（分析化学专业论文）单分子水平上表面吸附行为的研究.pdf

顾一 位论文 摘要 在单分子检测技术出现之前，检测方法主要足基于检测分子的总体平均效应， 即检测大量由一种( 或多种) 对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值。这 一平均效应掩盖了许多特殊的个体信息。单分子检测可以对体系中的单个分子进 行研究，通过分析其某项物理量随时间的变化关系，可以得到某一分子特性的分 布状况或发生特定变化的过程。单分子检测为分子生物学、化学、医学以及纳米 材料等许多科研领域的发展提供了一种有效手段。单分子水平上研究分子在表面 的行为有助于分析表面的性质和表面上分子的性质、分子的结构与构象、吸附解 吸、横向扩散动力学等。 本文主要使用普通型荧光显微镜研究了固液两相界面的单分子吸附行为，包 括建立了单分子水平上定量吸附分析的数据统计方法；比较了不同条件对蛋白分 子吸附解吸行为的影响；用量子点作为染料标记分子，观察脂质体与九d n a 相互 作用。具体工作如下： 1 由于噪音的存在使得信号在一定范围内波动，引起数据统计过程中的误差， 这种误差对于定量分析而言是有较大干扰的。荧光信号强度和背景强度都会随着 入射光强度的变化而变化，但是它们的变化趋势的不同将会引起信号噪音比、信 号背景比的变化，在入射光强度一定的条件下，选择最合适的曝光时间以获取最 大的信号噪音比及信号背景比；保证数据采集过程中参数设置的最优化，最大限 度的减小误差干扰；实验是在单分子水平上进行的，所以需要通过浓度与点数关 系、单步漂白和荧光的特异性来进行单分子的确定；为了保证数据的稳定性和重 现性，采用多次测量取均值和统计分布频率的数据处理方式减小误差。 2 用a l e x af l u o r 5 9 4 染料对牛血清白蛋白( b s a ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 进行了标 记，通过观察、统计荧光点数，分别分析了“软蛋白”b s a 在p h = 3 9 1 、4 8 9 、6 7 8 时以及“硬蛋白”溶菌酶在p h = 4 0 3 、6 8 2 、1 1 0 5 时，在亲水性的玻璃和疏水性的 聚二甲基硅氧烷( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ，p d m s ) 两种不同性质的表面上的吸附量的 变化。其变化与蛋白质的结构、蛋白电荷分布及表面电性有密切关系，因而表现 一定的规律性。 3 初步研究了分别包裹量子点q d5 2 5 、5 8 5 、6 5 5 的脂质体对y o y o 一1 一九d n a 和e t h d 一2 九d n a 在玻璃表面上吸附行为的影响。当p h 5 5 时，九d n a 是处于 自由扩散的运动状态，加入包裹量子点的脂质体能使其吸附固定于玻璃表面。而 且脂质体与d n a 相互作用存在一定的比例关系，并研究了作用时间、加入表面活 性剂和有机物乙醇对它们相互作用的影响。 关键词：单分子吸附；疏水表面；亲水表面：脂质体包裹量子点 h 学分了水甲f ：表面吸附行为的研究 a b s t r a c t b e f o r et h ed e v e l o p m e n to fs i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ( s m d ) m e t h o d s ，m o s to ft h e s t u d i e so fm o l e c u l e sa r eb a s e do na ne n s e m b l ea v e r a g e ，t h a ti s ，t od e t e c tt h ea v e r a g e r e s p o n s e sa n da v e r a g ev a l u e si nh o m o g e n e o u so ri n h o m o g e n e o u ss a m p l e t h ea v e r a g e e f f e c t sc o v e ru pt h es p e c i a li n d i v i d u a li n f o r m a t i o n ，h o w e v e r ，s m dc a ns t u d ys i n g l e m o l e c u l e st or e v e a lh e t e r o g e n e i t i e so ft h es y s t e mb yaw a yo fa n a l y s i s i n gp h y s i c a l p a r a m e t e r s a sf u n c t i o n so ft i m et o g e t t h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a r s p e c i f i c c h a r a c t e r i s t i c so rt h ep r o c e s so fc h a n g e s s m do f f e r sa ne f f e