（分析化学专业论文）氨基酸的多元校正滴定法测定.pdf

摘要 摘要 氨基酸的测定在理论上和实际应用中都有重要的意义。目前氨基酸的分析方 法主要有化学分析法、光谱分析法、电化学分析法和色谱分析法等，但利用多元 校正法对氨基酸进行测定的研究尚不多见。本文以氢离子选择性电极为工作电 极，根据氨基酸的酸性或碱性，以一定浓度的盐酸或氢氧化钠为滴定剂，采用多 元校正滴定法，对具有代表性的氨基酸的单组分溶液以及它们的双组分混合溶液 分别进行测定。本文主要做的工作如下：( 1 ) 从四种酸碱滴定形式( 包括酸直接 滴定、碱直接滴定、酸返滴定、碱返滴定) 中，分别确定了测定各类( 包括酸性、 碱性和中性) 单组分氨基酸及它们的双组分混合氨基酸的最佳滴定形式。( 2 ) 采 用最佳滴定形式，对谷氨酸、丝氨酸、精氨酸和组氨酸的单组分以及它们的各双 组分混合氮基酸进行了测定，其中单组分测定结果误差控制在1 左右，而双组 分测定结果误差控制在3 左右。( 3 ) 针对四种滴定形式，对各种类型的单组分 氨基酸和双组分混合氨基酸滴定曲线的形成原因，进行了较系统的讨论和解释。 关键词：氨基酸，多元校正滴定，氢离子选择性电极 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ed e t e r m i n a t i o no f a m i n oa c i dh a ss i g n i f i c a n tm e a n i n gi nb o t ht h e o r yf i e l da n d a p p l i c a t i o nf i e l d n o w a d a y st h e r ea l ev a r i o r sm e t h o d so fa m i n oa c i dd e t e r m i n a t i o n , i n c l u d i n g c h e m i c a l a n a l y s i s ，s p e c t r u ma n a l y s i s ，e l e c t r i c a la n a l y s i s a n d c h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s h o w e v e r , i ti sr a r e t ou s em u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nt o m e a s u r ea m i n oa c i d i nt h i st h e s i s t h ed e t e r m i n a t i o no fs i n g l ec o m p o n e n ta m i n oa c i d a n dd o u b l ec o m p o n e n t sm i x e da m i n oa c i di sc a r r i e do u t t h r o u g hm u l t i v a r i a t e c a l i b r a t i o nt i t r a t i o nw i t hs o l u t i o no fn a o ho rh c i 雏t h et i t r a n t h y d r o g e ni o n s e l e c t i v ee l e c t r o d ea st h ei n d i c a t o re l e c t r o d e , w h i l ea u t o m a t i ct i t r a t o ri so p e r a t e i n s t r u m e n t h e r e b gf o l l o w i n gj o b sh a v eb e e nd o n e ：( 1 ) t h eb e s tt i t r a t i o nw a yf o r d e t e r m i n a t i o no f e a c hs i n g l ea c i d i c ，a l k a l e s c e n t ，n e u t r a la m i n oa c i dc o m p o n e n ta n di t s v 捌o u sd o u b l em i x e dc o m p o n e n t si ss u m m a r i z e dt h r o v i 曲r e v i e w i n gt h ef o u rt i t r a t i o n w a y s ，i n c h i d i n gd i r e c tt i t r a t i o nw i t ha c i d , d i r e c tt i t r a t i o nw i t ha l k a l i ，b a c kt i t r a t i o n w i t ha c i da n db a c kt i t r a t i o nw i t ha l k a l i ( 2 ) t h l o u g ht h eb e s tw a yo ft i t r a t i o n ， d e s i r a b l ed