o l i n eo x i d a s e i m m o b i l i z e di nl a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s l a y e r e dd o u b l eh y d r o x i d e s ( l d h s ) c a ne f f e c t i v e l yi m m o b i l i z et h eb i o l o g i c a l m a c r o - m o l e c u l e s c h o l i n eo x i d a s e ( c h o x ) c a nb ee n t r a p p e di nt h el d h sg e lv i a e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n t h er e s e a r c hd i s c o v e r e dt h a td e t e c t i o no f c h o l i n ew i t ha n 姚文娟：类水滑z i 的合成、表征及其在生物传感器中的应用 三 u n m e d i a t e ds e n s o ra t0 5 v ( v s s c e ) r e s u l t e di na r a p i dr e s p o n s e ( 5s ) ，a 、v i d el i n e a r r a n g eo f 3 7 x 1 0 6 6 3 x 1 0 4 m ，a sw e l la sg o o do p e r a t i o n a ls t a b i l i t y t h ea p p a r e n t m i c h a e l i sc o n s t a n s ta n da c t i v a t i o ne n e r g yf o rt h ei m m o b i l i z e dc h o xa r e1 3 8m ma n d 2 6 6 9k j m o l r e s p e c t i v e l y t h es e n s i t i v i t yi s9 51m am c m - 2 t h el o wd e t e c t i o nl i m i t w a s0 3 u m i na d d i t i o n ，t h ee f f e c t so f t h ea p p l i e dp o t e n t i a l ，p hv a l u eo f t h es o l u t i o n , a n ds y s t e mt e m p e r a t u r eo nt h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s eo f t h es e n s o rw e r ei n v e s t i g a t e d a n dd i s c u s s e dh e r e i n !姚文娟：类水滑i m 合成、表征及其在生物传感器中的应用 第一章绪言 生物传感器“1 是一个非常活跃的研究和工程技术领域，它与生物信息学、生物 芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学 的交叉区域。生物传感器技术的研究重点是：广泛地应用各种生物活性材料与传 感器结合，研究和开发具有识别功能的换能器，并成为制造新型的分析仪器和分 析方法的原创技术，研究和开发它们的应用。目前，生物传感器已经成功应用于 医学诊断”、食品工业”1 、环境检测9 ，”1 、国防军事“”及人类卫生保健“等诸多 领域。它与传统的化学传感器和离线分析技术( h p l c 或质谱) 相比，具有选择性 好、灵敏度高、测速快捷和操作简便等优点，而且减少了样品的破坏，避免造成 污染，可以进行在线甚至活体分析“。 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器的定义 生物传感器是将固定化生物物质( 酶、蛋白质、抗原、抗体、生物膜等) 作为 敏感元件基元，通过各种物理、化学信号换能器捕捉目标物与敏感基元之间的反 应所产生的与目标物成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析仪器 【i 钔 1 1 2 生物传感器的基本原理 生物传感器一般有两个组成部分：其一是分子识别元件( 感受器) ，由具有分 子识别能力的生物活性物质构成；二是信号转换器( 换能器) ，主要是电化学或光 学检测元件，它可以将生物识别事件转换为可检测的信号“。