（微生物学专业论文）东湖浮游病毒的时空分布调查及遗传多样性的初步研究.pdf

项士孝位论文 m a s t e r st h e s j s 摘要 本文就若干水华永体和武汉东湖的浮游病毒的时空分布开展了生态学调查，并 对浮游病毒的遗传多样性进行了初步研究，结果如下； 在2 0 0 5 年4 月份到2 0 0 5 年1 2 月份之闯对落雁岛和关桥两个水华池塘进行了 综合调查。结果显示：在营养水平较高的水体中。浮游病毒丰度也相应较高，但浮 游病毒丰度的变化与营养物浓度的变化无显著的相关性。落雁岛和关桥两采样点浮 游病毒豹平均丰度分别为2 9 9 x l o sv l p s t m l 1 和4 2 4 x l o sv l p s m l 1 ( 都在9 、1 0 月份出现峰值) ，叶绿素a 浓度的平均值分别为9 6 0 6 1 1 9 l 1 和1 6 6 7 4 p g - l 1 。关桥采 样点的浮游病毒丰度与前一个月的叶绿素a 浓度呈显著的相关( 产0 8 0 9 ，p 0 0 1 ) ， 其显著水平高于与当月叶绿素a 浓度的相关性( 产0 6 3 4 ，p o 0 5 ) 。上述结果说明铜绿微囊藻水华 发生期闻。藻类的生物量是决定浮游病毒丰度的关键医素，但浮游病毒却难以有效 控制铜绿微囊藻的生物量。 在2 0 0 4 年8 月到2 0 0 5 年7 月之间，对东湖六个湖区的水温、透明度、p h 值、总 氮、总磷、浮游病毒丰度、浮游细菌数量及叶绿素a 含量进行了检测。夏季时浮游 病毒的丰度高于其它季节，而冬季的浮游病毒丰度最低。同时发现，噬菌体( 而不 是藻类病毒) 是浮游病毒的主要成员，浮游细菌是决定浮游病毒分布的关键因素， 而水温、营养水平等因素尽管不能直接影响浮游病毒的丰度，但却可以通过影响浮 游细菌的分布而间接影响浮游病毒的分布。通过浓缩水样、提取核酸，以t 4 噬菌体 的g p 2 3 基因设计引物进行p c r 扩增，成功扩增出一段约5 0 0 b p 的序列。进一步通过温 度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e e t r o p h o r e s i s ，t g g e ) ，对阳性的p c i 沪 物进行分析，结果至少可以区分出4 个泳带。上述研究结果不但说明采用p e r 与 t g g e 相结合的方法研究浮游病毒的遗传多样性是完全可行的，而且也初步说明不 同营养水平的水体中，浮游病毒的遗传多样性具有明显的差异。 关键词：浮游病毒；水华；时空分布；相关性；t g g e ；遗传多样性 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt e m p o r a la n ds p a t i a ld i s t r i b u t i o no f v i r i o p l a n k t o ni n s m a l lw a t e r - b l o o mp o u n d sa n dd o n g h ul a k oi nw u h a n , a l s o , g t m 甜cd i v e r s i t yo f v i r i o p l a n k t o nw a sa n a l y z e di nd o n g l l ul a k o , t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： w 0c a r r i e do u tas t u d yo nt h ed i s t r i b u t i o no fv i f i o p l a n k t o nf o rac o m p r e h e n s i v e i n v e s t i g a t i o ni nt w ow a t e rb o d i c s ( l u o y a n d a oa n dg u a n q i a o ) f r o ma p r i lt od e c e m b e ri n 2 0 0 5 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l t h o u g ht h ev i r a la b u n d a n c ew a sh i g h e ri nm o r e 州t z o p h i cw a t e rb o d y , t h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w c c l lv i r a la b u n d a n c ea n d n u t z i e n tc o n c e n t r a t i o n s i nl u n y a n d a oa n dg u a n q i a os a m p l i n gs i t e s , t h ea v e r a g ev i r a l a b u n d a n c e sw e r 02 9 9 x 1 0 sv l p s m l 1a n