（有机化学专业论文）蛋白质晶体生长中聚集体及热历史效应影响的研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工怍j 同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了观确的说明并表示谢意。 学位沦文作者签名：斛蓥导师签字：、1 番历台导师签字：尹、l 黔6 琶 i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂蕉有关保留、使用学位论文的舰定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 蕉j 玎以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 瓣萋 签字f 1 期：2 0 0 ，年丘月1 1e 1 导师签字矗1 卷皓 签字日期：2 多年年月确 山东师范大学砸一b 学位论文 摘要 生物大分子( 包括蛋白质、核酸和病毒等) 对生物体的生命活动起着十分重 要的作用，这是由它们具有特殊的空间结构所致。随着生物学领域对精确的生物 大分子结构需求的日盏增加，尤其是利用单晶x 射线衍射法得到的三维结构，使 得研究生物大分子的生长越来越受到重视。然而，生物大分子的结晶相当困难， 从某种意义上讲这是生物大分子结构测定的限速因素，目前对生物大分子的晶 体的生长机理，成核过程，基本的热力学和动力学参数等的认识很少，所以进行 生物大分子的晶体生长研究就显得非常有必要。而光散射技术和原子力显微镜是 进行这一研究的非常重要的工具。 光散射技术广泛应用于生物大分子的晶体生长研究中，它包括静态光散射和 动态光散射两种。利用静态光散射可以测定蛋白质溶液渗透的二级维里系数；利 用动态光散射可以测定蛋白质溶液的水平扩散系数，获得溶液中蛋白质粒子的流 体力学半径及分布情况，分离蛋白质结晶的成核与生长过程，研究大分子的聚集 行为和晶体生长的动力学。借助光散射，可以实现蛋白质晶体生长过程的动态控 制。近些年光散射仪器向着小型化、轻便化的方向发展，光散射技术不断得到改 进，日益完善，不仅用于地面实验，也应用于空间领域的蛋白质晶体生长研究中。 原子力显微镜，以其极高的分辨率和对细胞和生物分子的连续图像扫描的优 势，如今已经成为研究生物大分子形状、构型、行为、功能与构型关系以及聚集 的强有力的工具。借助于原子力显微镜，详细而精确的聚集体表面形态可以很容 易的观察到，甚至可以达到亚埃级的分辨率。 本文就是利用光散射和原子力显微镜对蛋白质溶液的聚集体进行研究，主要 包括以下几个方面的内容： 1 生长溶液中溶菌酶聚集体的研究 我们借助于动态光散射和原子力显微镜研究了在无n a c l 和有n a c l 存在时溶 菌酶溶液中聚集体的分布情况，研究了个小时之内和十二个小时之内的溶菌酶 溶液中聚集体的变化，并且对于结晶和不结晶的情况做了对比，也研究了温度变 化对溶菌酶溶液中聚集体变化的影响。 2 溶菌酶溶液热历史效应研究 蛋白质晶体生长与许多参数有关，但这些参数中蛋白质溶液的保存时间引起 山东师范大学碗士学位论文 的结晶变化研究甚少。m ic k a e l 等发现溶菌酶溶液保存时间的长短对最终生长出 的蛋白质晶体有一定程度的影响，晶体数目和尺寸随着存放时间发生变化，加入 沉淀剂后保存四周的溶菌酶溶液中的晶体数目有减少的趋势。宏观上的变化最终 是由于微观变化而造成的。我们利用d l s 技术对溶菌酶溶液中聚集体随保存时问 变化进行了研究，以期能发现宏观变化的微观原因。配4 0m g m 溶菌酶与含蹦 ，lc 1 缓冲溶液，置于生化培养箱中2 0 ，8 c ，3 6 c 保存，连续五周，每周做一 次队s 测量。实验表明，溶液中的聚集体由大小两部分的聚集体组合而成( 我们 分别称之为寡聚体和多聚体) ，随着保存时间的增加，寡聚体尺寸变化不是很明 显，多聚体的尺寸逐渐减小，这表明蛋白质溶液逐渐“均一化”。 将溶菌酶溶液分别在4 和3 6 保存2 4 小时，再按照一定的比例混合，加 入沉淀剂后放在室温培养晶体，晶体的数目会有不同随着加热溶菌酶比例的增 加，平均每生长阱的晶体数目减少。我们将在3 6 。c 与4 保存2 4 小时的溶菌 酶溶液按照不同的比例在室温下混合以后加入沉淀剂做动态光散射测量，发现随 着加热溶菌酶比例的增加，溶液中的寡聚体尺寸有增加的趋势。 ： 用原子力显微镜研究刀豆蛋白a 的聚集体 我们做了结晶和不结晶的条件下刀豆蛋白a 的原子力显微镜观测，对二者聚 集体的变化做了比较。在实验过程中，我们发现了在刀豆蛋白a 溶液中存在的环 状聚集体，光散射测量也显示了相应的结果，证明刀豆蛋白a 分子之间确实比较 容易相互作用而聚集。 