（动物学专业论文）蝽科部分种类线粒体细胞色素b基因序列及分子系统学研究.pdf

y6 1 0 2 0 4 蝽科部分种类线粒体细胞色素b 基因序列及分子系统学研究 代金霞 摘要：蝽科是半翅目异翅亚目中种类较多，分布较广的一个大类群，其中大 部分为重要的农林害虫，对农作物、果树危害极大。国内外学者对此类昆虫进行 了大量研究，但目前大部分工作都集中于形态学方面，且由于该类昆虫种类多， 数量大，多为单种属，以及形态构造上的一些特点，对其分类系统的确立还没有 统一的意见。本论文从分子生物学的角度入手，采用线粒体蛋白质编码基因细胞 色素b 基因( c y t b ) 作为分子标记，以一对通用引物进行p c r 扩增，通过测序共 获得蝽科4 个亚科11 属1 6 种昆虫及外群筛豆龟蝽长度为4 8 5 b p 的部分序列，应 用分子生物学软件对结果进行分析，使用4 种常见的建树方法：n j 法、m e 法、m l 法和m p 法重建系统发育树，对蝽科部分种类的系统关系进行研究，为探讨中国蝽 科昆虫的分予进化，建立该科昆虫分子水平的系统发育关系提供分子生物学方面 的证据，有助于建立完善的蝽科昆虫分类体系。 通过对结果的分析讨论，得出以下结论： 1 对1 6 种蝽象线粒体c y t b 基因长度为4 3 2 b p ( 去除引物) 的序列进行分析， 结果表明该片段序列中富含a 、t ，表现出强烈的a 、t 偏向性，a + t 含量为6 9 9 ， 且第三位点a 、t 偏向性更加明显，达到8 4 9 ，同时所有种类在该位点上碱基c 的含量极少，平均仅为3 2 ，且在种间表现出较大的差异( 0 7 _ 6 9 ) 。这反映 出c y t b 基因在密码子的使用上具有明显的偏好性。在编码的1 4 4 个氨基酸中，有 7 5 个发生了变异，变异率为5 0 2 2 在该序列片段中，核甘酸的替代转换略高于颠换( 转换颠换= 1 2 ) ，转换 的发生主要以a g 、g a 为主，颠换的发生主要以a t 、t a 为主，其它类型 的颠换则很少发生，碱基替换大都发生在密码子第三位，该位点上转换的发生占 所有转换总数的6 5 ，颠换占8 0 。 3 对蝽亚科6 属1 1 种进行系统发育分析，使用4 种常用的建树方法n j 法、 m e 法、m l 法和m p 法，所构建的分子数拓扑结构大体一致。这1 1 种蝽象大体分为 4 支，首先是同属内的种优先相聚，表明种间差异小于属间差异。属间关系则表现 为：珀蝽属与碧蝽属首先相聚，表明这二者关系较近，然后与菜蝽属聚为一支； 真蝽属的3 种、曼蝽属的2 种单独各成一支，且前者与第一支关系较近：麻皮蝽 单属单种自成一支，位于树的基部，是该亚科中分化较早的一支。总体上看，蝽 驻科6 个属阐的关系为( ( ( ( ( 珀潞属+ 碧蝽属) + 菜靖属) + 真蝽满) 十曼暗属) + 麻 皮皤满) 。 4 隧税摘取潦妥释的2 种与其他3 个疆科共7 种琵虫构建系统祷黻了解4 亚番幸 瓣豹系统关系，结果显示不褥静建树方法所褥登麓系统树有差异，4 个鬟科中，益 蝽亚辩与蝽鼗科关系最邋，这与传统分类穗唆合。络合4 受辩溺魏序列差异与传 统的系绞分类，支持将荔蝽驻科、霪嬉照科扶蝽辩中分立出来势挺秀为秘鹣鼹点。 它们之间的系统关系为：蜃蝗裂与荔蟪秘形贱姊妹群，较蟛科发弯褥旱；蜷辩作 为一个单系群，是蝽总科中最为进化的类聪。 5 运用c y t b 基趿序列对蝽科昆虫进行系统关系研究时，各腿静问的关系e 较 明确，所得到的系统树拓扑结构大体一致。因此c y t b 基因在对科下属种阀盼元进 行分析时，慰一个有效的分子标记。 关键词：蝽科线粒体d n a细胞色素b 基因系统发育 i i s t u d y o nt h e p h y l o g e n y o fs o m e s p e c i e s o fp e n t a t o m i d a eb a s e do n m i t o c h o n d r i a lc y t o e h r o m e bg e n e s e q u e n c e s d a ij i n x i a a b s t r a c t ：p e n t a t o m i d a ei so n eo ft h eb i g g e s tf a m i l i e si nh a m i p t e r ao r d e r , a n d m a n yo f t h e ma r ea l l p e s t si na g r i c u l t u r ea n df o r e s t p r e s e n t l y , m o s to fs t u d yo n t h e g r o u p a r ec o n c e n t r a t e do nm o r p h o l o g ya n dt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n g s u b f a m i l i e sa n dg e n u si sn o tv e r yc l e a r w es e l e c t e dm i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) c