（发育生物学专业论文）小鼠胚胎极性及相关问题的研究.pdf

摘要 摘要 哺乳动物早期胚胎发育机制仍然存在争议。哺乳动物囊胚形态发生有其特殊之处，囊胚 中包含后期胚胎发育的胚外部分。哺乳动物囊胚表现出明显的不对称性，包括胚胎一侧的内 细胞团和另一侧被滋养层包围的囊胚腔。内细胞团的位置，即极滋养层的位置决定了胚胎 胚外轴，为后期胚胎发育图式提供了基础，胚胎胚外轴决定后期胚胎发育的背腹轴。现在 ：存在的核心问题是囊胚的这种明显的不对称性是否在早期卵裂时就已经决定? 是否有某种潜 在的机制决定了这种胚胎发育形式? 是否和一些非哺乳动物相似，一些位置信息决定了这种 胚胎发育形式? 本实验以小鼠为实验模型，用对细胞无毒的f i t c 标记的右旋糖苷和t m r 标 记的右旋糖营标记2 细胞胚胎的两个卵裂球，跟踪其发育命运，来研究囊胚e m a b 极性如 何形成；通过透明带切割、胚胎分割和嵌合胚胎制作的方法，研究精子穿入位置、早期胚胎 分裂方式和胚胎极性的关系。 实验结果如下： 1 2 细胞胚胎两个卵裂球的后代在囊胚中分布并没有一定的规律。它们随机的分布在囊胚的 胚胎部分和胚外部分。 2 h c g 后1 3 到1 5 小时，大多数1 细胞胚胎第一极体与精子穿入位置相邻。 3 精子穿入位置对2 一细胞胚胎卵裂球分裂顺序没有影响，含精子穿入位置的卵裂球没有先 分裂的趋势。 4 分割2 - 细胞胚胎两个卵裂球，含精子穿入位置的卵裂球在分裂能力、发育到囊胚的能力 以及囊胚细胞数上没有显著差异。两个含精子穿入位置卵裂球组成的嵌合胚胎在发育能力上 和两个不含精子穿入位置的嵌合胚胎没有显著差异。 5 3 细胞胚胎分割后，大卵裂球的半胚胎和两个小卵裂球的半胚胎经体外培养后囊胚率及囊 胚细胞数差异不显著。3 细胞两个大卵裂球制作的嵌合胚胎和四个小卵裂球制作的嵌合胚胎 经过体外培养后囊胚率和囊胚细胞数差异不显著。 6 外部压力能影响囊胚腔位置，但去除透明带的胚胎发育到囊胚时也能形成止常的胚胎一胚 外轴。 这些结果表明了小鼠胚胎极性和精子穿入位置并没有特定关系，2 一细胞时，小鼠胚胎极 性并未形成。透明带对胚体的压力对小鼠胚胎极性形成有一定作用，但并不是囊胚极性形成 的全部原因。 关键词卵裂球：胚胎极性；e m - a b 轴：显微注射 a b s t r c t s t u d i e so np o l a r i t yo f e a r l ye m b r y oa n d r e l a t e di s s u e si nm o u s e a b s t r a c t t h em e c h a n i s m so f e a r l y m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t r e m a i nc o n t r o v e r s i a l bl a s t o c y s t m o r p h o g e n e s i so fm a m m a l si su n i q u e ，t h ee x t r a e m b r y o n i cs t r u c t u r e si si n v o l v e di nt h eb l a s t o c y s t m a m m a l i a nb l a s t o c y s td i s p l a y sa no b v i o u sa s y m m e t r y , w i t ht h ei n n e rc e l lm a s s ( i c m ) a to n ee n d a n dt h eb l a s t o c y s tc a v i t ys u r r o u n d e db yt h et r o p h e c t o d e r m ( t e ) a tt h eo t h e r t h ep o s i t i o no ft h e i c mi nt h eb l a s t o c y s t ，i e t h ee m b r y o n i cp o l ep r o v i d e sab a s i sf o rf u r t h e re m b r y o n i cp a t t e r n i n gi n t h ee m b r y o n i c a b e m b r y o n i c ( e m - a b ) a x i s i td e c i d e st h ed o r s o v e n t r a la x i so ft h em a m m a l i a n e m b r y o r e c e n t l yc e n t r a lq u e s t i o n si sh o wt h i sa p p a r e n t l yi n i t i a la s y m m e t r yi se s t a b l i s h e di ne a r l y e m b r y o ，a n dw h e t h e rt h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s