关键词：动态光散射，原子力显微镜，聚集体，溶菌酶，刀豆蛋白a 分类号：0 6 2 9 7 3 一些查堕型查兰婴主兰垡堡兰 _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ 一一 a b s t r a c t b i o m o l e c u l e s ( e g ，p r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d sa n dv i r u s e s ) w i t hs p e c i f i c s t r u c t u r e s p l a yi m p o r t a n tr o l e si nm a n yb i o l o g i c a lp r o c e s s e s t om e e ti n c r e a s i n gd e m a n d so f p r e c i s eb i o m o l e c u l a r3 ds t r u c t u r e s e s p e c i a l l yp r o t e i ns t r u c t u r e sb yx r a yd i f f r a c t i o n ， i ti sm o r ea n dm o r en e c e s s a r yt os t u d yt h e i rc r y s t a lg r o w t h h o w e v e r , d u et o t h e d i f f i c u l t i e s i np r o t e i nc r y s t a lg r o w t ha n dl e s sk n o w l e d g eo n b i o m o l e c u l a rc r y s t a l g r o w t hm e c h a n i s m ，p r o c e s so fn u c l e i cf o r m a t i o n ，b a s i ct h e r m o d y n a m i ca n dk i n e t i c p a r a m e t e r s ，i t i sv e r yi m p o r t a n tt ol e a r nc r y s t a lg r o w t hm e c h a n i s m l a s e rl i g h t s c a t t e r i n gi sa ni m p o r t a n tt o o lo f c o u r s ea sw e l la sa t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a r m ) l a s e r l i g h ts c a t t e r i n g ，i n c l u d i n gt w od i f f e r e n tm e t h o d o l o g i e s ，s t a t i cl i g h t s c a t t e r i n g ( s l s ) a n dd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ( d l s ) ，i sw i d e l ya p p l i e di nr e s e a r c ho f c r y s t a lg r o w t ho fm a c r o m o l e c u l e s l sc a r lb eu s e dt om e a s u r et h eo s m o t i cs e c o n d v i r i a lc o e f f i c i e n to fp r o t e i ns o l u t i o n d l si sa l l o w e df o rd e t e r m i n a t i o no ft h e t r a n s l a t i o n a ld i f f u s i o nc o e f f i c i e n ta n dc a l lp r o v i d ei n f o r m a t i o na b o u tt h es i z ea n d d i s t r i b u t i o no fm o l e c u l e si ns o l u t i o n i tc a r la l s ob eu s e dt os e p a r a t en u c l e a t i o na n d g r o w t hp r o c e s s e si np r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o na n dr e s e a r c ha g g r e g a t i v eb e h a v i o ra n d k i n e t i c so f c r y s t a l l i z a t i o n i nm a c r o m o l e c u l a r s y s t e m s s o t h e d y n a m i c a l c r y s t a l l i z a t i o np r o c e s s e sm a yb ec o n t r o l l e d i nr e c e n ty e a r s ，l a s e rl i g h ts c a t t e r i n g i n s t r u m e n t a t i o n sh a sb