y t o c h r o m eb ( c y t b ) g e n e a sm o l e c u l a rm a r k e r ，a m p l i f i e d4 8 5 b ps e q u e n c e ss e g m e n t w i t hap a i ro fu n i v e r s a l p r i m e r s f o r4s u b f a m i l i e sa n d1 6 s p e c i e s o ff a m i l y p e n t a t o m i d a ea tf i r s tt i m e ，i no r d e rt oc l a r i f yt h ep h y l o g e n yo ft h e m a l ls e q u e n c e sw e r e a l i g n e du s i n g s o f t w a r e c l u s t a l x ( 1 8 、，a n d m o l e c u l a r p h y l o g e n e t i c t r e ew e r e r e c o n s t r u c t e du s i n gs o f t w a r ep a c k a g em e g a 2 1a n dp h y l i p 3 6 a t h r o u g hs e q u e n c e s a n a l y s i s ，t h er e s u l ts h o w s ： 1 c y t bg e n e4 3 2 b ps e q u e n c e s ( n o ti n c l u d et h es e q u e n c e so ft h ep f i m e r s ) s h o w s s t r o n ga 厂rb i a s ，t h ea v e r a g ec o n t e n to f a + ti s6 9 9 ，a tb i a si sm o l e c o i i s p i c i o u sa t 3 r dp o s i t i o n ，c o m e su pt o8 4 9 a tt h es a l n et i m e ，t h ec o n t e n to fn u e l e o t i d eca tt h i s p o s i t i o n i s v e r yl o w e r , t h ea v e r a g e i s o n l y 3 2 a n d d i v e r g e n c ea m o n gs p e c i e s i s h i 曲e r ( 0 7 6 9 ) t h es e q u e n c e sc o d e d1 4 4a m m o n i aa c i d ，t h er a t i oo f v a r i a t i o nc o m e s u p t o 5 0 2 2 a m o n gt h en u c l e o t i d es u b s t i t u t i o no ft h es e q u e n c e s ，t r a n s i t i o ni sj u s tal i t t l e h i g h e rt h a nt r a n s v e r s i o n ( t s 厂r v = 1 2 ) m o s tt r a n s i t i o no c c u r sb e t w e e nga n da ， t r a n s v e r s i o nh a st h eb i a so fa + t t o o ，m o s to f t h e mo c c u r si nt h e3 r dp o s i t i o n 3 r e c o n s t r u c t e dt h ep h y l o g e n e t i ct r e ef o r11 s p e c i e so fs u b f a m i l yp e n t a t o m i n a e w i t hm e t h o d so f n e i g h b o r - j o i n i n g ( n j ) ，m i n i m u m - e v o l u t i o ( m e ) ，m a x i m u m l i k e h o o d ( m l ) a n dm a x i m u mp a r s i m o n y ( m p ) ，t h et a p n o l o g yo ft h et r e e sa r ea l m o s t i d e n t i c a l t h e s e1 1 s p e c i e sc a nb ed i v i d e di n t o4b r a n c h e s ：t h eg e n u sp l a u a a p a l o m e n a a n de u r y d e m af o r m e dab r a n c h ，t h e ya r et h ee v o l u t i o n a