（生物化学与分子生物学专业论文）trametes+spah282漆酶研究.pdf

致谢这项研究工作从丌始至今四年多时间。四年来，随着对真菌漆酶知识了解的逐步深入，我对该领域的研究兴趣也在不断增加，以致于今天已经成为生活的重要组成部分。我深刻体验了从事研究工作所付出的艰辛和忍受的寂寞，也感受了经过努力获得成功后的喜悦，更深切地感悟了作为一个科学工作者应该具有的修养和素质。所有这一切，我首先要衷心感谢我的导师施蕴渝院士，感谢施老师的悉心指导和真诚关怀。施老师渊博的学识，高尚的为人和对科学孜孜不倦的追求深深的感染、教育着我，她的悉心教诲将使我终生难忘。感谢科大实验室的曾王勇老师，涂晓明、徐应琪、蔡征、扬武林和张学成博士，王以庶小姐，他们为我实验工作的顺利进行提供了许多帮助。感谢安徽大学生命科学学院的王怡平教授，她在菌株筛选、微生物发酵生理学研究等方面给予了很多热忱指导和帮助；感谢安徽大学的张敏和吴涓老师，她们在微生物发酵条件实验和酶活测定方法方面给予了热情支持；感谢我的学生王军、蒲春雷、周婷、王静、赵萍、程晴、陈泉、洪宇植、胡乔彦等，他们分别参加了部分实验工作，他们刻苦好学的精神给我留下了深刻印象。在我完成初稿后，南丌大学生命科学学院的邢来君教授和军事医学科学院生物工程研究所的朱厚础教授在百忙中分别给予指导和精心修改，在此特表示衷心感谢，并向两位知名教授表示敬意。感谢王玉珍教授和杭俊博士在论文撰写过程中给予的建议和讨论。感谢我的家人对我的理解和支持。他们为我解除了后顾之忧，使我能够专心致志地工作，他们的鼓励增加了我获得成功的信心。感谢所有关心支持我的老师、同学、朋友和家人!中国科技大学博士堕查一堕垩! 生堕塑垄a b s t r a c tl a c c a s e ，ak i n do fp o l y p h e n o lo x i d a s ec o n t a i n i n gc o p p e r s ，i sa b l et oc a t a l y z ea l la r r a yo fo r g a n i ca n di n o r g a n i cs u b s t r a t e s ，i n c l u d i n gm o n o 一，d i 一，a n dp o l y p h e n o l s ，a m i n o p h e n o l s ，m e t h o x y p h e n o l sa sw e l la sm e t a lc o m p l e x e sb yc o n c o m i t a n tr e d u c t i o no fm o l e c u l a ro x y g e nt ow a t e r ，a n di ti so n eo fas m a l lg r o u po fe n z y m e sc a l l e db l u ec o p p e ro x i d a s e sw h i c hi n c l u d ep l a n ta s c o r b a t eo x i d a s e sa n dm a m m a l i a np l a s m ap r o t e i nc e r u l o p l a s m i n i tc a nb ef o u n di n a n t s ，i n s e c t sa n db a c t e r i a ，b u tf u n g ia r ei t sm a j o rs o u r c e s i np l a n t s ，i ti si n v o l v e di nl i g n i ns y n t h e s i z i n ga n dc e l lw a l ls t r u c t u r i n g i nf u n g i i ti sa s s o c i a t e dw i mm a n yb i o l o g i c a lf u n c t i o n ss u c ha sl i g n i nd e g r a d a t i o n ，r e m o v a lo fp o t e n t i a l l yt o x i cp h e n o l s ，m o r p h o g e n e s i s ，p i g m e n ts y n t h e s i s ，s p o r u l a t i o n ，p h y t o p a t h o g e n e s i sa n df u n g a lv i r u l e n c e b e c a u s el a c c a s e sa r er e m a r k a b l yn o n - s p e e i f i ca st ot h e i rr e d u c i n gs u b s 仃a t e ，t h e yh a v ee x t e n s i v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nt r e a t m e n to fp u l p i n gw a s t e w a t e r , d e t o x i f t c a t i o no fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s ，t r a n s f o r m a t i o no ft e x t i l ed y ea n dd e v e l o p i n gn e we n e r g i e s ，a n dh a v ea t t r a c t e dal o to fa t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s a f t e rap r e l i m i n a r ys c r e e n i n ga n das e c o n ds c r e e n i n g as t r a i nw i mh i 【g h e rp r o d u c t i v i t yo fl a c c a s e ，t r a m e t e ss p s t r a i na h 2 8 2 ，w a so b t a i n e df r o ms a m p l e sw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o mo u t s i d ew o r l d t h i sn e w l yi s o l a t e ds t r a i nw a sb a s i d i o m y c e t e ，a n dc o u l db ei n d u c e dt op r o d u c eah i g hl e v e lo fl a c e a s e sw h e ng r o w no nac e l l o b i o s e a s p a r g i n el i q u i dm e d i u m ，a n dt h el a e c a s ei s o z y m e sy i e l d sa n dc o m p o s i t i o nw o u l dv a r yw i t l ld i f f e r e n ts m a l l m o l e c u l ea r o m a t i ci n d u c e r s w h e nt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fi n d u c e r si nm e d i aw a s1m m ，ah i g h e ry i e l dc o u l db ea c h i e v e dw i t hi n d u c t i o no fd - t o l i d i n e t h ed o m i n a n tl a e c a s ec o m p o n e n tw a sl a c c a s eai nt h ec u l t u r es u p e m a t a n t si n d u c e db y2 , 5 - x y l i d i n e ，d - t o l i d i n ea n ds y r i n g i ca c i d ，w h i l et h ed o m i n a n tc o m p o n e n tw a sl a e c a s ebb y3 , 5 - d i x y d r o x y t o l u e n e a n dw h e ni n d u c e db yf e r u l i ca c i do rg u a i a c o l ，n e a r l ye q u a la c t i v m e so f t w ol a c e a s ei s o z y m e s ，l a c c a s eaa n dl a c c a s eb ，w e r ed e t e c t e di nt h ec u l t u r es u p e r n a t a n t s t h ee f f e c t st om i c r o o r g a n i s mg r o w t ha n dl a c c a s es y n t h e s i sw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fo - t o l i d i n e ，g u a i a c o l ，璺型垫查芏堡主笙墨点垩! 皇堕查壁翌查一3 , 5 一d i x y d r o x y t o l u e n ei nm e d i aw e r ea l s os t u d i e d t h el a c t o s eaf r o mt h ec u l t u r es u p e m a t a n ti n d u c e db yd t o l i d i n ew a sp u r i f i e dt oe l e c t r o p h o r e t i ch o m o g e n e i t yb yt h r e ec h r o m a t o g r a p h ys t e p s ：d e a e s e p h a r o s ef f , s u p e r d e x 一2 0 0a n dm o n o q t h es o l u t i o nc o n t a i n i n gp u r i f i e dl a c c a s