e c o m ec o n t i n u o u s l yp o r t a b l ea n dm i n i a t u r i z a t i o na n dt h e t e c h n i q u eh a sg r o w ng r a d u a l l yp e r f e c t n o to n l y i ti s a p p l i e d i nt h eb a s e m e a s u r e m e n t s ，b u ta l s oi su s e di nt h es p a c ee x p e r i m e n t so fp r o t e i nc r y s t a lg r o w t h w i t ht h eh i g hr e s o l u t i o na n dc o n t i n u o u s i m a g e so fc e l l sa n db i o m o l e c u l e s ， a f mh a sr e c e n t l yt u r n e dt ob eap o w e r f u lt o o lf o rt h es t u d yo fb i o m o l e c u l a rs h a p e s ， c o n f o r m a t i o n s ，b e h a v i o r s ，r e l a t i o n s h i pb e t w e e nf u n c t i o na n dm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n ， a n da g g r e g a t i o n s w i t ht h ea p p l y i n go fa f m ，t h es u r f a c em o r p h o l o g yo fs p e c i f i c a g g r e g a t e sm a yb er e a d i l yo b s e r v e d ，p o t e n t i a l l yt os u b a n g s t r o mr e s o l u t i o n i nt h i sd i s s e r t a t i o na g g r e g a t e si np r o t e i ns o l u t i o nh a v eb e e nm a i n l ys t u d i e db y d l sa n da f m t h et h e s i si sc o m p o s e do f t h r e ep a n sa sf o l l o w s 1 t h es t u d yo na g g r e g a t e so f l y s o z y m ei ns o l u t i o n 3 坐查堕薹查兰婴圭兰竺堡苎 t h ed i s t r i b u t i o no fa g g r e g a t e si nl y s o z y m es o l u t i o nh a sb e e ni n v e s t i g a t e db yt h e m e t h o do fd l sa n da f mi nc a s et h a tt h e r eh a sn a c lo rn o t t h ec h a n g e so t a g g r e g a t e sw i t h i n1 ha n d12 hh a v eb e e ns t u d i e d a n dt h ec o m p a r i s o nh a sb e e nm a d e b e t w e e nt h et w oc o n d i t i o n sw h e t h e ri tc a nc r y s t a l l i z eo rn o t b e s i d e s ，t h ei n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo nt h ec h a n g eo f a g g r e g a t e si nl y s o z y m es o l u t i o nh a sb e e nr e s e a r c h e d ， 2 t h e r m a lh i s t o r 3 ，e f f e c to nl y s o z y m es o l u t i o n t h es t o r a g et i m ea n dt h et e m p e r a t u r eh a v ei n f l u e n c e do nt h ec r y s t a la m o u n ta n d s i z e 4 0m g m ll y s o z y m ea n d2 n a c ia r es t o r a g e da tt h r e et e m p e r a t u r e s8d e g r e e 2 0 d e g r e e a n d3 