（分析化学专业论文）普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究.pdf

普鲁士蓝，壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究中文摘要 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究 中文摘要 普鲁士蓝( p b ) 膜作为一种分子材料，因其化学性质稳定，容易制备，并具有电色 效应、价格低廉等特点，广泛应用于光电转换、分子识别、离子选择性电极、生物传 感、防锈蚀和光解水等方面。由于它的这些优越的性能引起了人匀本文采用电沉积方 式修饰于金电极表面并对其电化学特性、对h 2 0 2 的催化作用及用作生物传感器进行研 究。 壳聚糖是由广泛存在于甲壳动物和昆虫外骨骼的甲壳素经部分脱乙酰化反应而 得到的一种天然氨基多糖，具有良好的吸附性、通透性和一定的抗拉强度，无毒，并 有很好的生物相容性，本研究中被用来改善纯p b 修饰生物电极的分析性能。 本文应用恒电位电解法制备了普鲁士蓝壳聚糖修饰电极，对电极制备、影响因 素、电化学性质及应用等进行了研究。利用循环伏安、红外光谱、电化学阻抗等电化 学实验技术研究了普鲁士蓝壳聚糖修饰电极的物理、化学性能。 壳聚糖与普鲁士蓝同时电沉积在金电极上获得的杂交膜具有良好的电子传递性 能和对过氧化氢的电催化性能，可以为生物分子提供一个合适的亲水性环境。通过分 析交流阻抗谱出现的频率和谱图形状随电极制备及反应条件的变化可以得到更多的 动力学信息和界面结构信息。通过实验确定制备p b c s 杂交修饰膜的最佳条件为：电 沉积液的p h 值为2 ；电解电位为0 4 v ；电沉积时间为3 0 0 s ，并且通过对交流阻抗曲线 的讨论更深入地解释了其中的原因。对p b c s 膜的电化学阻抗谱用传统的r a n d l e s 电路 模型进行拟合，得到相关参数为：r s = 1 0 0 3 q ，r e t = 2 9 0 5 q ，z c p e = 5 5 6 心，并由此可 估算膜的厚度为8 0 6 3 n m 。所制得的普鲁士蓝壳聚糖杂交膜的性能明显优于纯普鲁士 蓝修饰电极，在p h 为7 0 8 0 条件下性能较纯p b 修饰膜稳定，修饰电极具有优良的电 化学可逆性、良好的电子传递性能和对过氧化氢的电催化性能，氧化峰电流与过氧化 氢在1x 1 0 - 6 _ 5 x 1 0 。3 m o l l 范围内呈良好线性关系，为研制基于酶催化反应的电化学生物 传感器奠定了良好基础。 由于普鲁士蓝壳聚糖杂交膜具有上述优良性能，因此将其用于生物传感器的研 制，并获得了性能优良的葡萄糖传感器。过氧化氢在此修饰膜上的检测电位低( o 0 5 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究中文摘要 v ( v s s c e ) ，检出限低，为3 7 8 x 1 0 6 m o l l ( s n = 3 ) ，响应速度快，平均响应时间为2 5 s 左右。 关键词：普鲁士蓝，壳聚糖，控制电位电解，循环伏安法，计时电流法，电化学 交流阻抗，葡萄糖传感器； i i 作者：汪学英 指导老师：屠一锋 t h es t u d i e so f t h ec h e m i c a la n db i o l o g i cs e n s o r sb a s e do i lp r u s s i a nb l u e c h i t o s a nm o d i f i e d a b s t r a c t t h es t u d i e so ft h ec h e m i c a la n d b i o l o g i cs e n s o r sb a s e d o np r u s s i a nb l u e c h i t o s a nm o d i f i e d a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to ft h ec h e m i c a lm o d i f i e de l e c t r o d e sb yi n s o l u b l em e t a lh e x a c y a n o f e r r a t e ss u c ha sp r u s s i a nb l u e ( p b ) r e c e i v e dt h em o s ta t t e n t i o nf o rt h e i rr e m a r k a b l e s t a b i l i t i e sa n dg o o dc h e m i c a la n de l e c t r o c a t a l y t i c p r o p e r t i e s t h i st e c h n o l o g yi sn o w w i d e l ya p p l i e di nm a n ya r e a ss u c ha se l e c t r o c a t a l y s i s ，e l e c t r o c h r o m a t i cd e v i c e s ，e n e r g y s t o r a g e ，i o nr e c o g