c t i v em e a n sf o rs c i e n t i f i c r e s e a r c hf i e l d ss u c ha sm o l e c u l a rb i o l o g y ，c h e m i s t r y ，m e d i c i n ea n dn a n o m a t e r i a l sa n d s oo n r e s e a r c h e so n s i n g l e - m o l e c u l eb e h a v i o r so nt h es u r f a c e sh a v eag r e a t s i g n i f i c a n c eo na n a l y s i so ft h en a t u r eo fs u r f a c e sa n dm o l e c u l e s m o l e c u l a rs t r u c t u r e a n dc o n f o r m a t i o n ，k i n e t i c so fa d s o r p t i o n d e s o r p t i o na n dl a t e r a ld i f f u s i o n i nt h i s p a p e r , w eu s e d as t a n d a r df l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yt os t u d yt h e s i n g l e m o l e c u l eb e h a v i o ri ns o l i d l i q u i di n t e r f a c e ，i n c l u d i n g ：t h ed a t as t a t i s t i c a l m e t h o d st oq u a n t i t a t i v ea n dq u a l i t a t i v ea n a l y s i sa tt h es i n g l e m o l e c u l el e v e lw e r eb u i l t u p ；t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc o n d i t i o n so np r o t e i nm o l e c u l a ra d s o r p t i o n d e s o r p t i o n b e h a v i o rw a sc o m p a r e d ；t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nq u a n t u md o t s e n c a p s u l a t e di n t o l i p o s o m e sw i t h 九- d n aw a so b s e r v e d t h ed e t a i l sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ee x i s t e n c eo fn o i s ec a u s e ss i g n a lf l u c t u a t e si nac e r t a i nr a n g e ，l e a d i n gt o e r r o r si ns t a t i s t i c a l p r o c e s s ，a n d i ti s s i g n i f i c a n ti nq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s b o t h f l u o r e s c e n c es i g n a li n t e n s i t ya n db a c k g r o u n dc h a n g ew i t ht h ei n c i d e n tl i g h ti n t e n s i t y , b u tt h ed i f f e r e n c e si nt h et r e n d so ft h e i rv a r i a t i o n sg i v er i s et od i f f e r e n ts i g n a l n o i s e r a t i o ，s i g n a l - b a c k g r o u n dr a t i o h e r e i n ，w eu s e daf i x e di n c i d e n tl i g h ti n t e n s i t y ，c h o s e t h em o s ta p p r o p r i a t ee x p o s u r et i m et oo b t a i nt h em a x i m u ms i g n a l n o i s er a t i oa n d s i g n a l - b a c k g r o u n dr a t i o ；w ee n s u r e dt