6d e g r e ef o rf i v ew e e k s d l sm e a s u r e m e n th a sb e e np e r f o r m e d “e l 。) w e e k a n dt h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eu n i t sd o n tc h a n g eg r e a t l ya st i m eg o e s u p w h i l ec l u s t e r sg r a d u a l l yd e c r e a s ei ns i z e a n o t h e r e x p e r i m e n t w i t hd i f f e r e n t p r o p o r t i o n a lh e a t e dl y s o z y m es h o w st h em e a ns i z eo fu i n t si n c r e a s e si n c o n s p i c u o a s l 3 ， w i t ht h es t o r a g et i m eg o i n g 2t h ei n v e s t i g a t i o no na g g r e g a t e so fc o n c a n a v a l i na b ya f m t h ea g g r e g a t e so fc o n c a n a v a l i nah a v eb e e no b s e r v e dw h e t h e ri tc a nc r y s t a l l i z e o rn o ta n dt h ec o m p a r i s o nh a sb e e nd r a w nb e t w e e nt h et w oc o n d i t i o n st 0 1 o i d a l a g g r e g a t i o n sh a v eb e e no b s e r v e d ，a sw e l la st h ed l sr e s u l t s ，w h i c hi n d i c a t et h a tt h e m o l e c u l e so fc o n c a n a v a l i naa r ee a s i l yt oi n t e r a c tt of o r ma g g r e g a t e s k e yw o r d s ：l i g h ts c a t t e r i n g a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y , a g g r e g a t e s ，1 3 , s o z y m e c o n c a n a v a l i na c a t e g o d 7n u m b e r ：0 6 2 9 7 3 4 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 微重力科学是近3 0 年来随航天技术的发展而新兴起来的一门学科，它研究 在微重力环境中的物质形态和运动规律。在已开展的一些研究领域，如冶金学、 晶体生长、生物学、流体力学等方面的应用已证明了微重力的研究价值。在国家 高技术发展计划的推动下，我国于8 0 年代后期开始部署微重力研究，经过数年 的努力，目前在国际上已有一席之地【”。在微重力条件下研究分散体系( 包括胶 体科学) ，近年来在国际上倍受关注 “】。 要理解和解释蛋白质生物活性就必须了解蛋白质分子的三维结构。通常，对 于生物大分子( 分予量 2 0 0 0 0 d m t o n ) ，可以通过x 射线衍射了解它们的结构 但是进行x 射线衍射需要有蛋白质的单剐5 订】。目前，在x 射线衍射结晶学中存 在的最主要的障碍是得不到相应的蛋白质晶体或者得到的蛋白质晶体质薰不高。 因此，研究并揭示蛋白质晶体生长过程的机理，显得尤为重要。 生物大分子在微重力条件下的晶体生长实验最早开始于八十年代的中期，近 些年来，国际上观察微重力条件下生物大分子晶体生长的方法可分为两个方向。 一个方向是专门研究如何生长出高质量的晶体，这一个方向中，研究者一般要进 行空间实验，而不能用地基研究来代替，因为空间实验中生长出来的晶体质量通 常要高。另外一个方向主要是研究和定量描述微重力条件下晶体生长的机理，并 找出晶体质量得以改善的原因以理解晶体生长的过程，最终实现人为的控制生长 出来的晶体的质量。这一个方向可以进行地基研究，研究可以采用各种各样的技 术手段，如本论文中采用的光散射技术和原子力显微镜。 光散射技术广泛应用于生物大分子的晶体生长研究中，它包括静态光散射和 动态光散射两种。利用静态光散射可以测定蛋白质溶液渗透的二级维里系数：利 用动态光散射可以测定蛋白质溶液的水平扩散系数，获得溶液中蛋白质粒子的流 体力学半径及分布情况，分离蛋白质结晶的成核与生长过程，研究大分子的聚集 行为和晶体生长的动力学。借助光散射，可以实现蛋白质晶体生长过程的动态控 制。