e t e r m i n a t i o no u t c o m eo fg l u ，h i s ，a r ga n ds e rs i n g l ec o m p o n e n ta n di t s m i x e dd o u b l ec o m p o n e n t si so b t a i n e d t h ee t t o i 葛i sa b o u tl f o rs i n g l ec o m p o n e n t w h i l ea b o u t3 f o rd o u b l ec o m p o n e n t s ( 3 ) e a c ht i t r a t i o nc u r v eo fs i n g l ea m i n oa c i d c o m p o n e n ta n dd o u b l em i x e dc o m p o n e n t s ，o b t a i n e df r o me v e r yt i t r a t i o nw a y , i s s y s t e m a t i c a l l yd i s e n s e da n de x p l a i n e d k e yw o r d s ：a m i n oa c i d ，m u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o n ，h y d r o g e ni o ns e l e c t i v ee l e c t r o d e n 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：原矽 口g 年乃月f 乒日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：景磅 曙年易月l 酽日 第1 章引言 第1 章引言 1 1 氨基酸概述【1 ，2 】 氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，其主要存在形式有两种： 一种为游离态，主要存在于体液( 如血液) 和食品药品中；还有一种是结合态， 主要存在于肽和蛋白质中。作为游离态的氨基酸是构建生物机体的众多生物活 性大分子，是构建细胞、修复组织的基础材料，并且还是合成神经介质的不可 缺少的前提物质。不同氨基酸在生物体中具有不同的作用，如色氨酸可转化生 成人体大脑中的一种重要神经传递物质：精氨酸可以增加肝脏中精氨酸酶的活 性，有助于将血液中的氨转变为尿素而排泄出去。此外，含有氨基酸的食品和 药品也被大量生产，相关产品主要有食品补充剂，动物营养补充剂，临床营养 制剂，氨基酸注射液，口服液等，其中氨基酸成分多为混合氨基酸。准确、快 速地测定氨基酸的含量有重要的理论和实际意义。 2 0 世纪初，费歇尔( e f i s h e r ) 等对氨基酸进行过系统阐述。构成一般蛋 白质的氨基酸有2 0 种( 半胱氨酸和胱氨酸另计) ，空间立体构型均属l 一型，且 均为。一氨基酸( 即氨基连在与羧基直接相连a 碳原子上) 。a 一氨基酸都是白 色晶体，具有较高熔点( 2 0 0 。c 以上) 。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。 q 一氨基酸通式见式( 1 1 ) 。 ￥矿o r c c 一0 h i n h 2 ( 1 1 ) 大多数氨基酸在水中存在式( 1 2 ) 所示的电离平衡，在水溶液中，氨基酸 的存在形式包括偶极离子、正离子和负离子三种。当氨基酸以偶极离子的形式 存在时，分子所带电荷为零，氨基( 一n h 3 ) 和羧基( - c o o h ) 的存在形式分别为 一h 3 盯和- - c 0 0 一，所以偶极离子形式的氨基酸在水中既可以作为质子供体，也 可以作为质子受体，具有酸碱两性。而正离子形式的氨基酸可看作多元酸；同 样，负离子形式的氨基酸可看作多元碱。 h ，n + 一c h c o o h 当h ，n + 一c p c o o 一；兰塾兰h 2 n c p c o o 一 矗 矗矗 y + 正离子 y 偶极离子y 负离子 ( 1 2 ) 第l 章引言 式( 1 2 ) 中，各基团的表观离解常数按酸性减弱的顺序，以p k a - ( 即p k c o o h ) 、 p k a ：( 即p ，n t 2 ) 表示。当氨基酸分子所带的净电荷为零时，溶液的p h 值为氨基 酸的等电点( p i ) 。等电点下，两性离子正负电荷数值相等，氨基酸分子中一h 3 n + 基团和- - c o o 一基团的离解度相同，因此等电点值即氨基酸在等电点前后两个 p k a 值的算术平均值，各氨基酸的p i 值参见表1 1 。 