n i t i o n ，b i o s e n s o ra n ds oo n t h eb i o p o l y m e rc h i t o s a n ( c s ) i sak i n do fm a t r i xf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o nw i t l l a t t r a c t i v ep r o p e r t i e st h a ti n c l u d ee x c e l l e n tf i l m f o r m i n ga b i l i t y ，h i 曲p e r m e a b i l i t yt o w a r d w a t e r ，g o o da d h e s i o n ，n o n t o x i c i t y ，a n db i o c o m p a t i b i l i t y c h i t o s a nw a su t i l i z e dt oi m p r o v e t h ea n a l y t i c a l p e r f o r m a n c eo fp u r ep b - m o d i f i e de l e c t r o d eb e c a u s eo fi t s u n u s u a l c o m b i n a t i o n a lp r o p e r t y t h i st h e s i ss y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e dt h ep r e p a r a t i o no fp b c s m o d i f i e de l e c t r o d e s ，a f f e c t i n gf a c t o r sa n di t se l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n s t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fp b c sf i l mm o d i f i e de l e c t r o d ew e r ei n v e s t i g a t e d e x t e n s i v e l yb ys o m ee l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e ss u c ha sc y c l i cv o l t a m m e t r y ，f i i ra n d a ci m p e d a n c e t h ee l e c t r o d e p o s i t e dc h i t o s a n p r u s s i a nb l u eh y b r i d i z e df i l m so ng o l de l e c t r o d eh a s t h ef a v o r a b l ee l e c t r o nt r a n s f e ra c t i v i t ya n dt h ee l e c t r i c a lc a t a l y s i sf o rh 2 0 2a n di ta l s o p r o v i d e sah y d r o p h i l i cm a t r i xf o re m b e d d i n gt h eb i o m o l e c u l e s t h ea ci m p e d a n c e s p e c t r u mw a sa p p l i e df o rs t u d yo fm o r ed e t a i l e dk i n e t i ca n ds t r u c t u r a li n f o r m a t i o n t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t sh a v er e v e a l e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o nf o rd e p o s i t i o no fp b c sf i l m i si n c o m p l e t ea c c o r dw i t ht h er e s e a r c ho fc y c l i cv o l t a m m e t r y t h er e a s o no ft h i s p h e n o m e n aw a se x p l a i n e db yt h ef u r t h e rd i s c u s s i o nb a s e do nt h o s er e s u l t s b yt h er a n d l e s s i m u l a t i o n ，t h er e l a t i v ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r so ft h ep b c sf i l mh a v eb e e ne s t