eac o n t a i n i n gc o p p e r so ft h r e et y p e ss h o w e dab l u ec o l o r t h em o l e c u l a rm a s so fp u r i f i e dl a c c a s eaw a se s t i m a t e dt ob e6 2k d ab ys d s p a g e ，5 7k d ab yf p l c ，a n dm e a s u r e da s5 8 5 2 2d ab ym a l d i t o fm a s ss p e c t r u m l a c c a s eaw a sam o n o m e r i cg l y c o p r o t e i nw i t h11 - 1 2 c a r b o h y d r a t ec o n t e n ta n dh a dt h ei s o e l e c t r i cp o i n to f4 2 t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r ef o ro x i d i z i n gg u a i a c o lw e r e4 5a n d5 0 cr e s p e c t i v e l y t h eh a l f - l i f eo ft h ee n z y m ea t7 5w a s2 7r a i n t h ee n z y m es h o w e dag o o ds t a b i l i t yf r o mp h4 0t o8 0 t h ek mv a l u e so ft h ee n z y m et o w a r ds u b s t r a t e s2 , 2 - a z i n o d i r 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n es u l f o n i ca c i d ) ，g u a i a c o la n d2 , 6 一d i m e t h o x y p h e n o lw e r e2 5 ，4 2 0a n d2 5 5u m ，a n dt h ec o r r e s p o n d i n g “w e r e6 7 0 ，6 6 8 ，7 9b t mr a i n “m g 1r e s p e c t i v e l y t h ec u l t u r es u p e m a t a n ti n d u c e db y3 , 5 一d i x y d r o x y t o l u e n ec o u l db eu s e da st h es o u r c eo f l a c c a s eb ，a n dl a c c a s ebw a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb yat w o s t e pc h r o m a t o g r a p h y , w h i c ha l s od e m o n s t r a t e dt h es i m i l a rc h a r a c t e r i s t i c sa st y p i c a ll a c c a s e s m o l e c u l a rm a s so fp u r i f i e dl a c c a s ebw a se s t i m a t e dt ob e7 4k d ao ns d s - p a g e ，7 2k d ab yf p l c ，a n dw a sd e t e r m i n e dt ob e7 1 4 5 4d ab ym a l d i t o fm a s ss p e c t r u m t r e a t e dw i t hn g l y c o s i d a s ef ，l a c t o s ebl o s t2 5 o fi t sm o l e c u l a rm a s s t h ei s o e l e c t r i cp , o i n to fl a c c a s ebw a s4 0 i t so p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ef o ro x i d i z i n gg u a i a c o lw e r e4 7 5a n d4 5 r e s p e c t i v e l y t h eh a l f - l i f eo ft h ee n z y m ea t6 0 cw a s1 4 0m i n t h ee n z y m es h o w e dag o o ds t a b i l i t yi nar a n g eo fp hv a l u e3 5t o7 5 t h e v a l u e so ft h ee n z y m et o w a r ds u b s t r a t e ss y r i n g a d a z i n e ，g u a i a c o l ，2 , 2 - a z i n o - d i 一( 3 e t h y l b e n z t h i a z o j i n es u l f o n i ca c i d ) ，a n d2 , 6 一d i m e t h o x y p h e n 0 1w e r e2 8 0 ，1 2 4 9 0 ，1 7 7 0a n d1 0 9 8g m ，r e s p e c t i v e l y t h ec o r r e s p o n d i n gv m a xw e r e5 0 4 0 ，1 9 1 0 0 ，1 1 7 4a n d1 5 9 0g mm i n 。