生物传感器是利用 生物物质作为识别元件，将被测物的浓度与可测量的电信号关联起来，并将生物 体功能材料( 酶、底物、抗原、抗体、动物细胞、微生物组织等) 固定化处理， 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 ! 当待测物质( 酶、辅酶、抗原、抗体、底物、维生素、抗菌素等) 与分子识别感 受器( 即接受器) 相互作用时，发生物理变化或化学变化，换能器件将此信号转 变为电信号或光信号等，从而检测出待测物质。 生物传感器的原理可用下图1 1 来表示： r n a ，p 。1 y p e p t i d e ) i s f e t f i g u r e1 1c o m p o n e n t s o f a g e n e r a l b i o s e n s o r 1 1 3 生物传感器的分类 由于传感器的种类繁多，分类方法也多种多样，一般按照以下几方面进行分 类： 1 ) 根据分子识别元件的不同可分为酶传感器、免疫传感器、酶免疫传感器、 细胞器传感器、微生物传感器、组织传感器等。 2 ) 根据所用信号换能器的不同可分为电极式生物传感器、场效应晶体管生物 传感器、光学式生物传感器、热敏电阻式生物传感器等。 3 ) 根据检测原理可分为光学生物传感器、电化学生物传感器及压电生物传感 器；根据检测对象的多少可分为单功能型和多功能型类。 4 ) 根据传感器输出信号的产生方式可分为生物亲合型生物传感器和代谢型或 催化型生物传感器。 ! 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 1 2 酶生物传感器。阳 生物传感器的发展，自1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n 两人提出酶电极的观念，从而把 酶催化反应的高度专一性和电极响应的高度灵敏性结合起来“”。1 9 6 7 年u p d i k e 和 h i c k s 把葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定化膜和氧电极组装在一起，首先制成了第一种生 物传感器，即葡萄糖酶电极“。到8 0 年代生物传感器研究领域已基本形成。此后 包括酶传感器的生物传感器研究逐渐兴旺起来，从用一种或多种酶作为分子识别 元件的传感器，逐渐发展设计出用其他的生物分子作识别元件的传感器“1 ，例如酶 一底物、酶一辅酶、抗原一抗体、激素一受体、d n a 双螺旋拆分的分子等，把它 们的一方固定化后都可能作为分子识别元件来选择地测量另一方。除了生物大分 子以外，还可以用细胞器、细胞、组织、微生物等具有对环境中某些成分识别功 能的元件来作识别元件。甚至可以用人工合成的受体分子与传感器结合来测定微 生物、细胞和相关的生物分子。与生物活性材料组合的传感器可以是多种类型的 物理或化学传感器，如电化学( 电位测定、电导测定、阻抗测定) 、光学( 光致发 光、共振表面等离子体) 、机械( 杠杆、压电反应) 、热( 热敏电阻) 或者电( 离 子或者酶场效应晶体管) 等等。所有这些具有生物识别功能的组合体通称为生物 传感器。这些传感器的出现改变了传统消耗试剂破坏试样的生化检测方法，可直 接分析，反复使用，且操作简单。 酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。生物酶的种类繁多， 把酶固定在电极上可以制成各种各样的酶生物传感器来检测底物，如：葡萄糖”“、 半乳糖啪删、尿酸乜4 1 ”、肌氨酸川、抗坏血酸汹、胆固醇删等。目前达到实用 水平已有2 0 0 种以上。”，广泛用于生物、医药、化工等领域m 。应用酶生物传 感器可以省去提纯酶的复杂步骤1 ，它具有一些独特的优点：( 1 ) 选择性好，灵 敏度高，能够直接在复杂试样中进行测定；( 2 ) 响应快、样品用量少，可反复多 次使用；( 3 ) 一般不需对样品进行处理，易于实现多组份的同时测定；( 4 ) 体积 小，可实现连续在线、在位、在体检测；( 5 ) 成本远低于大型分析仪器，便于推 广普及。 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用1 1 2 1 酶生物传感器的发展“阳 依据酶与电极之间的电子传递机理大致将酶电极生物传感器分为三代：第一 代生物传感器采用天然介体氧的催化机理设计制作；第二代生物传感器是将诸如 二茂铁、铁氰化钾等物质作为媒介体掺入酶层中，以减少溶解氧的干扰；第三代 生物传感器是指在无介体存在下，利用生物活性酶与电极间的直接电子传递制作 的生物传感器“。 1 第一代经典电化学生物传感器 1 9 6 2 年，在纽约科学院学术会议上，l e l a n dc c l a r kj n r 教授首次描述了酶传 感器；1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 制成了第一个葡萄糖酶电极生物传感器，它标志着 第一代生物传感器的诞生，从理论和实践上为生物传感器的发展奠定了基础。