h a tt h ep a r a m e t e rs e t t i n g sa r eo p t i m i z e di n p r o c e s so fd a t aa c q u i s i t i o na n dr e d u c et h ei n t e r f e r e n c eo fe r r o r w ed e t e r m i n e dt h e d e g r e eo fl a b e l i n g ，i ti m p l i e st h a ts i n g l e s t e pf l u o r e s c e n c eb l e a c h i n gc u r v em e a n st h e f l u o r e s c e n c ed o tw a ss i n g l em o l e c u l e ，a n di tp r o v i d e st h ep r e c o n d i t i o nf o rt h en e x ts t e p t oi d e n t i f yas i n g l em o l e c u l e ；w ec o n d u c t e dl i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc o u n t sa n d c o n c e n t r a t i o n ，t h es i n g l e - s t e pp h o t o b l e a c h i n ga n dt h es p e c i f i c i t yo ff l u o r e s c e n c et o v e r i f yt h ed o t sw eo b s e r v e dw a ss i n g l e - m o l e c u l e i no r d e rt oe n s u r et h es t a b i l i t ya n d r e p r o d u c i b i l i t yo fd a t a ，w ed e v e l o p e dad a t a p r o c e s s i n gp r o c e d u r eo fa v e r a g ev a l u e s i i i f r o mr e p e a t e dm e a s u r e m e n t sa sm o r ea s w ec a na n dt h e f r e q u e n c yo fs t a t i s t i c a l d i s t r i b u t i o n st or e d u c et h ee r r o r 2 b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dl y s o z y m ew e r el a b l e dw i t ha l e x af i u o r 5 9 4 d y eb e f o r eo b s e r v a t i o n ，a f t e rt h a tw ec o u n t e dt h ef l u o r e s c e n c ep o i n t so b s e r v e db v f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ac o m p a r is o no fa d s o r p t i o nc o u n t sb e t w e e n ”s o f tp r o t e i n s ” s u c ha sb s ao ng l a s sa n dp d m s ( p o l y d i m e t h y l s i l 。x a n e ) a tp h3 91 ，4 8 9 ，6 7 8a n d ”h a r dp r o t e i n ”s u c ha sl y s o z y m eo ng l a s sa n dp d m sa t p h4 0 3 ，6 8 2 ，11 0 5w e r e c o n d u c t e d r e s p e c t i v e l y a sw ea l lk n o w n ，p r o p e r t i e so fg l a s sa n dp d m sa r e h y d r o p h i l i ca n dh y d r o p h o b i ci n d i v i d u a l l y p r o t e i ns t r u c t u r e ，d i s t r i b u t i o no fp r o t e i nn e t c h a r g e sa n de l e c t r o n i cp r o p e r t i e so fs u r f a c es h o wr e g u l a r i t i e si nac e r t a i nd e g r e e a n d t h ev a r i a t i o n so ft h e i r a d s