1 m g t h ep r i m e rw a sd e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ed e t e r m i n e dn - t e r m i n a ls e q u e n c eo ft h el a c t o s eap r o t e i na n dt ot h ec o d o nu s a g ef r e q u e n c yi nt h ep h e n o l o x i d a s eg e n eo fc o r i o l u sh i r s u t u s ，t h ep a r t i a lg e n eo fl a c t o s eaw a sc l o n e db yp c rm e t h o df r o mg e n o m i ed n a ，a n dp r e l i m i n a r ya n a l y s i si n d i c a t e di tw a san e ws e q u e n c ew i t ha8 7 o s i m i l a r i t yt ot h ec o r r e s p o n d i n gs e g m e n ti nt h ep h e n o l o x i d a s e一2 主璺翌垫垄兰堡主垒奎塑垩! 墨堕查壁堑查一g e n ef r o mc o r i o l u sh i t s “t u s ，t h e r e f o r ew ed e d u c e dt h a tt h e r ew e r et e np u t a t i v ei n t r o n si nt h eg e n ea n dam a t u r es i n g l ec h a i np r o t e i nw i t ha b o u t5 0 0a m i n oa c i d sw a se n c o d e d t h eo x i d a t i o no f2 , 6 d i c h l o r o p h e n o l ，2 , 4 ，6 - t r i c h l o r o p h e n o la n df l u o r e n eb yf r e el a c c a s eaw a ss t u d i e d a n de x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a t2 0u n i t so fp u r i f i e dl a c c a s eaa l o n ew a sa b l et oc o m p l e t e l yo x i d i z e1 0 0 州2 , 6 - d i c h l o r o p h e n o l ，2 , 4 ，6 一t r i c h l o r o p h e n o li n6h nt h ep r e s e n c eo f1m m2 , 2 - a z i n o - d i ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z o l i n es u l f o n i ca c i d ) a n d1 - h y d r o x y b e n z o t r i a z o l e ，15 0u n i t so fl a c c a s eaw a sa b l et oo x i d i z e7 0 o f5 0i x mf l u o r e n ei n18h h o w e v e r , t h ec o n c e n t r a t i o no ff l u o r e n ew a sn o td e c r e a s e dw i t h o u t2 ，2 - a z i n o d i -( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n es u l f o n i ca c i d ) a n d1 - h y d r o x y b e n z o t r i a z o l e l a c c a s eaw a si m m o b i l i z e do nc h i t o s a nb ym e a n so fc o v a l e n tc o u p l i n gt oag l u t a r a d e h ) ，d e - p r e t r e a t e ds u p p o r t