表1 1 氨基酸在水溶液中的离解常数( 2 5 ) “ 分类戛鬻缩写符号 脚p 酸性氨基酸委螽茎酸 a g s h p：嚣 组氨酸 碱性氨基酸赖氨酸 精氨酸 h i s l y s a r g 1 8 2 2 1 8 2 1 7 3 6 5 4 2 5 6 0 8 9 5 9 0 4 96 7 9 6 7 9 1 7 l o 5 3 1 2 4 8 27 7 3 2 2 7 5 9 97 4 l o7 6 丝氨酸 s e t22 19 1 5 56 8 苏氨酸t h r 2 0 99 1 0 5 6 0 天冬酰氨 a s n2 0 28 8 0 5 4 1 谷氩酰氨 g l r i 2 1 79 1 35 6 5 酪氨酸t y r 2 2 09 1 l1 0 0 75 6 6 半胱氨酸c y s 1 9 68 1 81 0 2 85 0 7 甘氨酸g l y 2 3 496 05 9 7 中性氨基酸霪茎墓竺爱 篙篡 亮氨酸l c u 2 3 6 96 05 9 8 异亮氨酸 1 1 e 2 3 696 86 0 2 苯丙氨酸p h e 1 8 39 1 35 4 8 蛋氨酸 m e t2 2 892 15 7 4 脯氨酸p r o 1 9 91 0 6 0 63 0 色氨酸t r p 2 3 89 3 958 9 氨基酸的分类形式有多种，根据其在中性溶液中侧链的解离状态，可分成 酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸三类。其中，酸性氨基酸含有两个羧基 一个氨基，在中性溶液中，羧基完全解离并呈酸性，分子带负电荷，其等电点 p i 7 5 ，因此将碱 性氨基酸看作碱：而中性氨基酸一般只含有一个氨基和一个羧基，在中性水溶 2 第1 章引言 液中多以偶极离子形式存在，具有酸碱两性，其p i 值在5 6 5 间。综上，大多 数氨基酸都呈现不同程度的酸性或碱性，所以既能与酸结合成盐，也能与碱结 合成盐。在常见的2 0 中氨基酸中，属于酸性氨基酸的只有谷氨酸和天冬氨酸， 而碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸三种，其余的都为中性氨基酸( 具 体见表1 1 ) 。 此外，氨基酸也可按有机化合物分类法，分为脂肪烃氨基酸、芳香烃氨基 酸和杂环烃氨基酸。在营养学上，氨基酸可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。 并且还可根据氨基酸的侧链结构和极性对其分类，这里不做过多描述。 1 2 氨基酸的测定方法 氨基酸的测定在理论上和实际应用中都有重要的意义。目前，氨基酸的测 定方法主要有：化学分析法、光谱分析法、电化学分析法和色谱分析法。下面 对各类氨基酸的测定方法进行简要介绍。 1 2 1 化学分析法h 1 常采用的化学分析法是甲醛滴定法和凯氏定氮法。甲醛滴定法是利用氨基 酸的氨基与甲醛反应，形成羟甲醛基衍生物从而降低了氨基酸的碱性，滴定终 点在p h = 9 附近，这是指示剂酚酞的变色范围。此法主要用于测定中性和碱性 氨基酸，具有简便易行的优点，但由于滴定终点难以把握，准确度较差。凯氏 定氮法是通过测定样品中氮的总量，从而确定样品中含氮氨基酸或蛋白质的含 量。该法准确度较高，但操作步骤复杂，试剂消耗量多，测定周期长。 1 2 2 光谱分析法 光谱分析主要包括紫外一可见分光光度法和荧光分光光度法，并且在氨基酸 测定上有较广泛的应用，已有利用化学计量光谱法测定含8 种氨基酸混合液的 例子i5 1 。紫外分光光度法是利用某些氨基酸具有较强的紫外吸收能力的性质( 如 酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸) 进行测定，已有利用该法测定农药洗发水的混合 物中半胱氨酸的报道【6 1 。一般适合紫外分光光度法测定的氨基酸中的r 基团都含 有苯环共轭双键系统，对紫外波有吸收。 荧光分光光度法是利用化学物质能产生荧光的特点进行分析测定的【7 8 1o 一 般可选择适当的衍生剂与氨基酸分子中的氨基、羧基或其他活性基团进行衍生 第1 章引言 化反应，形成能产生荧光的物质，即可通过相关仪器测定相应的求得氨基酸的 含量。 光谱法测定氨基酸有快速方便准确的特点，但该法对所测氨基酸需具备相 应的特征官能团，如紫外分光光谱法中的待测物需具备紫外吸收基团，因此该 法的测定对象有较大局限性。 1 2 3 电化学分析法 电化学分析法测定氨基酸的主要方法包括直接电化学分析法和间接电化学 分析法。直接电化学分析法是利用某些氨基酸在电极上氧化时所表现出的电活 性进行测定，对于半胱氨酸等具有电活性的氨基酸可用此法进行测定【9 1 0 1 。而对 于其他没有电活性的氨基酸则采用间接电化学分析法，该法的基本思路是利用 某些化学反应改善氨基酸的电活性，使其能满足电化学分析的要求。一般可采 用衍生物与氨基酸反应，形成具有电活性的物质，通过测定这种物质的含量， 推算出样品中氨基酸的含量；也可选择适当的金属离子与氨基酸形成电活性的 配合物，提高氨基酸的检测灵敏度【“l 。另外也可采用电致化学发光分析测定氨 基酸，其基本原理为：具有电致化学发光活性的物质处于一定电位时，与溶液 中的氧化还原性物质相互作用，所形成的物质处于不稳定的激发态，当回到基 态时，能量以光的形式释放出来，通过测定光强度即可推算出待测物质的含量。 在电位滴定分析方面，由于氨基酸是弱酸，故通常采用非水滴定法进行测定【1 ”。 1 2 4 色谱分析法 色谱分析在氨基酸测定中也有诸多应用f b 】，主要包括纸色谱法、薄层色谱 法、气相色谱法和高效液相色谱法。其中纸色谱法采用不同的层析液和检测用 显色剂，可对3 0 多种氨基酸及其衍生物进行分析，具有操作简单、分析效能较 高、所需仪器设备廉价的优点。