o r p t i o nc o u n t sa r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h e s ef a c t o r s 3 p r e l i m i n a r ys t u d i e sa b o u tl i p o s o m e se n c a p s u l a t e dw i t hq u a n t u md o t s5 2 5 ，5 8 5 ， 6 55i n f l u e n c e do na d s o r p t i o nb e h a v i o ro fy o y o 1 九d n aa n de t h d 2 九d n a o n g l a s ss u r f a c e w h e np ha b o v e5 5 ，l - d n ai si nm o t i o n ，b u ta f t e ra d d i n gl i p o s o m e e n c a p s u l a t e dw i t hq u a n t u md o t sw o u l df i x e dn d n at ot h eg l a s ss u r f a c e a n dt h e p r o p o r t i o no fd n ai n t e r a c t sw i t hl i p o s o m e se x i s t sas a t u r a t i o nv a l u et h e o r e t i c a l l v w e a l s os t u d i d e dt h ee f f e c t so fr e a c t i o nt i m e ，a d d i n gi no r g a n i cs u r f a c t a n t so re t h a n o lo n t h e i rin t e r a c t io n k e yw o r d s ：s i n g l em o l e c u l ea d s o r p t i o n ；h y d r o p h o b i cs u r f a c e ；h y d r o p h i l i cs u r f a c e ； q u a n t u md o t se n c a p s u l a t e db yl i p o s o m e i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 杏氇日期：2 雨7 ，年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 缈 嘞 厂l 芝 口r l 7 j 伤排鳜 ：勤功 名名签签者师作导 硕l j 学位论文 1 1 单分子检测 第1 章绪论 上个世纪以来，随着检测灵敏度达到分子水平的一系列高灵敏检测技术的应 用，单分子检测迅速发展起来，为分析化学开辟了一个新的领域。单分子检测是 以单个分子为对象，研究单个分子的物理、化学行为，分子间的相互作用、分子 性质等的一门技术。由统计力学的各态遍历假设( e r g o d i ch y p o t h e s i s ) ，某个总体中 单个个体某一物理量的时间平均值等于该物理量在给定时间内的总体平均值，也 就是说，对于一个包含完全相同个体的系综，如果检测时间足够长，单分子检测 与系综检测将得到相同的结果。但许多化学和生物体系是非均相的，而且检测时 间可能小于信号的涨落时间，这样个体的轨迹平均值并不等于系综平均值。因此， 需要用单分子检测来表现分子性质、构象变化的直接动力学记录单分子轨迹， 单分子检测还可给出非均相体系的分子分布信息。同时，单分子检测还可对化学 反应的途径进行实时监测，特别是能在生理活性条件下对生物大分子进行探测并 提供分子结构和功能之间的信息，而这些用传统的检测方法是非常困难、甚至无 法获得的。总之，利用单分子检测能够捕获单个分子随时间变化的分子特性，提 供用传统的宏观测量方法得不到的分子微环境中微观个体信息，排除测量中的平 均效应，在化学分析、生物医学、纳米材料等研究领域都具有潜在的应用价值， 同时是进行单分子操纵和动力学研究的前提。 目前的单分子检测可按原理不同分类如下：基于电学或力学的扫描探针显微 技术( 多用于表面单分子研究) ，包括扫描隧道显微镜( s c a n n i gt u n n e lm i c r o s c o p y ， s t m ) 、原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 、扫描离子电导显微镜 ( s c a n n i gi o nc o n d u c t o rm i c r o s c o p y ，s i c m ) 、静电力显微镜( e l e c r o s t a t i cf o r c e m i c r o s c o p y ，e f m ) 等；基于光学的显微技术和光谱技术( 是单分子检测最常用的方 法) ，包括近场扫描光学显微镜( n e a r f i e l ds c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p