d4 2 4 x 1 0 8v l p s m l 1r e s p e c t i v e l y ( t h ep e a k v a l u e sa p p e a r e d 丘锄s e p t e m b e rt oo c t o b e r ) , t h ea v e r a g ec h l o r o p h y l lac c a l t 嘲咄 w c i e 9 6 6 6 i _ t g l 1 a n d l 6 6 7 4 p g - l ir e s p e c t i v e l y i ng u a n q i a os a m p l i n gs i t e , t h e c o r r e l a t i o nl e v e lb e t w e e nv i r a la b u n d 趾c ea n dc h l o r o p h y l lac o 删o nw a sl o w e ri n t h ei d e n t i c a lm o n t h ( 产0 6 3 4 ，p 0 0 5 ) t h a nt h a tt h ec l d o r o p h y l lac o n c e n t r a t i o nw a s a h e a do fo n em o n t h ( f0 8 0 9 , p 0 0 1 ) ，w h i l et h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc o r r e l a l i o n b e t w e e nv i r a la b u n d a n c ea n dt h ec h l o r o p h y l lac o n c e n t r a t i o no nt h en e x tm o n t h t h e r e s u l t sc o n f i r m e dt h ei d e a lt h a tt h ea b u n d a n c eo fv i r i o p l a n k t o nw a sm a i n l yd e c i d e db y t h eb i o m a s so fb l o o m - a l g a lb i o m a s s , w h i l ei td e n i e dt h eh y p o t h e s i st h a tv i r i o p l a n k t o n c o u l dc o n u o lt h eb i o m a s so f 肘：凸曰蜘删 f r o ma u g u s ti n2 0 0 4t oj u l yi n2 0 0 5 ，w ed e t e c t e dt h ee n v i r o n m e n tp a r a m e t e r s 0 翮叩a _ a l ：l 碥f i g h ti n t e n s i t y , l r d n s p a l c n c e , p hv a l u e , nc o n c e n t r a t i o na n dpc o n c e n v a t i o n ) a n db i o l o g i c a la c t i v i t y ( v i r a la b u n d a n c e , b a c t e r i a la b u n d a n c e , a n dc m o m p h y ha c o n c e n t r a t i o n ) a ts i xs t a t i o n si nd o n g h ul a k o ( 3 0 03 3 w , 1 1 4 0 2 3 曰v i r a la b u n d a n c ea t s i xs t a t i o n sw a s h i g h e ri nl a t es u m l n c rt h a nt h a ti no t h e rs e a s o n s , a n dt h el o w e s tv a l u e s w c i eo b s e r v e di nw i n t e r i tw a sf o u n dt h a ti nt h ed o n g h ul a k c m o s tv i r i o p l a n k t o nw h i c h o f i g i n e df r o mt h ep h a s eo fb a c t e r i aw e r eb a c t e r i o p h a g e o u rr e s u l t si n d i c a t e dt b 越t h e t e m p o r a lc h a n g e so fv i r i o p l a n k t o np o s s i b l yd e p e n d e do nb a c t e r i a la c t i v i t y w a t e r t e m p e r a u r e , t r o p h i cc o n d i t i o n sa n do t h e rf a c t o r sc o u l d n td i r e c t l ya f f e c tv i r i o p l a n k t o n a b u n d a n c e , b u tt h e s ef a c t o r sc o u l da f f e c tt h ed i s t r i b u t i o no fb a c t c r i a c o n s e q u e n t l y i n d i r e c t l ya f f e c tt h ed i s t r i b u t i o no fv i r i o p l a n k t o n t h r o u g hc o n c e n t r a t i o na n dd n a e x t r a c t i o np r o c e s s i n go fw a t e rs a m p l e s , p c rw a su s e dt oa m p l i f yaf r a g m e n to ft h e g e n e s ) e 3 ，w h i c hc o d e dc a s p i dv e r t e xp r o t e i n t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( t g g e ) o fp c ra m p l i f i e d9 2 3g e n ef r a g m e n t s 碡憾u s e dt oe x a m i n ev a r i a t i o n si n v i r o p l a n k t o nc o m m u n i t ys h u c t l 雌i nd o n g h ul a k e t h i st e c h n i q u ec o u l dd i s t i n g u i s ha t l e a s tf o u rd n a b a n d s , p r o v i d i n gar a p i di n s i s h ti n t og e n e t i cd i v e r s i t y , s ot r g ei sa r e l i a b l et e c h n i q u ea n dav a l u a b l et o o lf o rv i r o p l a n k t o ng e n ed i v e r s i t ys t u d i e s i ta l s o i n d i c a t e dt h a ti nw a t e rb o d i 髂w h i c hh a dd i f f e r e n tu _ o p h i cl e v e l s , v i r o p l a n k t o ng e n e t i c d i v e r s i t yw a so b v i o u s l yd i f f e r e n t k e yw o r d s ：v i r i o p l a n k t o n ：w a t e rb l o o m ；t e m p o r a la n ds p a t i a ld i s t r i b u t i o n ； c o n r e l a t i o n ；t g g e ：g e n e t i cd i v e r s i t y m 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明弓f 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：莠i l日期：伽7 年，月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录勐中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：掘j 生 日期纠年月j 5 日 导师签名：珏吣泽 日期：叮7 年月i ；日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程。，同意将本人的 学位论文提交“c t i l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回霾论塞握銮卮澄卮! 旦圭生i 旦= 生i 旦三生筮查： 作者签名：掘豇 日期：硼年6 月f j 日 导师签名：殄 净 1 日期： ，7 午月c ；日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 第一章综述 水是生命的起源，水体中生物的多样性在整个地球生物圈中占据相当重要的位 置，因而研究水体中一些未知的微生物种群也极为重要，目前的研究发现，浮游病 毒是水体微生物群落中丰度最高的有机物成分【。