t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o no fl a c c a s eac o u l db es p e c i f i e da s ：0 1gc h i t o s a na n d5 g l u t a r a l d e h y d e15m lc r o s s l i n k e df o r8h r s ，t h e na d d e d3 0 0ue n z y m et oi m m o b i l i z ef o r1 2h r s i nt h i sw a y17 6 4u go fc a t a l y t i ca c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a sa v a i l a b l e c o m p a r e dw i t ht h ef r e ee n z y m e ，t h ea f f i n i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m ed e c r e a s e dt o w a r ds u b s t r a t eg u a i a c o l ，b u ti t ss t a b i l i t yw a sc o n s i d e r a b l yi m p r o v e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a s5 5 。c ，5 。ch i g h e rt h a nt h ef r e ee n z y m e ，a n d5 6 5 o f i n i t i a le n z y m ea c t i v i t yc o u l dr e m a i n e d ，i fk e p ta tat e m p e r a t u r eo f7 0 ( 2f o r8h r s h o w e v e ra c t i v i t i e so ff r e ee n z y m ew o u l db eg r e a t l ya f f e c t e du n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s ，m o r et h a n9 9 o fi n i t i a le n z y m ea c t i v i t i e sw e r el o s ti n4h r s t h ee x p e r i m e n to no x i d a t i o no fp h e n o l i cc o m p o u n d s ，c a r r i e do u ti nt h er e a c t i o ns y s t e mo fi m m o b i l i z e de n z y m e ，s h o w e dt h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m es t i l lr e m a i n e da b o v e6 0 a f t e r1 2r o u n d so fo p e r a t i o n ，t h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c yo fl a c c a s ev g a sg r e a t l yi m p r o v e d t h e r e f o r et h i sn e w l yi s o l a t e dm i c r o o r g a n i s ma n dl a c c a s ei ts y n t h e s i z e dh a dp o t e n t i a li n d u s t r i a la p p l i c a t i o n sk e yw o r d ：t r a m e t e ss p a h 2 8 - 2 ，l a c c a s e ，g e n ec l o n i n g ，e n z y m ei m m o b i l i z i n g+ 3 璺壁垫查芏堡主堡圭堕垩! 墨堕鎏璺竺墅l 一中文摘要漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，它能催化一系列有机和无机化合物，包括单酚、二酚和多酚、胺基酚、甲氧基酚类和金属离子复合物等发生一个电子氧化，同时伴随有分子氧还原成水。它与植物抗坏血酸氧化酶、动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝氧化酶家族，产生于植物、昆虫和微生物，特别是真菌。在植物，漆酶参与木素合成和细胞壁构建；在真菌，漆酶涉及子实体发育、菌索形成、孢子色素产生和真菌致病性等。由于具有宽泛的底物专一性，漆酶在制浆造纸废水处理、有毒环境污染物转化和能源开发等诸多领域具有重要潜在应用价值，成为近年来倍受关注的环保用酶。r 从野外环境采集样品，经初筛和复筛，得到一株漆酶丰产新菌株：t r a m e t e s、fs 每赢h 2 8 2 ，该菌株在纤维二糖门冬氨酸液体培养基上经诱导可有效合成漆酶，漆酶的产量及其同功酶组成受低分子芳香化合物诱导。