e ，n s o m ) 、共 聚焦荧光显微镜( c o n f o c a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ，c f m ) 、荧光技术( f l u o r e s c e n c e ) 、 表面增强拉曼光谱( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 、光镊技术( o p t i c a l t w e e z e r ) 等；基于化学反应的检测技术，包括包括电化学检测( s m e d ) 、化学发光 ( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 检测等j 。这些方法实现单分子检测的共同优点在于：一、空 间分辨率高；二、能捕捉单分子的性质和行为；三、能收集微弱信号且放大检测， 并做相应的分析处理以获取准确的信息。 其中，在光谱学和光学显微镜方面的进展，不仅使得在表面和溶液中检测和 单分了水、ff i 表面吸附行为的研究 成像单分子成为可能，而且可以通过测量单分子的光谱并实时监测其变化而获取 单分子的动态信息。光谱方法具有快速、无损、时间分辨等特点，是研究单分子 化学的一个重要手段，并且单分子光学检测技术具有在凝聚相中探测识别单分子 的能力，在探索化学、分子生物学、分子药物学和纳米材料等方面具有无可比拟 的优越性。但是，多数情况下单分子信号的强度很弱，因此光学信号的放大是单 分子检测中非常关键的问题p ，4 j 。 1 2 界面单分子研究概述 界面是物质相与相之间交界的区域，通常有气液、气固、液液、固固和固 液五种。习惯上常将气液、气固界面称为表面，如固体表面、液体表面，其它 的称为界面，一般两者可以通用。当相对分子质量较大的高分子或固体微粒浓集 在两相界面上时，浓集区域能跨越界面两相的单分子层而渗入到一定厚度的液相 中，其厚度可能从几纳米到几十纳米，可以将这层液膜称为界面相。许多化学反 应和分离过程多与界面性质有关，例如：非均相催化反应、液液萃取过程、离子 交换分离等。在这些过程中，界面的特性对于反应和分离过程的速率及选择性有 着直接的影响。 界面单分子研究指在单分子水平上对分子在各种不同的界面上的吸附解吸、 横向扩散、相互作用等动力学行为进行表征，并探究其原因与机理的单分子检测 方法。界面相对于本体相而言自由能更高，因而倾向于吸附溶质分子来达到热动 力学平衡，吸附过程基本上可分为三个连续的阶段。第一阶段为溶质在溶液中的 扩散，通过液膜而到达吸附剂表面( 膜扩散) ；第二阶段为溶质在吸附剂的孔隙内扩 散( 内扩散) ；第三阶段为溶质在吸附剂内表面上发生吸附。通常吸附反应速率非常 快，在一般情况下，吸附过程开始时往往由膜扩散控制，在吸附接近终了时内扩 散起决定作用，而总的过程速度由第一、二阶段速度所控制。实际上，物质吸附 到表面后其结构通常都会有一定程度的改变。 随着单分子检测技术的不断进步，已在单分子水平上对不同两相界面的聚合 物、聚电解质、简单胶体等大分子吸附解吸进行了一些研究，发现它们的吸附量 有随着分子质量的增加而增加的趋势”】，在了解它们的吸附机理、吸附层结构、吸 附过程、吸附分子间相互作用等方面也取得了一定进展。但蛋白质吸附行为更复 杂，蛋白的大小、净电荷、电荷分布、静电力作用距离、疏水区域等都影响着吸 附量和吸附结构，所以蛋白在表面的吸附量随着温度、浓度、p h 值、离子强度、 蛋白本身性质和表面性质的变化而有不同的表现，尽管蛋白是生命的基本结构和 功能单位，关于蛋白吸附也进行了一定的研究，但是仍有很多现象和原因等待我 们去发现。 目前界面单分子行为已涉及的研究对象主要包括：d n a 分子( 包括寡聚核苷 硕l 二学位论文 酸) ；量子点、荧光有机染料分子如d i i ；蛋白质分子如藻红蛋白( r p e ) 、纤维蛋白 原( f i b r i n o g e n ) 、核酸核糖酶( r n a s e ) 、牛血清白蛋白( b s a ) 、绿色荧光蛋白( g f p ) 等。由于单分子荧光检测在研究生物大分子的活动规律与机理方面有着无法替代 的优越性和广阔的发展空间，本节主要介绍荧光方法用于界面单分子行为的研究。 1 3 荧光方法研究界面单分子行为 1 3 1 单分子荧光光谱识别分子吸附或扩散的基础理论 界面分子的吸附是一个动态的吸附解吸平衡过程，但大部分分子的吸附时间 都比较短暂，只有吸附持续时间达到检测时限的才会被确认。当样品中同时存在 运动状态不同的分子时，能用通过观察单分子荧光光谱的波动程度来区分处于聚 焦在界面上的激发光束内的分子是扩散还是吸附的，具体原则是【6 - 9 】：在检测时间 之内保证有足够大的信号噪音比的前提下，若分子在光束内自由扩散作无规则的 布朗运动，由于它位置在不断地变化会引起短暂而尖锐的荧光波动；若分子发生 吸附而固定，则它位于光束内的位置保持不变从而具有恒定的光子爆发量，荧光 爆发将持续存在直到分子发生解吸，因而其荧光的光子数随时间变化的曲线表现 为一个存在较长时间的、波动较小的、位于发射噪音之内的平台值。