r yg r o u p si nt h es u b f a m i l y ；p e n t a t o m aa n d m e n i d af o r m e dab r a n c hs p e c t i v e l y , a n dt h ef o r m e rh a sc l o s e r r e l a t i o n s h i pw i t ht h eb r a n c hl ： e r t h e s i n al o c a t e da tt h eb a s eo f t h et r e e ，f o r m e dab r a n c hb y o n e s e l f , a n di sm u c hm o r eo r i g i n a lt h a n o t h e r s i i l 4 t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n gt h e4s u b f a m i l i e sa r eu n c e r t a i na c c o r d i n g t ot h er e c o n s t r u c t e dt r e e s c o m b i n e dt h e s e q u e n c e sa n a l y s i s w i t ht h et r a d i t i o n a l s y s t e m a t i cc l a s s i f i c a t i o n ，w es u p p o r tt h eo p i n i o n t h a tt e s s a r a t o m i n a ea n ds c u t e l l e r i n a ei sa i n d e p e n d e n tf a m i l yr e s p e c y i v e l y t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f t h e mi s ：t e s s a r a t o m i d a e a n ds c u t e l l e r i d a ef o r m e ds i s t e r g r o u p a n d d i v e r g e d e a r l i e rt h a np e n t a t o n i d a e ； p e n t a t o m i d a ei st h em o s te v o l u t i o n a r y g r o u pi np e n t a t o m o i d e aa sam o n o p h y l e t i c c l a d e 5 t h es t u d yi n d i c a t e st h a tc y t bg e n ei sau s e f u lm o l e c u l a rm a r k e ra tt l a e g e n e r i c a n d s p e c i e sl e v e lf o rp h y l o g e n e t i es t u d y , b u t s t i l lh a ss o m e p r o b l e m a t s u b f a m i l y l e v e l k e y w o r d s ：p e n t a t o m i d a em t d n a c y t bg e n e p h y l o g e n y i v 1 蝽类研究概述 1 , 1 半翅目分类简介 第一部分前言 戆是半翅瑟舅遽耍鏊琵宝静营逶名稼，怒琵蛊缨孛静一个较大类群。半麓蘑 这个名称是林奈于1 7 3 5 辱建立的，当时包括的范围很广，除了真正的半翅日毒申类 戬癸，还越括蟋痒、萤火虫、弱缎。1 7 5 8 年螽作了修订，但仍包括缨尾目。t 7 7 5 年f a b r i c i u s 用有吻目这个名称。1 8 3 5 年b u r m e i s t e r 确定有吻弱是半翅目的同 物异名。1 8 1 0 年l a t r e i l l e 把半翅蠲分为辫翅亚日( h e t e r o p t e r a ) 和同翅醒目 ( h o m o p t e r a ) 蕊个弧耳。1 8 2 1 年m a c l e a y 建议搀同题亚霉提舞为曩，鄹将这一类 群分为半翅蠲和同翅目两个目。由于二者口器构造和变态的一致性，现在绝大多 数学卷同意将其分必两个贬晕的意见。同翅甄霆毙较霖魏，异翅涯强由炎叛辎醵 蝉科的同翅圈祖先演化而来。 事翅罄晏憨亚基( h e t e r o p t e r a ) 豹分科，通过f i e b e r ( 1 8 6 1 ) 和 s t a l ( 1 8 7 0 1 8 7 6 ) 等的工作，至十九世纪中叶融基本确定。h o r v a t h ( 1 9 1 1 ) 总结了 当时备家豹意冤，辩纳为4 3 个科。强嚣经过各学者的修订暑翦补充，特剐对于一魑 代表中间型的类群，作了深入的研究。l e s t o n 等( 1 9 5 4 ) 掇出了对陡栖缀的分类 意觅，c h i n a ( 1 9 3 5 ) 键出了水栖缎的分类系统。