i m a t e f o rr s = 10 0 3 q ，t l ：t = 2 9 0 5 f l ，z c p e = 5 5 6 心a n dt h et h i c k n e s sf o r8 0 6 3 n m t h ep b c s e l e c t r o d ei sm o r es t a b l et h a nt h a to fp bi np h = 7 8s o l u t i o nw i mf a s t e re l e c t r o nt r a n s f e r i l l t h es t u d i e so fl h ec h e m i c a la n db i o l o g i cs e n s o r sb a s e do np r u s s i a nb l u e c h i t o s a nm o d i f i e d a b s t r a c t r a t ea n dh a st h ee x c e l l e n tr e s p o n s eo nh 2 0 2 al i n e a rc a l i b r a t i o np l o tw a so b t a i n e di nt h e w i d ec o n c e n t r a t i o nr a n g e 丘o mlxl0 6 5x10 一m o l l i nt h i st h e s i s ，a n a m p e r o m e t r i cg l u c o s e b i o s e n s o rh a sb e e n p r e p a r e db y e l e c t r o d e p o s i t i o no fg l u c o s eo x i d a s eo np r u s s i a nb l u e c h i t o s a nh y b r i dm o d i f i e d f i l mw i t l la g o l db a s a le l e c t r o d e ，w h e r et h eh y b r i df i l ma c t sa st h ee l e c t r o nt r a n s f e rm e d i a t o ra n da l s o t h em a t r i xf o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e t h eb i o s e n s o rc o u l dr e s p o n dg l u c o s ed u et ot h e e x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a lc a t a l y s i so fp r u s s i a nb l u ef o rr e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e t h er e l a t e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fb i o s e n s o ra l s o h a v eb e e ns t u d i e di nd e t a i l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u md e t e c t i o np o t e n t i a lw a s o 0 5 v ( v s s c e ) a n dt h eo p t i m u mp hw a s6 0 u n d e rs e l e c t i v ec o n d i t i o n s ，t h eb i o s e n s o r h a dal i n e a rd e t e c t i o nl i m i to f 3 7 8 x 1 0 由m o l l ( s n = 3 ) a n dt h er e s p o n s et i m ea b o u t2 5 s k e y w o r d s ：p r u s s i a nb l u e ，c h i t o s a n ，p o t e n t i o s t a t i ce l e c t r o l y s i s ，c h r o n o a m p e r o m e t r y ， c y c l i cv o l t a m m e t r y ，a ci m p e d a n c e ，g l u c o s eb i o s e n s o r i v w r i t t e nb y ：w a r l gx u e y i n g s u p e r v i s e db y ：t uy i f e n g 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发 表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用 过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承担本声明的法律责任。 