实际中，常利用硅胶等薄层板及相应的展开剂 对氨基酸进行分离，然后分别采用紫外、荧光或可见光光度法进行检测。该法 可对6 0 多种氨基酸及其衍生物进行分离分析，具有开快、分离效能高、灵敏度 高、耐腐蚀的特点。 气相色谱法将所分析的氨基酸衍生为易于气化的物质，和质谱连用可测定 多组分的混合氨基酸 1 4 l 。液相色谱法中常用的有离子交换色谱，即利用氨基酸 在酸性条件下形成阳离子的性质，在阳离子交换柱中对其进行分离，将分离后 4 第1 章引言 的氨基酸进行衍生，产生在紫外可见光区内有吸收的物质，利用紫外可见光度 检测器进行定量分析，具有准确、可靠、重现性好的优点，能测定大量氨基酸 及其同系物。随着高效液相色谱法的发展，h p l c 逐步占据了氨基酸分析仪市场 的主导地位【1 5 】，近年来还出现了h p l c 和质谱联用测定氨基酸的相关报道【。 1 2 5 其它测定方法 近几年来，随着科技的发展，越来越多的尖端技术被应用于各领域氨基酸 的分析分离。如连续在线毛细管电泳测定氨基酸【1 ”，活性合成膜分离芳香族氨 基酸。此外还有关于电化学发光法，量热滴定法，以及核磁共振滴定法 2 0 , 2 1 】 测定氨基酸的应用。并且根据情况，将适用于氨基酸的各测定方法联用具有更 好的实用性，如毛细管电泳和荧光联用测定茶叶、饮料中的氨基酸【2 ”，h p l c 和 荧光联用测定氨基酸【2 3 等。 1 3 多元校正滴定法概述 多元校正滴定法又称为恒电位或恒p h 滴定法，在滴定过程中，一般取等p h 或等电位步长，即选取某一恒定间隔的p h 或电位值记录滴定剂体积。1 9 8 8 年， l i n d b e r g 和k o w a l s k i 首次将多元校正引入滴定分析中】，并由此产生了多元校 正滴定法。 在实际应用上，当待测溶液只含有一种组分时，常采用单电位滴定法，即 取某一电位或p h ，配制一系列浓度的溶液，根据所选取的电位或p h 处消耗的滴 定剂的体积与待测物的浓度间的比例关系，便可算出待测溶液中该组分的浓度。 这样的方法易于处理数据，但是只能测定单组分溶液。 当待测溶液含有多种组分时，则采用多电位滴定法。即选取一系列的电位 或p h ，在每个电位或p h 处，所消耗的滴定剂的体积与待测物的浓度都存在着 比例关系，据此便可计算出待测溶液中各组分的浓度。实际中，多电位滴定法 也可用于测定单组分待测溶液。 多元校正滴定法最早用于极弱酸和极弱碱( k a 或k b 1 0 ，根据突跃产生的条件【“1 可知此 处滴定曲线有突跃，突跃前后发生反应： y 2 + o h 一y 一+ h 2 0 之后，随着n a 0 h 的增加，y 一和碱继续反应，谷氨酸基本以y 2 一形式存在。 图4 2 所示h c l 直接滴定时，主要发生反应： y + h + y 2 ，y + h + y + 由于谷氨酸的p k b 2 - - 9 7 5 和p k b 3 = 1 1 8 1 ( 可由表1 1 中的p k a 值求得) ，可知其 与h c l 的反应程度非常微弱，溶液电位值( p h ) 的变化主要是h c l 提供的h + 的变化 所致，而同谷氨酸存在形式的变化基本无关，因此图4 2 中不同浓度的三条滴 定曲线接近重合，故直接用酸滴定不能测定谷氨酸的浓度。 图4 3 所示h c l 返滴定时，溶液中已预先加入过量的n b o h ，谷氨酸和n a 0 h 反应之后主要的存在形式为y 2 - 和y 一，h c l 除了中和剩余的n a 0 h 还与y 2 一反应， 所以p h 值变化和谷氨酸存在形式的变化相关，谷氨酸和n a 0 h 都与盐酸反应， 在滴定曲线中形成明显突跃。其中第一个滴定终点是盐酸和过剩的氢氧化钠的 反应终点，第二个则是盐酸和y 2 一反应生成y 一的滴定终点。随着h c l 的不断增 加，电位值上升，最终谷氨酸主要以y + 形式存在，电位变化仅由h c l 含量的变 化引起，不同浓度的滴定曲线后段平滑且趋于重合；而对于n a 0 h 返滴定( 见图 4 4 ) ，由于溶液中存在过量的盐酸，谷氨酸初始主要以y + 形式存在于溶液中， n a 0 h 先中和溶液中的h c l ，再与谷氨酸反应。由图可知，n a 0 h 返滴定得到的曲线 实际上只是n a 0 h 直接滴定得到的曲线向后平移了( 即n a 0 h 和h c l 反应的部分) 。 4 1 2 碱性氨基酸的测定 1 最佳滴定形式的选择 用n a 0 h 直接滴定、h c l 直接滴定、n a 0 h 返滴定和h c l 返滴定四种滴定形式 对浓度分别为0 0 0 1 0 0 m o l l 、o 0 0 1 5 0 m o l l 、0 0 0 2 0 0 m o l l 的精氨酸进行滴定， 1 6 第4 章结果与讨论 滴定曲线见图4 5 图4 8 。 自 1 句 1 0 0 主印 3 o 脚 d - l f o o 2 35 v 6 吨 749” 2 图4 5 盐酸溶液滴定不同浓度精氮酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为0 0 0 1 0 0 m o f l ，0 0 0 1 5 0 m o f l ，00 0 2 0 0 m o f l 的精氨酸溶液) 图4 ，6 氢氧化钠溶液滴定不同浓度精氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为0 0 0 1 0 0 m o l l ，0 0 0 1 5 0 m o f l ，0 0 0 2 0 0 m o f l 的精氨酸溶液) 。