随 后研究者先后尝试了聚乙烯碳酸酯膜和多孔膜包埋法“”、重氮化法“”、牛血清蛋 白一多聚甲醛膜法、牛血清蛋白一戊二醛交联法“”等技术方法，取得了良好的效果， 酶活力回收和稳定性都达到实用化要求。其中用牛血清蛋白一戊二醛交联法固定 g o d 性能较好，酶电极可稳定4 个月。 第一代生物传感器采用共价交联法可以有效地减少或消除敏感材料从载体上 脱落，提高传感器的稳定性；天然介体氧直接参与酶促反应，通过电子在反应中 心与电极表面之间的传递，实现生化反应信号向电信号的转换，由于直接的电子 传递过程较慢，传感器对底物敏感性不够理想，而且传感器容易受到环境氧浓度 的影响。此外，在电极反应的过程中，需要较高的极化电位，大约在0 6 o 8 v “”1 ， 在如此高的电位下进行氧化测定，试样中共存的其它电活性物质，如抗坏血酸( 维 生素c ) 和尿酸等，也可以在此电位下氧化而产生氧化电流，给测定带来干扰，因 此该方法的灵敏度和选择性相对较差。 2 第二代介体酶电极生物传感器 第二代生物传感器采用化学介体或特定生物分子取代0 2 h 2 0 在酶促反应中和 电极之间进行电子传递。 旦姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 作为良好的介体，需要具备以下条件“： 极易参与有生物活性材料和电极存在的氧化还原反应，在均相和非均相体系 中都能迅速进行电子传递； 还原态不被氧气氧化； 氧化态的再生所需要的电压低，并且不受p h 影响； 对生物无毒性，不被生物催化剂作为底物； 易于生物催化剂共固定化； 在工作或保存期问有足够长的稳定时间。 经过掺杂介体物质的第二代生物传感器，具有以下的优点： 只需较低的极化电位，就能使介体氧化，因而减少了其它具有较低氧化还原 电势物质干扰电极过程的机会； 二茂铁离子不与氧起反应，使传感器对氧不敏感，能够在缺氧或者氧浓度易 变化的条件下使用； 二茂铁离子与还原的葡萄糖氧化酶之间的电子传递快，因而电极响应迅速； 二茂铁衍生物为水不溶性，可直接限制在电极表面，无需投放到样品溶液中。 第二代生物传感器采用一些非生理的氧化还原媒介体如二茂铁及其衍生物等 代替氧，加强了酶与电极问的直接电子传输，起到了酶与电极问的电子开闭器作 用，加速了电极反应，降低了环境干扰，但目前第二代电流型传感器还存在着介 体流失、电极污染及一些电活性物质的干扰等问题。 3 第三代直接电化学生物传感器 直接电化学生物传感器主要用于解决酶等生物识别元件与电极之间的低效率 通讯的问题。造成这种现象的原因包括：大多数蛋白质的电活性中心包埋在蛋白 质分子深处，距离电极较远；蛋白质吸附在电极表面后，分子部分变性；不适合 的空间取向等等。 与前两代生物传感器相比，直接电化学生物传感器既不需要氧分子，也不需 要化学介体分子作为电子传递体，通常还不需要固定化载体，而是将酶分子直接 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 旦 吸附固定到电极表面，使酶的氧化还原活性中心与电极直接“交流”，能够更快地 进行电子传递，从而使酶电极生物传感器的响应速度更快、灵敏度更高，真正成 为“无试剂分析”。目前研究较多的是辣根过氧化物酶与电极的直接电子转移行为 “7 “1 。另外可采用通常的媒介体物质修饰酶分子上的氨基酸残基，使酶本身具有 传递电子的能力，将这种媒介体修饰的酶固定于电极上，直接进行电子转移。 b a t t a g l i n i “”等人研究用锇的配合物与葡萄糖氧化酶共价结合后固定于电极上，对 葡萄糖的响应结果表明，锇配合物修饰的酶是稳定的，固定于电极上不会造成媒 介体的流失，与二茂铁修饰的酶相比有较快的电极反应。通过酶的直接电子传递， 我们可以获得关于化学反应本身的动力学和热力学信息，了解生物大分子的结构 和各种物理化学性质的关系，从而在以后实践中得以广泛应用。 三代生物传感器的区别见图1 2 。 第一代酶电饺 i 氧爱体经典酶电镀) 第：代酶电扳 f 介体酶电檄) f i g u r e1 2 t h ee l e c t r o nt r a n s f e ro f b i o s e n s o r 1 2 2 酶的固定方法 j j f ：i 三代酶i 乜扳 ( 直接酶电极) 生物传感器中的生物活性物质酶是传感器的核心部分，酶是一种天然活性的 高分子催化剂，具有极高的催化效率和特异性及控制的灵敏度。根据酶促反应， 酶可分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。有 些酶促反应还需要辅酶、辅基或金属离子激活剂存在。但酶的应用形式只有两种， 里姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应州 一种是溶液酶，另一种是固定化酶。