研究生签名：趁望篡日期：星翌z ：! ! ：谚 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、 中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文 档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以 公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大 学学位办办理。 研究生签名： 导师签名： 期：丝宰：丝：堕 期：丝生! ! ：! ! 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究 第一章绪言 第一章绪言 1 1 普鲁士蓝壳聚糖杂交膜修饰电极的研究 1 1 1 普鲁士蓝的结构和性质 从1 7 0 4 年德国柏林人d i e s b a c h 发现普鲁士蓝( p r u s s i a nb l u e ，p b ) 至今，过渡金属 氰化物化学已经有了3 0 0 年的发展历史。人们对它进行了大量的研究，通过光谱分析 【1 3 】，揭示了六氰合铁酸( 盐) 的光谱学特性；k e g g i n 和m i l e s t 4 】等通过粉末衍射实验， 证明了普鲁士蓝及其类似物的化学键结构。普鲁士蓝分子基本结构为i 由f e 2 + 与f e ”交 错占据立方晶格位点的三维网络( 图1 1 ) 。在晶格结构中，点阵上的金属可以是不同类 的，因而普鲁士蓝有多种多样的类似物。普鲁士蓝晶格上f e ( i i ) 矛n 氰根离子中的碳原 子连结，f e ( 1 l i ) 则与氰根离子中氮原子的末端连结，立方单位晶胞为1 0 2a 。 m o s s b a u e r 谱和红外光谱【2 娴研究确证了在这种结构中，f e ( 1 1 ) 呈低自旋、f e ( i i i ) 呈高自 旋的电子状态。残余负电荷则由钾、钠、铵根等或亚铁离子平衡。含钾、钠、铵根的 普鲁士蓝被称为“可溶性 普鲁士蓝，六氰合铁酸铁则被称为“不可溶性 普鲁士蓝。 其实两种普鲁士蓝的溶解度都非常小( k 1 0 4 0 ) 。普鲁士蓝的立方晶体内的一些缺陷、 中间位点、空穴，有可能被带相反电荷的离子或电中性分子所插入或占据，这种开放 结构使普鲁士蓝分子能够容纳某些金属离子、水分子或其他一些电中性分子。一般认 为p b 膜中含有共沉积或吸留的离子、不确定量的水、水解的亚铁氰根以及结构无序 的复杂化合物。 - f 3 0f e 2 + c 0n 图1 1 普鲁士蓝晶体的结构 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 1 9 7 8 年n e 掸6 】将普鲁士蓝修饰到电极上，从此将普鲁士蓝及其类似六氰合铁酸盐 带入了一个新的研究领域。由于普鲁士蓝薄膜具有良好的化学稳定性、电光电特性、 电催化特性以及具有制备方便、成本低廉的优点，引起了人们的关注。普鲁士蓝被用 于制造化学传感器、电色显示装置、燃料电池、固态充电电池、信号增强设备等。六 氰合铁酸盐在很多方面有重大应用价值，包括电显色、电荷存储：离子交换选择、电 子媒介、催化电化学反应等【_ 7 1 。 1 1 2 壳聚糖的结构和性质 壳聚糖，也叫脱乙酰壳多糖 c h i t o s a n ，( 1 ，4 ) - 2 - 氨基- 2 - 脱氧- p - d 葡萄糖，简称c s ， 是由甲壳素经部分脱乙酰化反应而得到的一种天然氨基多糖，其基本组成单位是d 葡氨糖【8 1 ，结构如图1 2 所示。甲壳素是无脊椎动物，特别是节肢动物，如虾、蟹及昆 虫等外骨骼的重要组成部分，其学名为p ( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基- 2 - 脱氧- d 一葡萄糖，是一种 来源极其广泛的自然资源，储量仅次于纤维素。 图1 2 壳聚糖分子的结构 由上面的结构式可以看出，壳聚糖分子极性强，易结晶，其分子内既有亲水基和 疏水基，而且又具有配位能力的- n h 2 和o h 。因此，它不仅可以吸附金属离子【9 1 0 1 ， 还可以吸附非金属物质，如多氯联苯，蛋白质，核酸，卤素等【1 1 1 。 壳聚糖是迄今发现的自然界唯一的碱性多糖，它的等电, f i , , p k a = 6 3 【1 2 】，溶液的p h p k a 时难溶于水。壳聚糖也 不溶于碱溶液，可溶于有机酸，如醋酸、乳酸、苯甲酸和甲酸等。在酸性溶液中，氨 基可与质子结合，从而使壳聚糖带正电荷。壳聚糖化学性质稳定，在干燥密闭容器内 存放三年也不会变质，但由于具有缩醛结构，壳聚糖在酸性溶液中易发生降解，导致 溶液粘度下降，加入甲醇、乙醇等可延缓其粘度降低【1 3 1 4 1 。 壳聚糖容易制成有柔性的无色透明膜，具有良好的吸附性、通透性和一定的抗拉 2 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 强度，无毒，并有很好的生物相容性【15 1 ，因此这种生物相容性材料常被用来固定酶分 子，以保持酶的生物活性。 1 1 3 普鲁士蓝壳聚糖杂交膜的特性 壳聚糖是一种天然聚合物，它所具有的生物降解性、无毒、生物相容性使得它可 以作为固定酶或者蛋白质的优良材料【1 6 】。