近些年光散射仪嚣向着小型化、轻便化的方向发展，光散射技术不断得到改 进，同益完善，不仅用于地面实验，也应用于空间领域的蛋白质晶体生长研究中。 原子力显微镜，以其极高的分辨率和对细胞和生物分子的连续图像扫描的 优势，如今已经成为研究生物大分子形状、构型、行为、功能与构型关系以及聚 山东师范大学硕士学位论文 集的强有力的工具。借助于原予力显微镜，详细而精确的聚集体表面形态可以很 容易的观察到，甚至可以达到亚埃级的分辨率。 1 1 蛋白质晶体生长方法 蛋白质结晶通常是将蛋白质溶液溶解于含沉淀剂的溶液中，该溶液一般是有 一定p h 值的缓冲溶液，在某些情况下还需要另外加入一些其它物质，如抗菌剂 等。蛋白质结晶需要将上述蛋白质溶液通过一定的方法达到过饱和。形成过饱和 的方法有改变温度、沉淀剂的浓度和p h 值。目前，大多数蛋白质的结晶是基于 改变沉淀剂的浓度来形成过饱和的。改变沉淀剂浓度可以用四种方法：气相扩散 法，液一液扩散法，渗柝法，批量法。在很多文献中可以看到采用上述四种方法 结晶蛋白质i “】。 常用的蛋白质结晶的方法有气相扩散法和批量法，渗析法。 1 1 气相扩散法 气相扩散法，尤其是悬滴法，在蛋白质生长中是最普遍采用的一种方法，它 第一次出现是在结晶t r n a 的实验中。随后，越来越多的人采用这方法来生长 蛋白质晶体。 图1 1 表示气相扩散法的原理。在小液滴中，含有要结晶的生物大分子以及 缓冲溶液、沉淀剂和其它添加剂。在蓄积液中含有比小液滴中更高浓度的沉淀剂。 小液滴和蓄积液之间的平衡过程是通过水或有机溶剂的扩散来完成的。直到最后 两者的蒸气压相等，此过程才结束。如果发生了水从小液滴往蓄积液的转移，那 么小液滴的体积会发生变化，导致液滴中各物质的浓度发生变化，而对于蒸气压 比水高的物质，那么就会有水从蓄积液往小液滴转移的情况。这两种情况对于悬 滴法、坐滴法、和夹心法( 也叫三明治法) 都相同。 气相扩散法中常采用三种沉淀剂：盐，如氯化钠、硫酸铵；有机溶剂，如乙 醇、丙酮；各种分子量的聚乙烯乙二醇( p e g ) 。在盐和p e g 体系中，水从蛋白 质转移到沉淀剂溶液中：而在有机溶剂体系中，有机溶剂是从沉淀剂溶液转移到 蛋白质溶液中。有机溶剂的使用是很有限的，因为它们很容易导致蛋白质的变性。 6 山东师范大学硕： 学位论文 a b 图1 1 气相扩散法示意图 a 悬滴法b 坐滴法c 三明治法 f i g 1 1 t h es k e t c hm a ps h o w i n gv a p o rd i f f u s i o nm e t h o d a h a n g i n gd r o pm e t l l o d b s i t t i n gd r o pm e t h o dc s a n d w i c hm e t h o d 2 ) 批量法 批量法，如图1 2 所示，是将要结晶的生物大分子和沉淀荆混合在一起，并 使最终溶液中的生物大分子立即达到过饱和状态。对于悬滴或坐滴而言，蓄积液 的作用与气相扩散法中不同。它不再起到浓缩悬漓或坐滴溶液的作用，而仅仅起 到维持一个恒定的蒸气压的作用。因为结晶过程是从过饱和开始进行的，形成的 核子一般特大。 山东师范大学硕士学位论文 p r o t e i n1 例 p 斌唧t 甚r j t1 圳 图1 2 撤量法示意图 f i g 1 2 t h es k e t c hm a ps h o w i n gb a t c hm e t h o d 3 ) 渗析法 渗析法，如图1 3 所示，是利用半透膜允许小分子通过而大分子不通过的性 质来调节蛋白质溶液的离子强度或p h 值，使蛋白质溶液慢慢接近过饱和度。这 种方法的优点是：通过有控制的扩散，改变结晶的条件，从而慢慢的达到晶核形 成点。晶体的生长亦可不断地调整，已经产生的沉淀或者微晶可通过外部条件的 改变重新溶解。这种方法可以在低离子强度的条件下应用传统的盐析方法结晶， 既适用于大批量的结晶，也可应用于微量的结晶。 图1 3 渗析法示意图 f i g 1 3 t h es k e t c hm a ps h o w i n gd i a l y s i sm e t h o d 1 2 蛋白质晶体生长的物理化学 1 过饱和 饱和溶液在液相和固相之间存在着热力学和动力学的平衡，在晶体和溶液之 虫查塑蔓查兰堡：! 兰篁丝壅 川化学势是相同的，即： u 。= u 。m ( j + r t i n 声， 其中，“。是标准化学势，y 是活化系数，c 。是物质i 的浓度。饱和溶液中溶 质的浓度用溶解度c ；来定义。 当溶液中溶质的化学势大于晶体的化学势时，就达到了过饱和。通过改变影 响化学势的各种条件( 包括温度、蛋白质浓度、活性系数、盐浓度、压力等等) ， 就能达到改变溶质化学势的目的。过饱和度是结晶的驱动力，它可以定义为溶液 和晶体之间化学势的差异，通常用c c ；和( c c ；) c 。来描述，其中，c 是蛋白质 浓度。应该指出的是，要达到同样的过饱和度，可以采用不同的方法，如改变蛋 白质的浓度，升高或降低温度等等。一般而吉，蛋白质结晶时过饱和度在二1 0 之间，这个值远远超出了小分子晶体生长时的过饱和度值。 过饱和的过程和p h 值、离子强度、液体的电介质常数、温度以及蛋白质的 浓度都有关系。