m si nt h i sp r o c e s sd e c i s i v e ，o ri fi t i so p e r a t i n ga s n o n m a m m a l i a n m o d e l o r g a n i s m s ，i nw h i c hl o c a t i o ni n f o r m a t i o np l a ya ne s s e n t i a lr o l e i nt h e p r e s e n tr e s e a r c hw eu s ek m ( k u n m i n gs t r a i n ) m o u s ea sa na n i m a lm o d e l n o n t o x i cd e x t r a n c o n ju g a t e dw i t ht m r ( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ) a n df i t c ( f l u o r e c e i ni s o t h i o c y a n t e ) i sm i c r o i n j e c t e d t ot w oo ft h e 2 - c e l lb l a s t o m e r ea sm o l e c u l a rp r o b et ot r a c et h e d e v e l o p m e n tf a t e o ft h e b l a s t o m e r e ，i no r d e rt of i g u r eo u tt h em e c h a n i s m so ft h ef o r m a t i o no fe m - a ba x i s i n c i s i o no fz o n a p e l l u c i d a , e m b r y ob i s e c t i o n ，c h i m e r am a k i n ga r eo np u r p o s et os t u d yt h er e l a t i o na m o n gt h es p e r m e n t r yp o s i t i o n ，t h es e c o n dc l e a v a g eo r d e ra n dt h eb l a s t o c y s tp o l a r i z a t i o n t h er e s u l t sa r ea sf o i l o w s ： 1 t h e r ew a sn oc e r t a i nr e g u l a t i o ni nt h ed i s t r i b u t i n go ft h ep r o g e n yo f2 - c e l le m b r y ob l a s t o m e r ei n b l a s t o c y s t c e l l sr a n d o md i s t r i b u t e di nt h ee m b r y o n i ca n da b e m b r y o n i cp a r t so ft h eb l a s t o c y s t 2 m o s to f t h ef i r s tp o l a rb o d i e so nl c e l le m b r y o sw e r ec l o s e dt ot h ef e r t i l i z a t i o nc o n e1 3h o u r st o 15h o u r sa f t e rh c gi n j e c t i o n 3 t h e r ew a sn or e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ec l e a v a g eo r d e ro ft h e2 - c e l le m b r y o sa n dt h es p e r me n t r y p o s i t i o n ( s p ) b l a s t o m e r e sw i t hs p e r me n t r yp o s i t i o nh a v en oa d v a n t a g ei nc l e a v a g ef i r s t 4 i n2 - c e l l e m b r y ob l a s t o m e r ew i t hs pa n dt h eo n ew i t h o u ts pp r o d u c e ds i m i l a r r e s u l t si n c a p a b i l i t yo f c l e a v a g ea n dd e v e l o pt ob l a s t o c y s t t h en u m b e r so f c e l l si nt h eb l a s t o c y s tw e r es i m i l a r i nt h et w og