（生态学专业论文）pb2胁迫下宝山堇菜（viola+baoshanensis）中差异表达cdna筛选.pdf

i = l = 1 山大学硕士论文 p b 2 + 胁迫下宝山堇菜( v i o l ab a o s h a n e n j 妇) 中差异 表达c d n a 筛选 专业：生态学 作者：周颖 导师：束文圣 摘要 转基因植物修复技术已经成为当前重金属修复技术中的一个重要策略。但由 于重金属耐受及富集相关基因资源的缺乏、对植物富集耐受重金属的分子机制及 生理基础还缺乏详细全面的理解，限制了基因工程技术在植物修复上的应用。本 研究利用抑制消减杂交技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n , s s h ) ，筛选p b 诱导下宝山堇菜中差异表达的c d n a ，进而鉴定其中的与p b 耐受与富集相关的基 因，以期从分子水平上为揭示宝山堇菜富集p b 的机制提供理论参考。 论文选取本研究室首次发现报道的c d p b 超富集植物宝山堇菜( v i o l a b a o s h a n e n s 打) 为研究材料，以1 0 0m g lp b 2 + 处理4 8h 的宝山堇菜根部m r n a 为 检测子( t e s t e r ) ，对照组根m r n a 为驱赶子( d r i v e r ) ，利用抑制消减杂交技术， 以t - e a s y 为载体，转化j m l 0 9 感受态细胞，构建了p b 2 + 胁迫下宝山堇菜差异表 达e d n a 文库。从文库中随机挑选了1 8 2 个阳性克隆进行测序，获得3 4 个有意义 的无重复的c d n a 片断，大小区间为2 9 0 7 8 4b p 。对插入片段的b l a s t n 结果及比 对分析后，根据其功能，这些e s t 可分为6 类：1 ) 抗氧化相关：2 ) 胁迫蛋白：3 ) 蛋白降解相关；4 ) 信号转导相关；5 ) 代谢相关；6 ) 未知功能片段，同源相似性均在 8 0 以上。 i i l u 大学硕士沦文 对宝山堇菜分别用对照、4 0m g lp b 2 + 、3 0m g lc d 2 + 和2 0m mh 2 0 2 进行处 理，对其中2 4 个克隆进行点杂交，结果显示这些e s t 在p b 2 + 胁追下均有表达，表 明这些e s t 来源于宝山堇菜。对不同浓度( 对照、5 0 、1 0 0 、2 0 0m g lp b 2 + 处理) 和不同时间( 对照、2 4h 、4 8h 、9 6h 处理) 的样品提取总r n a ，进行n o r t h e r n 杂 交。结果显示与j pv u l g a r i sh s p 7 0 ( 热激蛋白7 0 ，h e a ts h o c kp r o t e i n7 0 ) 基因相似性 达9 0 的3 号克隆在宝山堇菜叶中随着处理时间的延长表达量逐渐增加，至4 8h 最大，9 6 h 开始下降，在根中6h 处理开始表达，4 8h 表达量较高，9 6h 表达量 降低。与e l a e a g n u sg s ( 谷氨酰胺合成酶，g l u t a m i n es y n t h e t a s e ) 基因相似性达8 2 的1 3 8 号克隆n o r t h e r n 杂交图显示，在时间梯度和浓度梯度条件下根中表达较低， 但在叶中却随着处理时间和浓度的增加，表达量开始增加。表明这两个克隆在宝 山堇菜铅胁迫下为上调表达基因。 上述研究结果初步表明，宝山婪菜对重金属p b 2 + 耐受与富集的生理与分子机 制是多基因控制的，涉及抗氧化、胁迫蛋白、蛋白降解、信号转导、代谢相关过 程的基因的联合响应，但其在p b 2 + 耐受与富集作用中的详细机制还需进一步的研 究。 关键词：宝山堇菜，铅胁迫，抑制消减杂交，点杂交，n o r t h e r n 杂交 i i i 中山大学硕士论文 s c r e e n i n go fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s i nv i o l ab a o s h a n e n s i s u n d e rp b 2 + s t r e s s z h o uy i n g m a j o r ：e c o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f s h uw e n s h e n g d ll i a o b i n a b s t r a c t c u r r e n t l y , i d e n t i f i c a t i o no ft h em e t a lr e s i s t a n c e r e l a t e do ra c c u m u l a t i o n - r e l a t e d g e n e sa n dg e n e t i ce n g i n e e r i n gh i g h b i o m a s sp l a n t sw i t ht h e s eg e n e sh a v ea l r e a d y b e e no