壳聚糖被用于制备化学修饰电极，最常用的 是交联壳聚糖，最常用的交联剂是戊二醛【1 7 1 9 1 。然而戊二醛的具有一定的生物毒一| 生1 2 0 ， 对酶的活性有一定的影响。本文不采用交联剂而是利用控制电位电解法将普鲁士蓝和 壳聚糖同时电沉积在基底电极上形成修饰膜，掺入c s 后，成膜条件发生改变，导致 形成具有空间结构和沉积量较大的修饰膜，较纯p b 膜更为粗糙，膜具有一定厚度和 立体性质，且存在较多聚集体，这一复合膜由于壳聚糖分子具有大量的氨基，可以为 生物分子提供一个合适的亲水性环境，更适用于固定化酶【2 1 1 ，而且由于壳聚糖的掺入 使p b c s 膜能在p h 为7 8 条件下仍保持良好的稳定性。 1 1 4 化学修饰电极的基本概念和原理 1 1 4 1 化学修饰电极的基本概念 由于电化学反应一般在电极溶液界面进行，因此电极表面的性能是进行电化学 反应的关键因素。要改善电极表面的性能往往需要对电极表面进行有目的的修饰，使 电极具有所期望的性能。于是通过吸附、聚合、共价键合等手段把具有不同功能、特 点的物质修饰到电极表面以借助这些修饰剂的特性来提高电极的选择性、灵敏度，从 而可以进行我们所希望的电极反应，达到在分子水平上实现电极功能设计的目的。化 学修饰电极构成了一种具有某种预定的性质的近代的电极体系，与其他电极相比，它 最突出的特性是，在电极表面接着或涂敷了具有选择性化学基团的一层薄膜( 从单分 子到几个微米) 。它是按照人们意图设计的，并赋予了电极某种特定的性质，如化学 的、电化学的、光学的和传输性等，因此化学修饰电极在提高选择性和灵敏度方面具 有独特的优越性。 化学修饰电极可利用电催化反应以提高测定的选择性和灵敏性；可利用离子交换 表面配合反应进行富集分离；可利用修饰膜的渗透选择性，起到“分子筛”作用而进 普鲁士蓝，壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究 第一章绪言 行分离：可利用媒介作用，加速氧化还原蛋白质在电极表面的电子传递过程；可利用 专一结合作用，将抗原抗体专一结合应与化学放大作用相结合，设计新型电化学生 物传感器。化学修饰电极在分析测定方面有着十分广泛的应用。 1 1 4 2 普鲁士蓝修饰电极的基本原理 普鲁士蓝薄膜有“可溶性”与“不可溶性 两种形式，由于都含有铁氰根，因而 都有良好的化学稳定性与电活性。图1 3 是普鲁士蓝修饰电极的经典的循环伏安图， 从图上可以看出，在电极反应过程中有两对氧化还原峰，在较负电位( 大约 + 0 2 v ，v s a g a g e l ) ，高自旋f e 3 + f e 2 + 发生氧化还原反应，p b 被还原为普鲁士白 ( p r u s s i a nw 1 l i t e ，p w ) ；在较正电位处( 大约+ 0 9 v ，v s a g a g c l ) ，低自旋f e ( c n ) 6 引4 。发 生氧化还原反应，普鲁士蓝被氧化为普鲁士黄( pr u s s i a n ye l l o w ，py ) 与普鲁士绿 ( p r u s s i a n gr e e n ，pg ；又名柏林绿，b e r l i ng r e e n ) 的混合物【2 2 2 3 1 。 lp o t e n l l a lm 幅幻，a 9 a l0 图1 3 普鲁士蓝的循环伏安曲线 k f e m f e l l ( c n ) 6 + e + k + 一k 2 f e u f e i i ( c n ) 6 在0 2 v ( v sa g a g c i ) 处 ( 1 ) f e m f e m ( c n ) 6 + e + k + k f e f e1 1 ( c n ) 6在0 9 v ( v sa g a g c l ) 处( 2 ) 当电极表面有易氧化和还原的物质存在时，峰高产生相应的变化。峰高的变化值 可以作为定量分析这些易氧化和还原物质的依据。 铁离子的氧化与还原反应过程中，阳离子可以穿过普鲁士蓝薄膜中的通道，这些 阳离子起到重要的电荷平衡作用。普鲁士蓝以及它的氧化还原形式的通道半径大约是 4 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 0 3 2l a i n ，穿过普鲁士蓝薄膜阳离子的水合半径要足够的小，通常情况下是碱金属与 铵根离子，而那些水合半径大的离子则不能穿过普鲁士蓝膜，这是p b 修饰膜作为非 电活性阳离子传感器敏感膜的基础。p b 这种具有独特的类似沸石的分子筛结构，对 溶液中的阳离子，特别是碱金属离子、n h 4 + 、矿等一价离子具有选择性透过性，并 且不同的阳离子选择性不同。利用该性质可制成电位型和电流型传感器； 普鲁士蓝发生电化学反应期间，普鲁士蓝膜的光学特征也会发生相应的变化。郭 晓明眩4 1 等对p b 膜进行了原位的可见光谱电化学测量。结果发现，p b 膜在不同的电位 下，在4 0 0 8 0 0 r i m 呈现不同的吸收，将电位恒定于0 v 时膜为无色，无明显的吸光度变 化；恒定在0 5 v 时，膜为深蓝色，此时在5 0 0 8 0 n m 吸光度明显增大；而将电位恒定于 1 2 5 v 时膜显淡绿色，此时在4 5 0 n m 处出现一新峰。六氰合铁酸铁( 盐) 根据其氧化还原 状态的不同而呈现不同的颜色，深蓝色的普鲁士蓝( p b ) ，可被还原为普鲁士白( p m ， 可被氧化为普鲁士绿( p g ) 。