在成核时，过饱和的程度要大于在蛋白质晶体生长时的过饱和 程度。因此，对于过饱和的过程需要精确控制。 在蛋白质晶体生长过程中经常会发现“生长停止”的现象l “j ，表现为，蛋白 质晶体生长到一定的尺寸后不再生长。但是将蛋白质晶体切开，在切开后的晶体 上又开始继续生长，直到一定的尺寸。这种现象可能与蛋白质表面的杂质有关， 杂质会影响对流。 2 成核 新相的成核起源于能量的振荡，而这种能量的振荡是由于过饱和引起的平均 自由能的增大。在大量溶液中成核时，成核是均一的，而在固体颗粒( 如灰尘， 实验设备的玻璃器壁等) 上成核是不均一的。 结晶并不一定在所有的过饱和溶液中都会产生。为了产生一个新相，体系要 克服定的势垒，这个势垒称为晶核活化自由能a g 。如果过饱和度太低，能量 振荡的幅度就不足以太到可以超过势垒的程度。我们可以把过饱和分成两个部 分，不稳定区和亚稳定区，在稳定区( 不饱和) ，晶体不会生长出来；在亚稳定 区，会有晶核生长，但不会有晶体生长；在不稳定区，晶体可以自发生长，见图 1 “其中，实线代表的是溶解度曲线，虚线代表的是“过溶解度”曲线，它除 了和溶质有关外，还和溶液等其它因素有关。 山东师范大学硕士学位论文 亡 n ) o q s a l t 】 图1 4 稳定区，亚稳区和不稳定区示意图 f i g 1 4 t h es k e t c hm a p s h o w i n gs t a b l e ，m e t a s t a b l ea n dl a b i l er e g i o n 对于我们熟悉的沉淀而言，会产生两种类型的沉淀： ( ；t ) 由很小的晶体组成的象晶体的沉淀物。在这种情况下，沉淀曲线位于不稳定 区。晶体的动力学曲线特征是晶体出现的时间延迟非常短。 ( h ) 由于非特异的v a l ld e rw a a l s 吸引力引起的胶状沉淀物或无定型沉淀。这是 新相，而非晶体。在此情况下，沉淀曲线穿过晶体相。 根据小分子结晶理论”，可以得出半径为r 的核，其a g 。由两部分组成： r1 a g p = 【- k t ( 4 x r 。) vi n j + 4 n f r 2 其中，v 是晶体内分子的体积，b 是过饱和度，k 是玻尔兹曼常数，y 是 核子和溶液之间的界面自由能。a g 。是体积和表面的函数，体积函数是负的，而 表面函数为正。表面函数对应于为产生一个新的晶体表面单元所必需提供的能 量；体积函数则正比于过饱和度，描述了从体系自由能降低而产生的能量获得。 a g 。随y 的增大而增大，在y 达到一定值时( 此值称为临界粒子大小，h ) ， a g ! 最大，然后随着y 的增大丽下降。这表明，核子达到临界尺寸y 。是稳定的。 a g 。随着过饱和度降低而降低，随着晶体溶液的界面自由能增大而增大。因此， 高的过饱和度会导致能量瓶颈，而不易产生新相，易于成核。存在的外部颗粒降 低了界面的自由能，增大了成核的频率。这样，当不均成核时，低过饱和是适 1 0 山东师范大学倾仁半位论文 直的。 对于小分子晶体生长，成核速率可以用下式表达： d 。= b 。( 一a g g k r ) 其中，动力学系数b ；是溶解度和动力学参数的积，这表明，溶解度越大， 成核越快。的确，当溶液中有许多自由分子时，它们更容易发生碰撞并连接在一 起。在这种情况下，在相对慢的过饱和速率时成核发生了。当分子溶解度较低时， 成核就会在高过饱和度出现，并且时间延迟较长。此时，晶体就会大量出现。因 此，溶解度高能促进成核。为了更容易成核，可以通过( a ) 将体系尽可能位于不稳 定区；( b ) 尽可能选择使蛋白质溶解度更高的条件。 3 过饱和和成核动力学 成核速率不仅依赖于过饱和度，也依赖于达到成核的途径。即生长晶体时， 平衡动力学依靠试验安排和实验方法的选择( 如气相扩散、渗析等) 。蛋白溶液 平衡速率影响过饱和动力学，因此也就影响结晶过程。降低平衡速率会导致更少 和更大的晶体出现，这是由于当平衡进行时，过饱和逐渐增大，一旦体系达到不 稳定区核子就会产生。假定成核在不稳定区和亚稳定区之间的边界线上发生，那 么生成小的聚集体会导致整个过饱和的降低，因而体系就被进一步驱使进入不稳 定区而生成更多的核子。在这场已存在的晶体的继续生长和生成核子之副类似于 “拔河”的战役中，目的只有个，那就是尽可能快的降低体系的自由能。这样， 一旦有少量晶体出现，如果平衡速率相对于晶体生长速率要快的话，体系将保持 在亚稳定区，阻止核子的继续生成。为了控制过饱和动力学，我们必须知道蛋白 质的溶解度，也需要了解平衡动力学。 目前，一些工作已经对气相扩散法生长蛋自质晶体的主要参数的影响进行了 研究【j ，这些参数有悬滴的体积，悬滴的稀释度，温度等等。研究表明，悬滴体 积的变化是时间的函数，它可以用下式来描述： v v o = d + r 1 8 ) e x p ( 一t r ) 】 v o 是起始液滴的体积，提液滴的稀释度，它是悬滴中沉淀剂浓度与蓄积液中沉 淀剂浓度的比值at 是时间常数，x = q v o p 其中，p o 是纯水的蒸气压， 与 沉淀剂有关。 表1 1 给出- i n 和8 的值。要注意的是，这仅仅是个半经验的公式，这个公 l i 山东师范大学硕士学位论文 式可让我们计算出过饱和度随时间变化的情况。