n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t r a t e g i e sf o rp h y t o r e m e d i a t i o n h o w e v e r t h e l a c k i n go fg e n er e s o u r c e sr e l a t e dh e a v ym e t a lr e s i a a n c eo ra c c u m u l a t i o ni np l a n t s r e s t r i c t si t sa p p l i c a t i o n i nt h ep r e s e n tr e s e a r c h t od e n t i f i e st h eg e n e sr e l a t e dt op b 2 + t o l e r a n c e h y p e r a c c u m u l a t i o n i ni i o l a b a o s h a n e n s 括，s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ( s s h ) w a su s e dt oi s o l a t et h ep b 2 + r e s p o n s i v eg e n e su n d e rp b 2 + s t r e s s i nt h ep l a n t t h ec d 2 + p b 2 + h y p e r a c c u m u l a t o rb a o s h a n e n s 括f r o mh u n a np r o v i n c e ，w h i c hw a s i d e n t i f i e d b y o u rl a b o r a t o r y , w a su s e di n t h i s e x p e r i m e n t u s i n gs u p p e r s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) t e c h n i q u e ，t h ed i f f e r e n c eo ft h em r n ab e t w e e nt h e r o o t so fb a o s h a n e n s 血w h i c hg r o w ni nq u a r t e ro fh o a g l a n d ( e x c e p tm g s 0 4a n d k h 2 p 0 4 ) 1 0 0m g r lp b 2 + f o r4 8h ( t e s t e r ) a n dr o o t so fb a o s h a n e n s i sw h i c hg r e wi n q u a r t e ro fh o a l a n d ( e x c e p tm g s 0 4a n dk h 2 p 0 4 ) f o r4 8h ( d r i v e r ) w e r ec o m p a r e d t h em i x t u r eo fs u b t r a c t e dd n af r a g m e n t sw a sc l o n e di n t ot - e a s yv e c t o ra n d t r a n s f o r m e di n t oec o l ij m l 0 9t oe s t a b l i s ht h es u b t r a t i v ec d n al i b r a r yi nv i o l a i v 叫1 山大学硕：仁沦文 b a o s h a n e n s 括t op b 2 + s t r e s s t o t a l18 2p o s i t i v ec l o n e sw e r es e l e c t e dr a n d o m l ya n d s e q u e n c e d 3 4d i f f e r e n tc d n af r a g m e n t sw e r eo b t a i n e dv i as e q u e n c e sa n a l y s i so f e d n ai n s e r t s ，a n dt h el e n g t ho fi n s e r t sw e r er a n g e d2 9 0t o7 8 4b p t h e yw e r e c l a s s i f i e di n t os i xd i f f e r e n tg r o u p sa c c o r d i n gt ot h e i rf u n c t i o n ：i ) a n t i - o x i d a t i v e ；2 ) s t r e s sp r o t e i n ；3 ) p r o t e i nd e g r a d a t i o n ；4 ) s i g n a lc o n d u c t i o n ；5 ) m e t a b o l i s m ；6 ) u n k n o w ng e n e s t oi n v e s t i g a t eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n su n d e rs t r e s s ，2 4c l o n e sw e r es e l e c t e df o r d o t b l o ta n a l y s i s t o t a lr n aa n dm r n aw e r ee x t r a c t e df r o mv i o l ab a o s h a n e n s i s ( c o n t r l ，4 0m g lp b 2 + ，3 0m g lc d ”a n d2 0m mh 2 0 2t r e a tp l a n t ) t h er e s u l t ss h o w t h a ta l lt h e s ee s t se x p r e s s e di nt h ep l a n tu n d e rp b 2 + s t r e s sh s p 7 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n 7 0 ) a n dg s ( g l u t a m i n es y n t h e t a s e ) w e r es e l e c t e df o rn o r t h e r nb l o ta n a l y s i s m r n a w e r eh y b r i d i z e df r o mb a o s h a n e n s i su n d e rc o n t r o l ，p b ”s t r e s s ( 5 0m g l ，1 0 0m g l ， 2 0 0m g l ) w i t h4 8ha n d10 0m g lp b 2 + ( 6h ，4 8h ，9 6h ) n o r t h e r nb l o ta n a l y s i s r e v e a l e dt h a tt h eh s p 7 0a n dg sw e r eu p r e g u l a t e de x p r e s s i o nu n d e rp b 2 + s t r e s s t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h em e c h a n i s m so fp b l r e s i s t a n c ea n dh y p e r a c c u m u l a t i o n i nb a o s h a n e n s 如m a yb ec o n t r o l l e db yal o to fg e n e s ，w h i c ha r ei n v o l v e d i n a n t i o x i d a t i v ep r o c e s s e s ，s t r e s s - r e l a t e dp r o t e i n , p r o t e i nd e g r a d a t i o n , s i g n a lc o n d u c t i o n ， m e t a b o l i s m sa n ds oo n h o w e v e r , f u r t h e rr e s e a r c hi sn e c e s s a r yt oi d e n t i f yt h es t r i n g e n t m e c h a n i s mw i t hp b ”r e s i s t a n c ea n dh y p e r a c c u m u l a t i o ni nt h ep l a n t k e y w o r d s ：v i o l ab a o s h a n e n s i s ，p b 2 + s t r e s s ，s s h ，d o t b l o t ，n o r t h e r nb l o t ， v 中山大学硕士论文 b p c d n a d e p c d n a d t t e d l a i p t g l b b _ m e p c r p o d s o d c a t r n a s d s s s h 1 a e u x g a l 缩略词表 b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e j ca c i d d i t h i o t h r e i t o i e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d i s o p r o p y l - b d - t h i o g a l a c t o s i d e u b r i ab r o t h p _ m e r c a p t o e t h a n o l p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e r o