由于普鲁士蓝在发生电化学反应期间，p b 膜的光学特征 也会发生相应的变化，因此能够作为各种化学识别的依据，使普鲁士蓝可以作为光学 传感器的敏感元件。 m u r r a y 等人于1 9 7 5 年提出化学修饰电极( c m e ) 这一概念后，多种无机聚合物被用 于化学修饰电极的研究。其中多核过渡金属氰化物是很重要的一类，p b 是多核过渡 金属中的重要一员。p b 修饰电极在分析化学尤其化学传感器中的研究作得较多，不 少研究成果己应用于实际样品的分析检测。 1 1 5 普鲁士蓝一壳聚糖修饰电极的制备 普鲁士蓝是文献报道最早的配合物，自被发现以来，科学工作者对它进行了广泛 而深入的研究。与有机膜及生物膜修饰电极相比，p b 膜修饰电极更易制备，重现性 好，而且较为稳定。 通常，过渡金属氰化物修饰电极的制备方法主要有以下几种： 化学沉积法化学沉积法是将待修饰基底电极直接浸入含有铁氰化物和过渡 金属离子的溶液中，由于化学反应而直接沉积在电极表面。 电化学沉积法电化学沉积法是将待修饰基底电极浸入含有铁氰化物和过渡 金属离子的溶液中，然后进行恒电位或恒电流电解。 普蛰士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一紫绪言 自组装膜衍生法自组装衍生法是在金电极表面自组装一层含有第二化学官 能团的有机硫化物，然后再衍生化为铁氰化物修饰电极。 碳糊法碳糊法是先合成铁氰化物，然后按一定比例与石墨粉混合。 本文应用控制电位电解法将p b 和c s 同时电沉积在金基底电极上，制得了具有优 良电子性能与较耐碱性的修饰电极( 在下文中将详细讨论) 。 1 1 6 基于普鲁士蓝化学修饰电极的应用 由予p b 翻类似物制备简单、性质稳定，并具有电色效应，价格低廉等特点，可 用于催化、电分析、离子选择性电极、固体电池和电致变色材料等。 1 分子识别 p b 在氧化还原过程中会伴有阳离子衍进出晶格以维持p b 膜的电荷平衡： f e 4 f e ( c n ) 6 1 3 + 4 e + 4 m 十一m 4 f e 4 f e ( c n ) 6 3 其中衍为一价碱金属离子或n 峨等。可应用于贮、n a + 、r b + 、秘+ 、c s + 、 n h + 4 等多种阳离子检测的传感器犯5 。2 s 】。 2 电化学催化 p b 在电极表面氧化还原时，可分别于0 9 v 和0 2 v ( v sa g c l a g ) 附近产生两对可 逆的氧化、还原峰，这是p b 修饰电极被用来检测各种有机和无机化合物的基础。这 些化合物包括一些重要的生理物质。s u e l y 等人把p b 修饰电极与流动注射技术结合用 于抗坏血酸的检测阐，使用p b 彦饰铂电极用于h 2 s 2 0 8 翻，无水肼羚强，凡茶酚胺的检 测阉。 p b 修饰电极对s 0 3 厶、s 2 0 3 二、n h 2 0 h 、n 0 2 。、n 2 琢、n a d h 、飓0 2 、h 2 a 等具有 电催化性，利用此性质因此可用于测定溶液中的这些离子。 3 生物传感器 p b s 皂, 电催化过氧化氢酶反应的产物，理论上它就可能发展成为一种新的生物传 感器由于p b 对h 2 0 2 电还原的高催化活性和选择性，以p b 为基础的电催化剂被称为“人 工过氧化物酶 3 】；结合p b $ 1 作各种生物传感器的研究近年来大量出现，如葡萄糖 传感器、尿酸传感器、胆固醇传感器、乙醇传感器等等。 6 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 1 2 基于普鲁士蓝壳聚糖的生物传感器 生物传感器【3 4 】是在化学传感器的基础上发展起来的，是现代生物技术与微电子、 化学等多学科交叉结合的产物。它较传统的离线分析技术更方便、省时、选择性高、 分析速度快、价格便宜，而且还可以在线甚至活体进行分析。生物传感器己被应用于 医学、军事、环境等领域 3 5 1 。 1 2 1 生物传感器的定义 所谓生物传感器就是由固定化生物物质( 酶、蛋白质、抗原、抗体、生物膜等) 做 敏感元件与适当的化学信号换能器件组成的生物电化学分析工具或系统【3 5 1 。其敏感元 件可以是生物成分，如：酶、抗原、激素；也可以是生物体本身，如：细胞、细胞器、 组织等。其常用的换能装置有光电转换器、电位电流测定电极、压电晶片、电化学电 极、离子敏感声效应管、热敏电阻及微光管等，将生物化学信号转变为可以输出并定 量测定的电信号，形成了酶传感器、免疫传感器、酶免疫传感器、细胞器传感器、微 。生物传感器、组织传感器等【3 6 - 3 7 1 。 1 2 2 生物传感器的工作原理 生物传感器技术是建立在固定化细胞和固定化酶技术的基础之上的，它以生物分 子去识别被测目标，然后将生物分子所发生的物理或化学变化转化为相应的电信号予 以放大输出，从而得到检测结果3 7 1 。它主要由感应器和换能器二个部分组成。其基本 组成及工作原理如下图1 4 和1 5 所示。能够对物质进行检测的生物活性膜与被测物 质作用时，有的会使一些特定物质的量有所增减，有的伴有热的变化，有的导致声波 的产生。所有的这些信号都可以通过相应的检测装置检测，并转化为是信号输出，从 而进行分析测定。 