大多数酶是水溶性的，稳定性差、易失活、 不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中得到更为广 泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化 剂的成本。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。固定化酶，即 把酶固定在特殊载体上，使它和整体的相分隔开来，酶固定化后还能与底物进行 分子交换。已固定化的酶像化学反应所用的固定催化剂那样，既能发挥它们的催 化特性，又能回收，并能多次反复使用，可节约大量酶。固定化技术在很大程度 上决定着传感器的性能，如选择性、灵敏度、稳定性、检测范围与使用寿命等。 因此，研究酶的固定是非常重要而有意义的。 酶的固定化方法有很多种“，大致可分为四类：吸附法。“、包埋法。“1 、共价 结合法。”1 和交联法陆6 1 。近年来，在酶电极制备中，还出现了电化学聚合法。这些 方法有各自的优点，必须根据使用的酶与具体环境加以选择，可以只使用一种方 法，也可以两种或多种方法并用。酶的固定化应当尽量做到：( 1 ) 酶的活性损失 最小；( 2 ) 酶与载体结合牢固，不易脱落；( 3 ) 稳定性好，适用的温度范围及p h 范围宽；( 4 ) 酶在载体上的负载量大；( 5 ) 响应强，灵敏度高；( 6 ) 污染轻，干 扰少等。 包埋法的基本原理是载体和酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过 物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的 构象及酶分子的化学变化，反应条件温和，因而酶活力回收率较高。固定化时保 护剂和稳定剂的存在不影响酶的包埋产率。这种酶包埋在高聚物内的方法对大多 数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。包埋法又分为凝胶包埋法和 微囊化法。凝胶包埋法是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将快状聚合形成 的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强 度提高1 0 倍，并改进酶的脱落情况。微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内， 膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接 触。小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。但对大分子底物， 常存在扩散限制等问题，催化反应受传质阻力的影响，不宜发生酶催化反应嘞”。 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用旦 载体偶联法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化 学共价键实现不可逆结合的酶固定方法啪删，又称共价结合法。根据共价键不同又 分为重氮法，肽键法和烷化法。共价键法的反应条件繁杂，酶的处理条件较剧烈， 有的酶高级结构容易发生变化，活化中易遭到破坏，从而使酶活性降低。但载体 偶联法所得的固定化酶与载体连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重 复使用性，在高浓度基质溶液和盐类等溶液中也不易解离。其常用载体包括天然 高分子( 纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等) 、合成高聚物( 尼 龙、多聚氨基酸、乙烯一顺丁烯二酸酐共聚物等) 和无机支持物( 多孔玻璃、金属 氧化物等) 。共价结合法载体的活化或固定化操作较复杂，要严格控制条件才能使 固定化酶的活力高。蛋白质通过什么基团参加共价连接，载体的物理和化学性质 等对固定化酶都有影响。 交联法是用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键， 得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内 交联。采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各 异的固定化酶。目前交联剂中以戊二醛应用最广。交联法一般作为其它固定化方 法的辅助手段m 1 。 吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖 类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。