x i d a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e c a t a l a s e r i b o n u c l e i ca c i d s o d i u md o d e e y ls u l f a t e s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n t r i s a c e t i ce l e t r o p h o r e s i s u n i t 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l b - d g a l a c t o p y r a n o s i d e 碱基对 互补脱氧核糖核酸 焦炭酸二乙酯 脱氧核糖核酸 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 丙基- - 1 3 - - d - - 硫代半乳糖营 l b 培养基 b 巯基乙醇 聚合酶链式反应 过氧化物酶 过氧化物歧化酶 过氧化氢酶 核糖核酸 十二烷基磺酸钠 抑制消减杂交 乙酸电泳缓冲液 酶活力单位 5 溴4 一氯3 吲哚凸半乳糖苷 中山大学硕士论文 1 、前言 含p b 的污染物通过污水灌溉、污泥利用、农药和化肥的施用、大气沉降等途 径进入到土壤环境中，造成了严重的土壤污染( 蒋定安等，2 0 0 2 ；郭义龙等，2 0 0 3 ) 。 含p b 污染物不仅影响土壤微生物、土壤酶活性以及土壤的理化性质( 刘霞等， 2 0 0 3 ：k h a n 等1 9 9 8 ) ，而且会对农作物产量和质量产生影响，甚至通过食物链危 害人类的健康。考虑到p b 对人体的危害以及土壤p b 污染的普遍性和严重性，如 何修复p b 污染土壤已成为世界各国科学家的研究热点。植物修复技术作为一种新 兴的、高效的生物修复途径现已被科学界和政府部门认可和选用。有关耐重金属 植物与超富集植物的研究逐渐增多，植物修复作为一种治理污染土壤的技术被提 出并得到广泛应用。 目前关于重金属p b 的植物修复技术己引起广泛关注。一般而言，超富集植物 具有低生物量。生长缓慢，繁殖不易等局限性，因而对超富集植物展开生理生化 以及分子生物学的研究，揭示其对重金属的吸收、转运、隔离、贮存以及外泌过 程机理，将有助于提高这些植物对重金属的提取效率，同时也可通过这些植物重 金属直接相关基因资源的克隆和鉴定，进而转入大生物量、广分布的植物中，从 而推动基于超富集植物的重金属污染植物修复技术的发展和实际应用。 1 1p b 的植物毒性 1 1 1 影响生长发育 一般认为生长在p b 污染土壤上的植物直接受害的器官是根系，在形态上变现 为侧根数目减少，根系生物量和体积下降。不同浓度的p b 2 + 处理对植物根系的生 长均有抑制作用，而且浓度越高对根系生长的抑制作用越强。培养介质中 p b 2 + = 1 0 。4 m o l l 就会对植物根系的生长造成明显抑制( d o n g h u a 等，1 9 9 4 ) 。种子 萌发期和幼苗期极易受到pb ：h 的毒害，萝h 、白菜种子的萌发率随p b 2 + 处理浓度 的增高而下降( 周鸿等，1 9 8 9 ) ，p b 2 + 毒害作物出苗缓慢，随着毒害程度的加深和 毒害时间的延长，p b 2 + 使水的吸收量减少，耗氧量增大，阻碍植物生长，甚至引 起植物死亡( c h e t t r i 等，1 9 9 8 ) 。 l a n e 等( 1 9 7 8 ) 认为p b 2 + 抑制植物生长可能与生长素诱导的细胞生长有关，也 中山大学硕十论文 有人认为p b 2 + 阻碍细胞生长的最初原因是p b 2 + 诱导了氧化念i a a 的生成 ( m u k h e r j u 等，1 9 7 6 ) 。m e a n s 等( 1 9 8 0 ) 发现细胞有丝分裂时钙调素( c a m ) 特征 性的出现在纺锤体中，并在染色体运动过程中调节微管的聚合与分开。w a l l a c e 等 f 1 9 9 6 ) 认为p b 2 + 胁迫下的根系细胞质膜外表面结合位点上的c a 2 + 可能被p b 2 + 所取 代。l i u 等( 1 9 9 4 ) 观察到植物a l l u mc e p a 的根细胞进行有丝分裂时，p b 2 + 处理造成 染色体损伤出现秋水仙碱阻断有丝分裂，并在分裂后期出现桥接。由此推断秋 水仙碱阻断有丝分裂现象的发生可能是由于c a 2 + 与p b 2 + 竞相吸收，阻止c a 2 + 的跨 膜内流，使钙调素( c a m ) 和c a a t p 酶不能被激活。从而阻断了有丝分裂的进 行，最终表现为根系生长受抑，植物对其它营养成分的吸收减少，进而影响了整 个植物的生长发育。 也有报道表明低浓度的p b 2 + 能够促进植物的生长( 夏增禄等，1 9 8 4 ；周毅等， 1 9 8 6 ) 。当然不同植物其受刺激的p b 2 + 浓度的范围也是不同的。b e g o n t a 等( 1 9 9 8 ) 用1 0 0 、2 5 0 、5 0 0m g lp b ( n 0 3 ) 2 处理印度芥菜，发现在1 0 0m g lp b 2 + 处理促进了 根系的生长，表现为生物量比对照有所增加，但在高p b 2 + 处理水平下，根系的生 物量显著下降。