此前，他还提出了这个亚日各科的 系统发生图。 在我国出于异翅亚目和同翅驻目作为两个目应用已久，通常所用的半翅目就 是m a c l e a y 的半翅瓣，也裁是l a t r e i l l e 鸵舅遽亚髫。 异翅亚目全世界已知约三万种。胡经甫( 1 9 3 5 ) 在中国昆威名录中共记 裴8 0 0 耱。蘩采臻( 1 9 7 7 ，1 9 8 1 ) 共记载薅羹各辩1 7 0 0 种左右。 1 2 蜷科昆虫研究概况 1 2 1 分类系统简介 媾秘( p e n t a t o m i d a e ) 建半戆莛吴援噩莓串最夫豹科之一，崮l e a c h 于1 8 1 5 蓝f 建立，全世界已知7 6 0 属4 1 0 0 种左右( 张虎芳等，1 9 9 9 ) 。蝽科的分类目前还 没有统一静系统。m i l l e r ( 1 9 5 6 ) 曾撼出1 1 个亚科的分类系统：其中包括 p h y l l o c e p h a l i n a e ，a s o p i n a e ，s e r b a n i n a e ，c y r t o c o r i n a e ，p e n t a t o m i n a e ， d i s c o c e 曲a l i n a e ，p o d o p i n a e ，t e s s a r a t o m i n a e ，d i n i d o r i n a e 。s c u t e l l e r i n a e 糊 e d e s s i n a e 。随后c h i n a ( 1 9 5 9 ) 提出1 3 亚科分类系统：其中包括上述前1 0 个亚 科，此外还增加了a c a n t h o s o m a t i n a e ，c a n o p i n a e ，m e g a r i d i n a e3 个亚科。g r o s s ( 1 9 7 5 1 9 7 6 ) 提出2 亚科系统：a p h y l i n a e 和p e n t a t o m i n a e ，前者现在被普遍认 为是独立的科。g a p u d ( 1 9 9 1 ) 提出了9 亚科系统，其中不包括上述1 1 个亚科中 的后4 个，但增加了m e g a r i d i n a e 和a p h y l i n a e 。s c h u h 和s l a t e r ( 1 9 9 5 ) 在他 们所编写的世界蝽类昆虫：半翅目异翅亚目专著中，将t e s s a r a t o m i n a e ， d i n i d o r i n a e ，s c u t e l l e r i n a e3 个亚科提升为科，共记述了8 个亚科。在这些分 类系统中，有些亚科被不同的学者视为科，有的则被当作族对待。h a s a n 和 k i t c h i n g ( 1 9 9 3 ) 曾提出过族间的进化关系，却未给出正式的分类系统。我国学 者章士美( 1 9 8 5 ，1 9 9 0 ) 等将我国蝽科共分为六个亚科：盾蝽亚科 ( s c u t e l l e r i n a e ) 、荔蝽皿科( t e s s a r a t o m i n a e ) 、兜蝽亚科( d i n i d o r i n a e ) 、 短喙蝽亚科( p h y l l o c e p h a l i n a e ) 、益蝽亚科( a s o p i n a e ) 和蝽亚科( p e n t a t o m i n a e ) 。 他在中国二十个省、自治区蝽科昆虫种数比较一文中，所列蝽科6 亚科共3 8 9 种。近几年又不断有新种发表。h u a ( 2 0 0 0 ) 在( l i s to fc h i n e s ei n s e c t s 中 将盾蝽亚科、荔蝽亚科、兜蝽亚科分别以科级水平记录。此外，在有些属的归属 问题上各学者意见亦不统一，如对于赤条蝽属g r a p h o s o m a ，驼蝽属 b r a c h y c e r o r i c ，萧采瑜( 1 9 7 7 ) 、章士美( 1 9 8 5 ) 等将其置于蝽亚科，而能乃扎 布( 1 9 8 6 ) 、r i d e r ( 1 9 9 8 ) 等将其置于舌盾蝽亚科( p o d o p i n a e ) 。 l2 2 蝽科研究现状 关于蝽科的研究，目前大部分工作集中于形态学方面，近几年不断有新种 发表。据统计，不包括盾蝽亚科( s c u t e l l e r i n a e ) 、荔蝽亚科( t e s s a r a t o m i n a e ) 、 兜蝽亚科( d i n i d o r i n a e ) 在内，我国目前定名的蝽科昆虫已超过5 0 0 种。另外一 些学者从细胞学等方面对蝽科部分种类进行了研究。张虎芳( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 对益 蝽、斑须蝽等部分蝽科昆虫的染色体核型和减数分裂进行了研究，表明几种蝽象 的染色体组成均为2 n ( 6 ) = 1 4 ，具x y 性别决定机制，减数分裂行为比较一致， 但在中期常染色体和性染色体的排列方式具有种特异性，可为蝽科昆虫的形态和 系统发育提供有用的证据。