r o u p st o o d e v e l o p m e n t a lc a p a b i l i t yo fc h i m e r ae m b r y oo ft w os pb l a s t o m e r e sh a dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t ht h ec h i m e r ae m b r y oc o m p o s e do ft w on s pb l a s t o m e r e s 5 t h eb i gb l a s t o m e r ea n dt h et w os m a l lb l a t o m e r e si n3 - c e l le m b r y oh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i nc l e a v a g er a t e s ，b l a s t o c y s tr a t e s ，a n dt h en u m b e r so fc e l l si nt h et w og r o u p sw e r es i m i l a ra f t e ri n v i t r oc u l t u r e c h i m e r ae m b r y om a d eo ft w ob i gb l a s t o m e r e si n3 一e e l la n dt h a tm a d eo ff o u rs i n a i l i i i 东北农业大学理学顾十学位论文 b l a s t o m e r e sh a dn o ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nc l e a v a g er a t e s ，b l a s t o c y s tr a t e s ，a n dt h en u m b e r so f c e l l si nt h et w og r o u p sw e r es i m i l a ra f t e ri nv i t r oc u l t u r e 6 p r e s s i o ni n f l u e n c e dt h ep o s i t o no fb l a s t o c o e l h o w e v e r , t h ee m b r y ow i t h o u tz pf o r m e de m a b a x e sn o r m a l l yt o o t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a te m b r y op o l a r i z a t i o nd i dn o te s t a b l i s hb e f o r eb l a s t o c y s tf o r m a t i o n i t h a dn or e l a t i o n s h i pw i t hs p e r me n t r y p o s i t i o n ，b o r d e r l i n eo f2 - c e l le m b r y o sb l a s t o m e r e sa n d c l e a v a g eo r d e ro f2 - c e l le m b r y o p r e s s i o nf r o mz o n ap e l l u c i d aa f f e c t e db l a s t o c y s tp o l a r i z a t i o n b u t t h eu l t i m a t er e a s o no ft h eb l a s t o c y s tp o l a r i tw a s h tc o m p r e s s i o n k e y w o r d s ：b l a s t o m e r e ；e m b r y op o l a r i z a t i o n ；e m a ba x e s ；m i c r o i n j e c t i o n i v c a n d i d a t e ：w a n gz h o n g w e i s p e c i a l i t y ：d e v e l o p m e n tb i o l o g ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f z h o u j i a b o 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ；( 洼! 翅遗直墓丝重要挂别主塑的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 主中伟日期：易矿年石月豸 f i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：艺冲伟日期：知谚年石月留同 导师签名：厍豺f t g q ：孑锋白循 引言 1 引言 发育到囊胚阶段的小鼠胚胎细胞分化为两种类型：内细胞团( i c m ) 和滋养层。