本实验室在对宝l h 堇菜水培实验中也发现类似的这种现象：即宝 t i 堇菜水培试验时，一定浓度的铅处理样品与对照和其它重金属处理相比较，生 物量显著上升。由此推测p b 2 + 对超富集植物来讲是一种促进生长的因子。一方面， 植物在低p b 2 + 胁迫下应激产生保护作用，通过加速生理生化活动，产生大量的代 谢产物，同重金属络合来解毒；另一方面，激活的代谢系统也加速了对重金属的 吸收，反过来又抑制了植物的代谢活动。在低p b 2 + 胁迫下，植物的适应性反应大 于重会属的毒害作用，表现出“积极”的结果；而在高p b 2 + 胁迫下时，后者大于前 者，从而表现“消极”的抑制作用。 1 1 2 影响植物的生理生化指标 对叶绿素含量及光合系统的影响 过量p b 2 + 进入植物体内，破坏生物膜的结构，导致叶绿体，线粒体及细胞核 等重要器官的损伤( 彭呜等，1 9 9 1 ；c h e t t r i 等，1 9 9 8 ) ，影响光合作用、呼吸作 用以及碳水化合物代谢等过程，最终导致植物生长减缓甚至死亡。p b 2 + 处理使叶 绿体的显微结构发生变化，主要表现在基粒类囊体结构的解体，基质明显减少， 中山大学硕士论文 代之以大量的质体小球，它们类似于叶绿体衰老时所表现的结构。m i l e 等( 1 9 7 2 ) 用p b 2 + 处理菠菜叶片离体叶绿体，发现光系统i i 的活性受到严重的影响，而在处 理浓度相同的情况下，光系统i 的活性不受影响。已有许多报道表明p b 2 + 胁迫下 植物的叶绿素含量减少( w o x n y 等，1 9 9 3 ：k a s t o r i 等，1 9 9 8 ) 。p b 2 + 处理抑制了叶 绿素的生物合成( s i n h a 等，1 9 9 3 ) 。p a r a s a d 等( 1 9 8 7 ) 认为，p b 2 + 胁迫条件下叶绿 素含量的下降可能是由于高浓度的p b 2 + 破坏叶绿素合成过程并影响了叶绿素酶的 活性。k u p p e r 等( 1 9 9 6 ) 的研究发现，叶绿素分子中的m 9 2 + 可被包括p b 2 + 在内的 多种重金属所替代，并认为这是植物在胁迫条件下的伤害机制之一。此外，在胁 迫条件下，叶绿体结构的破坏也会导致叶绿素含量的减少( 徐勤松等，2 0 0 2 ) 。 p b 对植物体内酶系统的影响 研究表明，不同植物对p b 2 + 胁迫的响应不同，随着p b 2 + 处理浓度增加，臃菜 叶片s o d 、p o d 活性呈现出先升高后降低的趋势( 时忠杰等，2 0 0 2 ) 。各植物体 内m d a 含量则表现为随p b 2 + 处理浓度提高而不断增加的趋势( 时忠杰等，2 0 0 2 ； 唐咏等，2 0 0 1 ；王东红等，2 0 0 2 ) 。l e e 等( 1 9 7 6 ) 测定了p b 2 + 处理对大豆叶片中 几种酶活性的影响，结果是淀粉酶活性增强，谷氨酰胺合成酶活性降低，酸性 磷酸酶、过氧化酶活性增加。 p b 胁迫对植物质膜相对透性的影响 植物细胞通过细胞膜来传递信息、能量，进行水分、养分以及各种离子的运 输，细胞膜是植物细胞极重要的组成部分，由于质膜是有机体与外界环境的界面。 所以植物细胞质膜首先接触到重金属，相应地重金属首先并直接影响到细胞质膜。 p b 2 十浓度越高，胁迫时间越长，对植物细胞质膜的选择透性、组成、结构和生理 生化功能等的伤害就越大。李春荣等( 1 9 9 7 ) 的研究表明，通过用质膜透性变化 表示细胞膜受损害的程度。随着p b 2 + 胁迫浓度的增大，质膜透性逐渐增大，1 0 0 m e c lp b 2 + 处理时电导率较对照下降了2 1 9 ， 而2 5m 扎p b 2 十处理的较1 0m l p b h 处理的上升幅度 l t d , ，仅比1 0m g lp b 2 + 处理的上升了3 7 ，这与m d a 的 变化趋势相似。究其原因，可能与s o d 、p o d 和类胡萝h 素的活性氧清除能力有 关。 中山大学硕士沦文 1 2p b 的超富集植物 普遍认为富集重金属含量超过一般植物1 0 0 倍的植物属于超富集植物，即 c r 2 十、c 0 2 + 、n i + 、c u “、p b 2 + 含量应在1 0 0 0m 啦g 以上。目前，p b 的超富集植 物被发现的并不耋；( r e e v e s 等，2 0 0 0 ) 。自然界中多数植物对p b 2 + 的吸收能力很低， 普通植物一般p b 2 + 含量为l of r 叭g 干重( m c g r a t h 等，2 0 0 0 ) 。而且，由于p b 2 + 特 殊的化学性质( p b ”有很高的负电性，被认为是弱l e w i s 酸，易与f e 、a i 、m n 氧化物、有机质和碳酸盐形成共价键) ，土壤中的p b 2 + 不易被植物吸收，即使p b 2 + 进入植物根系也只有很少部分能向地上部转移。仅见的几种p b 的超富集植物都是 生长在富含p b 2 + 和z n 2 + 的矿化土壤、采矿区和冶炼厂废弃物等处，见表l 。