当诱导物初始浓度为1m m o l l 时，使用邻甲苯胺诱导能获得较高的漆酶产量。2 ，5 一二甲苯胺、邻甲苯胺和丁香酸诱导菌株合成漆酶的主要组分为同工酶a ，3 , 5 二羟基甲苯诱导菌株合成漆酶的主要组分为同工酶b ，而愈创木酚和阿魏酸能同时诱导几乎等量活性的漆酶a 和b 合成。分别研究了不同浓度的邻甲苯胺、愈创木酚和3 , 5 二羟基甲苯对菌株生长和漆酶同工酶合成的影响。以邻甲苯胺诱导的菌株发酵上清液为初始材料，经过d e a e s e p h a r o s ef f 、s u p e r d e x 2 0 0 和m o n o q 柱层析三个色谱步骤将主要活性组分漆酶a 分离纯化至电泳均一。纯化的漆酶a 溶液呈蓝色，拥有全部三型铜原子，s d s p a g e 法测得酶亚基分子量6 2k d a ，f p l c 法和m a l d i- t o f 质谱法测得活性态酶分子量分别为5 7k d a 和5 8 5 2 2d a ，分子中含有约li - 1 2 的碳水化合物。酶的等电点为4 2 ，氧化愈创木酚的最适反应p h 值为4 5 ，最适温度为5 0 c ，在7 5 时半衰期为2 7r a i n ，在p h 4 ，0 - , 8 0 范围内稳定性较好。以3 ，5 - 二羟甲苯诱导的菌株培养上清液为材料，经过两个色谱步骤将主要酶活性组分漆酶b 分离纯化至电泳均一。该酶也具有典型的漆酶光吸收特征。s d s p a g e法、f p l c 法和m a l d i - t o f 质谱法测褥它的分子量分裂为7 4 k d a 、7 2 k d a 和7 1 4 5 4 d a ，分子中含有2 5 的碳水化合物。酶的等电点为4 0 ，氧化愈创木酚的4 中国科技大学博士论文肖亚中：真茵漆酶研究最适反应p h 值为4 7 5 ，最适温度为4 5 。c ，在6 0 。c 时半衰期为1 4 0 m i n ，在d h 3 5 7 5 范围内稳定性较好。漆酶a 氧化a b t s ( 2 , 2 一a z i n o - d i -( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n es u l f o n i c a c i d ) 、愈创木酚和二甲氧基苯酚的分别为2 5 、4 2 0 和2 5 51 t m o l l ，其对应的a ) 【分别为6 7 0 、6 6 8 和7 9 n o l m i np e rm g 。漆酶b 氧化愈创木酚、a b t s 、丁香醛连氮和二甲氧基苯酚四种底物的j 乙值依次为1 7 7 0 、2 8 0 、1 2 4 9 0 和1 0 9 8 l a m o l l ，对应的。分别为1 9 1 0 0 、5 0 4 0 和1 1 7 4和1 5 9 0p m o l m i np e rm g 。根据测定的漆酶a 蛋白n 末端氨基酸序列信息，应用p c r 法从真菌基因组克隆了它的基因序列。克隆的漆酶基因是一新序列，它与c o r i o l u sh i r s u t u s 漆酶基因有8 7 相似性，推测其拥有1 0 个内含子，编码一个r 、厂约由5 0 0 个氨基酸构成的成熟单体多肽蛋白。万|研究了游离的漆酶a 对2 , 6 二氯酚、2 , 4 ，6 三氯酚和芴三种化合物的氧化作用。实验表明，2 0 u 的漆酶a 能在6 h 内完全氧化1 0 0 i t m o l l 2 , 6 二氯酚、2 , 4 ，6 三氯酚，但酶对2 ，4 ，6 三氯酚的氧化速率稍快于2 , 6 二氯酚。在1m m o l la b t s和1 一羟基苯并三唑( h b t ) 存在的条件下，1 5 0u 的漆酶a 在1 8h 内能氧化7 0 的芴。当反应混合物中缺乏a b t s 和h b t 时，未检测到芴含量有明显减少。以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂进行了漆酶a 的固定化研究。确定的酶固定化适宜条件为：o 1g 壳聚糖与1 5 m l5 戊二醛交联8h 后，加入3 0 0u 酶固定1 2h 。在此条件下获得的固定化漆酶催化能力为1 7 6 4u g 载体，酶活回收率5 8 5 。与游离酶相比，固定化漆酶与愈创木酚的亲和力降低，但固定化酶的稳定性有明显改善义固定化漆酶的最适温度为5 5 。c ，比游离酶提高5 ；7 0 c 条件下保温8h ，固定化酶保留酶活5 6 5 ，而在相同条件下游离酶酶活明显下降，4h 酶活损失达9 9 以上。使用固定化漆酶反应装置进行酚类化合物转化实验，连续进行1 2 批次操作，固定化酶酶活仍保持6 0 以上，漆酶使用效率明显提高。这表明新分离的菌株及其产生的漆酶具有潜在工业应用价值。y关键词：丹硎啦蛐p 正渤弋漆酶，基因克隆酶固定化。s 一主里型垫垄兰堡主丝查堕垩! 盎堕查堕! 堕l 一第一部分文献综述第一节漆酶及漆酶来源一、什么是漆酶漆酶( 1 a c c a s e ) 又称苯二醇：氧氧化还原酶( e c l 1 0 3 2 ) ，是一类含铜的多酚氧化酶，它能催化一系列有机和无机化合物发生一个电子氧化，同时伴随有氧还原成水( t h u r s t o n1 9 9 4 ) 。漆酶以氧作为终电子受体，其作用底物的专一性不强，基本上与对苯二酚( p d i p h e n 0 1 ) 结构相似的化合物都能被其氧化，如多种酚类、胺类及其它金属复合物等。