（生物化学与分子生物学专业论文）内生真菌抗病活性筛选及其产活性物质研究.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 植物内生真菌( e n d o p h y ticf u n g i ) 是指生活在健康植物的宿主体内，但对 宿主的植物组织并不引起明显侵染的真菌。内生真菌长期生活在植物内部，因此 部分内生真菌具有和宿主类似的代谢途径，产生具有抗病活性的物质，从而成为 新药开发的来源之一。内生真菌作为一种新的微生物资源，以其以繁殖周期快、 代谢产物专一、占用资源少、原材料利用方便等特点，已经成为人们最新研究的 热点之一，目前人们力求从内生真菌的代谢产物中寻找新的抗肿瘤等新型活性化 合物。 本文主要从两种植物中分离得到的内生真菌子囊菌门毛壳菌属的角毛壳菌 ( c h a e t o m i u mc u p r e u m ) 以及子囊菌门节菱孢属的节菱孢( a r t h r i n i u ms p ) 作 为研究对象，首次从角毛壳菌中分离得到卵孢霉素，以及从节菱孢中分离得到卷 线孢菌素，首次利用x 一单晶衍射测定了化合物的晶体结构，初步研究化合物抗 真菌、细胞毒以及抗肿瘤等生物活性。另外，改造木霉菌酯素的化学结构，研究 木霉菌酯素衍生物的构效关系。 主要由以下三部分组成： 一、本论文首次研究了从罂粟科植物博落回( m a c l e a y ac o r d at a ) 中分离 得到的一种角毛壳菌( c h a e t o m i u mc u p r e u m ) ( 菌株z j w c f 0 7 9 ) 的代谢产物的化 学结构和生物活性，该真菌属于子囊菌门的毛壳菌属，经培养、分离、纯化后得 到代谢产物的晶体，经x 一单晶衍射测定晶体结构为3 ，37 ，6 ，67 一t e t r a h y d r o x y 一 4 ，47 一d i m e t h y l 一1 ，17 一b i ( c y c l o h e x a 一3 ，6 - d i e n e ) 一2 ，27 ，5 ，57 - t e t r a o n e ( 卵孢霉 素) ，初步生物活性试验表明：卤虫急性毒性试验测定卵孢霉素半致死浓度为1 1 5 p g m l ，卵孢霉素对肿瘤细胞株h l - 6 0 和a 5 4 9 的半抑制浓度分别为2 8 6 6 i 和 8 1 6 6 “i 。 二、本论文首次研究了从蓼科植物水蓼( p o l y g o n u mb y d r o p i p e l l ) 中分 离得到的一种节菱孢( 彳，f 五，砌，砌s p ) ( 菌株p h l 0 1 2 ) 代谢产物的化学结构和 生物活性，该真菌属于子囊菌门节菱孢属，经培养、分离、纯化得到的代谢产物 晶体是5 ，6 ，7 ，9 ，1o - p e n t a h y d r o x y 一2 - m e t h o x y 一7 一m e t h y l 一1 ，4 ，5 ，6 ，7 ，8 - h e x a 浙江人学硕 ：学位论文摘要 h y d r o a n t h r a c e n e 一1 ，4 - d i o n e 和1 ，4 ，5 ，6 ，7 - p e n t a h y d r o x y 一2 一m e t h o x y 一7 一 m e t h y l - 5 ，6 ，7 ，8 ，9 ，1 0 _ h e x a h y d r o a n t h r a c e n e 一9 ，1o - d i - o n e 的互变平衡的构型， 为卷线孢菌素。初步生物活性试验结果表明，卷线孢菌素具有抑制枯草芽孢杆菌 的活性，最低抑制浓度为5 0 9 9 m l ，表明卷线孢菌素经过卤虫急性毒性测试，对 卤虫的半致死率超过2 0 0 i t g m l ，说明卷线孢菌素无毒。 三、对木霉菌酯素进行脱酰化的化学结构改造并用x 一单晶衍射法表征化合 物的结构，初步研究了木霉菌酯素衍生物的结构与生物活性的关系，试验结果表 明，脱酰化衍生物的生物活性低于母体化合物。 关键词：内生真菌，角毛壳菌，节菱孢，卵孢霉素，卷线孢菌素，脱酰木霉菌 酯素 i i 浙江人学硕i ：学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t e n d o p h y t i cf u n g ia r ef u n g it h a tc o l o n i z et h ei n s i d eo fh e a l t h yp l a n tt i s s u e s ， p e r s i s t i n gf o rac e r t a i na m o u n to ft i m ew i t h o u tc a u s i n gv i s i b l ed i s e a s es y m p t o m s m u c he n d o p h y t i cf u n g ip r o d u c ean u m b e ro fa c t i v em e t a b o l i t e sw h i c hh o s tp l a n t sa l s o c a np r o