12345 v 7 。9竹” 昭 图4 7 氢氧化钠溶液返满定不同浓度精氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为o 0 0 1 0 0 m o f l ，0 0 0 1 5 0 m o f l o 0 0 2 0 0 m o f l 的精氨酸溶液) 1 7 晕阜m需ii；ii篡 功僧研o嗣咖憎劫锄 第4 章结果与讨论 图4 8 盐酸溶液返清定不同浓度转氮酸溶液的滂定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为o 0 0 1 0 0 m o f l ，0 0 0 1 5 0 m o f l ，0 0 0 2 0 0 m o f l 的精氨酸溶液) 由以上四图所示滴定曲线可知，在所有图中，不同浓度的滴定曲线都可在 一定电位区间内达到明显分离，即都可被用于测定精氨酸。其中相对于另外三 种滴定形式，用碱直接滴定，曲线无突跃，走势平缓。这是因为精氨酸p k a 2 值 为9 0 4 ，其与碱的反应程度比较微弱，所以不同浓度的各条滴定曲线相互接近， 同一电位下，不同浓度的精氨酸消耗的滴定剂体积差异不大。 而另外三种滴定形式的滴定曲线出现明显突跃，突跃范围内的电位变化 较大，且在这一区域内，不同浓度的精氨酸溶液所消耗的滴定剂体积的差异较 大。但是考虑到返滴定中需在待测溶液中预加等量的酸或碱，所以选用酸直接 滴定作为精氨酸的最佳滴定形式。 同为碱性氨基酸的组氨酸情况和精氨酸类似，酸直接滴定也是组氨酸最佳 滴定形式( 滴定曲线见图4 9 ) 。 o123 4 5 v 7。”住 图4 9 盐酸溶液滴定不同浓度组氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为0 0 0 1 0 0 m o f l ，o 0 0 1 5 0 m o f l , o 0 0 2 0 0 m o f l 的组氩酸溶液) 第4 章结果与讨论 2 关于滴定曲线的讨论 碱性氨酸由于带两个氨基，在水中存在三级电离平衡，以碱性氨基酸中的 赖氮酸为例，其电离形式见下： 叩例：) 一掣一c o o h 酽) ；兰坚坞n + 倒：x 一钮一c o o ) + n h ,+ n h , ( 4 2 1 三兰兰h ，盯( c 心) 弋； 卜c o o 。旷) 三皇兰h 2n a m 2 ) 弋卜o o o ) 乜妣 组氨酸和精氨酸在水中电离形式类同于赖氨酸，在水溶液中也有y ”、y + 、y + 和y 。四种存在形式。在1 1 中阐述过碱性氨基酸水溶液等同于碱，理论上可直 接用h c l 滴定。 从图4 5 中可见，随着h c l 的滴入，溶液电位呈上升趋势，滴定曲线出现 明确突跃，而且有两个滴定终点。第一个滴定终点和其至第二个滴定终点间的 曲线波动，是由于溶液中吸入了c 0 2 所产生的碳酸导致的。碳酸的p k a ：值1 0 2 5 和精氨酸的p 9 0 4 值接近，也消耗了h c i ，但在多元校正法测定中对实验结 果并无影响。精氨酸p k b 2 - - - - 4 9 6 ，c k b 2 i o 一。因此滴定曲线有突跃，突跃前后发 生反应： y 1 + h + ；兰y + 随着h c l 的增加，最终精氨酸基本以y “形式存在。 图4 6 中，n a 0 h 直接滴定精氨酸时，发生反应： y + 0 h y 。 由于精氨酸p k a 3 = 1 2 4 8 ，e k a 3 1 0 。8 ，精氮酸和盐酸共同与n a o h 反应，在滴定曲线中形 成明显突跃。突跃后精氨酸以主要y + 形式存在，并继续和碱反应生成y 和y 。 但由于k a 值小，滴定曲线无突跃，且反应程度渐弱，所以不同浓度的滴定曲线 后半段平滑并趋于重合。而对于图4 8 所示的h c i 返滴定，实际上相对于h c i 1 9 第4 章结果与讨论 直接滴定，只是增加了为中和n a o h 所消耗的h c l 的量。 h c l 直接滴定组氨酸的滴定曲线和精氨酸的类似，此处不作详细说明。 3 滴定控制电位的选取 由图4 5 可知测定精氨酸的电位区间为1 0 0 m v 2 2 0 m v ，由图4 9 可知测定 组氨酸的电位区间为5 0 m v 到2 2 0 m v ，分别选择合适的9 个电位点进行滴定。 表4 1 盐酸溶液直接滴定精氨酸和组氨酸工作电位的选取 4 测定结果 组氨酸和精氨酸溶液的测定结果分别见表4 2 和表4 3 。 表4 2 组氨酸测定结果 表4 3 精氨酸测定结果 标准值( m o l l )测定值( m o l l )误差( ) 1 1 0 1 0 1 0 9 1 0 。一0 9 1 3 0 1 0 11 2 9 1 0 一0 8 1 5 0 1 0 11511007 1 7 0 x 1 0 11 7 0 x 1 00 0 1 9 0 1 0 。1901000 第4 章结果与讨论 4 1 3 中性氨基酸的测定 1 最佳滴定形式的选择 采用前文中的四种滴定形式对浓度分别为o 0 0 1 0 0 m o 儿、o 0 0 1 s o m o 儿 和o 0 0 2 0 0 m o l l 的丝氨酸进行滴定，滴定曲线见图4 1 0 图4 1 3 。 