它在水体生态系统中具有重要的 生态作用f 2 ，并对宿主种群的多样性、微生物循环、水环境乃至整个生态系统都具 有重要影响【3 】病毒粒子能侵染几乎所有的细胞，影响许多生物地球化学和生态过 程包括营养要素循环，细菌和藻类的生物多样性和种类分布，藻类水华的控制以及 遗传运输等。然而对于浮游病毒的研究起步较晚，在病毒自然生态研究史上具有重 要意义的最早的研究是s h a r p 在1 9 4 9 年采用了超速离心和透射电子显微镜技术计数 海水中的病毒粒子【4 】。但是由于当时超微型生物在海洋生态系统中的重要地位没有 得到充分的认识，这一技术直到8 0 年代后期才得到充分的应用。而且大部分的研 究都是针对海洋水体，在淡水水体中研究较少。 1 1 浮游病毒生态学研究概况 1 1 1 浮游病毒种类与数量 浮游病毒( v i r i o p l a n k t o n ) 主要是水体中浮游藻类和浮游细菌( 包括蓝细菌) 的 病毒。其形态有球形、纺锤形、柠檬形、长尾蝌蚪、短尾蝌蚪等多形性眇 7 搠 前人的研究中有根据病毒尾部形态学特征和病毒粒子衣壳直径将其分类的根 据病毒尾部形态特征将其分为粘病毒( m y o v i r i d a e ) ，长尾病毒( s i p h o v i r i d a e ) 和短 尾病毒( p o d o v i r i d a e ) 9 1 ，它们分别约占总数的5 0 ，1 8 及1 9 有人根据衣壳 直径大小认为在水体浮游病毒中衣壳直径大小在3 0 n m - 7 0 n m 的病毒占绝大多数，而 其中衣壳直径大小在3 0 n m - 6 0 n m 的病毒占总数的6 5 9 上( 埘。 最初对海洋病毒粒子浓度的报道为1 0 9 颗粒每升t 2 , “】，从此引起了人们对海水病 毒粒子的生态研究的兴趣。后来越来越多的研究发现，病毒在表层水体中大量存在， 是水体中数量最多的生命形式。 水体中浮游病毒粒子浓度的范围为1 0 4 m l p s m l 1 到1 0 9 m l p s m l 1 这种数量上 的可变性程度取决于水体中浮游生物的组成成分。病毒丰度是动态的，与季节、水 深、理化因子、营养条件等有判2 1 2 l 。病毒一般在晚秋季节达到最大，多数与水体 中细菌丰度的季节变化趋势一致。冬季海洋冰层中所含病毒的量可达冰层下水体中 的l o - l o o 倍【1 3 】，而在海域深处( 2 0 0 m ) 浮游病毒丰度迅速下降”4 】。与深海不同，在 近海或江河口处，水面病毒的含量比水下要高数倍【1 5 1 。为了维持水环境中烈性噬菌 体的种群稳定性，需要一定浓度的供噬菌体复制的宿主细胞，试验表明，只有当宿 主细胞浓度达到1 0 4v i , p s m l l 时噬菌体才会增殖【1 6 】1 1 1 2 浮游病毒活性 浮游病毒在水体中大量存在，表明其在水体中活性是很高的。影响浮游病毒失 活的因素很复杂，包括许多理化因子和生物因素。在这些因素中，有机颗粒物质是 影响力最强的因素 x 7 , 1 9 , 1 9 阳光对浮游病毒的失活和降解也起重要作用 2 0 , 2 1 2 , 2 1 。由 于病毒侵染细胞主要是随机扩散，因而病毒活性与宿主的密度与大小有关，因此病 毒更容易侵染在海水中数量最大的微型原核生物，如异养细菌、蓝细菌等。 有研究表明，在经0 2 2 1 a m 膜过滤掉浮游细菌和大的有机颗粒物质的水样中， 浮游病毒失活率会大大下降u s j g , 2 n 进一步实验证明，在加热或高压灭过菌的水中 接种浮游病毒，浮游病毒的失活率也会大大降低 2 2 , 2 玷q ，这可能是当这些热源物质 存在时，在适宜的温度下( 4 - 2 喳) ，这些物质的酶活性会增加，导致浮游病毒失活。 一些热不稳定物质，如某些大分子量物质或者水解酶等会导致明显的病毒降解瞄1 目前研究表明，阳光对浮游病毒的失活和降解起重要作用在表层水体中，阳光是 导致浮游病毒失活的重要因素之一光( 主要是紫外一蓝光，也有其它波段) 是引 起病毒遗传物质损害的主要因子1 2 堋由光照引起的病毒失活占总失活的 2 5 - - 6 7 在研究浮游病毒的失活与降解的关系时，w o m m a c k 等鲫发现在海水中， 不同的噬菌体在有阳光的条件下，病毒的失活率不同，无阳光时，失活率差不多， 但在不同的实验条件下，病毒的降解率基本上是一致的淡水中的研究结果与海水 中的基本一致网s u t t l c 【4 2 等认为被光损伤的病毒可被宿主或病毒本身所带的d n a 修复系统所修复w c i n b a u c r 等【2 9 】发现把光损伤过的病毒与宿主在光复活条件下温 育，部分病毒的侵染性可恢复，产量会增加。在不同的水环境条件下，宿主的光修 复作用程度是不同的，在寡营养环境中浮游病毒的活性恢复率仅达2 0 0 , 4 ，而在沿岸 水体中，浮游病毒的活性恢复率可达5 0 。 1 1 3 浮游病毒的生态学功能 近些年的研究发现，病毒对传统意义上的微生物食物环中的各主要角色均有相 当程度的影响，它使得微生物食物环中的物质流向更为复杂化，在微生物食物环中 有着重要的生态学意义，主要有三个方面：病毒对宿主、营养物质循环以及基因转 2 硕士学位论文 l a s t e r s t h e s i s 移等方面的影响。 