7 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 识烈元件转换元件 一门 i 电子仪嚣 图1 4 生物传感器的组成示意图 图1 5 生物传感器的工作原理示意图 1 2 3 生物传感器的分类 1 2 3 1 根据生物传感器中用作生物元件的材料来分 近年来，生物传感器的研究得到蓬勃发展。根据生物传感器中用作生物元件的材 料来分，它们大致可以分为以下几类：酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫 传感器、场效应晶体管生物传感器、d n a 传感器。其中酶传感器是最早问世的生物 传感器，也是生物传感器领域中研究最多的一种类型。 i 酶传感器 利用酶在生化反应中特殊的催化作用，可以使糖类、醇类、有机酸、氨基酸、激 素、三磷酸腺苷等生物分子，在常温下迅速被分解或氧化，在反应过程中消耗或产生 的化学物质即可用转换器转变为电信号再记录下来。目前国际上己经研制成功的酶传 感器有几十种，如葡萄糖、乳酸、尿素、尿酸、过氧化氢、胆固醇和氨基酸传感器。 鉴于电极的重现性和稳定性在测试中的重要性，许多文献都集中于研究酶在电极表面 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 的固定化和生物催化层的有序组装。近十年来，最常用的方法包括电聚合高分子膜固 定法、分子自组装固定法和溶胶一凝胶固定方法。 ( 1 ) 电聚合高分子膜酶传感器 用电化学聚合方法制备生物传感器通常是在中性溶液中，酶和聚合单体及其它相 关物质( 辅酶、介体等) 同时存在下，通过恒电位或电位循环扫描法使单体电氧化或还 原聚合在基础电极上，聚合过程中由于吸附或静电作用使酶或介体等其它物质同时嵌 入聚合膜中。与经典的酶固定化方法相比，用电化学聚合高分子膜固定酶制备生物传 感器有如下一些优点：方法简单，电化学聚合和酶的固定化可一步完成并直接固定于 电极表面；聚合层厚度和酶的聚合量容易控制和调节，从而可制得重现性好的电极。 由于不少高分子膜具有选择性透过某些物质的功能，可起到降低干扰，防止电极被沾 污的作用【3 8 】。 f o u l d s 和l o w e l 3 9 】最早报道了用聚毗咯固定酶于p t 电极上制成以氧为电子受体的 生物传感器；s u n g 矛i ：i b a e 4 0 】报道了在电聚合吡咯导电膜时掺杂共价键合葡萄糖氧化 酶，酶可以在共价键合后仍然保持其活性，响应时间小于3 0 s 。还可以被用于电聚合 固定酶的导电高分子还有聚苯胺4 2 。4 5 1 、聚吲哚【4 6 1 等。因为导电的高分子膜只有在失去 其导电性之后传感器才有较好的响应 4 0 1 ，因此，近年来人们开始直接用非导电的聚合 高分子膜来制备生物传感器。已报道的有聚邻苯二胺、聚苯酚及其衍生物等。此类膜 的厚度通常只有1 0 1 0 0n m 。薄膜带来的优点是响应快，酶在膜中的浓度相对较大， 因此制得的传感器很灵敏。这些非活性聚合高分子膜大都具有选择性透过某些物质的 功能【4 7 4 9 1 ，能有效地降低或消除抗坏血酸、尿酸等干扰。用电化学聚合高分子膜固定 酶或其它生物器件制备生物传感器是一种非常有效的方法。它具有制作简单、响应快 速、抗干扰能力强、适于制作微电极等优点。目前对它的研究还基本上局限于电极制 作方面的工作。而对电化学聚合高分子膜固定酶的机理以及传感器的响应机制等尚不 清楚，有待于进一步研究。 ( 2 ) 分子自组装膜酶传感器 自组装( s a m s ) t 5 0 1 是通过固液或气固界面间的自发化学吸附( 表面化学反应) 进行 的，即被组装分子的反应头基与基底表面物质自发进行化学反应，在基底表面形成由 化学键连接的二维有序的s a 膜，并通过分子间的短程力、色散力和同层内分子问的 9 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 范德华力使己经吸附的分子紧密地排列在一起剐。1 9 8 0 年s a g i v 5 2 】首次报道了自组装 ( s e l f - a s s e m b l y 简称s a ) 技术，他将羟基化的s i 片浸入十八烷基三氯硅烷( o t s ) i 拘稀溶液 中，得到了单层超薄有序的自组装膜。随后，自组装单层膜和由此扩展的双分子和多 分子层的s a 膜的研究逐年增加，分子自组装在化学合成的复杂性和表征的手段上得 到很大的提高。s a 膜在生物传感器【5 3 1 、生物仿生【5 4 】、微电子学、光学、微电子机械 系统、催化和电化学【5 ”7 1 、化学传感器、光学器件等许多方面具有广泛的应用。由于 它在分子尺寸、组织模型和膜的自然形成三个方面很类似于天然的生物双层脂膜，这 种稳定的人工自组体系对仿生和生物物质的电催化方面的研究尤为重要【5 8 删。例如 w i l l n e r 6 1 - 6 2 ，c r e a g e r 6 3 1 ，w i l s o n t 删和王洪恩均报道了将葡萄糖氧化酶固定至u s a m s 中制成葡萄糖传感器；屠一锋等【6 6 】利用自组装技术和气相反应逐层将巯基己酸修 饰于金电极上。金电极表面的短链巯基修饰层，为酶的固定提供了静电和亲水的环境。 s a m s 优点在于可以提高固定化酶的稳定性。 ( 3 ) 溶胶一凝胶固定方法 溶胶一凝胶( s o l g e l ) 法是金属醇盐或半金属醇盐在水、互溶剂及催化剂存在下生 成均质溶液。经水解缩聚等化学反应，释放出水和相应的醇。生成物聚集成溶胶，形 成三维氧化物网络。