主仍 31 1 置 1 。 脚 至1 1 o12345 v 7。9”。 图4 1 0 盐酸溶液滴定不同浓度丝氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为o0 0 1 0 0 m o l l ，0 0 0 1 5 0 m o l l ，0 0 0 2 0 0 m o l l 的组氨酸溶液) 吕8；长鼍；i=；j； o12345 v 品町 7 。” 图4 1 1 氢氧化钠溶液滴定不同浓度丝氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为o 0 0 1 0 0 m o l l ，0 0 0 1 5 0 m o l l ，o 0 0 2 0 0 m o l l 的组氨酸溶液) 2 1 第4 章结果与讨论 o 1 2 34 5 v 7。 竹” 位 图4 1 2 氢氧化钠溶液返滴定不同浓度丝氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为0 0 0 1 0 0 t o o i l0 0 0 1 5 0 m o f l 0 0 0 2 0 0 m o l l 的组氨酸溶液) o12345 v 函 759伸”住 图4 。1 3 盐酸溶液返滂定不同浓度丝氨酸溶液的滴定曲线 ( 三条曲线从上到下分别为0 0 0 1 0 0 m o f l 。0 0 0 1 5 0 t o o l l , 0 0 0 2 0 0 m o l l 的组氨酸溶液) 由以上四图所示滴定结果可知，除了图4 1 0 中三条不同浓度的滴定曲线无 明显分离，其他三张图中，曲线都可在一定电位区间内明显分离，即碱直接滴 定和酸、碱返滴定形式都能被用于测定丝氨酸。但考虑到返滴定中需在待测溶 液中预加等量的酸或碱，所以采用碱直接滴定作为测定丝氨酸的最佳滴定形式。 需要说明的是，有关采用碱直接滴定形式测定谷氨酸的工作见文献 4 3 ，本 文中不再重复。 2 关于滴定曲线的讨论 丝氨酸在水中的电离形式形同式( 1 2 ) ，其等电点p i = 5 6 8 ，在水溶液中主 要以偶极离子形式y + 存在，h c l 直接滴定时发生反应： h 3 n 。c f c o o 一+ h + ；= 兰h 刘+ _ c h c o o h c h ，o hc h 2 0 h 主，c重) 第4 章结果与讨论 由于丝氨酸p k b 2 = 1 1 7 9 ，可见其和h c l 反应程度非常弱，三条不同浓度的滴定 曲线基本重合( 见图4 1 0 ) ，所以h c l 直接滴定不能测定丝氨基酸浓度 n a 0 h 直接滴定所得滴定曲线见图4 1 1 ，随着n a o h 的加入，溶液电位值下 降，精氨酸同n a o t l 发生反应： y + + o h 一；兰y 。 精氨酸逐渐以负离子y 。形式存在，虽然其p k a 2 = 9 1 5 ，滴定曲线无突跃，但溶液 电位值的变化和精氨酸存在形式的变化相关，因此三条不同浓度的滴定曲线在 一定电位区域内分开。 图4 1 2 为n a 0 h 返滴定曲线，虽然溶液中存在过量的盐酸，但丝氨酸和盐 酸反应程度极其微弱，所以可看作滴入的n a o h 首先中和溶液中的h c l ，曲线产生 突跃。之后，n a o h 再与丝氨酸发生反应： y + + o h 。；兰y 。 由于丝氨酸p k a 2 - - 9 1 5 ，c k a 2 1 0 一，理论上丝氨酸和n a o h 共同与盐酸反应，滴定 曲线有突跃，之后随着h c l 的增加，精氨酸基本以y + 形式存在。 4 2 双组分混合氨基酸的测定 4 2 1 碱性氨基酸混合溶液的测定 1 最佳滴定形式的选择 本文选择碱性氨基酸中的精氨酸和组氨酸的混合溶液作为测定对象。用 n a 0 h 直接滴定、h c l 直接滴定、n a o h 返滴定和h c l 返滴定四种滴定形式分别对 浓度比为1 ：0 、1 ：0 5 、l ：1 、o 5 ：1 、0 ：1 的组氨酸和精氨酸的混合液进行滴定，结 果见图4 1 4 图4 1 7 。 第4 章结果与讨论 书 1 主一 j 图4 1 4 盐酸溶液滴定不同浓度比的组氨酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 起始处起从上到下，组氮酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 ，5 、1 ：1 、o 5 ：1 、0 ：1 ) 图4 1 5 氢氧化钠溶液滴定不同浓度比的组氨酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 起始处起从上到下组氨酸与精氨酸的浓度比依次为i ：0 、1 ：0 5 、1 ：1 、0 5 ：1 、0 ：1 ) o 1 23 4 5 v 7 。” 图4 1 6 盐酸溶液返清定不同浓度比的组氨酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 起始处起从上到下组氨酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 5 、1 ：l 、o ，5 ：1 、0 ：1 ) 第4 章结果与讨论 君 1 0 0 ；： 1 - 1 5 0 。