另有 研究发现，紫花苜蓿、羽叶鬼针草、酸模、白麻、芥子草和普通豚草对p b 2 + 也具 有很高的生物富集量，是很有利用价值的土壤p b 2 + 污染修复植物f 叶春和等，2 0 0 2 ； 刘秀梅等，2 0 0 2 ；周国华等，2 0 0 2 ) 。 表1 典型超，高富集植物中p b 2 + 最大含量( m g k g ) 本研究室在湖南省宝山金属矿废弃坑口发现堇菜科的一新种一宝山堇菜 ( 1 4 0 l ab a o s h a n e n s i s ) ，地上部和地下部对p b 2 + 的富集量分别为1 5 8 3 1 0 6 1 5m g k g ， 3 9 8 7 1 4 9 4 5m g k g ，初步认定为一种新的p b 高富集植物。 中山大学硕士论文 1 3 植物吸收累积p b 2 + 的机制 1 3 1 植物对p b z + 的吸收 根系是植物直接接触土壤的器官，也是植物吸收重金属的主要器官。p b 2 + 到 达根表面，主要有两条途径：一是质体流途径，即污染物随蒸腾拉力，在植物吸 收水分时与水一起达到植物根部；另一条途径是扩散途径，即通过扩散而到达根 表面。根系对p b 2 + 的吸收在前期是以表面吸附为主，吸附能力大小可能与根系的 吸附表面、吸附位点、平衡浓度有关。溶液中p b 2 + 浓度越高，根系吸附量相对越 多。在p b 2 + 被吸附到根表面后，主要是细胞的吸收过程和化学沉淀过程，该过程 只有活细胞才能进行。到达植物根表面的p b 2 + 进入植物体，有主动吸收，也有被 动吸收。 p b 2 + 一旦进入根系，可贮存在根部或运输到地上部。从根表面吸收的p b 2 + 能 横穿根的中柱，被送入导管，进入导管后随蒸腾流被动运输到地上部。一般认为 穿过根表面的p b 2 + 离子到达内皮层有两条途径：一是质外体途径，即p b 2 + 离子和 水在根内横向迁移，到达内皮层是通过细胞壁和细胞间隙等质外体空间；二是代 谢性的共质体途径，是一种代谢性的主动吸收过程，由a t p 酶和酸性磷酸酶提 供能量，通过细胞内原生质流动和通过细胞间相连接的细胞质通道。但由于内皮 层上有凯氏带，p b 2 + 离子不能通过，只有转入共质体后，才能进入木质部导管。 w o z n y 等( 1 9 9 5 ) 认为p b 2 + 进入中柱后随蒸腾流被动运输到地上部，运输 过程中由于p b 2 + 会与中柱内的阳离子交换位点而被固定在茎部中柱内。根部吸收 的p b 2 + 是植物体内p b 2 + 的主要来源，其在植物体内的累积与植物体内物质的结合 形态有关。进入根细胞后，p b 2 + 可游离态存在，当浓度过高的时候，会对细胞产 生毒害作用，干扰细胞的正常代谢，因而细胞质中的p b 2 + 会与细胞质中的有机酸、 氨基酸、多肽和无机物等结合，通过液泡膜上的运输体或通道蛋白转入液泡中。 因此，植物体内p b 2 + 的累积分配规律为：根 茎 叶 籽粒( 叶春和等，2 0 0 2 ； 匡少平等，2 0 0 2 ) 。从分子水平来看( 刘军等，2 0 0 1 ；叶春和等，2 0 0 2 ；江行玉等， 2 0 0 2 ) ，胞间隙是富集p b 2 + 浓度最高的部位，细胞壁和液泡次之，细胞质最低。刘 威( 2 0 0 4 ) 发现宝山堇菜a b 2 + 在根部横向运输以共质体和非共质体运输为主；p b 2 + 在叶肉细胞多形成颗粒，细胞壁是其结合的主要部位。 巾山大学硕十论文 周鸿( 1 9 8 6 ) 从组织水平探讨了玉米幼根吸收p b 2 + 及p b 2 + 的迁移途径，结果 表明到达玉米主胚根的p b 2 + 大部分被吸附在根表面，进入根的p b 2 + 总量很少。刘 云惠等( 1 9 9 9 ) 通过玉米根、茎、叶上的伤流、蒸腾等试验探讨了玉米对a b 2 + 的吸 收及运输机制。其结果也表明：p b 2 + 在植物体内活性较低，到达根部的p b 2 + 大部 分被固定，向地上部运输的比例较低，玉米吸收p b 2 + 经共质体途径定向运输进入 导管，是一个主动过程；另外大部分是通过自由p b 2 + 空问被根吸收。对于超富集 植物，金属阻隔在液泡中对其转运到地上部是不利的，因而在超富集植物的液泡 膜上可能存在一些特殊的运输体，能把暂时贮存在液泡中的余属装载到木质部导 管，但目前还缺乏直接的证据。 1 3 2 植物对p b 的耐性 植物通过改变根际化学性状、原生质泌溢等限制p b 2 + 离子跨膜吸收 在p b 2 + 胁迫下，植物可反馈分泌一些物质，如柠檬酸、苹果酸、乙酸、乳酸 等。这些物质与p b 2 + 离子可形成可溶性络合物抑制p b 2 + 的跨膜运输，增加p b 2 + 在 根际土壤的移动性，降低植物周围环境中p b 2 + 离子的有效含量，减少植物对p b 2 + 的吸收，从而避免植物受害。杨仁斌等( 2 0 0 0 ) 指出有机酸和氨基酸对土壤中重 金属a b 2 + 具有较强的活化效应，其中柠檬酸、酒石酸和草酸的活化能力最强。t a t a r 等( 1 9 9 8 ) 用p b 2 + 处理黄瓜幼苗，发现其茎部柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸的含 量发生变化，睨明这几种酸可能与v b 2 + 结合，并参与了p b 2 + 的运输。其他研究也 证实了这一说法( 李玉红等，2 0 0 2 ；罗春玲等，2 0 0 3 ) 。 