把所读取荧 光光子数随时间的变化关系作图，图中荧光的尖锐爆发就是单分子扩散通过激发 光束，而发生强吸附时荧光在发射噪音内呈现出一个稳定的平台，在一个单分子 发生吸附的过程中，仍然会有其它分子偶尔进入其激发光束，从而造成在的荧光 爆发平台之上的尖锐波动。例如，mjw i r t h 等用单分子荧光光谱对分子在色谱分 离过程中“脱尾”现象的成因进行了探究，证明了造成拖尾的原因是表面形貌差异 而导致的强吸附位点的存在【6 】。他们还对s p 6 寡核苷酸在氯化钾水溶液一氯化二甲 基十八硅烷修饰的s i 0 2 表面的快速横向扩散和可逆强吸附用共聚焦荧光显微镜进 行了研究，发现两种运动状态的分子同时存在，用单分子荧光光谱测得的横向扩 散速率是4 10 。6c m 2 s ，解吸速率常数是3s 一，强吸附的分子只占分子总数的lo 【9 1 。 眨眼对于荧光发射来说是一种暂时的能量损失，但光漂白有可能是一种不可 恢复的能量损失，为减小这种能量损失所带来的光谱测量误差，可调节激发光强 度和照射时问来减小光漂白程度，同时这些现象与分子的性质有着直接的关系。 荧光漂白后恢复i l m l 2 1 ( f l u o r e s c e n c er e c o v e r ya f t e rp h o t o b l e a c h i n g ，f r a p ) 或荧光相 关光谱( f c s ) 1 3 1 可以精确测定横向扩散系数，并且f r a p 可用于同时地检测吸附动 力学常数以及表面扩散速率常数【1 4 , 1 5 j ，f r a p 技术需要的荧光基团的浓度较高，因 此它不受自发背景荧光的限制，但f r a p 的时间分辨率为毫秒尺度，而f c s 技术 既能够提供动态特性，也能够提供灵敏度。 挚分了水甲f ：表：西吸跗行为的研究 1 3 2 界面单分子荧光检测技术 荧光方法指用荧光标记或通过本体自发荧光来显示和追踪单个分子以获取分 子的构象和动力学信息的方法。由于荧光信号测量灵敏度高而且光子对分子干扰 极轻微，所以是研究单分子最灵敏、最简便的方法之一，尤其是对于需要观察细 胞内单分子实时变化的细胞生物学研究【4 1 。 在激发光照射下，荧光分子从基态激发到激发态，然后发射光子返回到基态。 这样的循环过程中产生大量光子形成“光子爆发”( p h o t o nb u r s t ) 。在凝聚相，一个 分子的荧光辐射通常按照四个步骤来循环：一、电子从基态向激发态跃迁，其速 率随着激发光功率的增大而线性增加；二、电子在激发态的内弛豫过程；三、由 电子激发态向电子基态的辐射或非辐射式跃迁，其速率与激发念寿命有关；四、 电子基态的内弛豫过程。对于凝聚相中的小分子，振动和转动弛豫发生在皮秒量 级，而激发态的寿命和吸收时间在亚纳秒至纳秒量级，因而荧光的周期主要由吸 收( 第一步) 和发射( 第三步) 步骤决定。根据荧光寿命和分子在激光束中停留的时 间，可算出单个分子发射的最大光子数为1 0 5 1 0 6 个。由于光学和溶剂噪音限制，目 前激光诱导荧光的检出限约为1 0 1 3m o l l ，采用高数值孔径物镜和高效单光子计数 雪崩光电二极管( a v a l a n c h ep h o t o d i o d e ，a p d ) ，能接收到约5 1o 的荧光光子。 这样从一个荧光分子上可以收集到五千至五万个光子，足以进行单个分子的探测、 光谱辨认和对反应的实时监测。对于生物大分子如蛋白质和核酸，可以用荧光分 子标记来达到单分子检测的目的。常见的荧光分子主要包括有机染料分子、荧光 蛋白分子、共轭高分子等和近年来开发出的一些新的荧光分子，如量子点、树枝 状高分子、小肽片段等。 单分子荧光检测除了应用于界面分子构象研究外，还广泛用于读取界面分子 动力学信息，如吸附解吸、旋转、扩散、分子间相互作用等。荧光方法应用于单 分子检测的关键是消除拉曼和瑞利散射以及杂质荧光等背景的干扰。目前用于识 别界面单分子的荧光方法可分为两大类，侧重于时间分辨的荧光光谱法和侧重于 空间分辨的荧光成像法。荧光光谱法方法主要有荧光寿命( f l u o r e s c e n c el i f e t i m e ) 、 光子爆发量( p h o t o nb u r s ts i z e ) 、时间分辨荧光各向异性( t i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c e a n i s o t r o p y ) ，将这些方法联合应用能有效降低信号识别上的误差。而荧光成像中主 要利用各种成像技术，可采用高效滤光片、共聚焦、近场和隐失场激发以减少激 发体积来有效地削弱背景，提高信号噪音比。 荧光寿命是指分子分子吸收能量后电子由基态被激发到单线激发态后在单线 激发态所平均停留的时间。单分子的荧光寿命测定的准确性取决于能检测到的光 子数及本身荧光寿命的差异，不仅与其自身的性质有关，还与它所处的局域环境 有关，因而可以通过荧光标记生物大分子的某一特殊位置来检测界面生物大分子 硕l j 学位论文 构象的变化和重排等【l 6 1 7j 。并且荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础， 不但可以揭示分子的结构、动力学方面的信息，而且还是获取许多分子间或分子 内的弱相互作用信息，特别是动态信息的唯一手段，例如分子在界面上的组装、 蛋白质或其它大分子在固液界面吸附过程中的构象调整等。