2345 v 7。” ” ” 图4 1 7 氢氧化钠溶液返滴定不同浓度比的组氨酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 起始处起从上到下组氨酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 5 、1 ：1 、0 5 ：1 、0 ：i ) 从以上四图所示滴定结果可知，除了图4 1 5 中不存在使五条不同浓度比的 滴定曲线明显分离的电位区间，在其他三图所示的滴定结果中，曲线都可在一 定电位区间内明显分离，即可被用于测定双组分混合碱性氨基酸。但考虑到返 滴定中需在待测溶液中预先加入等量的酸或碱，所以采用碱直接滴定作为混合 碱性氨酸的最佳滴定形式。 2 关于滴定曲线的讨论 在4 1 2 中已经讨论过用h c l 直接滴定单组分碱性氨基酸能达到良好实验 结果，精氨酸、组氨酸虽然都是碱性氨基酸，但精氨酸p k a 2 = 9 0 4 ，而组氨酸 p k a 2 = 6 0 ，相差较大，可看作精氨酸较组氨酸的碱性更强。这可以解释图4 1 4 中盐酸滴定精氨酸比滴定组氨酸出现更明显的突跃，两者和盐酸的反应不同步， 溶液电位值的变化和混合液中精氨酸与组氨酸的浓度比有关，因此h c l 直接滴 定精氨酸和组氨酸的混合液可行。溶液中氨基酸和盐酸发生以下反应： y + + h + y + ，y + + h + y 2 + 晟终精氨酸和组氨酸都以正离子形式存在，与盐酸反应程度极其微弱，各不同 浓度比的滴定曲线末端趋于重合。 n a 0 h 直接滴定( 见图4 1 4 ) ，在4 1 2 中也已讨论过，从碱性氨基酸的离 解常数判断，其与碱反应程度非常微弱，滴定曲线没有突跃，不同浓度比的混 合氨基酸的滴定曲线不能较大程度的分离。 图4 1 5 所示，在采用以盐酸为滴定剂的返滴定中，由于同属于碱性氨基酸 的组氨酸和精氨酸与碱反应的程度微弱，因此与用盐酸直接滴定相比，盐酸返 滴定可看作仅是简单的增加了达到突跃时滴定剂的消耗量。观察两种滴定形式 第4 章结果与讨论 所得到的滴定曲线，可选择的工作电位范围基本相似，在- 2 0 r n v l o o m v 之间。 图4 1 6 所示为n a o h 返滴定曲线，由于溶液中存在过量的h c i ，精氨酸和 组氨酸初始主要以正离子y ”、y + 形式存在。滴入的n a o h 首先中和溶液中的h c i 之后和组氨酸与精氨酸发生反应，最终随着p h 值的升高，两种氨基酸都将以负 离子形式存在。 3 滴定控制电位的选取 由图4 1 3 可知适合测定的电位区间为- 2 0 m v - l o o m v ，分别选择合适的9 个电位点进行滴定( 见表4 3 ) 。 表4 3 盐酸溶液直接滴定精氨酸和组氨酸混合液工作电位的选取 精氨酸组氨酸 标准值( o l l )测定值( m o i l )误差( )标准值( m o l l )测定值( m o l l )误差( ) 5 其他讨论 由于滴定曲线和电位值f 密切相关，而本实验中电位值即p h 值，因而也可 通过溶液p h 值的变化，根据氨基酸的各存在形式的分布曲线了解反应状况。精 氨酸和组氨酸各存在形式的分布曲线分别见图4 1 8 和图4 1 9 。可见在同一p h ( 电位) 范围内，精氨酸和组氨酸的离子分布形式相同，可理解为在混合待测液 第4 章结果与讨论 中酸或碱和这两者同时反应。具体可根据电位所对应的p h 值，利用该图，确定 氨基酸的存在形式以了解混合氨基酸中的各组分和酸或碱的反应状况，这种方 法在单组分氨基酸中也适用，文献 4 3 也对此进行过应用阐述，此处不再做具 体讨论。 暑 图4 1 8 精氨酸各存在形式的分布曲线图4 1 9 组氨酸各存在形式的分布曲线 4 2 2 酸性氨基酸和碱性氨基酸混合溶液的测定 1 最佳滴定形式的选择 本文选择了酸性氨基酸中的谷氨酸和碱性氨基酸中的精氨酸的混合溶液， 以及谷氨酸和碱性氨基酸中的组氨酸的混合溶液作为测定对象。用四种滴定形 式分别对浓度比为1 ：0 、1 ：o 5 、1 ：l 、0 5 ：1 、0 ：1 的谷氨酸和精氨酸的混合液进行 滴定，结果见图4 2 0 图4 2 3 。 2 0 0 1 1 一 名印 ；o 锄 1 1 毋 图4 2 0 盐酸溶液滴定不同浓度比的谷氨酸和精氮酸混合溶液的滴定曲线 ( 从上到下，谷氮酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、l ：o5 、i ：l 、0 5 ：1 ，o ：1 ) 第4 章结果与讨论 1 一0 名和 ；， 1 5 0 _ 抽 - 2 $ 0 。123 5 v 7。9” 图4 2 1 氢氧化钠溶液滴定不同浓度比的谷氮酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 从上到下，谷氨酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 5 、l ：l 、0 5 ：l 、0 ：1 ) 。2345 v 7。