在一定条件下，少数真菌漆酶还能以单酚( 甲酚) 和抗坏血酸为底物，使其发生氧化反应。但漆酶不能氧化转化酪氨酸。二、漆酶的分布漆酶与植物抗坏血酸氧化酶( a s c o r b i ca c i do x i d a s e ) 、动物血浆铜蓝蛋白( c e r u l o p l a s m i n ) 同属于铜蓝氧化酶家族，是一个古老的氧化还原酶。1 8 8 3 年日本学者y o s h i d a 首次在日本漆树( r h u sv e r n i c i f e r a ) 树汁中发现漆酶，1 8 9 7 年l a b o r d e报道在真菌中也有漆酶，此后的许多年里，又分别在细菌( c l a u s1 9 9 7 ) 、昆虫( k r a m e r2 0 0 1 ，h o p k i n s1 9 9 2 ) 、特别是在大量的高等真菌菌株中检测到了漆酶的存在。白腐真菌是自然界中最主要的漆酶生产者，约有7 0 种不同来源的白腐真菌菌株已经被鉴定能产生漆酶，其中绝大部分为担子菌( 约占8 0 ) ，其次为子囊菌( 约1 5 ) ，极少数为半知菌和其他低等真菌( 约4 ) ，尚未在酵母菌中发现有内源性漆酶。到目前为止，仅有5 株细菌被鉴定能合成漆酶样活性蛋白质，且细菌漆酶在理化性质上与真菌漆酶有较明显差异( o i v a u d a n1 9 9 3 ，c l a u s1 9 9 7 ) 。第二节漆酶的诱导与合成根据漆酶的合成方式及其与菌体生长的时相关系，可将真菌漆酶分为组成型漆酶( c o n s t i t u t i v el a c c a s e ) 和诱导型漆酶( i n d u c i b l el a c e a s e ) 。组成型漆酶的合成贯穿于菌体生长各个阶段，不因菌龄改变而停滞。诱导型漆酶的合成一般发生于菌6 -望鲨垄兰堡主笙查堕垩主! 墨堕查堕翌壅一一体生长代谢次级阶段，易受环境条件( 特别是诱导物) 的影响。许多真菌菌株既能合成组成型漆酶，又能合成诱导型漆酶。几乎每个菌株均能合成多种漆酶同工酶，如灰葡萄孢菌( b o t r y t i sc i n e m a ) 能合成3 个漆酶同工酶，p h i z o c t a n i as o l a n i 和f u s a r i u m p r o l i f e r a t u m 菌株分别至少能分泌4 个漆酶同工酶，p l e u r o t u ss a j o r 一皑胁有5 种漆酶同工酶，其中1 种为组成型，其它4 种为诱导型( s o d e n2 0 0 1 ) ，而m a n s u r 等人报道的白腐菌1 6 2 至少能合成7 个漆酶同工酶( m a n s u r l 9 9 7 ) 。另外，同一菌株产生的漆酶同工酶在理化性质上彼此之间存在的差异不一，有的高度相似，有的具有较低的序列相似性，在作用底物专一性、碳水化合物含量及其组成、最适反应温度和p h 值等性质上有明显不同。影响真菌漆酶合成的生理条件包括碳、氮营养源，溶解氧，重金属和芳香族化合物等。通常情况下，使用营养丰富的碳、氮源培养有利于获得较高的漆酶酶活( g a | h a u p2 0 0 2 ，k w a n1 9 9 9 ) ，但诱导型漆酶合成的启动往往开始于发酵培养基中碳源营养物质( 如葡萄糖) 的浓度趋近于零。真菌是好氧微生物，氧是真菌生长的限制因素之一，液体发酵培养过程中适量供氧有利于漆酶合成，但溶氧过多有时会使漆酶产率降低( r e h m a n1 9 9 2 ) 。铜是漆酶蛋白的结构组分，也是漆酶合成的诱导剂，它能有效提高多种真菌漆酶同工酶产量( p a l m i e r i2 0 0 0 ) 。一些与木素结构单元类似的小分子芳香化合物，作为漆酶合成诱导剂亦被广泛用于提高酶产量( g i a n f r e d a1 9 9 9 ) ，如苯胺化合物和木素制备物是较早使用的漆酶合成诱导剂，2 ，5 二甲代苯胺( 2 ，5 x y l i d i n e ) 对于多数真菌是最有效的( 表1 1 ) 。2 ，5 一二甲苯胺于1 9 5 8 年首次被报道用于诱导担子菌云芝( t r a m e t e sv e r s i c o l o r ) 漆酶的合成。f a h r a e u s 和r e i n h a m m a r ( 1 9 6 7 ) 报道使用该化合物能使云芝漆酶的酶活提高1 6 0倍以上。除此之外，2 ，5 二甲苯胺还能有效刺激f o m e s a n n o s u m 、b o t r y t i sc i n e m a 、p h o l i o t am u t a b i l i s 和p h l e b i ar a d i a t a 等木腐真菌的漆酶合成。一些环境条件如培养温度、光照时间等，也能对菌株生长及其漆酶合成产生影响。如r e h m a n ( 1 9 9 2 ) 报道蜜环菌漆酶和p a l m i e r ( 1 9 9 7 ) 报道侧耳菌( 尸髓u r o l u so s t r e a t u s ) 漆酶的有效合成是在避光条件下进行的。