操作简便、实验条件温和是 其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料， 吸附过程可同时达到纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体可以再生。国内 科研人员选择不同的载体，进行了很多研究。彭立凤等”。研究了以c a c 0 3 粉未为 载体，吸附法固定脂肪酶的方法。该固定化酶很容易从反应体系中回收，重复使 用5 次，酶活力保留7 3 3 7 ，用其催化棕榈油固相甘油解反应生成单甘酯，是一 条“绿色”工艺，并减少了催化剂的消耗。但吸附法也有不足，如酶量的选择全 凭经验，p h 值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载 体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等，因此，其应用受到 限制。为提高其适用性能，我们将此法与其它方法联用：岳振峰等“”以粉末状壳 旦姚文娟：类水滑彳i 的合成、表征及其在生物传感器中的应_ i 聚糖为载体，采用先吸附后交联的固定法，固定a 一葡萄糖氧化酶，酶活力为 1 4 3 0 0 u ，酶活力回收率为5 9 6 ，效果较好，其酸碱稳定性及热稳定性好，可望 为今后固定化酶法生产低聚麦芽糖的工业化提供参考。 一般来说，将酶固定化后其活性有所降低，另一方面，酶固定化后，对热、 蛋白分解酶或各种试剂的稳定有所增加，保存期办延长。四种酶固定化方法各有 优缺点，通常把几种方法综合起来效果更好。无论采用何种方法，固定化酶的稳 定性是首要考虑的因素。 1 2 3 酶的固定化材料 酶的固定化是将酶束缚于特殊的载体，使它与整体相分隔，但仍能与底物进 行分子交换，这种固定化了的酶既具有酶的催化特性，又具有能回收、反复使用 等特点，使用寿命和贮存寿命都比溶液酶长。固定化酶的性能取决于固定化酶所 使用载体材料的性质和固定化方法，而酶的固定化程度直接决定酶生物传感器的 检测性能。常用固定化材料包括无机、有机聚合物、凝胶以及生物材料等。包埋 法多以天然或合成的聚合物凝胶为载体，如藻酸盐1 、树脂”、聚乙烯醇1 、聚 丙烯酰胺“7 1 等。吸附法多以无机材料为载体，主要包括粘土7 、多孔玻璃、氧 化铝1 及活性炭”等。 1 无机材料 用无机吸附剂将酶吸附于载体表面而使其固定化是酶固定化技术中最早采用 的一种方法。常用的吸附剂有硅藻土、高岭土、硅胶、氧化铝、多空二氧化钛等 氧化物及无机盐。最近的研究表明”：载体吸附酶量、载体与酶结合的牢固程度 以及固定化以后的酶活力取决于载体的本质。就固定化q 一淀粉酶而言，用纯s i 0 2 制得的硅胶球型微粒比石英粉、氟石粉、氧化铝、硅藻土等与酶结合得更牢固， 并且固定化酶活力相对较高，在连续使用时仍表现出较高活力。k i m 和l e e ”7 1 用硅 酸盐聚四氟乙烯复合膜固定酪氨酸酶制成生物传感器检测酚类化合物，该方法加 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 入聚四氟乙烯改善了纯硅胶膜易碎性的同时，增加了传感器的稳定性。 粘土是天然无机吸附类材料中的一种，广泛分布于地球表面，颗粒极细，结 构紧密，成晶体状，与水混合后容易分散成直径1 2 9 m 的细粒。粘土的片状柱层 结构以及强大的离子交换能力，可以使生物大分子经离子交换吸附在粘土层板间。 这提供了一种新颖、廉价、便捷的酶电极制备方法，是构建生物传感器的一种新 型材料。此外一些纳米级的无机材料，如金”、银、s i 0 2 啪1 的纳米粒子，也可作 为固定化酶的载体。还有t i 0 2 凝胶4 “、多层碳纳米管”1 等。 2 有机聚合物材料 高分子合成材料具有良好的抗微生物性能，机械强度大，有再生能力和价格 优势。因而以有机聚合物开发研制酶固定化载体，制成生物传感器，能得到很好 的检测效果。例如：用多聚氨基甲酰基磺酸盐水凝胶固定肌醇六磷酸的酶传感器 呻1 ，可测得的肌醇六磷酸浓度线性范围为0 1 2 2 1 0 m m ，检出限为0 1 0 0 2 m m ，此 传感器可应用于食品卫生及工业环境监控。一种新型葡萄糖传感器”4 1 是将酶包埋 于丙烯酸一聚氨基甲酸酯光致固化的聚合物膜中，此聚合物制备快速简便，能稳定 3 个月，经固定化的酶传感器响应快速，响应时间约为3 3 0 s ，寿命可达1 个月， 线性范围为0 1 1 5 m m 。王文序等。”利用等离子体技术使聚丙烯膜表面氨基化，把 - n h 。导入聚合物进行表面改性，再用戊二醛将葡萄糖氧化酶共价固定在改性后的聚 丙烯膜上，氨基化的聚丙烯膜表面固定化酶的能力大大增加。 3 溶胶一凝胶 溶胶一凝胶法具有独特的优势，对酶分子无特殊要求，温和的反应条件和其非 晶态结构都有利于保持酶的结构完整性。 