与植物细胞壁结合 研究认为，植物细胞壁是重金属离子进入的第一道屏障，它的金属沉淀作用 是植物耐重金属的原因，这种作用能阻止重金属离子进入细胞原生质，而使其免 受危害。由于金属离子被局限于细胞壁上，不能进入细胞质影响细胞内的代谢活 动，使植物对重金属表现出耐性。只有当重金属与细胞壁结合达到饱和时，多余 的金属离子才会进入细胞质。黄瓜茎叶可溶性组分的凝胶层析及h p l c 的分析结 果表明，p b 2 + 大量沉积在细胞壁上( 杨居荣等，1 9 9 3 ) 。 形成p b 2 + 络合物 6 中山大学硕士论文 螫合是植物对细胞内重金属解毒的主要方式之一。当部分金属离子穿过细 胞壁和细胞膜进入细胞后，能和细胞质中的蛋白质、草酸、柠檬酸、苹果酸等形 成复杂的稳定螯合物，它们能使重金属的毒性降低。 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 是富含半胱胺酸残基的低分子量金属结 合蛋白( 刘小梅等，2 0 0 3 ) 。不同的p h 条件下，p b 2 + 与m t 结合成不同的p b 2 + m t 复合物( 贺卫国等，1 9 9 9 ) 。郝守进等( 2 0 0 1 ) 对金属硫蛋白的c t 、p 结构域与p b 2 + 结 合形式及稳定性的研究，揭示出结构域与p b 2 + 可产生两种形式的结合物，一种 为结合4 个p b 2 + 的m t ( p b 2 + 4 一n m t ) ，另一种则为结合7 个p b 2 + 的m t ( p b 2 + 7 一位m t ) ， 而b 结构域与p b 2 + 反应仅生成一种结合3 个p b 2 + 的产物( p b 2 + 3 一b m t ) 。李伟等 ( 2 0 0 1 ) 实验表明转基因植株对p b ：+ 的吸收分别比对照提高了2 8 和3 5 。由 此推测，金属硫蛋白对p b ：+ 的螯合作用使细胞质内游离p b 2 + 的浓度降低。 植物螫合肽( p h y t o c h e l a t i n s p c ) 是重金属胁迫下植物体内产生的一类结构与 m t 相似的、由酶催化合成的富含谷胱甘肽的多肽物质。p c 与金属离子螯合后 形成无毒的化合物，降低了细胞内游离的重金属离子浓度，从而能够减轻重金属 对植物的毒害作用。研究发现p b 2 + 可诱导s t i c h o c o cc u s b a c i l l a r i s ( p a w l i k - s k o w r o n s k a 等，2 0 0 0 ) 、h y d r i l l av e r t i c i l l a t a ( g u p t a 等，1 9 9 5 ) 和p h a e l d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ( m o r e l l i 等，2 0 0 1 ) 产生p c 与p b 2 + 螫合后形成无毒的化合物，从而减少p b 2 + 对细胞的损 伤。 酶系统的作用 正常情况下，植物体内的活性氧代谢保持平衡。当遭受重金属胁迫时，其体 内的活性氧代谢失调，活性氧水平上升，引起膜脂过氧化。目前，认为活性氧水 平升高导致的膜脂过氧化加剧是膜损伤的重要原因。植物体内存在清除活性氧的 抗氧化酶类系统，主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 和过氧 化氢酶( c a t ) 3 种酶类，其中s o d 是抗氧化酶系统中极为重要的金属酶，催化 快速歧化反应，在保护酶系统中处于核心地位。许多研究表明，p b 2 + 处理使植物体 内的抗氧化酶类活性发生变化( r u c i n s k a 等，1 9 9 9 ) 。严重玲等( 1 9 9 7 ) 的研究表明， 在p b 2 + 胁迫下，烟草体内的活性氧增加，诱导s o d 活性增强，当活性氧水平超 过s o d 的歧化能力极限时，过多的活性氧对多种功能膜及酶系统的破坏，导致 l _ | _ l 山大学硕士论文 s o d 活性急剧下降，甚至低于同一生育期的对照水平。 1 4p b 等重金属耐性富集相关基因的克隆、鉴定及转基因研究 超富集植物一般植株矮小，生长速度慢，在植物修复中很难具有实际应用价 值，而生长速度快、生物量大的植物往往对重金属耐性低，组织中富集量不高。 为解决这一矛盾，人们开始运用分子生物学和基因工程技术将能超富集或耐受重 金属相关的基因克隆入生长快速、生物量大、适应能力强的植物体，将能够大大 提高植物修复重会属污染土壤的能力。但首要要解决的就是从重金属超富集植物 或耐性植物中克隆分离出这些基因。目前对于p b 耐性及富集的相关基因报道的还 较少。主要是c d 、z n 、c u 等重金属耐性及富集相关基因。 利用c d n a 文库筛选和酵母功能互补技术在超富集植物中克隆出多种金属 运载蛋白基因，这些基因的过量表达对重金属在细胞中的运输、分布和富集以及 提高植物的抗性方面发挥了重要作用，从而使人们在分子水平上对植物重金属超 富集特性获得了进一步的了解。