7 -里型垫垄芏堡圭笙查堂垩二墨堕堡堕堑查一表1 1 一些常用真菌漆酶合成诱导剂名称使用诱导的菌株文献第三节真菌漆酶的一般理化性质典型的真菌漆酶是分子量为5 0 8 0k d a 的酸性单体蛋白质，拥有四个铜原子，等电点p i 值为3 5 4 5 、含糖约1 5 3 0 ( t h u r s t o n1 9 9 4 ) ，但来自二孢蘑菇臼g a r i c y u sb i s p o r u s ) 和a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 的漆酶则是由2 个相同亚基构成i f 3 - -聚体，其全酶分子量分别为1 0 0 和1 1 0k d a ( w o o d1 9 8 0 ，k u r t z1 9 8 2 ) ；而禾顶囊壳菌( g a e u m a n n o m y c e sg r a m i n 括) 和子囊菌( p o d o s p o r aa n s e r i n a ) 漆酶各由3 个和4 个亚基构成，其分子量分别为1 9 0 和3 9 0k d a ( e d e n s1 9 9 9 ，d u r r e n s1 9 8 1 ) 。铜是真菌漆酶发挥催化作用不可缺少的辅基，根据光谱和磁学特征，可将漆酶分子中的4 个铜原子分为i 、i i 和i i i 型，其中，i 型铜的电子顺磁共振( e l e c t r o np a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e ，e p r ) 参数a i l = 4 3 - 9 5 x 1 0 - 4 c m - 1 ，由于在6 0 0r i m 左右有光吸收，使漆酶呈现“蓝色”；i i 型铜没有可以检测的光吸收，其e p r 参数a = 1 5 8 2 0 1 l o - 4 c m - 1 ( 图1 - 1 ) ；i i i 型铜在3 3 0n m 左右有一宽的吸收肩峰，能被光谱检测( 图1 2 ) 。也有一些真菌漆酶分子中仅检测到2 个铜原子，如来自射脉菌( p h l e b i ar a d i a t a ) 和侧耳菌( p l e u r o t u s f l o r i d a ) 等菌株的漆酶，它们拥有i 、i i 型铜，但缺乏i i i 型铜的信号( n i k u - p a a v o l a1 9 8 8 ，d a s2 0 0 1 ) 。而在木腐真菌p h e l l i n u sr i b i s 中，其漆酶拥有1 个铜原子，1 个锰原子和2 个锌原子，缺少i 型铜( m i n 2 0 0 1 ) 。8 里型垫查兰堡主堡查堕垩兰_ 盎堕查壁堡壅一在p 如“m f 淞d s t r e a f 淞，其漆酶p o x a l 拥有1 个铜原子，1 个铁原予和2 个锌原子，在4 0 0n m 有明显吸收峰( p a l m i e r i1 9 9 7 ) 。由于缺少i 型铜，这2 个酶均不能显示漆酶特征的兰色，而是“白漆酶”。来自p h l e b i ar a d i a t a 的漆酶由于被木素衍生物“修饰”，则成为“黄漆酶”( l e o n t i e v s k y1 9 9 7 ) 。聃t f _ 广r 惭图1 1 漆酶电子顺磁共振图f i g 1 - 1e p rs p e c t r u mo f l a c c a s e ( 引自e g g e r t1 9 9 6 )图1 2 典型的真菌漆酶光谱图f i g 1 - 2a b s o r b a n c es p e c t r u mo f f u n g a ll a e c a s e ( 引自f u g u s h i m a1 9 9 5 )- 9 垦翌垫查兰壁主笙查堕垩士! 墨萱查堕竺查一不同来源的真菌漆酶在底物专一性、最适反应温度和p h 值以及热稳定性等方面存在较大差异，其催化反应的动力学常数因所选择底物不同而改变。漆酶作用的底物相当宽泛，按化学结构不同可将其分成7 类，包括( 1 ) 酚类及其衍生物：主要为对苯二酚和邻苯二酚等多元酚及其衍生物。( 2 ) 芳香胺及其衍生物；结构类似于酚类底物，主要为多氨基苯及其衍生物。( 3 ) 多环芳烃和杂环类化合物：如蒽( a n t h r a c e n e ) 、苊( a c e n a p h t h e n e ) 、芴( f l u o r e n e ) 及咔唑、n 一乙基咔唑等。( 4 )羧酸及其衍生物：一般指在芳环羧酸基的邻位或对位连有羟基、氨基或烷氧基的芳香酸，碳链上连接有酚或非芳胺基团的非芳香酸，如原几茶酸和对香豆酸等。( 5 ) 甾体激素和生物色素，如0 c 巧日胞激素和雌三醇等。( 6 ) 偶氮类人工合成色素，如活性橙9 6 ( r e a c t i v eo r a n g e9 6 ) 、活性黑5 ( r e a c t i v eb l a c k5 ) 和活性紫5 ( r e a c t i v ev i o l e t5 ) 等。( 7 ) 金属有机复合物及其他非酚型底物，如二茂铁及其衍生物等。人工合成化合物丁香醛连氮( s y r i n g a l d a z i n e ) ，和a b t s ( 2 ，2 a z i n o d i 一( 3 - e t h ) ，l b e n z t h i a z o l i n es u l f o n i ca c i d ) 是大多数真菌漆酶的最适作用底物，其催化这两个底物反应的j 乙值在微摩尔级。2 ，6 二甲氧基苯酚、丁香酸和愈创木酚也常用于漆酶活性测试，