根据上述公式可以计算出的用气 相扩散法生长刀豆蛋白a ( c o n c a n n v a l l i n a ) 时过饱和度随时间变化的曲线| | 7 l 。 表1 1估计悬滴中水蒸发动力学所用时间常数t 的参数值 t a b l ei 1 p a r a m e t e r so f t i m ec o n s t a n tte s t i m a t e df r o m jq 1 i idv t i p 1 h j ti 1 n d y n a m ic sir lh a n g n gd r o p s 4 结晶与溶解度图的关系 虽然测量出每个生物大分子的溶解度图或相图是不太可能的，但是，理解溶 解度图和达到过饱和结晶所采用的方法是非常重要的。 1 ) 气相扩散法 在气相扩撒法中，一种很常见的情况是，蓄积液中沉淀剂浓度是悬滴中沉淀 剂浓度的二倍。从图1 5 可以看出，蛋白质从不饱和的a 点( 浓度为c ，) 丌始浓 度逐渐增大，最终达到过饱和的b 点( 浓度为c 1 ) 。对于图中( a ) 的情况，最 终实验结果得不到蛋白质晶体，而( b ) 的情况却不同，可以生长出晶体，因为 在( a ) 中的不到晶体，b 点将一直位于亚稳定区，而当有晶体出现时，溶液中 的蛋白质浓度会由b 点向c 点变化( c 点位于溶解度曲线上) 。 ab 图1 5 用气相扩散法生长晶体时大分子和沉淀剂浓度的关系及溶解度曲线示 意图 横轴为沉淀剂的浓度，纵轴为蛋白质的浓度 a 生长不出晶体b 生长出晶体 1 2 山东师范大学硕上学位论文 f i g 1 5 s k e t c hm a ps h o w i n gt h er e l a t i o nb e t w e e np r o t e i na n dp r e c i p i t a t i o n c o n c e n t r a t i o na n dt h ep r o t e i ns o l u b i l i t yc u r v e a n o tc r y s t a l l i z e b c r y s t a l l i z e ! ) 批量法 在一个密闭的批量法体系中，如图1 6 中所示，有三种情况会出现。一，如 果蛋白质溶液是不饱和的( 如图中a 点) ，就不可能出现晶体( 除非有另外的参 数，如温度等发生变化) 。二，在过饱和区中位于溶解度曲线和沉淀曲线之问的 区域f 如图中b 点) ，箭头表示了结晶时溶液中蛋白质浓度的变化情况。三，图 中c 点，蛋白质会立即沉淀下来，因为过饱和度很高。在某些情况下，蛋白质 会从生成的这些沉淀上接着生长出晶体。 图1 6 用气相扩散法生长晶体时大分子和沉淀剂浓度的关系及溶解度曲线示 意图 横轴为沉淀剂的浓度，纵轴为蛋白质的浓度 f i g 1 6 s k e t c hm a ps h o w i n gt h er e l a t i o nb e t w e e n p r o t e i na n dp r e c i p i t a t i o n c o n c e n t r a t i o na n dt h ep r o t e i ns o l u b i l i t yc u r v e 1 3 蛋白质晶体的特点和生长的主要参数 实验方法的确定与蛋白质晶体的特点和生长的主要参数有密切的关系。 i 蛋白质晶体的特点 由于生物大分子本身内在的因素( 固有的结构复杂、分子本身大且柔软、对 外界敏感易变化) ，生物大分子晶体与小分子晶体相比有如下特点： i ) 样品来之不易( 量少、昂贵) 。 1 3 山东师范大学硕士学位论文 2 ) 不易结晶( 分子大、组成复杂、结构复杂) ，只有在热力学不稳定的过饱和 溶液中结晶。结晶过程时多参数协同综合过程，条件苛刻；重复性差。 3 )生物大分子的空间群有限，因而晶体外形简单。 4 ) 蛋白质晶体长不大，极限限度一般 1f i l m 。 5 ) 晶体含有大量溶剂( 3 0 7 5 ) ，晶体一离开母液则失水而垮。 6 ) 机械力弱，易碎，即点阵力弱。 7 ) 光学性能差。 8 ) 生物大分子晶体晶胞大，倒易格子密集，因而数据量大。 9 ) 晶体衍射能力弱，影响数据质量，很难收集分辨率数据。 1 0 ) 对辐射敏感，易衰变致死。 】1 ) 从晶体外形难以确认晶体质量好坏( 只能用x 射线衍射法分析) 。 ! 蛋白质晶体生长的主要参数 生物大分子一般离不开水，在结晶过程中，首先想办法扰动分子表面水的结 构和生物大分子之间的相互作用方式，使之克服表面能以定向有序地相互作用， 自发组装成核，进而在晶体表面上继续有序排布成晶体。要做到这一点，必须认 为控制和调整参数，达到最佳条件。 1 ) 蛋白质样品的纯度：生物大分子能否结晶，能否获得优质晶体，是首要考虑 的问题。 2 ) 温度：蛋白质晶体的生长条件一般是在恒温器中进行恒温( 即固定温度参数， 改变其它参数) 下的晶体生长，或者在线形改变温度梯度下进行晶体生长。 3 ) 时间：蛋白质晶体的结晶时间较长，大单晶生长时间所需要的时间可以从几 个小时倒几个月不等，也有报道需要一年或更长的时间以后爿能看到晶体， 晶体生长相当缓慢，需要几个星期或几个月才能长到充分大，一般的规律是 保持晶体以最小的速率生长，以便获得又大又好的晶体。 