内细胞 团将来形成胎儿和部分胎盘。滋养层将来形成大部分胎盘而不参与胎儿部分的形成。囊胚呈 现轴极性，即胚胎一胚外轴( e m - - a b ) 。i c m 的位置决定了囊胚的不对称排布，它分布于 e m a b 轴的一极与极滋养层共同形成囊胚的胚胎区域。囊胚的e m a b 极性与着床后胚胎 的背一腹极性是一致的，囊胚的胚胎极性标志着将来胎儿背部的朝向。 经典观点认为：未受精的小鼠卵母细胞是圆形的，具有动物极一植物极轴( a v 轴) 。 人为规定第二极体所在位置为动物极，小鼠卵母细胞沿着a v 轴极化，动物极位于细胞质 帽中心，没有微绒毛。胚轴在第一次卵裂或更早就已经发生特化。第一次卵裂平面接近或者 穿过a v 轴。当胚胎发育到囊胚时，胚胎形成e m a b 轴。 第一次卵裂形成两个不同的卵裂球，但这种不同产生的原因还不清楚。卵母细胞中特定 的m r n a s 或者转录因子的不均匀分布可能导致2 细胞胚胎两个卵裂球的不同。细胞骨架的 不均匀分布也可能导致这种差异。第二次卵裂不同步，先卵裂的半球分裂形成囊胚的内细胞 团。囊胚腔的形成是卵极性的内在特性所决定的，2 一细胞阶段就已经开始建立。第一次卵裂 平面接近精卵融合位置。卵母细胞表面8 0 的区域覆盖微绒毛，精子可在这些覆盖微绒毛区 域与卵融合。 最近的很多实验对经典的观点提出了质疑。认为哺乳动物胚轴的建立不依赖于着床前胚 胎的卵裂形式。囊胚形成过程中发生的细胞分化，是由经历了多次有丝分裂发生致密化的胚 胎细胞之间相互作用调控的。 1 1 精子穿入位置与胚胎极性的形成的关系 许多生物中，在朱受精的卵母细胞中就已经出现极化的现象，特化出动物极和植物极轴 ( g i l b e r ts f , 2 0 0 6 ) 。例如海胆、蟾蜍胚层的分布取决于一些因子在动物极一植物极轴上的特化 性分布。在一些动物中，精子穿入位置也被认为是胚胎后期发育不对称的关键。在海鞘类动 物，精子穿入会引起一系列的细胞质重组，这将决定第一次卵裂后细胞的分布。在青蛙，精 子穿入位置影响皮质旋转的方向，最终决定了胚胎的背腹轴。在这些例子中，卵母细胞极性， 以及第一次卵裂之前的一些事件对以后胚胎发育的类型起决定性作用。 最近不同实验室的研究互相矛盾的很多。争议的重点是s e p 和卵母细胞的极化是否相 关；动物极的位置是否能用第二极体的位置作为标志；第一次卵裂平面是否受到精子穿入的 影响。 1 1 1 精子优先穿入卯母细胞的位置 精子穿过透明带之后并非立即进入卵母细胞，而是在卵周隙中游走，寻找适当位置进入 东北农业大学理学硕十学位论文 i i i 卵母细胞。精子从什么位置进入卵母细胞存在很多争议，一般认为精子从接近第二极体的位 置进入卵母细胞。z e m i c k a - g o e t zm 的实验室第一次提出第一次卵裂平面和精子穿入位置 ( p i o t r o w s k ak ，2 0 0 1 ) 以及第二极体的位置相关( 例如，第二次减数分裂的位置用第二极体的 位置来标记) 。并且z e m i c k a - g o e t zm 的实验室证明精子在植物极半球穿入。然而，h i i r a g it 的实验室证明，精子优先( 6 3 ) 从含有减数分裂染色质的半球穿, n ( h i i r a g it ，2 0 0 4 ；m o t o s u g i ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。这种矛盾还需要进一步的确认。在注射h c g l 5 1 6 小时后能检测到受精卵的 受精锥，可以将受精锥作为精子穿入位置和第二极体的位置进行比较。精确的确定精子穿入 位置，对于第一次卵裂平面的确定是至关重要的，如果精子在动物极附近穿入，那么 z e m i c k a - g o e t zm 的预想( 第一次卵裂平面接近动物极和精子穿入位置) 和h i i r a g it 的预想 ( 第一次卵裂平面从精子穿入位置和动物极之间穿过) 就很难区别对错，如果精子从植物j 卜 球穿入那么两个观点就十分矛盾。 1 1 2 精子穿入位置和第一次卵裂的关系 精子入卵导致皮质旋转，钙离子波动等一系列事件，这些事件很可能影响早期胚胎分裂 方式。z e m i c k a g o e t zm 用荧光珠标记精子穿入位置，跟踪这一位置到囊胚( z e m i c k a - g o e t zm ， 2 0 0 1 ) ，结果表明第一次卵裂平面和精子穿入位置靠近。但是用荧光珠进行标记的方法还存在 争议，这种方法还需要进一步验证，h i i r a g it 报道标记在细胞膜上的荧光珠在卵裂的时候向 卵裂沟迁移( d a v i e st j ，2 0 0 2 ；p l u s abe ta 1 ，2 0 0 2 ) ，如果荧光珠在胚体上的位置不能确定，那么 它将不能作为标志物使用。第一次卵裂平面和精子穿入位置是否存在某种特定关系还不确定。 1 1 3 精子穿入位置和囊胚极性 一般认为，精子穿入可以造成卵母细胞的胞质重新分布，从而影响胚胎发育命运 ( p i o t r o w s k ak ，2 0 0 1 ；r o b e r t i sde ta 1 ，2 0 0 0 ) 。