浮游病毒的生态学效应是通过病毒与宿主的相互作用来体现的【捌。病毒与宿主 有三种基本的作用类型：( 1 ) 裂解性感染：病毒吸附到宿主细胞上，将其核酸注入 细胞内，指导宿主产生大量子代病毒，使宿主细胞裂解后释放出来，并开始另一个 生命循环。( 2 ) 慢性感染：子代病毒感染是非致死性的，宿主细胞是通过泌出或出 芽释放病毒( 3 ) 溶源性感染：病毒基因组成为宿主细胞基因组的一部分，并随宿 主细胞分裂而复制病毒基因，产生前噬菌体( p r o p h a g e ) 或前病毒( p r o 、，i r 郴) 该宿 主成为溶源性细菌溶源性细菌具免疫性，即对其本身产生的噬菌体或外来的同源 噬菌体不敏感，这些噬菌体虽可进入溶源性细菌但不能增殖，也不导致溶源性细胞 裂解。 水体中的病毒大量存在，而表层水中的病毒由于光照等因素降解 2 2 , 2 5 , 3 1 阀。研 究发现水体中病毒的数量在一天或一周内是恒定的，因而水体中会有新的病毒不断 的产生来替代被降解的病毒宿主的大量降解就会导致病毒数量的激增，研究表明， 每天水体中1 0 - 2 0 的异养菌的5 - 1 0 的蓝藻会被病毒降解掉1 3 3 】水体中的细菌含 量高达1 0 9 个细胞，升，细菌细胞的降解会给水体微生物食物链提供重要的有机碳源， 营养物质和微量元素等。此外，部分病毒也能使真核浮游植物死亡，病毒中的细胞 溶解酶能作用很多种真核浮游植物，如m i c r o m o n a sp m i l l a 2 1 1 ，a u r e o c o c c u s a n o p h a g e f f e r e m l 3 4 1 ，c h r y s o c h r o m u l i n as p p 【3 习和p h a e o c y s t i s p o u c h e t i t 4 1 9 1 。随着对浮游 病毒种群及丰度认识的加深，已将病毒及病毒裂解宿主细胞的概念引荐到水生食物 网的模型中，证明病毒裂解作用增强了细菌生物量向溶解的有机质库池( d i s s o l v e d o r g a n i cm a t t e rp o o l ，d o mp 0 0 1 ) 的流动 3 6 1 病毒对蓝藻和真核藻类的裂解可增大光 合作用所固定的碳向d o mp o o l 流动使本来应该由初级生产力经浮游动物消费最 终进入d o mp o o l 的碳直接进入该池所以病毒的裂解大大促进了宿主生物量直接 进入溶解的有机质库池的速度，使有机物在细菌与d o mp o o l 问反复循环，结果是 维持了高水平的细菌产量，减少了有机物向高营养水平的转移p 1 单细胞生物群落中的基因转移包括垂直基因转移和水平基因转移，垂直基因转 移是指通过细胞分裂、繁殖来向后代传递基因的过程。水平基因转移是指个体间通 过接合、转化和转导进行基因转移的过程。由于病毒可通过影响这两种基因转移过 程来影响单细胞生物间的遗传交换，因而可在遗传水平上影响宿主的种群多样性。 病毒的影响与细胞的密度和大小有关，病毒有助于维持生态系统的物种多样性f 堋。 同时病毒的侵染可促进遗传物质的交换，对微型生物的短期适应，种群遗传和进化 产生影响。这一过程可通过病毒将一个宿主的d n a 片断转接到另一宿主的遗传物 3 硕士荦位论文 m a s t e r s t h e s i s 质上，虽然通常认为这一过程会严格地局限于某类宿主之间，但有报道发现病毒能 进行种问的遗传物质转移p 列。另外，病毒裂解细胞后会产生游离的d n a ，通过自 然转运转移到另一宿主细胞。因此病毒对遗传物质交换的促进对海洋细菌的遗传结 构以及种群进化会产生重要影响。 1 2 自然水体中浮游病毒的研究方法 1 2 1 形态观察鉴定技术 透射电镜方法( t r a n s m i s s i o ne l c c f f o nm i c r o s c o p y ，t e m ) ：该方法主要是用来 观察水体中浮游病毒的形态即头部大小、有无尾部结构、尾的长短及一些微细结构 等该方法的具体操作较为复杂，由于游离病毒在海水中的丰度较低，病毒样品需 要先做提纯浓缩，如超速离心的方法，然后将样品在金属网格上做戊二醛或甲醛固 定、染色、干燥等样品制各处理后，方可在透射电镜下观察或计数。它能够提供关 于整个浮游病毒群落的形态多样性和丰度方面的大量信息透射电镜方法的最大优 势就在于可以直接计数自然水体中的病毒粒子的数量而无需对宿主进行感染，因此 它能够提供关于整个病毒群落的形态多样性和丰度方面的大量信息而这种方法的 主要缺点是由于水样中杂质的影响，计数结果稍微偏低由于在测量低丰度样品时 由于需要对样品进行浓缩，因此误差范围也高达2 0 - 2 5 ，此种方法无法确定病毒 颗粒是否具感染性及宿主的类型，而且设备昂贵，所需的分析时同长，对操作者的 专业水平要求较高生物体中的病毒可以借助于其它电镜样品制备技术做电镜观 察其它科学领域理论和技术的发展带动了镜检前样品制备技术的不断发展和成像 分析途径的优化，显微镜技术与计算机分析技术的结合使得电子显微镜成为测定病 毒的形态结构盼最重要的手段【拥 1 2 2 浮游病毒分离浓缩技术 由于水体中病毒浓度相对较低，病毒在脱离寄主细胞的环境中极易失活，我们 在对浮游病毒进行定量与定性分析之前需要对水体中的病毒进行浓缩处理因此快 速有效的分离浮游病毒首先需要对大量的水样进行浓缩。