任树芝( 1 9 9 2 ) 对蝽类部分昆虫卵壳的细微结构进行 了扫描电镜观察；赵冬香( 1 9 9 4 ) 等研究了蝽科1 3 种昆虫的雄性外生殖器，阐明 该结构可作为蝽科内亚科间及属间的分类特征。马春燕( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 首次对蝽 科8 种蝽象进行了酯酶同工酶研究。 2 系统学的概念及发展概况 2 1 系统学的定义及发展( 黄原，1 9 9 8 ) 2 系统学( s y s t e m a t i c s ) 是生命科学中综合性很强的基础学科。是探索、描述 并解释生物多样性及其分类和演化关系的学科。分类学( t a x o n o m y ) 是研究生物 分类的原理、方法和实践的学科，包括分类、命名、描述和鉴定等内容。二者的 研究内容不同，但有一定交叠。系统学等于分类学加上生物间各种相互关系( 主 要包括表型关系、分支关系、遗传关系、系统发育关系、年代关系和地理分布关 系) 的总和。 生物系统学作为生命科学中的- - n 基础学科，具有其独特性和不可替代性， 生物学各领域中任何科学研究，首先要正确判断研究材料或对象是何种类，否则 就会丧失科学性、对比性和重复性，因而不具有科学价值。这在害虫防治、天敌 引进和饲养释放等方面均有重要意义，经济动物优良种类的选育，亦直接涉及到 近缘种和种下阶元的分类问题，精确可靠的分类鉴别将会带来重要的经济效益。 对于系统发育关系和系统地位的确认，以及对物种特征的深入研究将有助于有关 领域的科学思维，推动有关研究的进展。 m a y r ( 1 9 6 9 ) 曾以分类工作性质作为动物分类发展历史的划分标准，将其分为 六个发展时期：( 1 ) 地区性动物区系时期；( 2 ) 林奈时期；( 3 ) 经验主义时期； ( 4 ) 达尔文时期；( 5 ) 种群分类时期；( 6 ) 近代分类学时期。 到了近代分类学时期，分类学方法与理论发生一系列重要变化和发展，又进 入了一个新的阶段。首先是遗传学等学科的研究进入分子水平后，许多发现对进 化论的若干方面提出补充和修正，引起很多争论，直接影响到分类学的理论基础。 此外，细胞学、血清学、生物化学、电子计算机技术的发展带来一系列新的分类 手段和方法论。因此，由6 0 年代中期开始，分类学领域中出现所谓的四大学派： 即( 1 ) 传统分类学派：以林奈为主要代表人物。( 2 ) 支序分类学派：该学派由 德国昆虫分类学家h e n n i n g 创立，以系统发育系统学为理论基础，故又称其为系 统发育系统学派。( 3 ) 进化分类学派：以m a y r ，s i m p s o n ，a s h l o c k 等人为代表， 这一学派基本接受支序学派通过支序分析重建系统发育的方法。( 4 ) 数值分类学 派：该学派起源于本世纪初植物分类学家a d a n s o n 的工作，由s o k a l 和s h e a t h 二人加以发展，借助电子计算机的运算实现分类的目的。 目前，随着生化技术和现代分子生物学的迅猛发展，很多分类学家尝试将这 些新技术应用于分类学，再加上染色体技术的发展与运用，使分类学向更加完善、 综合、科学的方向发展。运用多种分类手段，如从生理、生态、内部结构、外部 形态、生物学特性等着手的综合分类成为如今分类学的发展方向。昆虫系统学也 随之发展成为一门多学科相互渗透的综合性学科。 2 。2 分子系绫学概述 2 2 1 定义 分子系统学是检测、猿述并解释羹物在分子求平豹多弹性及其演健蕊律的学 科。是一门综合性很强的交叉学科。其理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、 比较嫩物化学、分予生物学和避化论。其方法来源予免疫学、仪器分析、生物化 学和分子生物学。刹用分子信息进行分类研究，有诲多优点： ( 1 ) 分子序硎的信息代表了遗传本质，不受环境影晌，不鼹标本个体发育状态和 强境条终趋影响。 ( 2 ) 熊够提供充分的可定量测度的进化信息。 3 ) 焱不霞类群麓窍较好豹可跑牲，麓一释瀵怒熬焚目足液。 ( 4 ) 能够反映生物的进化机理。( 程家安，2 0 0 1 ) 2 。2 。2 基本原理 分子系统学以下列一些基本原理为基础： ( 1 ) 黧命的雏纯一皴侄和多样瞧原理： 生化一致性表现在所有生物都具鸯相似螅元素缎成、楣同的攀体结梅、棚戗 的遗传、事物利用和能量转化功能等。生化多样性首先表现在组成生物体的化合 物秘类繁多，其次袭现在分子缀成移绻搀交傀大。 ( 2 ) 擞物大分子进化速率恒定性原理： 淡年诗辩魏生锈丈分子痔列豹改变速率大致缣掩懂定，或大分子葶确之蓠豹 差异稷度与分歧后独立进化的时间成正比。这一原理也称为分子钟假说，是6 0 年代裙羯磷究蛋自蔟氨基虢痔巅差弄与分纯年代之间的关系得裔的( z u c k e r k a n d l 和p a u l i n g ，1 9 6 5 ) ，随后dna 序列的研究也基本支持这一假说。 ( 3 ) 表信息分子的进佬原理： 裘信息分子是进化的产物，它的进化是与代谢途径进化相关联鲍。寤于生甥 体内的一切反应是由酶催化完成的，所以一种新的表信息分子的产生常伴随着一 耱瑟的酶健殷应或代落途径，麸这一意义上表信怠分予是基嚣型( 藜座位) 奁分 子水平上的表现。 ( 4 ) 爨源 e 较蕤瑾： 噍有同源分子之间的比较才有意义，才能建立正确的系统发商关系。分子系 统学静弼源萄区分兢三个不同的簇次：蒋先最不同基因组之闻基因的同源关系， 其次是同源基因间不同核甘酸对妓同源肽链上不同氨基酸像置上的对应关系，第 三个屡次是表信息分子问的同源关系。这三个朦次中，不同基因缎之间基因( d n a 4 彦列) 的同源性是最萋本秘最复杂的。 ( 5 ) 样品同质性原理： 攒一个榉品应是缝戆生穆学摹位( 如一个基毽域其夷疆产物，一个基因缀及 其所有产物即个体等) 。 2 3 研究方法 耀蓑，翅子瑟盎系绕学磺究戆豢要方法有援羧彦戮努爨( d n as e q u e n c e a n a l y s i s ) 、限制性片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、分子杂交援术( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) 、醚梳扩璜多 态性d n a ( r a n d o ma m p l i f l e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 及d n a 指纹图谱技术婷。 2 3 1d n a - d n a 杂交法 d n a 重缎杂交憋基于d n a 变性一复性动力学原理两建立起来的定量憾计基因组 之间单拷贝d n a 序列相似性的一种快速方法。用同样的经放射性标记的d n a ( t r a c e r ) 与未标记d n a ( d r i v e r ) 进行同濠杂交反应，与男夕 瓣的基因缀d n a 榉燕 进行辩源杂交反应。结果分析时以同源杂交与异源杂交反应的t m ( at m ) 以及标 准杂交反应魄( n p h ) 豹鼷离系数终为0 较熬糖标，毯u p g 融法梭建系统发弯糖。 2 3 2r f l p 法 r 耗p 楚壤裁瞧片段长度多态往r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 的英文缩写。r f l p 的遗传本质是由单碱基突变或结构重排( 包括碱基缺失、重复、 插入、高变醒串联蓬复) 雩i 起静。通过限制襁内切酶( r e ) 清纯不同个体的溺源 d n a 分子，缀电泳分离后表现的限制性片段差异与同位素或非同位素标记的掇针 杂交，从而鼹示与探针合同源顺序的酶切片 瑟在长廉上的蒺异。d n a 分子突变造 成的鹣切位虑的丧失或增如酆可以从凝胶电溶上反映出来。r f l p 跫分予袅浆学上 应用r e 后发现的一种良好的遗传标记，远远超过了同工酶的识别位点。但是r f l p 也是一秘复杂戆按零，d n a 襻纛霪量较大，整哭毙梭爨志锈酶熬键点，还霉搂簸 放射性污染等等因索限制了这种方法的使用。 2 3 。3 殛鞠托r r a p d p c r ( 随机扩增多态性d n a ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a - p c r ) 是w i l l i a m s 等( 1 9 9 0 ) 发龋酶种遗传标记方法，应用单一人工合成的箍机弓i 物 ( 一般为l o b p ) 来扩增d n a 分予上的1 个或多个区域。被扩增的廖列可以是重复 d n a ，也可以是单拷贝的d n a ，将这些能用随机引物扩增的嚣域称为随机扩增的多 态性d n a ，并涯硬r a p d 是拔孟德尔方式速传蛉。r a p d - p c r 攥终筵攀快速，毽缺点 为可黧复性麓。 2 3 4 探针杂交技术 核酸的分子杂交是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一。有一定同源性 的d n a 单链分子或d n a 单链与r n a 分子，其互补的区段在去掉变性条件后能复性 形成双链d n a 分子或d n a r n a 异质双链分子。核酸的分子杂交技术有不同的形式 和方法，包括s o u t h e r n 分子杂交技术、n o r t h e r n 分子杂交技术和原位杂交技术。 应用核酸分子杂交技术检测物种的遗传多态性、d n a 同源性及m r n a 的差异，可进 行昆虫近缘种和地理种群鉴定。 2 3 5d n a 指纹图谱技术 d n a 指纹图谱( d n af i n g e rp r i n t i n g ，d n af p ) 技术是一种用特异性探针 来检测基因组中d n a 位点差异性的分子生物学技术。随着各种高水平的探针和微 卫星探针、寡聚核苷酸探针的问世，d n a f p 在遗传病的诊断、基因图谱的绘制、 遗传标记的寻找方面得到广泛的应用。多态小卫星d n a 及微卫星d n a 位点能以孟 德尔方式稳定遗传和分离。d n a 指纹能同时在许多位点上提供可靠的遗传标记， 该方法与其他方法相比，大大提高了遗传分析的速度。广义上的d n a f p 包括所有 的进行个体识别的d n a 多态性分析技术。