c e s sa st h e i rl o n g t e r mg r o w t hi np l a n t si n t e m a l l y , a n dt h em e t a b o l i t e st h u s b e c o m eo n es o u r c e so fn e wd r u g s e n d o p h y t i c f u n g i a sn e ws o u r c e so f m i c r o o r g a n i s m s ，h a sb e c o m ear e s e a r c hf o c u si nr e c e n ty e a r s ，a n dp e o p l es t r i v et of i n d n e w a n t i t u m o r , a n t i - f u n g a la n do t h e ra c t i v ec o m p o u n d si ne n d o p h y t i cf u n g i i nt h i s p a p e r , t h ee n d o p h y t i cf u n g ic h a e t o m i u mc u p r e u ma n da r t h r i n i u ms p b e l o n g i n gt oa s c o m y c o t aw e r es t u d i e dm a i n l yf o rt h e i rm e t a b o l i t e s t h ea c t i v e c o m p o u n d sw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e db yc h e m i c a lm e t h o d s ，a n dt h e i rc h e m i c a l s t r u c t u r e sw e r ed e t e r m i n a t e db yx r a ys i n g l ec r y s t a ld i f f r a c t i o n a n do nt h eb a s i so f s t r u c t u r ea n da c t i v i t yo ft r i c h o d e r m i n , w et r a n s f o r mi t sc h e m i c a ls t r u c t u r ea n ds t u d y i t sa c t i v i t y t h i sp a p e rc o m p r i s e st h r e ep a r t so fr e s e a r c hw o r k f i r s t ，w es t u d yo ne n d o p h y t i cc h a e t o m i u mc u p r e u mf r o mm ac l e a y ac o r d a t a ( w i l l d j 灭b rh e r b ，w h i c hw a si d e n t i f i e db ya n a l y s i so fm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n dt h es e q u e n c eo ft h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s ( 2 8 sr d n a ) o fr d n a t h ec r y s t a l ， i s o l a t e df r o mc u l t u r eb r o t ho fc h a e t o m i u mc u p r e u m ，w a si d e n t i f i e db yx r a ys i n g l e c r y s t a ld i f f r a c t i o na s3 , 3 ，6 ，6 一t e t r a h y d r o x y - 4 ，4 - d i m e t h y l - 1 ，1 - b i ( c y c l o h e x a 3 ，6 d i e n e ) 一2 ，2 ，5 ，5 - t e t r a o n e ，o o s p o r e i n w ed e m o n s t r a t e dt h eo o s p o r e i nh a da n t i f u n g a l a c t i v i t ya g a i n s tr h i z o c t o n i as o l a n i ，b o t r y t i sc i n e r e a , p y t i u mu l t i m u m ，a n t i t u m o r a c t i v i t i e sa g a i n s th l 一6 0a n da 5 4 9a n dt o x i c i t yt h r o u g ha r t e m i as