4 ) 浓度：母液中大分子浓度通常应该尽可能的高，据报道从1 到几百m g m l 的浓度范围内均有晶体长出，单最常用的是5 1 0 0 m g m l 。但是，浓度过高 也会引起麻烦，会碰到一种广泛的结晶作用，即许多晶体一起生长出来，形 成聚集态、孪生态，这时必须降低大分子的浓度，以减慢结晶过程而获得单 品。 山东师范大学形l 士学位论文 5 ) 沉淀剂浓度、离子强度：己发现许多金属离子具有诱导或促进不同大分子结 晶的能力。在许多情况下，金属离子时生物活力所必须的，因此很自然的会 想到它们可能有助于维持分子的某些结构特征。在另一些情况下，金属离子， 特别是过渡系列中的二价金属离子，对大分子的生物活力并没有什么作用， 却能促进晶体生长。 6 ) p h 值：在寻找结晶条件时，需要研究的最重要的变数，除去沉淀剂的浓度 之外，便是p h 值。据报道，非晶态沉淀或微晶与大单晶之间的差别可能只 有0 2 个p h 单位，甚至更小，这又给我们的实验带来一定的困难。 7 ) 其它添加剂：添加剂由于某种原因使大分子更加稳定，或者由于与大分子发 生特殊的反应而使大分子更加均一。 8 ) 振动和声：为了培养大的单晶，母液一旦配好后，几个星期之内都不得有任 何形式的干扰，并且也不应检查晶体的生长情况，这已是传统的规定了。过 早的去触动蛋白质晶体生长的容器常常会把极有希望的生长中心变成一大 堆微晶。 以上所讨论的仅是部分蛋白质晶体的特点和影响生长的参数，从这些特点和 参数来看，研究蛋自质晶体生长，需要无干扰的实时观测方法，例如可以选择本 报告中的主要研究方法一动态光散射法。 1 4 蛋白质晶体生长与微重力的关系 生物大分子在微重力条件下的晶体生长实验最早开始t - l 十年代的中期，进 行微重力条件下晶体生长的原因是科学家希望能得到高质量的晶体用于x 射线 衍射分析”j 。 几年前，观察微重力条件下生物大分子结晶生长的方法分成了两个分支。一 个分支是产生高质量的晶体用于生物技术和研究应用，如用于x 射线衍射分析。 这一类分支一般只能进行空间实验，不能用地基研究代替。另外一个分支是研究 和定量描述微重力条件下晶体生长和质量得以改进的机理，以理解晶体生长的过 程和控制晶体生长为最终目的。这一类分支可以进行地基研究，研究可以采用各 种各样的技术手段，如静态和动态光散射口4 1 ，界面角度仪1 2 5 2 6 1 ，原子力显微镜 1 2 7 2 8 1 ，x 射线衍射分析1 2 9 3 0 1 等等。 山东师范大学硕士学位论文 蛋白质晶体生长在微重力环境下会生长出比较好的晶体。一般认为，缺少重 力驱动的浮力是得到较好晶体的主要原因之一。然而，在微重力条件下，浮力已 经很显著地减少了，但m a r a n g o n i 对流可能仍然会存在。晶体生长工作者在空间 生长晶体时时间比较短，因此有必要对悬滴法重的m a r a n g o n i 效应进行研究。这 也有助于研究并发展新的蛋白质结晶的装置。 在正常重力情况下，重力对晶体生长的影响主要是两个方面： 1 在晶体生长过程中，由于物质的转移，在生长的晶体附近有浓度梯度。密度 梯度导致浮力，因此产生r a y l e i g h 对流。对流对蛋白质晶体质量的影响一直是人 们感兴趣的课题，一般认为对流会对晶体质量产生不利的影响。但是到目前为止 还没有一个一致的看法。 2 溶液中晶体的生长隶属沉降，这导致了晶体的不对称生长和晶体的共生。 基于上述两种原因，人们普遍相信，利用微重力环境能提高生长出来的晶体 的质量。另外，在微重力条件下，有可能生长出在地面条件不可能生长出来的晶 体。微重力环境还有一个好处是减少了容器的影响，因为容器表面影响蛋白质成 核和晶体生长口i , 3 2 j 。 重力对蛋白质晶体生长还有另一方面的影响 3 3 1 。重力会导致蛋白质聚集和晶 体有一个最大稳定的尺寸，超过这个尺寸，聚集就会变得不稳定。晶体也会出现 张力导致的裂纹或者是破碎。重力的称度越高，临界尺寸就越小。 在微重力生长蛋白质晶体的实验已经有许多工作者进行过。这些实验在俄罗 斯卫星( p h o t o n 和c o c i m a 。2 ) 3 4 - 3 6 1 ，m i r 空间实验站，中国的空间飞行器 ( c o c i m a 2 1 3 s 1 ，f s w - 2 1 3 叼) 以及美国航天飞机 4 0 - 4 7 it - 进行过。 大多数实验表明，与在地面所做的平行实验的结果相比，在微重力环境下生 长的蛋白质晶体平均比较，质量也比较好，适宜做x 射线衍射分析。d a x 和 m c p h e r s o n 等得到了很好的结果，他们利用液一液扩散法生长了卫星烟草镶嵌病 毒( s t m v ) 。在微重力环境下生长的蛋白质x 射线衍射的分辨率达到1 8 a ，而 在地面上生长的蛋白质晶体最高的x 射线衍射的分辨率也不过2 3a 。微重力环 境下不仅能生长出更好和更大的晶体【4 8 1 ，在某些时候，和地面生长相比较，生长 出来的晶体形状会不同，生长的速率要更快些。 山东师范人学坝 。学位论文 1 5 蛋白质的一些参数 在本论文中，用动态光散射研究的主要是溶菌酶，用原子力显微镜研究的主 要是溶菌酶和刀豆蛋白a 。 科研工作站将溶菌