再经蒸发、干燥转变为凝胶1 67 1 。溶胶一凝胶应用于生物传感器领 域具有如下优点：( 1 ) 基质在可见光区是透明的，适于光化学生物传感器的制作；( 2 ) 基质具有一定的刚性，提高了生物活性分子的热稳定性；( 3 ) 基质热稳定且呈化学惰 性，对生物活性分子的失活作用很小，保持了酶分子的活性；( 4 ) 通过溶胶一凝胶制备 条件的优化，可控制基质的孔径大小及其分布，使酶分子有足够的自由活动空间而又 不至于从基质中脱落，从而提高传感器的使用寿命；( 5 ) 溶胶一凝胶材料还具有生物相 容性，为微电极植入人体提供了新的可能性；( 6 ) 还可通过对前驱体的功能化赋予溶 胶一凝胶新的性能；( 7 ) 溶胶一凝胶的制备条件十分温和，生物分子可以在不同的制备 阶段加入，并且可以制成不同大小与形状的修饰电极等。溶胶一凝胶材料作为酶固定 化载体，开辟了制备生物传感器的新领域。屠一锋等制备了纳米级至微米级的超薄溶 胶一凝胶修饰膜【6 8 】直接用于化学修饰电极及酶固定化【6 9 】。 2 组织传感器 组织传感器实际上也是酶传感器，因为酶都是从动植物的器官、组织中提取出来 1 0 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究 第一章绪言 的，经过纯化成为单一的酶。组织传感器是利用天然组织中酶的催化作用，直接由含 某种酶的动植物组织而构成的一种传感器。最早提出组织传感器的是r e c h n i t z 7 0 1 ，当 时是将猪肾组织切片覆盖在氨气气敏电极上制备成可测定谷氨酞胺的传感器。组织传 感器具有价格低廉、性能稳定、使用寿命长等优点，但如何将它商品化仍有许多问题。 3 微生物传感器 微生物传感器的测定原理有两种类型。一种是利用微生物在同化底物时消耗氧的 呼吸作用；另一种是利用不同的微生物含有的不同的酶。微生物传感器中最常见的是 生化需氧量传感器( b o d ) 。张先恩【7 1 1 、孙裕生【7 2 】、邓家祺【7 3 】等曾研制并将b o d 传感 器商品化。 4 免疫传感器 免疫传感器利用抗体与抗原之间的免疫应答机理，将其中之一修饰到换能器内 ( 或表面) ，可以检测复杂体系中对应的免疫组分 5 场效应晶体管生物传感器 场效应晶体管( f e t ) 生物传感器是将生物技术和晶体管工艺相结合的生物传感 器，它是由酶或其它分子识别物质和离子选择性声效应管( i s f e t ) 结合构成的，可用 来测定许多蛋白质、氨基酸和青霉素等有机化合物m 7 8 1 。只要生化反应中能产生离子 浓度的变化( 如p h 值) ，就可以通过i s f e t 反映出来陟8 0 1 。例如可以埋入假牙内测定p h 值的i s f e t 传感器，可以测定胃内p h 的传感器和把i s f e t 装在探针前端可以连续检测 血液p h 值的传感器。 6 d n a 传感器 d n a 传感器是将特定序列的d n a 固定到换能器表面，通过与目标d n a 杂交，形 成双链d n a 后，检测由于杂交产生的响应信号，对目标d n a 进行高选择性、高灵敏 性的诊断。因此在检测与疾病有关的基因变异，对基因筛选、药物的研制和开发、食 品和环境的控制、在分子水平上对遗传疾病进行诊断和治疗具有十分深远的意义。 1 2 3 2 按测量信号不同来分 按测量信号不同来分，电化学生物传感器又可分为电流型、电位型、电容型和电 导型。电流型传感器利用固定在电极上的酶对酶底物的催化氧化或还原，产生可在电 极上还原或氧化的组分，获得电流信号；电位型传感器是基于离子选择性电极原理而 普鲁士蓝壳聚糖修饰的化学和生物传感器研究第一章绪言 发展起来的，固定到电极表面的酶对底物催化，产生离子型物质，能引起指示电极电 位改变，电位变化关系遵循n e r e s t 方程；电容型传感器则以通过免疫反应结合到电极 表面的免疫组分所引起的电容变化值为测定信号；电导型传感器利用酶催化底物反 应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液电 导率为响应信号。 1 2 4 电流型生物传感器的发展过程 电流型生物传感器的发展过程大概可分为三个阶段： 1 第一代生物传感器 上世纪六十年代初，c l a r k 和l y o n s 提出了研制酶电极的设想，酶电极由固定了 生物成分的非活性基质膜( 透析膜或反应膜) 和电化学电极所组成【8 1 。8 2 1 ，1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 首次将葡萄氧化酶膜覆盖在铂电极上，利用酶的天然电子传递体氧来沟通与 电极之间的电子通道。直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的传感器，称为第一 代生物传感器。其结构较简单，工作原理较易理解。以葡萄糖氧化酶为例，其响应机 理为：0 2 在葡萄糖氧化酶作用下，催化氧化葡萄糖，生成h 2 0 2 。由于还原态葡萄糖 氧化酶( g o d r e d ) 的氧化还原活性中心在酶分子内部，被蛋白质包围，不易直接与常规 电极交换电子，因而得不到可测量的电信号。可以通过测量反应物中0 2 减少量或生成 物中h 2 0 2 的产生量这两种方法获得电信号。第一代传感器存在受氧分压影响和h 2 0 2 过电位高、干扰多、受氧溶解度限制等缺陷。 2 第二代生物