a l i n a s e c o n d ，w es t u d i e do ne n d o p h y t i ca r t h r i n i u ms p f r o mp o l y g o n u mh y d r o p i p e r l ， w h i c hw a ss e n s i t i v et ot e m p e r a t u r e ，t h eo p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r ew a s2 5 ( 2 - 2 6 c ， i i i 浙江人学硕j ：学位论义 a b s t r a c t a n dp i g m e n ta l s op r o d u c e dm o r et h a no t h e rt e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s t h er e d s c y s t a l w a sg e tb yc h l o r o f o r me x t r a c t ，a n dd e t e r m i n a t e db yx - r a ys i n g l ec r y s t a ld i f f r a c t i o na s b o s t r y c i n w et e s tt o x i c i t yt h r o u g ha r t e m i as a l i n aa n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t y t h i r d ，w eu s e dx r a ys i n g l ec r y s t a ld if f r a c t i o nt od e t e r m i n a t et h ec r y s t a l s t r u c t u r eo ft r i c h o d e r m i n h a n d l e db yd e a c y l a t i o n ，w eg e td e a c e t y l t r i c h o d e r m i n x r a ys i n g l ec r y s t a ld if f r a c t i o nw a su s e da g a i nt od e t e r m i n a t ei t sc r y s t a ls t r u c t u r e w e s t u d i e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na c t i v i t ya n ds t r u c t u r e k e yw o r d s ：e n d o p h y t i cf u n g i ，t r i c h o d e r m i n ，d e a c e t y l t r i c h o d e r m i n ，o o s p o r e i n ， b o s t r y c i n 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得监姿盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：雹翘 签字日期：研。年弓月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 孝起 乙jj 导师签名： 签字吼 列a 年；月 孑日 签字目期劬f6 年弓月7 日 浙江大学硕十学位论文致谢 致谢 本论文是在导师陈绍瑗副教授的悉心指导下完成的，从论文的选题到实验结 果数据的分析都凝聚着导师的心血。导师严谨的治学态度、渊博的知识、为人师 表的师德风范、呕心沥血献身事业的精神使我终生受益，并将激励着我今后的学 习和工作。衷心感谢陈老师对本人的淳淳教导，她的言传身教使我终生受益。值 此论文完成之际，我怀着深切的感激之情，谨向我的导师陈绍瑗副教授表示最衷 心的感谢! 实验开展和论文的撰写过程中，得到了林福呈教授和章初龙副教授的悉心指 导和热情的帮助。林福呈老师渊博的知识、开拓创新的老师风范、豁达的处世态 度，章初龙老师严谨的治学态度，广博的专业的知识都让我受益匪浅，感谢王宏 凯老师的关心和指导。 感谢王国平和郑必强给予我实验和论文上的帮助，感谢本实验室刘小红、董 波、赫荣林、张福生、汪莹、高惠敏、樊荣辉、厉晓东、杨冠美、庄飞龙、程国 庆等同学给予实验和生活上的帮助。同时还要感谢浙江大学生物技术研究所的老 师和同学给予的支持与帮助，感谢所有帮助过、鼓励过我的人。 感谢父母二十多年来对我生活与学习的关心、帮助、理解与支持，感谢他们 无私的奉献，是他们给我前进的动力! 值此论文完成之际，谨向所在给予我关心 和帮助的亲人和朋友致以最诚挚的感谢! 最后，向参加本论文评阅和答辩的专家、教授致以最诚挚的谢意。 