随之发展而来的荧光 寿命成像显微技术是把时间分辨荧光光谱学的高时间分辨率和荧光显微技术的高 空间分辨率相结合运用的一种新方法，特别适合于当两种生物样品的荧光光谱非 常近似、光谱技术无法将其区分开的情况下。 光子爆发量适宜于光谱性质相似分子的识别，且有只需单激发光源和单检测 通道装置的简易特点。时间分辨荧光各向异性与分子的旋转驰豫过程有关，可用 于扩散单分子的识别。 单个分子的荧光强度存在涨落波动及具有偏振荧光特性是单分子荧光的重要 特征。偏振荧光特性是指分子只吸收那些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致 的光子，并发出具有一定偏振方向的荧光，分子的荧光强度受到激发光的制约。 因此，如果固定激发光的偏振方向，对于标记于生物大分子的某一特殊位置的荧 光分子，其荧光强度就会随着生物大分子在反应过程中构象的变化而变化，可以 利用单分子的这种重要特征来研究和推测界面生物大分子的结构和功能。 目前，根据检测的原理不同，荧光成像方法应用于界面单分子研究的方式主 要包括宽场和扫描两种，宽场方法中常见的包括落射式荧光显微镜 ( e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 和全内反射式荧光显微镜( t o t a li n t e r n a l r e f l e c t i o n f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) ，扫描方法中使用最多的是共聚焦显微镜( c o n f o c a l m i c r o s c o p y ) ；f 1 近场扫描光学显微镜( n e a r f i e l ds c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p y ) 。 宽场检测采用的检测器是阵列电子耦合器件( c h a r g e c o u p l e dd e v i c e ，c c d ) ， 可以同时收集所有像素的信息，适用于以成像的方式检测生物及化学反应过程， 是研究活体细胞研究的一种常用方法，但时间分辨率主要受读出时间限制。其中 一种重要照明方式是全内反射式照明。这种照明方式激发体积小，集中在界面的 薄层内从而大大降低了背景干扰，可以显著提高信噪比，适合于进行表面及界面 上的单分子研究。 共聚焦技术通常是结合荧光相关光谱( f c s ) 共同完成的【1 8 】，最早将这两者结合 起来应用于单分子检测的是r i g l e r 等【1 9 】。从荧光相关光谱衍生出来的技术还有荧 光互相关光谱( f l u o r e s c e n c ec r o s s c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ，f c c s ) 、共聚双光子激 发、时间相关单光子计数( t i m ec o r r e l a t e ds i n g l ep h o t oc o u t i n g ，t c s p c ) 、扫描荧 光相关光谱( 或称图像相关谱) 、全内反射荧光相关光谱等。相对于荧光相关光谱， 荧光强度分布分析( f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd i s t r i b u t i o na n a l y s i s ，f i d a ) 和光子频率 统计( p h o t o nc o u n t i n gh i s t o g r a m ，p c h ) 是近些年发展起来的新技术，它们弥补了 荧光相关光谱在捕捉荧光涨落信息时的缺陷，二者的结合还可以给出复杂体系中 学分了水i p 一卜表面吸附行为! j 勺研究 的大量统计信息。 1 3 2 1 全内反荧光显微镜技术( t i r f m ) 光从光密介质传播到光疏介质且入射角大于临界角时，入射光全部反射回光 密介质，同时由于光的波动效应在界面处的光疏介质内产生一个振幅随着离界面 的距离以指数形式衰减的电磁波隐失波。它沿着入射面上的介质边界传播， 是一种非均匀波，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈 指数衰减。恰好处于界面薄层范围内的荧光分子才能被这个逐渐衰减的场激发。 获取在光漂白之前最大的检测信号光子数和得到最好的信号背景比这两个 方面是单分子检测的重要因素，但后者是决定性因素。全内反射式荧光显微镜能 减小探测体积、有效减少背景干扰从而提高信号噪音比。目前有棱镜型和物镜型 两种。棱镜型t i r 有利于获取高的信噪比，但对样品的厚度有限制；物镜型t i r 虽然在获取较好的信噪比方面不如棱镜型，却能观察较厚的样品，从而使其能与 扫描探针显微镜结合应用于单分子成像技术【1 , 2 0 】。 现今对于全内反技术的应用有一些改进，如：tpb u r g h a r d t 等将铝膜镀在玻璃 表面，修饰过的膜增差t i r 和未经修饰的t i r 分别用于罗丹明标记的肌纤维成像， 对照实验结果发现前者的背景和检测体积都明显减d , t 2 1 】。