因此在2 细胞阶段，从s e p 起源的卵裂球比它姐 妹卵裂球更早进入下一次卵裂，优先形成i c m 细胞系。 1 2 第二极体与动物极的位置关系 第二极体长久以来一直被作为动物极的标志( g a r d n e rr l ，1 9 9 7 ，2 0 0 1 ；p i o t r o w s k ake ta 1 ， 2 0 0 5 ；p l u s abe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。a v 轴的说法从非哺乳动物而来，并且在两栖动物爪蟾中可以作 为早期卵裂方式的标志特征。但第二极体在小鼠胚胎中是否能作为动物极的标志，第二极体 在胚体上的运动幅度是否会影响它作为早期卵裂标志物还存在很多争议。一些研究表明第二 极体所在位置为第一次卵裂平面所在位置。z e m i c k a - g o e t zm 的研究组认为第二极体的位置 在早期卵裂时不会发生变化，但是h i i r a g it 等的报道说明第二极体的位置在第一次卵裂的时 候向卵裂沟迁移( h i i r a g it 2 0 0 4 ) ，这一观点和g a r d n e rr l 实验室的观点一致( g a r d n e rr l ， 2 0 0 3 ) 。这些差异可能是不同的实验条件决定的，不良的培养条件可能降低第二极体的运动性。 2 引言 1 3 第一次卵裂和胚胎极性 经典观点认为哺乳动物卵裂方式为旋转卵裂，第一次卵裂为经向裂，分裂方向和a v 轴一致，第二次卵裂一个卵裂球经向分裂，另一个卵裂球纬向分裂，两个卵裂球分裂平面互 相垂直。但是近期实验表明小鼠卵裂方式并不是完全按这种方式，假想的a v 轴在小鼠胚 胎卵裂中是否真正存在还有争议。 1 3 1 第一次卯裂和两原核的关系 一般认为小鼠第一次卵裂通常为等分裂，卵裂平面沿动物极植物极方向，称为经向裂。 h i i r a g it 和m o t o s u g in ( 2 0 0 5 ) 认为小鼠原核胚有丝分裂中期，两原核迁移到卵子中心，核 膜破裂之前两原核的共用平面为第一次卵裂面( h i i r a g it ，2 0 0 4 ) 。然而z e m i c k a - g o e t zm 的实 验室认为卵裂平面垂直于两个原核所在的平面，他们认为h i i r a g it 的实验可能是由于细胞松 弛素对实验结果造成了影响( p l u s abe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。但是细胞松弛素的添加并不是造成结果产 生差异的唯一原因，因为细胞松弛素只应用在显微操作处理组，而大多数的数据来自于未添 加细胞松弛素的胚胎，卵裂平面依然为两原核的共用平面( h i i r a g it ，2 0 0 4 ) 。两个研究组的结 果差异可能是由不同的显微观测条件和不同的衡量标准造成的，因为胚胎是一个三维立体结 构，所以要想通过原核所在平面来说明卵裂平面，就要有一个共同的衡量标准。另外不同的 培养条件也可能影响到胚胎卵裂方式，例如用显微镜观察时不同的光照强度也可能对实验结 果造成差异。 1 3 2 第一次卵裂平面和囊胚胚胎一胚外轴的关系 许多动物第一次卵裂和以后的体轴相关，例如线虫类动物c e l e g a n s 第一次卵裂平面和 前一后体轴垂直。而在海鞘类，第一次卵裂沿着前一后轴方向进行。第一次卵裂和体轴的关 系，决定了第一次卵裂后两个卵裂球内成型素信息的不同。 问题是，在小鼠中是否存在第一次卵裂和以后体轴之间的关系。经典实验说明第一次卵 裂后的卵裂球在发育上没有本质的区别，但近期的实验却明显的和这一论断相矛盾。 一些研究组认为2 细胞时两卵裂球分别有形成囊胚时胚胎部分和胚外部分的趋势 ( g a r d n e rr l ，2 0 01 ；p i o t r o w s k ak e ta 1 ，2 0 0 1 ；p l u s abe ta 1 ，2 0 0 5 ) 但是其他报道不能再现这一实 验结果( a l a r c o nv b ，2 0 0 3 ；c h r o s c i c k aa e ta 1 ，2 0 0 4 ；m o t o s u g ine ta 1 ，2 0 0 5 ) 。这些矛盾的产生 可能是由于不同研究组对卵裂球后代产生胚胎一胚外区域的分析方法不同。z e m i c k a - g o e t zm 将囊胚腔底部的一层细胞界定为胚胎一胚外的分界限，由于分界的范围不是很明确，所以不 能清晰的分出胚胎和胚外部分，因为这一分界区域就占据了整个早期囊胚的三分之一，起到 一个缓冲区域的作用。并且将这一区域作为分界区域并没有充足的理f h ( p i o t r o w s k ake ta 1 ， 2 0 0 1 ；p l u s abe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。如果胚胎一胚外界限和2 细胞时两个细胞的界限之间存在关系， 那么必须要运用新实验方法进行进一步的分析。 