9 0 年代以来，一系列基于p c r 技术的检 测基因突变的方法被提出来，主要有：p c r - s s c p ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m ，单链构象多态性) ：可以检测到点突变和多态性位点，但不是任 何核苷酸序列的改变都引起单链构象的变化，因此s s c p 方法不能鉴定所有的突 变。s s c p 技术不能用于系统发育分析。p c 肛r f l p ：指p c r 技术与r f l p 分析联 合应用检测d n a 多态性和变异的快速方法。p c r - d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n t g e l e 1 e c t r o p h o r e s i s ，变性梯度凝胶电泳) ：指在含有梯度变性剂( 如甲酰胺、 尿素) 和特定温度的条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，不同的d n a 具有不同的熔 融浓度( t m ) ，进而影响到迁移率不同，据此可以将有一定不同碱基的d n a 分开。 2 3 6 核酸序列的分析技术 核酸序列的分析技术包括d n a 序列分析和r n a 的序列分析。d n a 核苷酸序列 的测定常用双脱氧法和化学法。近年来将核酸序列分析方法与p c r 及r f l p 技术相 结合，可以快速经济地测量大量个体d n a 顺序分析，并可以保证使某一区段每个 核菅酸位置上出现的变异都能被发现，通过比较不同类群的同源核酸的核苷酸排 列顺序，据此建立分子系统发育树，并推断类群间的演化关系。但缺点是耗资大， 费时多，尚不能大规模地应用于分子系统学。目前在昆虫系统学研究中常用的基 因有m t d n a 、核糖体d n a 、r d n a 及其产物r r n a 等。 3 线粒体d n a 的特点及其在系统学研究中的应用 3 1 线粒体d n a 的特点 线粒体是真核细胞的胞质细胞器，存在于真核生物的所有细胞中。昆虫的线 粒体d n a ( m i t c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 大小一般为1 5 4 1 6 5 k b 之间，广泛存在 于昆虫体内富含线粒体的飞行肌及卵内。相对于核d n a 来说，线粒体d n a 是一个 封闭的环状双链，外形长度约s u m ( 张亚平，1 9 9 5 ) ，其长度的变异可在不同种、 同种不同个体间以及同一个体内观察到，但这种长度差异并非源于基因数目，主 要是由于非编码区的长度差异，有时也由于编码区的重复。在绝大多数情况下， 线粒体d n a 在种级甚至更高阶元水平上具有相对稳定性。线粒体d n a 易于分离和 纯化，具有相对恒定的信息容量，多数动物的线粒体d n a 由3 7 个基因和一段长 度可变的非编码序列组成。这3 7 个基因分别是：2 个r r n a 基因( 1 6 sr r n a 和1 2 s r r n a ) 、2 2 个t r n a 基因、1 3 个蛋白质基因( c o i ，c o i i ，c o i i i ，c y t b ，a t p 合成 酶亚基6 和8 ，n a d h 脱氢酶n d i n d 6 及n d 4 l ) 。m t d n a 的基因排列具有相对稳定 性，基因组中不含间隔区和内含子，遗传结构简单，无重复序列，遵守严格的母 系遗传方式( 即仅通过卵子将细胞质传给下一代，雌雄性后代都接受其母亲的基 因型，但只有雌性随后将线粒体传给下一代) 。m t d n a 在遗传过程中不发生基因重 组、倒位、易位等突变。进化速率快，是单拷贝核的5 1 0 倍。在分子系统学研 究中，m t d n a 的应用仅次于r d n a 。但与r d n a 相反，m t d n a 是快速进化的序列，主 要用于群体水平和近缘种类之间的比较。 正是由于m t d n a 的这些特征，自从7 0 年代后期限制性内切酶方法用于m t d n a 分析以来，m t d n a 己成为整个动物分子系统学研究中应用最广泛的分子之一。利 用m t d n a 多态性来探讨昆虫类群系统发育关系亦成为当前昆虫系统学研究的热 点。 3 2 细胞色素b ( c y t b ) 基因的分子特征 线粒体d n a 的c y t b 基因是一种蛋白质编码基因，是目前结构和功能研究得最 为清楚的基因之一。c y t b 基因全长约为l 1 0 0 1 2 0 0 b p ，在物种间序列长度没有 明显的差异。c y t b 基因在碱基组成上具有偏好性，并具有种间差异。碱基组成的 偏好是由于变异或选择的压力造成的，在密码子的不同位点，由于不同的选择压 力，转换与颠换的比率发生改变，由于密码子第三位点比第一、第二位点更趋向 于沉默以及核苷酸的组成对变异幅度的影响，从而造成了在不同类群间碱基组成 的偏好。在昆虫c y t b 基因中，a + t 含量明显高于g + c 含量。在密码子的第三位点， 这种偏向更加明显( 5 g c ；9 5 a t ) 。无脊椎动物c y t b 基因序列转换的频率高于 颠换频率。由于密码子第三位点上的转换通常不引起氨基酸的改变，因此进化速 率较第一、二位点快。c y t b 基因中同时存在的较快和较慢进化的密码子位点，以 及保守区域和突变区域的存在使得c y t b 基因可以应用于系统分类研究。