黄超 2 0 10 年元月 浙大华家池畈 浙江人学硕十学位论文l 综述 1 综述 1 1 植物内生真菌的概念 18 9 8 年，v o g l 等n 1 首次利用黑麦草的种子( l o l i u mt e m u i e n t u m ) 分离得到 一株内生真菌( f u n g a le n d o p h y t e 或e n d o p h y t i cf u n g i ) ，虽然已经经过百余 年的发展，但是内生真菌外部表征不明显，人们一直忽视其作用和存在。直到 2 0 世纪8 0 年代初期，b a c o n 担1 等发现高羊茅( f e s t u c aa r u n d i a a c c a ) 内生真菌 与牛的中毒症状相关后，内生真菌的生物学作用方面的研究才正式开展起来。 1 1 1 植物内生真菌的涵义 从八十年代后期开始，人们开始研究内生真菌对植物影响的生理生化机制和 内生真菌代谢活性物质的开发应用，大多数工作集中在温带地区和亚热带地区 具有重要经济价值的植物，目前热带地区的植物开始受到人们的注意幢1 。近年来， 分子生物学和基因工程技术也逐渐应用于内生真菌的研究中b 1 。内生真菌的定 义，学术界仍有很多争论和分歧h 鲥，有两种定义普遍为人们所接受。第一种观 点认为内生真菌是指在某一时期生活在健康植物体内但对寄主植物组织并不引 起明显侵染的真菌d 酣，这些真菌仅指健康植物体内所含有，而并不考虑将来某 些时间这些真菌与宿主植物发生的互作关系 1 ；第二种观点认为内生真菌是指生 活在植物体内或其生活史的一定阶段处于植物体内的一类真菌哺1 。 1 1 2 植物内生真菌的演变 尽管在过去几十年的发展时间里，内生真菌的生态学、形态学以及分子生物 学等方面的知识逐步积累，但是关于内生真菌的进化起源、物种形成和生态学上 的地位等基本问题仍未得到解决n 们。 根据已有的研究表明，部分的内生真菌极有可能是从植物病原菌演化而来。 植物的病原菌和植物本体在长期相互作用的同时可能发生了两方面的变化：一是 由于外界的环境发生了变化，导致植物本体的免疫能力得到提高，因此当病原菌 浙江大学硕 学位论文l 综述 入侵植物的时候与宿主的防卫能力达到平衡的时候，病原菌也就以内生真菌的方 式存在于植物体内，但是随着宿主植物的衰老或者受到环境的胁迫时，又会转变 为病原菌，对宿主进行侵害，相对于植物病原菌，内生真菌的致病能力是很微弱 的。病原性内生真菌的存在可能有助于宿主植物在逆境中的生存1 。二是植物病 原菌由于基因突变丧失能力，从而对宿主不产生毒害。病原炭疽菌 ( c o l l e t o t r ：c h u m m a g n a ) 的一个突变株不仅不致病，而且还能可激活宿主的防 卫系统，使之免受炭疽菌和镰刀菌等病原菌的侵害m 1 。 1 1 - 3 植物内生真菌与宿主之间的关系 1 1 3 1 互利共生关系 植物内生真菌和宿主之间的关系，并不是一般的寄生、病原和腐生等关系， 而是互利共生( m u t u al isti ca s s o c i a ti o n s ) n 引，主要就表现在：( 1 ) 植物为内 生真菌提供原材料以及微量元素等，对内生真菌起到保护的作用。( 2 ) 内生真菌 均代谢产物能够刺激宿主植物的生长和发育，增强宿主对生物胁迫以及非生物等 胁迫的抗性阻4 1 。 二十世纪八十年代，自从c l a y n 5 1 等发现高羊茅( f e s t u c aa ：u n d i n a c e a ) 与 内生真菌构成互惠关系以来，越来越多的宿主与内生真菌共生关系被人们所发 现： ( 1 ) 、目前已经发现的内生真菌对植物宿主有益作用可以表现为以下的几 个方面：抗逆境( 干旱等) n6 1 ，线虫n ”以及食草动物等的摄食，提高植物的营养 状态( 提高植物对氮、磷的摄取能力等) 8 2 们，促进植物生长( 分泌i a a 、g a 等 促进植物生长激素物质) 旺，抗病原菌心2 2 盯等。 内生真菌对宿主植物的有益作用是有特定环境和特定条件所决定的，一旦破 换了特定的生长条件和环境，内生真菌就有可能妨碍宿主植物的生长。目前禾本 科植物感染内生真菌对干旱胁迫的生理反应的报道中，研究结果并不一致，有正 面效应旺6 1 无显著效应伸7 1 以及负面效应n 引。 ( 2 ) 、目前也发现对植物宿主有害作用的报道：s ie b e r 等妇9 1 对大叶碱 ( a c e r m a c r o p h y l l u m ) 愈伤组织与其内生真菌共培养发现：愈伤组织的生长可以 促进内生真菌的生长，但是相反内生真菌的生长就阻碍了愈伤组织的生长。 2 浙江大学硕士学位论文1 综述 s c h u l z 们等通过对落叶松以及大麦两种植物的内生真菌以及病原菌感染引起的 宿主防卫性次生代谢产物以及大量内生真菌次生代谢产物的分析，发现内生真菌 能产生对宿主有害的次生代谢产物。内生真菌的浸染同样可以引起宿主植物的防 卫反应。内生真菌的入侵，导致植物防卫机制的启动，从而限制了内生真菌的生 长和治病，内生真菌与宿主植物处于一种动态的拮抗平衡关系。这种关系并不稳 定，外界的环境的破坏容易破坏平衡的结构”。 1 1 3 2 内生真菌宿主的选择 在内生真菌中，宿主的变化很大。一些内生真菌可以从不同生态和地理条件 的属于不同科属的多种宿主植物中分离出来，但是某些特殊的内生真菌仅限于某 一特殊的种属的几种宿主植物。 