最近c d x 2 已经被作为滋养层决定因子提出，它在卵母细胞中存在，在2 细胞的时候只 在一个卵裂球中存在( d e bke ta 1 ，2 0 0 6 ) 。d e bk 等( 2 0 0 6 ) 认为2 一细胞时的两卵裂球分别单独 3 东北农业大学理学硕l ：学位论文 形成内细胞团和滋养层。因为这一论断和很多研究相左( a l a r c o nv b ，2 0 0 3 ；c h r o s c i c k a ae ta 1 ， 2 0 0 4 ；m o t o s u g in e ta 1 ，2 0 0 5 ；a l a r c o nv b ，2 0 0 5 ) ，因此还需进一步研究。 最近，一些争议的焦点集中在2 细胞卵裂球的命运是否和包裹在外面的透明带的形状相 关。应用哪种方法确定2 细胞卵裂球后代在囊胚中的分布才更公正有效，小鼠的品系是否影 响卵裂球行为和发育能力，当明显的标记物( 例如第一极体) 位置不固定的时候如何确定卵 裂的方向和类型，当早期阶段囊胚腔不只一个的时候如何确定胚胎一胚外轴，这些问题都有 待于研究。 1 42 细胞胚胎卯裂球的分裂顺序与胚胎极性的形成 小鼠胚胎第二次卵裂是典型的异时分裂。据此人们猜测，2 细胞胚胎卵裂球分裂的顺序 将预示着其后代细胞在囊胚中的分布。有报道认为，2 细胞阶段的卵裂球就已经有了预定的 命运。较早分裂的卵裂球有较强的趋势形成囊胚的胚胎部分，较晚分裂的卵裂球形成胚外部 分。也就是说，2 细胞胚胎卵裂球的分裂顺序预示着囊胚极性即e m a b 轴的建立 ( p i o t r o w s k ak ，2 0 01 ；g a r d n e rr l ，2 0 01 ) 。 大量的研究表明小鼠胚胎的早期模式可能首先表现为一种趋向性，p i o t r o w s k ak ( 2 0 0 1 ) 采用了避免细胞内注射的方法进行细胞示踪，分析2 一细胞卵裂球在囊胚时的发育命运。表明 2 一细胞卵裂球既有形成囊胚的胚胎部分也有形成非胚胎部分的趋势。并且发现首先分裂剑3 一 细胞阶段的细胞易丁形成胚胎部分。有研究表明认为，2 一细胞胚胎两个卵裂球后代在囊胚阶 段被边缘区分开。边缘区是指位于胚体区( 包括内细胞团) 和平行于囊胚腔表面的一层细胞。 边缘区的细胞数依赖于第一次卵裂的角度。该角度与囊胚的胚胎胚外轴有关( p i o t r o w s k a k ，2 0 0 1 ) 。但是，早期的研究没有分析3 细胞胚胎卵裂球在囊胚胚胎和胚外区域的分布，因此 不能排除2 细胞胚胎卵裂球的分裂顺序预示囊胚极性的可能j 2 细胞卵裂球的分裂顺序是否决定了囊胚的极性呢? 这一问题还存在着争议。 w a k s m u n d z k am ( 2 0 0 6 ) 向一个卵裂球中注入荧光标记的右旋糖苗进行细胞示踪实验。跟踪 标记的和未标记的卵裂球的命运一直到囊胚阶段。结果证实囊胚的胚胎和胚外部分的细胞排 列不依赖于最初的两个卵裂球的分裂顺序。a l a r c o nv b ( 2 0 0 5 ) 用质膜标记分子标记早、晚分 裂的2 细胞卵裂球的细胞系，发现第二次卵裂的顺序与囊胚的e m a b 极性无关。2 一细胞卵裂 球的第二次分裂的顺序与囊胚腔形成也无关。这说明早期胚胎细胞是有全能性的( v e m a d e t hb ， 2 0 0 5 ) 。实验证明分离的或重组嵌合体中的早期卵裂球既可以形成1 c m 又可以形成滋养层细 胞，说明它们有自由发育的潜能( f u j i m o r it ，2 0 0 3 ) 。 1 54 - _ 幺wj i g 胚胎卵裂球的排布和胚胎极性 以第一次卵裂平面为参照，小鼠第二次和第三次卵裂分为四种方式，平行于第一次卵裂 平面的分裂称为经向裂( m ) ，垂直于第一次卵裂平面的分裂称为纬向裂( e ) 。形成4 一细胞胚 胎的分裂方式包括m e ( 先经向裂后纬向裂) 、e m ( 先纬向裂后经向裂) 、m m ( 两次经向裂) 、 4 引言 e e ( 两次纬向裂) ，这四种卵裂方式d p m e 卵裂方式最常见。2 0 0 5 年，p i o t r o w s k ak 的实验结果 表明，4 细胞胚胎卵裂球的空间排布，以四面体状为主( 2 p b 与三个卵裂球相连) ，占胚胎数 的8 1 ；胚胎四个卵裂球都与2 p b 相连，2 p b 位于卵裂球中间的占l l ：胚胎两个卵裂球与2 p b 相连，另外两个与2 p b 远离，卵裂球呈菱形排布的占8 。同时，他们对呈四面体排布的胚胎 进行了研究，结果发现，5 2 是由2 一细胞胚胎经m e 卵裂得到，4 8 经e m 卵裂得到。说明2 细 胞卵裂球，优先卵裂的是m 卵裂还是e 卵裂不固定。这与2 0 0 2 年g a r d n e rr l 等得到的实验结果 相符，g a r d n e rr l 还证实2 细胞胚胎经m e 或e m 卵裂后，卵裂球呈四面体排布；经m m 卵裂的卵 裂球都与2 p b 相连；经e e 卵裂或偏分裂，卵裂球呈菱形排布。 1 6 胚胎极性相关分子 和胚胎极性相关的一些分子被相继发现，科学家们试图在分子水平上探索胚胎极性形成 的原因。对o c t 4 、c d x 2 、n a n o g 等一系列分子的研究一定程度上揭示了胚胎极性形成的过程。 