物更具化学和热稳定性及良好的坚固性， 常用的基质材料如二氧化硅比有机聚合 同时基质中因含有足够的水分又保持了 酶活性及稳定性。除树脂、藻酸盐等外，还有多种可用于固定化酶的凝胶。选用 适宜的前驱体及固定化条件可以缩短凝胶化时间，加入聚乙二醇改性剂、非表面 活性剂模板可调大凝胶孔径，微波及超临界干燥可提高其强度。李源勋等嘲1 用对 堕 姚文娟：类水滑f i 的合成、表征及其在生物传感器中的应用 苯二酚和甲醛在酸催化下得到一类新凝胶，具有疏松多孔、亲水性强，不溶于有 机溶剂，对底物有很好的吸附作用，对产物没有亲和性，本身可用于多糖及单糖 的分离，用其固定糖化型淀粉酶转化葡萄糖，产率超过9 7 ，反应器连续使用6 8 h ， 其产率保持不变。 溶胶一凝胶体系是应用很广胶的固定化酶的载体材料。将葡萄糖氧化酶包埋在 溶胶一凝胶矩阵里制成葡萄糖传感器。”，检出限可达6 1 j m o l l 一。超氧化物歧化酶固 定在硅一p v a 溶胶一凝胶薄膜o “，大大提高了酶的响应速率以及固定化酶的稳定性。 4 生物材料 生物材料特有的生物结构为酶的存活提供了很好的微生物环境，使酶活力保 持率高，寿命长。丝素蛋白是一种自然存在的纤维状聚合物，是应用较为广泛的 固定化酶的载体材料。宛晓春等”采用共价键合法和包埋法将酶固定在丝素蛋白 膜上，方法简便易行，酶膜稳定，热稳定性提高，7 0 。c 保存1 h 活力几乎不降低， 而溶液酶活力降低8 5 ，固定化酶的最适p h 值由酸性偏向中性，p h 值稳定性也有 所提高。严少华等啪1 将丝心蛋白和纤维素结合制成复合膜，两者均能保持各自的 特性，并克服了丝心蛋白在空气中易干燥碎裂的缺点，用此复合膜固定葡萄糖氧 化酶制成的葡萄糖生物传感器具有较好的灵敏度与稳定性。甲壳素固定l 一天冬酰 胺酶。“，酶经固定化后其米氏常数k m 值是游离酶的1 0 倍，酶活力回收也很高， 且酶经固定化后对蛋白质水解酶的稳定性及贮存能力均比游离酶有很大程度提 高。 酶固定化的成功与否决定于酶与固定化材料的良好结合而并不破坏酶的生物 催化特性。理想的固定化材料，一般应具有良好的化学稳定性和机械刚性、结合 能力强、再生容易等基本性质。而用于固定化酶，它必须能吸附蛋白质，有能与 酶表面基团相作用的功能团，具有亲水性和良好的生物相容性，同时可以根据酶 的特性而做定向化学修饰，从而改进酶的固定化技术。 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应_ i j旦 1 3 无机粘土 无机微晶结构材料( 粘土，沸石或相关铝矽酸盐) 可以用来修饰电极，它们 的化学性质比较稳定，如能经受住高温和强氧化等条件。这些无机材料能通过离 子交换把离子结合起来( 如离子交联聚合物) 作为电活性离予的载体。这些材料 储量丰富而且便宜，如天然形成的粘土o “。粘土是胶状的、含水的层状铝矽酸盐， 大部分都是自然形成的并属于页硅酸盐一类的矿物。“1 。根据交换离子的类型，粘 土可分为阳离子粘土和阴离子粘土，l a p o n i t e 属于阳离子粘土，水滑石属于阴离子 粘土。根据所查资料显示，用粘土固定的酶种类很多嘲川，其中葡萄糖氧化酶( g o d ) ，彳绝对优势，这是由于葡萄糖生物传感器在临床诊断中应用的结果。同时，用 。0 定酶的粘土种类也很多，其中人工合成类水滑石有着其独特的优点。在本论 文中，详细研究了类水滑石这种固定化酶的优良载体构建生物传感器的性能。 1 8 姚文娟：类水滑i i 的合成、表征及其在生物传感器中的应用 1 3 1 阳离子粘土 大部分粘土是硅氧四面体和铝氧八面体( 图1 3 ) 。”。 f i g u r e 1 3c l a yl a y e r sa l ec o m p o s e do ft e t r a h e d r a l ( a ) ，t e t r a h e d r a ls h e e t ( b ) ，o c t a h e d r a l ( c ) ， o c t a h e d r a ls h e e t ( d ) ，s h e e t sa l el i n k e di n t o ( e ) 1 ：1a n d ( f ) 2 ：1 ( t e t r a h e d r a l o c t a h e d r a ls h e e t s ) c l a yl a y e r s 姚文娟：类水滑石的合成、表征及其在生物传感器中的应用 旦 侧面共享氧原子形成四面体或八面体。四面体或八面体之间共享氧原子则形 成阶层。粘土可以是硅酸盐和铝酸盐以1 ：1 组成的层状矿物。在2 ：1 层状矿物中， 例如广泛使用的蒙脱石，它是由两层硅氧四面体之间夹着一层铝一八面体而构成的 晶层，四面体和八面体的顶端共享氧原子( 图1 3 ) 。表1 1 给出了一些重要的蒙脱 石粘土