某些植物具有专一性d 引。内生真菌在长期的进化过程中为了能够更好的适应 宿主植物发展相应对宿主植物有益的功能，帮助宿主抵抗不良的生长环境，增加 宿主的竞争力，从而形成各种各样的关系，最终形成共生以及宿主专一性臼引。 内生真菌的宿主专一性相当明显。在同一地区的两种亲属关系较远的植物的内生 真菌差异很大，种类也截然不同b 钔，甚至在亲缘关系较近的统一种属植物中的内 生真菌群落差异也是较大的d 卯。一般说来，在植物原产地的内生真菌多为宿主专 化性强的种类，其他地区则是非专化性强的真菌种类 3 6 ol e u c h t m a n n ”7 1 等通过对 分离不同自不同宿主的内生真菌同工酶的分析发现，同工酶的带型与宿主有关。 内生真菌的宿主专一性与真菌浸染宿主的过程有关，真菌孢子吸附到宿主表面并 被识别是由真菌孢子表面的多糖和宿主的调控所决定，同时真菌孢子的萌发收到 宿主的专一性调节。 1 1 4 内生真菌的多样性 内生真菌在植物内是普遍存在的，主要是由子囊菌以及无性型组成，也包括 少数的担子菌和接合菌。根据内生真菌的来源以及特征来分，可以分为两大类： 麦角类禾草内生真菌，即是从植物草本植物内部分离出来的并与宿主植物有明显 互惠关系的内生真菌；还有一类为树木和灌木内生真菌，也被称为非麦草类内生 真菌，也包括从禾草分离出来的非麦角类内生真菌。 不同的植物分离的内生真菌的种类和数量也是不同的，少则几十种，多则近 浙江大学硕斗j 学位论文i 综述 百种，f is h e r 们等从e u c a l y p t u s n it e n is 上分离得到6 0 多种内生真菌，h y d e 等经过对澳大利亚亚热带地区棕榈树内生真菌的全面研究，分析得到平均每种有 10 0 中的内生真菌，这些差异的可能是植物本身以及环境的差别所造成。a n o r1d h 伽 等分析了巴拿马两种植物叶子上的内生真菌，分析发现8 3 个健康的叶片内具有 4 1 8 个形态学种的内生真菌，经过内生真菌与宿主专一性的分析，平均每种宿主 有专一的内生真菌4 5 种。 1 1 5 内生真菌的专一性 1 1 5 1 宿主专一性 研究表明可知很多种群可以在宿主种的水平上具有专一性，p e t r i n i 等b 8 1 通 过对生长于同一地点的欧洲赤松n 锄s y lv e s t r k 三和f a g u ss y l v at i c a 三的内生 真菌群落进行了分析，在这两棵树上的两组真菌群落明显不同，在其他研究中也 得到同样的结论。 1 1 5 2 组织专一性 c a r r o l l 2 1 等研究了7 种分布在法国和瑞士的针叶树上不同组织的内生真菌 群落，发现不同部位的内生真菌种类明显不同，因此，提出内生真菌种类具有一 定的组织专一性的假说。许多的研究结果也支持此假说。内生真菌具有一定组织 专一性的原因可能是由于不同的内生真菌具有利用不同基质的能力，从而决定了 内生真菌不同的生活方式。 1 1 6 内生真菌在植物类群里的分布规律 内生真菌普遍存在于目前已研究过的各种陆生及水生植物中。禾本科植物牧 草中的系统发生的内生真菌是最早的关于内生真菌的认识。目前全世界至少已在 8 0 个属2 9 0 多种禾本科植物中发现有内生真菌。近几年在多种草本植物，灌木、 果树，栽培作物甚至苔藓，藻类和蕨类植物中也发现了内生真菌哺1 。 1 1 7 内生真菌在植物体里的分布规律 内生真菌系统地分布于植物体根，茎，叶，花，果实和种子等器官、组织的 4 浙江人学硕 ：学位论文l 综述 细胞或细胞间隙。近年来，已从花生、百慕大草、果仁、黄瓜、甘蓝、甜菜根的 茎、马铃薯的块茎、胚珠和种子、棉花的胚根、棉铃和水稻叶子及其它植物储藏 器官内分离到大量内生真菌”。内生真菌菌丝在宿主植物的叶鞘和种子中含量最 多，而叶片和根中含量极少”，不同的内生菌占据植物体内不同的生态位。 1 2 关于植物内生真菌次生代谢产物的研究理论 从天然产物中分离得到具有生物活性成分或者先导化合物是研究创新型新 药的有效途径之一。在过去的几十年中，有一半的药物是来自于天然产物或者天 然的先导化合物，约有5 的药物为天然化合物的直接应用h 引。微生物在目前的开 发利用中作用显著：头孢霉属( c c p h a l o s p o r i u r ns p ) 是头孢霉素的来源之一， 青霉素就是从点青霉菌( p e n i c i l l i u mn o t a t u m ) 中分离得到的。目前在微生物 的次生代谢产物中已经发现有6 0 余种的药理作用鲥。利用微生物发酵生产药物 相对于化学合成具有显著的优势，环境污染少、资源利用少，其优越性显而易见。 1 2 1 内生真菌的优势 植物内生真菌与宿主之间有着与其他生物之间不同的紧密生态关系。宿主与 内生真菌之间由于长期的共同作用，发展出各种各样的关系，提高植物的抗病能 力，提高抵抗灾害的能力，提高适应环境变化的能力等。在内生真菌和植物的互 作中，内生真菌的次生代谢的活性至关重要，因而研究内生真菌的次生活性代谢 产物具有非常重要的意义和价值。 相比较于其他的微生物而言，内生真菌的优势主要凸现在以下的几个方面： 第一，内生真菌与宿主的亲密关系使得发现有活性的次生代谢产物的几率大大增 加；第二，内生真菌数量积极庞大，可以为次生代谢产物的研究提供大量的素材； 第三，目前内生真菌的研究相对较少，因此具有广阔的研究空间。