o c t 4 是在卵内表达的p o u 结构域蛋白质，在卵裂阶段的胚胎的所有卵裂球中持续表达。 在囊胚阶段仅在i c m 中表达，原肠作用之前在胚胎外胚层中持续表达，直到原生殖细胞形成 时，o c t 4 在生殖细胞系中限制性表达。o c t 4 在胚胎干细胞( e s ) 中也有表达。因此，表达o c t 4 的细胞具有多种分化潜能，在已分化的细胞中o c t 4 下调。s o x 2 ( 一个h m g b o x 转录因子) 在 卵裂阶段的胚胎的所有卵裂球中都表达，在囊胚阶段仅在i c m 和外胚层中限制性表达。s o x 2 与o c t 4 协作共同激活i c m 的某些基因如f g f 4 ，u 仉的转录。这些基因的3 端的增强子包含o c t 4 和s o x 2 两个结合位点，这两个位点距离很近，以使o c t 4 和s o x 2 这两个因子结合成复合体激活 转录。单独的任意一个因子都不能激活靶基因。因此，s o x 2 与o c t 4 协作是i c m 细胞分化平l i 维 持、抑制滋养层细胞命运所必需的，在胚胎极性建立过程中有极其重要的作用( r o s s a n t j , 2 0 0 4 ) 。 果蝇相关同源异型框转录因子2 ( c a u d a l r e l a t e dh o m e o b o xt r a n s c r i p t i o nf a c t o r2 ) e p c d x 2 ，最 早于果蝇体内分离。哺乳动物受精卵从8 一细胞才开始表达c d x 2 ( w a n gq t e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。c d x 2 在早期胚胎的外部细胞和内部细胞中都表达，但是桑椹胚时期，c d x 2 只在外层的卵裂球中表 达，而此时o c t 4 在所有的卵裂球中都表达。c d x 2 在内部细胞的表达下调以及外部细胞的正常 表达说明这一分子可能与胚胎极性相关。有报道显示，虽然牛囊胚滋养层中o c t 4 的转录已经 停止，但是o c t 4 蛋白依然存在( k u r o s a k ase ta 1 ，2 0 0 4 ) ，说明c d x 2 在囊胚时期的表达抑制了o c t 4 表达，滋养层中o c t 4 和c d x 2 能够互相调节( n a k a n i s h io e ta 1 。2 0 0 5 ) 。一旦o c t 4 ；乖 i c d x 2 达到所需 的初始浓度之后它们之间就能互相调节达到一个平衡，这样，它们就能互相抑制彼此在内细 胞团和滋养层中的过量表达。这也就解释了在敲除c d x 2 基因之后o c t 4 又能重新在滋养层样细 胞中表达( s t r u m p f d e ta 1 ，2 0 0 5 ) ，并且滋养层标志基因在o c t 4 敲除胚胎中依然表达洲i c h o l sj e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 n a n o g 是一种同源异型基因，在3 5 天的囊胚内细胞团中表达，并且是植入胚胎的外胚 层标志基因。在敲除n a n o g 基因的囊胚内细胞团和胚胎干细胞都将发育成胚外内胚层。n a n o g 基因的表达和c d x 2 也有一定的关系。n a n o g 在敲除c d x 2 囊胚的外层细胞中也表达，过去的 5 东北农业大学理学硕：i 二学位论文 文献表明n a n o g 只在桑椹胚内层细胞和囊胚内细胞团表达( c h a m b e r sie ta 1 ，2 0 0 3 ；m i t s u ike t a 1 ，2 0 0 3 ) 。这就说明c d x 2 的缺失导致n a n o g 表达异常。n a n o g 蛋白在1 6 细胞和3 2 细胞胚 胎中表达c d x 2 的所有细胞中都能检测到，但在囊胚期n a n o g 只分布在囊胚的内细胞团。早 期胚胎中，c d x 2 敲除和未敲除的胚胎在n a n o g 表达上没有差异。这些结果表明c d x 2 对n a n o g 在囊胚外层细胞表达也有抑制作用。胚胎极性相关的各个分子之间有着错综复杂的关系，不 同时期的表达和调控情况都影响着胚胎发育的方式。 1 7 本实验的研究目的和意义 小鼠机体发育图式( b o d yp a t t e m ) 是从何时开始? 囊胚的e m a b 极性是如何形成? 这 些问题到目前为止仍然阐述的不清楚( t a mp pe ta 1 ，2 0 0 4 ) ，其研究结果差别很大，共至是相互 矛盾的。因此，此问题的进一步探讨对揭示哺乳动物胚胎极| 生的建立，进而揭示发育的奥秘 有着极其重要的意义。本研究以小鼠为动物模型，采用对细胞无毒的f i t c 右旋糖菅和t m r 右旋糖营标记2 细胞胚胎的两个卵裂球，跟踪其发育命运，来研究囊胚e m a b 极性如何形 成：通过胚胎分割和嵌合胚j j f i 传j j 作的方法，研究精子穿入位置、早期胚胎分裂方式和胚胎极 性的关系。 