能改变入射角的变角度 全内反荧光显微镜是研究表面对其数百纳米范围内的分子的表面吸斥力的有力手 段【2 2 1 。 1 3 2 2 共聚焦荧光显微镜( c f m ) 结合荧光相关光谱( f c s ) 1 荧光相关光谱 荧光相关光谱( f c s ) 2 3 彩1 是一种利用共聚焦技术减少样品照射体积、降低散射 光影响从而实现单分子检测的新方法。该方法是通过测定溶液中微区内( 通常小于 1 0 。1 5l ) 粒子由于布朗运动或化学反应而产生的荧光强度的变化波动来反映的荧光 涨落信号，并对荧光强度信号随时间变化的函数进行分析，从而获得粒子的结构、 所处微观环境、微观动力学作用等方面的相关信息。由于这种方法具有时间分辨 率高、测量时不破坏体系的平衡状态及较高的空间分辨率等优点，f c s 技术在生 命科学领域，特别是在活体动态过程的研究应用中显示出广阔的前景，被广泛地 应用于测量扩散速率、体系局部浓度、分子间相互作用等。 基本原理：通过归一化自相关函数( n o r m a l i z e da u t o c o r r e l a t i o nf u n c t i o n ) g 例 将荧光强度的涨落与迟延时间r 相关，定义式n ) 为 ? 。 奄fft ) 奄ffe + t1 b ft ，2 _ 一 ( ff 。 其中，f “) ：荧光信号强度；6 f “) = ，“) ：表示荧光强度相对于平 均值的涨落： ：荧光强度平均值；r 多f ( t + o ：经迟延时间t 后的荧光涨落。荧光 硕 j 学位论文 强度涨落自相关函数g “) 的宽度取决于粒子的扩散系数和激发区域的空间尺寸， 而幅度取决于激发区域内荧光粒子的数目。粒子受激发发出荧光，到达探测器的 荧光强度与粒子浓度、激发效率和收集效率存在着正比关系。其中，粒子浓度取 决于扩散过程；激发效率取决于粒子的光学和光谱特征，如光子激发的激发面积、 荧光量子产率、荧光淬灭和漂白速率等等，在饱和激发的情况，还与饱和激发面 积和激发光强度有关；收集效率取决于实验装置的光学特征，例如光路和物镜的 光学参数、共焦小孔的位置和大小等等。自相关函数包含着样品的平衡浓度、反 应动力学和分子扩散速率等信息。自相关函数开始时振幅反比于检测体积内的分 子数，然后从其初值随着时间衰减，而这种衰减取决于分子的扩散速率。比如， 快速移动的自由荧光配体比结合了分子后移动速度减慢的配体其自相关衰减要快 得多 2 6 , 2 7 】。 f c s 最新的技术发展是与双光子激发( t w o p h o t o ne x c i t a t i o n ) 结合应用的f c c s 技术，其测量的是激发光谱近似而发射光谱不同的两种荧光标记物同时被不同波 长的光激发，在两个探测通道内荧光的相关性 2 s l 。f c s 主要分析相关函数的形状， f c c s 则主要分析互相关函数的幅度或一致性，互相关函数的幅度代表了通过激发 体积的双色粒子的浓度。这种方法的优点是只有同时标记了两种染料的分子才能 产生相关荧光，任何引起两个荧光探针结合或者分离的反应都可以被监测到，在 理想状况下，如果样品中没有双色标记的粒子，相关度就是零。 2 共聚焦荧光显微镜结合荧光相关光谱研究界面单分子行为 c f m 的工作原理是从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体 上，若物体恰在焦点上，则反射光通过原透镜应当汇聚回到原光源，这就是共聚 焦。共聚焦显微镜利用这一原理，在反射光的光路上加了一块半反半透镜( d i c h r o i c m i r r o r ) ，将已经通过透镜的反射光折向其它方向。它的优点是通过移动透镜系统 可以对一个半透明的物体进行三维扫描；能把探测体积减小到1 0 。2m l 以下因而 灵敏度高。新近开发使用的激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统 光学显微镜的基础上采用共轭聚焦原理和装置，利用计算机进行数字图象处理的 一套观察、分析和输出系统。其优点是能够对观察样品进行断层扫描和成像。目 前也有应用全内反荧光相关光谱( t i r f c s ) 对用c 1 8 修饰的石英水两相界面上的单 分子进行计数的研究报道【2 引。 1 4 界面单分子的研究现状 影响单分子在两相界面行为的因素主要有：界面的性质、与界面作用时间、 分子本身的性质、分子的标记度等。两相界面单分子行为中研究最多的是吸附行 为，而其吸附行为中的一个重要方面是弄清其吸附机理，因为这对于了解其吸附 量、吸附层结构、吸附动力学等都有重要作用。 ，7 单分了水、f ， ：表面吸附行为的研究 1 4 1 检测固液两相界面的单分子行为 处于固液两相界面的单分子主要有吸附解吸、横向扩散等动力学行为，对此 相应的现象和机理有过一些研究报道。现在用不同材料或不同制备方式修饰的固 体表面的研究正逐渐受到越来越多的关注。研究固液两相界面为基础分离理论如 色谱分离和电泳、分子基因学、生物传感设计及生物兼容材料等的研究提供了依 据。常用于固液两相界面研究的手段有：在超高真空中研究固液界面的非原位技 术，包括低能电子衍射、俄歇电子衍射s n x 射线衍射等；电化学方法；谱学方法， 包括紫外可见光谱、椭圆偏振光法、拉曼光谱、红外光谱等；显