目前，有研究 表明：分离自植物内生长真菌的生物活性物质有5 1 是目前所未知的新物质【4 引， 大大大于从土壤微生物钟分离得到新的具有生物活性的物质的几率3 8 7 1 。 1 2 2 植物内生真菌产生活性物质的机理 宿主植物与其内部的内生真菌长期共存，关系身份密切。目前已有实验表明， 浙江人学顾t 学位论文l 综述 内生真菌和植物之间具有相似的次生代谢产物合成途径，获得相关基因的直接传 递，这些传递可以“共生生物一寄主”或“寄生生物一寄主”间的相互作用过程或 者生活在共同的生活环境中，经过长期的直接或者间接的接触导致遗传物质的吸 收。 “内共生理论”认为次生代谢中出现有用的生化途径，这样就可以被其他生 物利用，表现出相互作用和“协同作用”8 川。如有些真菌激素，包括其性过程 中产生的一些性激素，经过化学结构分析与哺乳动物的的性激素十分相似b 引。同 样，该理论也认为生物次生代谢过程中生化途径的不断演化导致有益物质进入宿 主体内，并且内生真菌的生化信息有时可以传递到其他细胞中去。在生物早期系 统发育研究中，具有完全互补遗传特性或者参与代谢过程的其他整个生物( 如细 菌或者蓝藻) 被认为可以组合进入真核细胞，形成叶绿体和线粒体。由上可以推 测，在长期的进化工程中，宿主细胞有可能将遗传信息传递给其内生真菌，这样 导致内生真菌与宿主具有类似的生理生化代谢途径，关于进一步的机理研究，需 要进一步的证据加以确实。 1 2 3 植物内生真菌与宿主的共同进化 植物内生真菌物种的多样性决定了代谢产物的多样性。在代谢过程中会产生 许多的活性物质，其中有些是与宿主相同或者类似的产物，有些则是新型的物质， 具有特殊的生理活性。随着研究的不断深入，人们发现内生真菌代谢出和宿主的 生物活性物质并不是偶然的现象。内生真菌长期生活在植物宿主的环境中，并且 和植物宿主一起共同进化形成的互惠共生关系，这样内生真菌可以从宿主吸收营 养物质供自己生长繁殖，同时内生真菌在宿主植物的生长发育中起到中重要的作 用m 1 。 内生真菌以及植物宿主的稳定共生系统中，内生真菌产生许多结构复杂的次 生代谢产物，近年来收到关注的是与宿主相同或者相似的生物活性物质，其中内 生真菌产生相类似活性物质肯定与宿主植物有着密切的联系，但是植物与内生真 菌之间关系过于复杂，因此到目前为止，内生真菌与宿主植物之间的相互作用机 制还没有弄清楚。 关于内生真菌与植物宿主之间生物活性物质的“进化”机制，目前有以下几 f ； 浙江人学硕。l ：学位论文l 综述 种说法： 第一，是被认为“内共生理论”。该理论认为真核细胞的叶绿体和线粒 体源于共生的蓝细菌，因此有人认为一旦共生生物之间代谢出有用的生化途径， 这就可以被共生生物所利用，因此可以表现出“协同进化”。s t r o b e l 2 1 等认为， 红豆杉和其中的内生真菌可以产生紫杉醇，这样更加有利于内生真菌在宿主体内 这个竞争性环境中生存。 第二，是被认为“基因传递理论”。该理论认为宿主植物与内生真菌长期共 同生活，导致遗传物质的交换或者传递，因此使得两者之间具有相同的次级代谢 产物合成途径。l i 等认为在红豆杉内部，红豆杉将基因传递给内生真菌，导致 某些真菌可以产生紫杉醇，另外内生真菌将基因传递给红豆杉也并不是不可能， 但是植物细胞具有较严密的保护作用，因此前一种的几率比后一种的几率要来的 大。s ti e r l e 拈卅也认为真菌和宿主之间存在某种遗传交换机制。 另外，同一宿主中的内生真菌也存在着复杂的相互作用，包括有力的松散的 互生关系以及抑制作用等，例如，目前许多内生真菌，分离自博罗回等具有抵抗 终极腐霉以及立枯丝核茵的生物活性。真菌间的相互作用，有助于内生真菌在特 定的宿主内分布达到动态的平衡。 1 2 4 目前内生真菌的主要研究方向 1 9 9 3 年，s t i e r l e 5 1 等从短夜红豆杉的韧皮部中分离得到一株生产紫杉醇的 内生真菌后，引起了人们从内生真菌中寻找其他抗肿瘤活性物质的研究热潮。目 前研究的主要方向有：抑菌活性物质、抗虫类活性物质、抗肿瘤类活性物质，植 物生长调节类物质以及其他一些活性物质，如酶类、抗糖尿病物质类等。内生真 菌因其丰富的次生代谢产物已经成为新药合成以及先导化合物的重要来源。 1 3 药用代谢产物的研究现状 1 3 1 药用植物的多样性 植物是全球生物多样性的重要一环，也是保障人类重要的生活资源。药用植 物就是在人们认识和利用植物过程中，所具有特殊的化学成分，对人体具有一定 7 浙江犬学硕l 学位论文1 综述 的治疗以及保健作用，后者具有抗肿瘤、杀菌以及杀虫等作用的各类植物的总称， 涉及面相当广泛。 世界上目前已经有的植物大概有2 5 万种左右，我国地域面积辽阔，覆盖面 积广阔，是世界上植物生物多样性最丰富的国家之一，全国目前已知的植物约有 2 57 0 0 种，大多数植物具有药用价值。经过2 0 世界8 0 年代的资源普查，发现我 国的药用植物资源种类包括3 83 个科，23 0 9 个属，1 114 6 个种，其中藻、菌以及 地衣等植物油4 5 9 种，苔藓、蕨类以及种子植物等有10 6 8 7 种。在这些药用植物 中。临床类植物油7 0 0 种，少部分为人工栽培。 