6 材料方法 2 材料与方法 2 1 主要仪器及设备 显微操作仪( 德国l e l c a ) 拉针仪( 日本n a r i s h i g e ) 磨针仪( 日本n a r i s h i g e ) 断针仪( 日本n a r i s h i g e ) 二氧化碳培养箱( 美国f o r m a ) 电子分析天平( 瑞士m e t t l e rt o l e d o ) 超净工作台( 苏州净化设备有限公司) 倒置显微镜( 日本n i k o n ) 照相机( 日本c a n o n ) 实体显微镜( 日本o l y m b u s ) 荧光显微镜( 日本o l y m p u s ) 2 2 主要试剂配制 2 2 1 主要试剂 p m s g ( p r e g n a n tm a r es e r u mg o n a d o t r o p i n 天津市华孚高新生物技术公司) h c g ( h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n 天津市华孚高新生物技术公司) 2 2 2 体外操作液 体外操作液为m 2 或者不添加c a 2 + m 9 2 + 的m 2 液。m 2 用五蒸水配制。配制好的溶液用 0 4 5 p m 和0 2 2 p m 滤膜除菌。分装后4 c 保存并于两周内使用。 2 2 3 活体染液的配制 活体染液h o e c h s t 3 3 3 4 2 的配制：用五蒸水将整瓶h o e c h s t 3 3 3 4 2 配制成1 0 0 1 x g m l ( 1 0 0 x ) 分装。一2 0 保存待用。使用之前加入适量m 2 操作液使其终浓度为l l i g m l 贮存液，常温避 光保存。 2 2 4 荧光标记物的配制 将包装为1 0 m g 的荧光标记物异硫氰酸荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，f i t c ) 标记 的右旋糖苷( 蓝光激发能发出绿色荧光) 和四甲基若丹明( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记 的右旋糖营( 绿光激发能发出红色荧光) 分别用l m l 生理盐水稀释分装在离心管中，使用时 7 东北农业大学理学硕f ：学位论文 稀释至终浓度2 m g m l 使用。 2 3 显微操作针的制备 根据不同需要用垂直拉针仪拉制不同口径的操作针。要求注射针尖端外径在5 1 t i n 左右。 持卵针、斜口针和切割针在拉制时要求很低，。但断针、磨针和拉尖时要注意技巧。 制备持卵针和斜口针时需要先断针，断针后持卵针外径为9 0 9 m 左右，断针之后的持卵 针需要进一步加工，将断完的针放在断针仪电热丝上方，通电后加热电热丝使针尖缩口，继 续加热直至持卵针内径为2 5 1 t m 左右。制备斜口针时先将拉好的操作针在外径2 5 m 处断开， 然后磨出4 5 度左右的斜口。 将磨好的针通过一段粗细适当的橡胶管与注射器相连，将针置于5 氢氟酸中反复吹气 数秒，然后将针移至1 0 管装有三蒸水的大离心管( 5 0 m l 离心管) 中清洗。清洗之后的斜口 针需要在断针仪上烤一下斜口处，使锋利的开口处变钝，以免划伤胚胎。 需要对切割透明带的玻璃针进行拉尖，要求前端细尖不要过长，细尖之后骤然变粗，这 样有利于透明带切割。 2 4 实验动物 所用实验动物为性成熟雌性昆明白小鼠，购自哈尔滨医科大学第二附属医院。饲养于尔 北农业大学动物组织学与胚胎学研究室动物房，严格控制光照条件( 光照1 4 小时；黑暗1 0 小时) 和室内温度2 2 c ，可以自由采食饮水。饲养l 2 周后用于实验。此时为5 - - 6 周，体 重1 8 2 2 9 。 2 5 胚胎的采集 胚胎是从超排合笼后的雌鼠输卵管中获得的，操作液为m 2 液。雌鼠腹腔注射p m s g l 0 i u ，4 8 小时后注射h c g1 0i u 与雄鼠合笼。见阴道栓的雌鼠于注射h c g l 3 1 7 小时用颈椎 脱臼法处死，用镊子撕开输卵管壶腹部取原核胚一卵丘复合体，用o 1 的透明质酸酶作用5 分钟去除卵丘细胞，收集含受精锥胚胎；h c g 后2 4 2 6 小时用同样方法收集原核胚。分别 于注射h c g 后4 4 、4 8 小时自输卵管中冲取2 细胞、3 细胞胚胎。 2 6 胚胎操作及实验方法 2 6 1 受精锥的标记 h c g 后1 3 1 7 小时收集的1 细胞胚胎置于显微操作仪下，观察并收集含有受精锥的胚 胎，观察含有第一极体和受精锥的胚胎，记录第一极体接近受精锥及第一极体远离受精锥的 8 材料与方法 胚胎数量。用切割针将受精锥位置透明带切出一个小口，认为此位置为精子穿入位置。标记 透明带的胚胎置于胚胎培养液中培养。分别于注射h c g 后2 4 小时和4 8 小时进行进一步操作 或观察精子穿入位置卵裂球的卵裂顺序。 2 6 2 原核胚胎的荧光标记 注射h c g 后2 4 2 6 小时收集的原核胚胎。将胚胎置于含有5ug m l 的c b 的m 2 液中。 在显微操作仪下，用事先制备好的注射针对其进行荧光标记物注射，荧光标记物为f i t c 标 记的右旋糖苷，浓度为2 m g m l 。每次操作1 0 枚胚胎，胚胎在体外操作时间小于1 5 分钟。标 记后的胚胎在置于k s o m 培养液中清洗3