水体中自由存在的病毒颗 粒直径很小，需要对其进行吸附、相分离、强离心沉淀等处理。目前认为比较好的 病毒浓缩方法主要有两类：( 1 ) 吸附洗脱法。包括膜吸附过滤、盐沉淀、吸附剂吸 附等。膜吸附过滤洗脱法被认为是比较好的水体病毒浓缩方法 4 0 4 ”，是利用病毒在 滤膜表面有可逆性吸附的原理，选用具电荷微孔滤膜、吸附剂制备的吸附层滤板等 4 滤材过滤大体积的水样，然后用洗脱缓冲液洗脱吸附膜上的病毒。( 2 ) 基于病毒的 物理学特征的分离方法。如超速离心、透析法等。普通的超速离心法作为浮游病毒 的浓缩手段具有浓缩效率较高，无特异性吸附等优点，且密度梯度离心法能对特异 性的病毒类群进行分离浓缩。 1 2 3 浮游病毒定量技术 在水体浮游病毒的定量研究方面，主要有空斑法( p l a q u ef o r m a t i o nu n i t s ， p f u ) 、m p n 法( m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r ) 、荧光法( e p i f l u o r e e n c em i c r o s c o p y ， e f m ) 、流式细胞计数仪计数( f c m ) 和标记示踪法等方法。 1 2 3 1 空斑法( p l a q u ef o r m a t i o nu n i t s ，p f u ) 噬菌斑计数法是最传统的病毒计数技术，它是在敏感细胞培养的基础上做病毒 感染后观察噬菌斑的数量，由于任一个具感染力的病毒单位都会在敏感宿主的细胞 层上形成一个透明的裂解圈或生长抑制圈( 即空斑) ，通过计数空斑即可测定病毒 的数量。从而获得病毒数量信息。由于p f u 法的操作简单可行，灵敏度高( 其检出 限为每毫升5 个空斑) ，并可用于病毒的纯化，所以它已被广泛的应用蛰 对。p h s 的 研究工作中而该方法的局限性在于要求宿主必须能在固体培养基上培养，且宿主 细胞平板的形成可能会受到天然样品中细菌的干扰，而需要注意区别由于样品中细 胞毒性物质造成的假阳性，同时这种方法也不能有效地区分不同类型的病原体1 4 2 】 1 2 3 2m p n 法( m o s t - p r o b a b l o - n u m b e r ) m p n 法最早是用于对噬藻体( 蓝藻病毒) 进行计数的，其方法是将病毒溶液 进行梯度稀释，用每个稀释度的多个平行样品( 通常是l o 个) 分别感染宿主细胞， 通过检测较长时间内藻的生长情况来判断是否有病毒感染，最后将出现感染的稀释 度数和平行样品数和最可能数目表进行比较，估测出病毒的数目。该法为计数不能 在固体培养基上形成空斑的病毒提供了可能，而且简单易行，灵敏度高，检出限可 达到每毫升1 个病毒。但这种方法的工作强度大，准确性和精确度也不如p f u 法f 4 3 】 1 2 3 3 荧光显微镜法( e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，e f m ) 荧光显微镜技术应用于病毒定量，是将病毒溶液经过核酸荧光染料对样品染 色，再在可以激发荧光的显微镜下观察计数。这项计数方法是一项精确且操作简单 的计数方法。可以直接对病毒浓度很低的样品作精确计数，避免了昂贵的、大体积 的仪器的使用，但在较高浓度病毒计数时准确度稍低于流式细胞计数法。 e f m 法的基本思路是根据特定的荧光染料对不同的浮游生物的核酸染色的不 同，从而在荧光显微镜下就可以进行区分和计数。通常，荧光法都需要浓缩、酶解 游离核酸、染色、固定、镜检等一系列步骤，而常见的荧光染料有d a p i ，y o - p r o ， s y b r 等d a p i 是最早用于对浮游病毒进行研究的荧光染料，它能够对双链d n a 进行特异性染色。y o - p r o - 1 和s y b rg r e e ni 则是近年来才被应用于浮游病毒的计 数的 4 4 , 4 5 1 。这两种染料的优势在于具有较低的背景色及高于d a p i 荧光的稳定性和 亮度，因此它们已替代d a p i 成为主流的荧光染料。与y o - p r o 不同，s y b rg r e e ni 仅染色水样中的病毒和细胞，尽管这种染料的褪色较快( 0 - - i 以通过加入抗褪色剂来 减缓) ，但由于它的染色时间较短( 小于1 5 分钟) ，亮度较高，而且不受乙醛固定 剂的影响1 4 5 1 ，因此，s y b rg r e e ni 被认为是日前用于荧光计数浮游病毒的最佳染 料。和t e m 法相比，e f m 法的优势在于精度较高( 其误差范围为7 - 1 1 ，所需的 设备少，经济可行，且能够在实地进行。但用这种方法得不到关于病毒群体或被感 染生物体组分的信息，小的细菌与大的病毒不易区分，单个病毒也不能从病毒聚合 体中分辨出来。 1 2 3 4 流式细胞计数法( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 近十几年来，流式细胞术已被广泛应用于水体微生物研究该技术最初被用于 植物种群的区分与计数，接着又被用于异养细菌群落研究，而这几年则被开发用于 海洋病毒的分析。