竹n住 图4 2 2 氢氧化钠溶液返滴定不同浓度比的谷氨酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 从上到下，谷氨酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 5 、1 ：l 、0 5 ：1 、0 ：1 ) o 1 2345 v 7。1 0”镗 图4 2 3 盐酸溶液返滴定不同浓度比的谷氨酸和精氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 从上到下，谷氨酸与精氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 5 、1 ：1 、o 5 ：1 、0 ：1 ) 2 8 抽柚伽恤幻。瑚恤伽抽拗 期抽伽仰幻。抽仰伽斯拗 第4 章结果与讨论 从以上四图可知，用h c l 或n a o h 直接滴定谷氨酸和精氨酸混合液时，不存 在一个覆盖所有浓度比的滴定曲线，并使各曲线在同一条件下差异较大的电位 范围。因此用酸或用碱进行直接滴定谷氨酸和精氨酸混合溶液都不可行。而从 后两者实验结果可以看出，图中每条滴定曲线都有滴定突跃，且滴定突跃部分 跨越的电位范围较大，在这个电位范围内，各浓度比的滴定曲线在达到同一电 位时，所消耗的滴定剂体积差别较大，因此返滴定对于测定谷氨酸和精氨酸混 合溶液是较好的滴定形式。所以n a o h 返滴定，h c l 返滴定都可作为谷氨酸和丝 氨酸混合溶液的滴定形式。 两种返滴定形式中，h c l 返滴定可选的电位范围为1 0 0 m v1 5 0 m y ：n a o h 返滴定可选的电位范围为1 5 0 m v 1 5 0 m y ，大于前者。因此选用适用电位区域 较大的n a o h 返滴定形式作为最佳滴定形式，同理适用于谷氨酸和组氨酸的混合 溶液的测定。氢氧化钠返滴定谷氨酸和组氨酸混合液的滴定曲线见图4 2 4 。 o1234 5 v 7 8 9” 1 2 图4 2 4 氢氧化钠溶液返滴定不同浓度比的谷氨酸和组氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 从上到下，谷氨酸与组氨酸的浓度比依次为1 ：o 、1 ：o 5 、1 ：1 、o ，5 ：1 、o ：1 ) 2 关于滴定曲线的讨论 由于酸性氨基酸和碱性氨基酸自身就会发生反应： 珞+ 十珞。+ 场 再加入酸或碱进行滴定，反应过程中可能多种氨基酸离子形式交叉存在，比较 复杂。在单组分氨基酸的测定中，已讨论过h e l 和谷氨酸反应程度微弱，n a o h 和精氨酸的反应程度微弱，所以图4 2 0 中曲线的突跃是由盐酸同溶液中与谷氨 酸反应后剩余的精氨酸反应所产生的，而图4 2 1 中曲线的突跃是由氢氧化钠同 溶液中与精氨酸反应后剩余的谷氨酸反应所产生。 第4 章结果与讨论 图4 2 2 所示，n a o h 返滴定时，初始阶段n a o h 主要中和溶液中同精氨酸反 应剩余的h c l ，并同溶液中的谷氨酸反应： y 答+ + o h 畦+ h 2 0 y 谷2 + o h k + h 2 0 曲线产生突跃。相较之，氢氧化钠和精氨酸反应可以忽略。突跃后，随着电位 值下降，n a o h 主要和精氨酸发生反应，这也就是为什么初始时所有精氨酸浓度 相同的滴定曲线重合，而最后所有谷氨酸浓度相同的滴定曲线重合。同理可以 解释图4 2 3 所示的h c l 返滴定结果中，滴定曲线初始与末端的重合现象，在突 跃前，盐酸和精氨酸发生反应： y 精+ h + y 嘉 突跃后盐酸基本只同谷氨酸发生反应。 3 滴定控制电位的选取 由图4 2 2 知适合测定谷氨酸和精氨酸混合液的电位区间为1 5 0 m v - 1 5 0 m v ， 由图4 2 4 知适合测定谷氨酸和组氨酸混合液的电位区间为1 5 0 m y - 2 0 m v ，分别 选择合适的9 个电位点进行滴定( 见表4 5 ) 。 表4 5n a o h 返滴定酸性和碱性氨基酸混合液工作电位的选取 4 测定结果 谷氨酸和精氨酸混合溶液的测定结果见表4 6 ，谷氨酸和组氨酸混合溶液的 测定结果见表4 7 。 表4 6 谷氨酸和精氨酸混合溶液待测溶液的测定结果 第4 章结果与讨论 表4 7 谷氨酸和组氨酸混合溶液待测溶液的测定结果 5 其他讨论 同4 2 1 中的讨论类似，也可根据电位所对应的p h 值对照氨基酸的各存在 形式的分布曲线，确定氨基酸的存在形式，以了解混合氨基酸各组分同酸或碱 的反应状况，具体不做过多讨论。谷氨酸各存在形式的分布图见图4 2 5 ，精氨 酸和组氨酸各存在形式的分布曲线分别见4 2 1 中图4 1 8 和图4 1 9 。 喜 图4 2 5 谷氨酸各存在形式的分布曲线 4 2 3 酸性氨基酸和中性氨基酸混合溶液的测定 1 最佳滴定形式的选择 本文选取了酸性氨基酸中的谷氨酸和中性氨基酸中的丝氨酸的混合溶液作 为测定对象。用四种滴定形式分别对浓度比为1 ：0 、l ：o 5 、1 ：l 、o 5 ：1 、0 ：1 的谷 氨酸和丝氨酸的混合液进行滴定，结果见图4 2 6 图4 2 9 。 第4 章结果与讨论 2 主一 j1 s 1 图4 2 6 盐酸溶液滴定不同浓度比的谷氮酸和丝氨酸混合溶液的滴定曲线 ( 起始处起从上到下谷氨酸与丝氨酸的浓度比依次为1 ：0 、1 ：0 5 ，1 ：1 、0 5 ：1 、0 ：1 ) 图4 2 7 氢氧化钠溶液滴定不同浓度比的谷氨酸和丝氨酸混合溶液的滴定