近些年来研究已经涉及到4 7 科8 1 属1 1 4 种3 变种，包括蕨类植物、裸子植 物、藻类植物以及藤本、草本、木本等被子植物，而我国研究的只有2 1 科4 4 属 6 2 种2 变种，相对于我国丰富的药用植物资源，内生真菌的研究还是远远不够 的 1 3 2 研究现状 1 3 2 1 抗肿瘤物质的研究 ( 1 ) 紫杉醇 19 93 年s ti e r l e d 卯等首次从红豆杉中分离得到一株内生真菌的新种 t a x o m y c e sa n d r e a n a e ，在培养液中可以分离得到紫杉醇( t a x 0 1 ) ，其结构如图 1 - 1 所示。紫杉醇是一种二萜类生物碱，具有独特的抑制微管接聚和稳定微管的 作用，是一类广谱性的看该类药物，目前紫杉醇对于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前 列腺癌以及食道癌具有重要的抑制作用，是近年来发现的最重要的抗肿瘤的药物 之一。 浙江大学硕f ：学位论文 i 综述 图1 - 1 紫杉醇的化学结构 至今已在欧洲红豆杉( zb a c c a t a ) b 鲥、短叶红豆杉抬7 5 引、东北红豆杉( z c u s p i d a t a ) 5 9 - 6 1 1 、南方红豆杉( zm a i r e i ) 陆2 “4 1 、云南红豆杉( zy u n n a n e n s i s ) 陆5 1 、喜马拉雅红豆杉( zw a l l i c h i a n a ) 陆6 。6 8 、红豆杉( zc h i n e n s i s ) 哺 、榧 树( t o ；r e y ag r a n d i f o t i a ) ”们、落羽杉( t a x o d i u md i s t i c h u m ) ”和南洋杉科 g o l l e m i an o b i l i sn 钉中分离到了多种能产生紫杉醇的内生真菌。 由于红豆杉中含有的紫杉醇量极低，并且红豆杉生长极为缓慢，自然资源匮 乏，化学合成则花费巨大，影响环境，因此紫杉醇的来源成为一个重要的问题。 但是内生真菌的发现，为紫杉醇的来源提供了明确的方向。p e s t a l o t i o p s i ss p p 是红豆杉中最常见的内生真菌之一n3 1 ，它几乎分布于所有热带植物中 3 9 o 这些发 现为人类突破植物资源周期长，不可再生等限制，利用植物内生菌来工业化发酵 生产重要植物药物提供了新思路。 目前分离的分离的产生紫杉醇的内生真菌产量还是极低的，由s tie r le 分离 得到的内生真菌产生紫杉醇量仅为2 4 - 5 0 n g l 。k i m 4 1 等从银杏植物中分离得到 的链格孢属( a 1 t e r n a r i as p ) 内生真菌的紫杉醇产量最高达到2 6 0 n g l 。 l i - ji a y a o 等 5 1 从落羽松中分离得到内生真菌小孢拟盘多毛孢( p e s t a l o t i o p s i s m i c r o s p o r a ) ，产量最高可以达到1 4 8 7 n g l ，初步显示其商业价值。 ( 2 ) 鬼臼毒素 鬼臼毒素( p o d o p h y ll o t o x i n ) 是存在于足叶草( p o d o p h y l l u mp e l t at u m ) 9 浙江大学硕i j 学位论文l 综述 等植物中一类天然的木脂素，该毒素能够抑制微管蛋白的解聚作用和阻断中期细 胞的分裂，能够抑制d n a 拓扑异构酶的活性，并且还是多种抗癌药物的合成前体， 如图1 - 2 所示。鬼臼毒素的衍生物e t o p o si d e 和t e n ip o si d e 毒性较低，对多种 的肿瘤疾病具有明显的疗效，目前已经在美国上市。目前已经从小檗科 ( b e r b e ri d a c e a e ) 鬼臼亚科( p o d o p h y ll o i d e a e ) 桃儿七( s i n o p o d o p h y ，j 删 h e x a a d r u m ) 、南方山荷叶( d i p h y l l e i as i a e a s i s ) 、川八角莲( & s o s m av e i t a h i i ) 中分离到6 株能产鬼臼毒素的交链孢属( 彳f 口朋盘，a ) 、无孢菌群( m y c e l i a s t e r i l i a ) 、丛梗孢属( m o n i l i a ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 内生真菌”们。 o m e 图1 - 2 鬼臼毒素的化学结构 ( 3 ) 长春新碱 长春新碱( v i n c r is t i n e ) 是抗癌药物长春花( 白t h a r a n t h u st o s e u s ) 植物 中发现一种应用广泛的抗肿瘤药物，结构如图1 - 3 所示。目前，长春新碱主要是 从植物中提取，但是植物的含量极低。张玲琪等从长春花的茎的韧皮部中分离到 1 株内生真菌一一一尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) ，并用h p l c 和t l c 对该 菌的培养产物进行分析，结果表明该菌能产长春新碱 7 1 。