1 9 8 9 年， 第一对关于脊椎动物c y t b 基因部分片段的扩增引物出现后，c y t b 基因被广泛地 用于系统学研究，目前认为它是对物种种上和种下分类阶元进行系统进化研究较 好的分子标记。 3 3 线粒体d n a 的c y t b 基因在分子系统学中的应用 系统发育分析是系统学研究的热点，系统发育研究采用的数据通常是d n a 序 列。m t d n a 序列是目前研究昆虫系统发育、种群遗传变异和分化，以及难以用外 部形态特征来区别的近缘种、种下分类单元鉴定等方面应用最为广泛的分子之一。 通过对包含有不同遗传信息的d n a 序列进行研究，可以对形态分类不能解决的类 群的系统关系进行分析和探讨，也可对传统的分类进行验证。 d a v i d 等( 1 9 9 9 ) 对哺乳动物人、鼠、牛、羊等1 7 种个体的c y t b 基因序列 进行分析并构建系统树，结果认为c y t b 基因序列没有物种间的明显差异。d o d g e 等( 1 9 9 5 ) 对鸟类p i p i l os p p 4 个种类及s p i z e l l a 属6 个种类的c y t b 基因 4 3 3 b p 长度片段进行分析，结果认为$ p i z e l l a 属为单系群。s u m i d a 等( 1 9 9 8 ) 对两栖类日本池蛙的c y t b 序列和1 2 sr r n a 序列进行分析，通过构建n j 树和m l 树，结果显示日本池蛙分为两大类群，但没有显示种内的分歧。h o l y o a k e ( 2 0 0 1 ) 也利用c y t b 基因和1 2 sr r n a 基因序列对新西兰的古老蛙种l e f o p e l m a 属的分类 系统和分类地位进行了研究。z h u 和j a m i e s o n ( 1 9 9 2 ) 对澳洲彩虹鱼的线粒体细 胞色素b 基因序列的变化进行了研究，认为它们在种间没有氨基酸序列的变异， 系统树支持传统的分类系统。f a r i a s ( 2 0 0 1 ) 通过对c i c h l i d a e 科鱼类的m t d n a 的c y t b 基因进行序列分析，探讨了c y t b 基因作为系统进化研究的分子标记的局 限性。同时对c i c h l i d a e 科及l a b r o i d e i 科7 2 种鱼类的c y t b 基因序列进行分析， 推论这些鱼的系统进化关系。 在昆虫学领域，c y t b 基因也被广泛地应用于昆虫系统学研究中。 p i r o u n a k i s ( 1 9 9 8 ) 对膜翅目蜜蜂b o m b u s p a s c u o r u m 进行遗传变异研究，指出其 线粒体c y t b 基因序列较c o i l 基因序列有更多变异，并将c y t b 基因序列用于区分 阿尔卑斯地区b o m b u sp a s c u o r u m 的地理亚种。b i r u n g i ( 2 0 0 0 ) 以c y t b 基因作为 分子标记，研究白纹伊蚊a e d e s a l b o p i c t u s 种群的遗传结构。b e l s h o w ( 1 9 9 7 ) 应用c y t b 基因和2 8 s 核糖体亚基的联合数据，分析了茧蜂科茧蜂亚科与其它亚科 间的分子系统发生关系。另外，v a n e - w r i g h t ( 1 9 9 9 ) 应用1 6 sr r n a 和c y t b 的联 合数据，对非洲蝴蝶姊妹种的进化关系进行探讨，所得分析结果支持早期的形态 分类研究。j e r n m i n 和c r o z i e r ( 1 9 9 4 ) 对膜翅目蚁类的c y t b 基因序列进行分析， 对其碱基组成及密码子的偏好性进行了研究；b e r n a s c o n i 等( 2 0 0 1 ) 在对双翅目 昆虫s c a t h o p h a g a 属的研究中，通过c o i 及c y t b 基因的联合数据，对该类群的系 统关系进行探讨。 近几年来，国内应用线粒体d n a 的c y t b 基因的序列对动物系统发育和亲缘 关系的研究也在不断深入。在脊椎动物中，对鱼类( 何舜平，1 9 9 9 ：白星等，2 0 0 0 ； 高天翔等，2 0 0 1 ) 、两栖类( 杨学干等，2 0 0 1 ) 、爬行类( 周济亮等，2 0 0 1 ；王义 权，1 9 9 9 ) 、鸟类( 陈晓芳等，2 0 0 3 ) 及哺乳类( 李明，1 9 9 8 ：刘向华等，2 0 0 3 ： 宿兵，2 0 0 1 ；蒙世杰，2 0 0 1 ) 等部分动物的c y t b 基因序列及系统进化都进行过 研究。在无脊椎动物中，邵红光( 1 9 9 9 ) 对原尾虫的d n a 序列变异及无翅类昆虫 的系统进化进行了研究，通过测定3 种原尾虫和2 种双尾虫约4 5 0 b p 长度的c y t b 基因序列，计算3 种间的k i m u r a 双因子遗传距离，用距离法和简约法构建分子系 统树，讨论了原尾虫的系统发育和分类地位，指出原尾虫、跳虫、双尾虫都为单 系群，原尾虫和跳虫为姊妹群，双尾虫则与有翅类亲缘关系最近。任竹梅( 2 0 0 0 ) 对山稻蝗及相关物种的c y t b 基因部分序列