目前，已鉴定的金属阳离子运载蛋白家族主要有 c d f ( c a t i o nd i f f u s ef a c i l i t o rp r o t e i n s ) 家族、n r a m p ( n a t u r a lr e s i s t a n c ea s s o c i a t e d m a c r o p h a g ep r o t e i n s ) 家族和z i pf z i n ca n di r o nr e g u l a t e dt r a n s p o r t e rp r o t e i n s ) 家族 等( 朗明林，2 0 0 3 ) 。 目前与p b 富集或耐性相关基因的主要报道有： g r a v o t ( 2 0 0 4 ) 报道，将从 a r a b i d o p s i s 中分离出来的a t h m a 3 基因( 重金属a t p a s e s 家族的一员) 转入酵母 中表达，酵母表现出对p b 2 + c d 2 + 高耐性。s o n g 等( 2 0 0 4 ) 发现酵母y c f l 敲除突变体 d t y l 6 7 过表达y c f l 较野生型具更强的p b 2 + 、c d 2 + 抗性，转基因拟南芥过表达y ( f ， 显示y c f i 具功能活性同时能提高p b 2 + 、c d 2 + 耐性和积更大数量的p b 2 + 、c d 2 - 。 a t h m a 3 ( p 1 b a t p a s e ) 与g f p 融合表达表明a t h m a 3 定位于液泡膜上，可互补 p b 2 + c d 2 + 超敏突变体y s f l 细胞。此外，向烟草中转小麦p c s 基因t a p c s l 的研究， 转t a p c s l 烟草对p b 2 + 的耐性大大增强( c a r m i n ag i s b e r t 等，2 0 0 3 ；m a r t i n e z 等， 2 0 0 5 ) 。相关报道还有：1 ) 转基因n t c b p ( 类似哺乳动物环核苷门控阳离子通道) 的烟草对p b 2 + 的高度敏感，提高了p b 2 + 的累积量( r a m a n j u l u 等，2 0 0 0 ) 。 2 ) r e n s i n g 等( 1 9 9 8 ) 报道在细菌中存在一种p b 2 + 转运p 型a t p 酶3 ) c a d c a 操 纵子( 金黄色葡萄球菌质粒p 1 2 5 8 ) 表现对p b 2 + 的抗性。c a d a 基因编码一种p - t y p e 中山大学硕士论文 a t p a s e ，功能转运c d 2 + 、z i l = h 、p b 2 + ( r e n s i n g 等，1 9 9 8 ) 。 细菌a c c ( 1 - 氨基环丙 烷1 羧酸) 脱氨酶基因在3 5 s 启动子、农杆菌r o l l ) 启动子( 根特异表达) 或烟草 致病相关基因p r b 1 b 启动子等的驱动下在番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 中表 达可介导对c d 2 + 、c 0 2 + 、c u 2 + 、m 9 2 + 、n i + 、p b 2 + 的耐受与积累( g r i c h k o 等，2 0 0 0 ) 。 1 5 本研究目的、意义 本研究利用本研究室首次发现报道的一种新的p b 超富集植物，采用s s h 技 术拟将克隆出宝山堇菜中与p b 耐性相关的差异表达基因，探究其p b 耐性和富集 的分子机制，尝试为宝山堇菜用于p b 等重金属污染区的植物修复和植被重建提供 分子水平上的依据，以提高植物修复效率。并拟通过基因工程改良生物量大、生 长速率快的生物，培育出具p b 超富集特性的转基因品种，提高其对p b 等重金属 的耐性和富集效率，使利用植物控制p b 等重金属污染成为现实。 9 - i ，山大学硕：t 论文 2 、材料与方法 2 1 材料 2 1 1 植物材料 m s 培养基组培宝山堇菜( h o l ab a o s h a n e n s 括) 。 2 1 2 仪器设备 p t c 2 0 0 型p c r 仪( m jr e s e a r c h 公司) ，p u 一5 3 0 紫外分光光度计( b e c k m a n ) ， g s - 1 5 r 台式离心机( b e c k m a n ) ，t y p h o o n8 6 0 0 v a r i a b l em o d ei m a g e r 扫描仪 ( m o l e c u l a r d y n a m i c s 公司) ，紫外交联仪( u l t r a l u m u v c 5 1 5 ) ，储磷屏( m o l e c u l a r d y n a m i c s 公司) ，真空浓缩仪( s a v a n t 公司) 。 2 1 3 试剂 q i a q u i c kr n e a s yp l a n tk i t 和q i a q u i c kp c r p u r i f i c a t i o nk i t ( q i a q u i c k 公 司) ：b ds m a r t t mp c rc d n as y n t h e s i sk i t 和c l o n t