从叶中分离筛选到一株 能产生与宿主相同的抗癌物质长春新碱的无孢菌群( m y c e l i as t e r i l i a ) 菌株， 产量约为0 2 0 5ug l 引。云南大学郭波等n ”近年来虫长春花中分离得到2 1 株真 菌，其中4 株可以产生长春新碱类化合物，分别属于镰刀属( f u s a r i u ms p ) 、 链格孢属( a 1 t e r n a j i as p ) 、无孢菌群( m y c e l i as t e r l i a ) 等。 l o 浙江火学硕l 学位论文1 综述 图1 - 3 长春新碱的化学结构 ( 4 ) 其他抗肿瘤活性物质 从美登木( m a y t e n u sh o o k e r i ) 中分离筛选到一株球毛壳菌( c h a e t o m i u 叨 g l o b o s u m ) ，能产生与宿主所产的美登素( m a y t e n si n e ) 不同的抗癌物质球毛壳 甲素( c h a e t o g l b o s i na ) 恤0 1 。球毛壳甲素是s e k i t a 等于1 9 83 年发现的抗癌化 合物，为细胞分裂抑制剂，结构如图1 - 4 所示。 h 图1 - 4 球毛壳甲素的化学结构 从福罗里达榧树上分离得到的内生小孢拟盘多毛孢( p e s t o t i o p s i s m i c r o s p o r a ) 菌株中分离得到一种提取物，为粗榧酸( t o r r e y a n i ca c i d ) ，苯醌 二聚体结构，具有选择性杀死人体癌细胞组织的作用哺。 从欧洲红豆杉( y a x u sb a c c a t a ) 的内生真菌枝顶霉属( a c r e m o n i u ms p ) 中提 浙江大学硕 j 学位论文l 综述 取到一种白灰制菌素h ( 1 e u ci n o st a ti n a a ) ，它对人体的某些癌细胞具有很强的 抑制作用，具有很高的开发利用价值随2 1 。 从传统药用植物雷公藤( t r i p t e ，y g e u mw i l f o r d i i ) 的内生真菌中得到了3 种 生物碱类细胞分裂抑制素( c y t o c h a l a s i n s ) 对多种人肿瘤细胞有很强抑制作用 8 3 1 从喜树( c a m p t o t h e e aa c u m i n at a ) 果实中分离、纯化得到菌株w z 0 0 1 产生喜 树碱( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) 的类似物，对多种肿瘤细胞具有抑制作用4 1 。 另外研究发现，植物内生真菌所代谢产生的多糖类化合物幢5 “1 ，虽然不能杀 死肿瘤细胞，但可以促进抗体的产生，即通过恢复和提高患者的免疫功能而发挥 其抗癌活性，它与化合物联合使用，还可减少化疗药物的毒副作用。 1 3 2 2 抗菌类物质的研究 很多内生真菌能产生的抗生素类物质以提高宿主植物的抗病能力。次生代谢 产物体外抗菌试验表明：约有3 0 的内生真菌能够产生具有抗菌活性的物质哺7 1 。 这些活性的物质不仅对植物病原体起作用，还对其它的细菌、真菌和一些原生生 物起抑制作用。从内生真菌中筛选抗生素类物质己成为新型抗生素来源的一个重 要方面，在医学、食品工业以及农学上都具有重要的意义。 s t r o b e l 等哺7 1 从卫矛科药用植物雷公藤( 行印t e c y g e u mw i l f o r d i l 3 中分离到 一株内生真菌( c r y p t o s p o r i o p s i sc f q u e r c i n a ) 能产生一种新型环肽抗生素 c r y p t o e a n d i n ，不但能抑制癣菌及白色念珠菌等人类病原真菌，而且还能有效抑 制核盘菌( s e l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 和灰葡萄孢( b o t r y t i sc i n e m a ) 等植物致 病真菌。该菌还能产生一种新酰胺生物碱( e r y p t o c i n ) 对稻瘟病菌( 局玎i c u l a r i a o _ r y z a e ) 及其他多种植物病原真菌有较强的抑制作用哺引。此后s t r o b e l 等哺明又从 锡兰肉桂( c i n n a m o m u mz e y l a n i c u m ) 的一种内生真菌( m u s c o d o ra l b u s ) 中得到5 种挥发性化合物，均具有不同程度的细菌和真菌抑制作用。 p e l a e z 等伸们从一种刺柏( 1 u n i p e r u sc o m m u n i s ) 分离到的l l o r m o n e m a 属内生 真菌产生一种新的三萜糖昔，对假丝酵母、念珠菌和曲霉表现出很高的杀菌活性， 与临床葡聚糖合成抑制剂p n e u m o c a n d i nb 几乎有相同的杀菌谱和活性。