与前面所介绍的几种仪器技术相比，f c m 是最晚应用与水体超微 型浮游生物生态研究的，其主要优势在于能快速分析大量细胞，并获取数据易于进 行多元数据分析，准确性得到提高，误差减小，还能检测低浓度下的细胞数量，检 测下限与灵敏度都得以提高流式细胞计数仪是对病毒的数量、单一病毒的大小、 辅助生化和生理特征进行测定的非常直接灵敏的途径所有样品运行测试在流式细 胞计数仪中进行，对于病毒浓度较高的样品测试结果是目前最准确的，但无法测试 病毒较稀的样品若要评估病毒在水生生态系统及微生物食物环中的地位及作用， 首先必须要有可靠的测试方法对其进行准确计数【蛔。 流式细胞仪技术方法的主要原理是通过激光照射通过检测小室的含有单个细 胞的液体微流，由检测器接受细胞的前向、侧向散射光及荧光信号，传输到计算机 中进行分类、计数的一种仪器。同时在检测小室出口处微流形成液滴，还可以将包 围着感兴趣的细胞外面的液滴加上不同电荷，这样带有不同电荷的液滴在通过偏转 板时就可得到分离。目前应用于浮游病毒检测的f c m 染料有两种：s y b r g r e e ni 和s y b rg o l d c h e n 等人在用f c m 法计数用s y b rg o l d 染色的天然湖水样品时，至 少可以分辨出4 个不同的病毒颗粒类型，同时由于s y b rg o l d 的成本更低，染色更快 而且不受固定剂的影响，荧光比s y b rg r e e ni 更明亮，更稳定，持续时间更长达2 分钟，因此它很有可能会替代s y b rg r e e ni 目前的地位用s y b rg r e e ni 染料对 6 自然水样进行染色，再结合灵敏的流式细胞术来计数其中的病毒，不仅快速准确， 而且可以节省大量的人力和物力，这无疑为将来进一步了解病毒在微生物食物环乃 至整个海洋和淡水统中的地位及其在生物地球化学循环中的作用提供了便利。目前 利用流式细胞术尚不能区分传染性与非传染性病毒。如欲采用该技术直接获得混合 种群中特定一类病毒的有关信息，则可以将流式细胞术与其它方法( 如荧光标记的 抗体) 结合起来，根据荧光信号的差异来区分不同的类群。流式细胞仪具有快速、 准确的特点，它以每秒处理上千个数据的速度处理单个细胞的光学特性，因此尤其 适合于统计分析。但是流式细胞仪计数法也有几个方面的缺点，最主要因素是其昂 贵的价格，其次是操作较为复杂，尤其是在进行分选时需要丰富的经验和技术。随 着技术的改进，相信不远的将来f c m 会更广泛，更方便、更精确地应用于超微型浮 游生物生态学、生理学等各方面的研究上总之，应用流式细胞术进行病毒及病毒 宿主之间相互关系的研究，不仅是在医学研究上，在环境及海洋科学领域也有着其 不可比拟的优势和进一步发展的潜力【盯删。 1 2 3 5 标记示踪法 根据标记物的不同，可以将标记示踪法分作两类：放射性示踪法和荧光示踪法。 放射性示踪法是s t e w a r d 等人参照测量细菌生产力的方法而设计的，这个方法的基 本原理是用砸或3 2 p 标记浮游病毒的核酸，然后计数宿主裂解后的放射性标记物的 量，这个量所代表的就是病毒的生产量，最后用病毒的生产量除以病毒的平均释放 量就能够推算出被感染的宿主的数量1 4 9 1 由于放射性示踪法不适于检测病毒生产力 较低的样品，因此最近又有人将荧光染料用于对病毒生产力的示踪研究中。荧光示 踪法的基本原理和放射性示踪法是相同的，但荧光染料对宿主正常生理活动的影响 小，且无需推测转化系数，所以精度更高，此外它的操作性，安全性和灵敏度也优 于放射性示踪法。而这种方法的缺点主要是由荧光染料的性质决定的，如由于s y b r g r e e ni 在光照下极易褪色，所以它只能用于对避光培养的p h s 体系的研究。标记 示踪方法不但使得我们能够直接测定病毒的生产速率并推算它所造成的致死率，而 且也可以用于直接记录病毒粒子的降解率，同时还为我们提供了有关物质从浮游菌 群流向浮游病毒的直接证据 1 2 4 分子生物学方法 由于超微型浮游生物绝大部分为原核生物或病毒粒子，细胞微小，无论在细胞 水平还是生理水平上都不能为其可靠的系统发育提供特性，而它们核酸中的保守基 因序列，如r r n a 则可为其系统发生地位提供有意义的信息御捌】。其次病毒的细胞 7 硕士擘位论文 m a s t e r st 1 - l e s i s 培养是检测水体病毒的方法之一，但是病毒的细胞培养检测周期长，有不少病毒目 前还难以分离培养，很多病毒的宿主范围还未完全了解，某些宿主尚未建立可供研 究的细胞系，故难以满足病毒检测的要求。因此，分子生物技术主要是以p c r 为核 心的定性检测方法阻鄙髯l 是迸行超微型浮游生物分类研究的重要手段。 分子生物学技术检测海水体中病毒是在浓缩水样和病毒核酸抽提纯化的基础 上，通过对病毒的核酸物质进行检测，对海水中病毒进行定性、分型和定量等f 翁康 生等，2 0 0 2 ) 。主要有两种方法：( 1 ) 核酸杂交检测病毒核酸，利用核酸探针、基因 芯片检测病毒核酸。( 2 ) 聚合酶链式反应( p c r ) 检测病毒核酸。运用分子生物学 技术傲病毒的基因分析主要有两种方法：( 1 ) 对病毒核酸的克隆或p c r 产物做限制 性酶切片段长度多态性分析( r f i j p ) ，对病毒核酸做不同的限制性核酸内切酶酶切， 通过凝胶电泳、核酸杂交等技术分析酶切片段多态性。( 2 ) 克隆或p c r 产物核酸序 列分析，产物直接做核酸序列测定，与己公布的序列作比对，分析核酸基因型和基 因多态性这类p c r 方法的通常的过程是先用适当的方法浓缩水样中的噬藻体，然 后对标志性的噬藻体d n a 片段进行p c r 扩增，最后再用d n a 杂交、变性胶梯度 电泳( d g g e ) 、毛细管电冰( c d c e ) 等高灵敏度的检测方法加以检测【5 5 l 。此外， w o n m m c k 等人还将用脉冲场电泳( p f g e ) 所分离出的不同大小的噬藻体基因组用 于p c r 检测 在对噬藻体的研究过程中，人们发现由于印2 0 基因【5 2 】和d n a 聚合酶基因闻具有 相当强的保守性，所以它们可以当作研究噬藻体的分子进化关系的指示基因。人们 已经将p c r 技术用于分析天然样品中的噬藻体种类，并根据上述基因的序列建立了 部分噬藻体的分子进化图谱在对浮游病毒的分子生物学研究方面研究较少，有研 究者对加拿大g u l 醐中的t 4 噬菌体作了研究，根据编码衣壳蛋白的g p 2 3 基因作为保 守基因设计引物，对天然水体样品处理后进行p 保扩增，序列分析之后，发现水体 中的很多t 4 噬菌体种类都是目前未作报道的【5 6 1 也有研究者对水体中的1 r 7 类噬菌体 作过报道，根据d n a 聚合酶保守基因设计引物，对不同类型的水体样品处理后进行 p 氓扩增，测序后分析其进化关系 1 3 浮游病毒的分布规律 前人的研究结果表明季节，温度，营养水平，水流。海拔，盐度，浮游植物和 浮游细菌等都对浮游病毒的分布产生影响。然而这些影响因子中，季节，营养水平， 浮游植物和浮游细菌这四个因子与浮游病毒分布的关系的研究最多多数报道表 明，在野外情况下水体细菌含量和叶绿素a 浓度能够预测水体浮游病毒的丰度 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 5 7 , 5 8 8 1 。富营养化程度能够直接使浮游病毒丰度激增”o , 5 s , 6 2 1 3 1 季节变化 在对水体的浮游病毒分布进行调查的研究中发现，浮游病毒丰度呈一定的季节 变化。在美国的坦帕海湾和北方的a d r i a t i c 海，浮游病毒丰度在冬季可以到达1 0 6 v l p s m l 1 ，在晚秋季节病毒丰度达到1 0 7 v l p $ m l 1 5 t a q 。在美国的c h e s a p e a k e 海湾 也发现水体中的浮游病毒丰度呈明显的季节变化趋势“在这些研究中我们发现 了一个共同点，就是浮游病毒的峰值大多数情况下总是出现在秋季。导致这个结果 的原因可能是由于秋季水体中浮游植物的水华因为大多数水体中在春季浮游植物 数量会激增，因而春季的浮游植物数量也会使浮游病毒数量增加，但此时的浮游病 毒丰度还没有达到最大。当经过了夏季浮游细菌的大量繁殖与裂解之后，浮游病毒 丰度就达到峰值。 l j 2 营养水平 研究水体营养水平与浮游病毒丰度变化的关系非常重要，实际上，当研究者发 现在富营养化程度较高的水体中浮游病毒大量存在时，就认为水体的营养水平情况 可能是决定和控制浮游病毒时空分布的重要因烈1 0 l 。这种假说的理论支持是相对于 贫营养的情况下，富营养化水体中的浮游细菌数量水平更高，这也就直接导致了浮 游病毒数量的增大【8 捌。有研究者报道在对美国的a d r i a t i c 海研究发现浮游病毒丰 度与水体营养水平呈正相关t 6 ，】也有研究者对亚热带的两个河口进行调查后发现在 营养水平较高的河流检测到更高的浮游病毒丰度，而且发现在加入了无机营养成分 后，能够使浮游病毒数量增加1 4 5 2 ，因而作者推测无机营养水平对浮游病毒丰度 起到重要的作用i t , 4 。但也有研究者认为水体的浮游病毒与营养水平无关，c o r i n a l d e s i 等发现在大的水域范围内，病毒分布与自给营养物及其他环境参数无关，且发现营 养水平不是直接影响病毒的分布，病毒分布与细菌行为有判鲫。 1 3 3 浮游病毒与水中生物因子之间的关系 水体中浮游病毒数量和分布情况取决于其宿主在水体中的分布状况。浮游病毒 的宿主主要为浮游细菌和浮游藻类。因而研究浮游细菌和藻类在水体的数量变化以 及揭示它们与浮游病毒之间的关系对深入了解浮游病毒在生态环境中的行为极其 重要。在很多调查了浮游病毒和浮游细菌数量变化的研究中都发现，浮游病毒丰度 和浮游细菌数量呈显著相关f 5 舯j 8 , 5 7 , 6 6 , 6 7 , 6 9 , 7 0 , 7 1 l 而在这些研究中，如果分析发现叶绿 9 素a 含量如果与浮游病毒呈相关性的话，那么浮游细菌数量也必然与浮游病毒丰度 呈相关性【5 7 , 5 8 郧l 。也有研究者认为研究水域的大小程度不同会对分析浮游病毒与浮 游细菌、浮游植物之间的相关关系有影响。有人认为在小的水域中浮游病毒