（微生物学专业论文）利用离子束诱变筛选大肠杆菌tat转运系统受阻的突变株.pdf

摘要 本研究通过低能n 离子注入处理大肠杆菌野生型菌株m c 4 1 0 0 a ，利用其蚀刻 效应和诱变效应将外源质粒直接导入菌体中、根据t a t 转运系统相关基因的缺失型 菌株分裂后分离功能的异常，t a t 突变型菌株对s d s 的敏感性以及在m 9 培养基中 生长性能为指标，筛选t a t 蛋白质转运系统受阻的突变菌株。 经低能n 离子注入处理后，转入质粒p 8 7 6 0 ，并筛选到了7 株与m c 4 1 0 0 a 相 比有很大差异的转化子，这些转化子细胞呈链状排列，丧失了细胞分裂后分离的能 力；2 s d s 对其有一定的杀伤性；在厌氧状态下，失去了以甘油为碳源和t m a o 为电子受体的生长能力。表明这7 株突变株具有一系列与双精氨酸转运系统受阻菌 株相同的性状，因而这些突变很可能发生在与细菌蛋白质t a t 转运系统相关的基因 上。并且突变菌株在3 7 下生长缓慢，难以形成菌落，而在4 c 放置3 d ，可形成 直径约为0 5 m m 的菌落。 通过十二烷基磺酸钠( s d s ) 、紫外线( u v ) 、三黄片( s h p ) 、反复冻融4 种物j ： 方法对大肠杆菌m c 4 1 0 0 a p 8 7 6 l ，菌株进行质粒消除。摸索了d n a 在非损伤条斗 下的消除规律，并获得了几株质粒消除的菌株。同时用m 9 培养基培养和镜检两种 方法检验了质粒消除后菌株的基本特性。结果表明，质粒消除没有改变突变菌株的 性状。 现将编码t a t 基因的质粒p 8 7 3 7 转入质粒已消除的菌株中，进行互补检测。结 果表明，导入质粒p 8 7 3 7 后，菌株的形态没有恢复，且在m 9 培养基中仍不能生长， 说明不能互补。这初步确定了这些突变菌株为t a t 转运系统的相关基因发生突变， 而非矧基因。 为了构建基因文库，确定突变菌株的具体突变位点。提取m c 4 1 0 0 a 菌株的核 d n a ；测定基因组d n a 的纯度；选用限制性内切酶m o bi 进行酶切，电泳，观察 酶切效果。对实验结果进行分析表明，大肠杆蔚基因组甲基化程度较高，因此m o b ，对其没有酶切效果。 总之，离子注入可以介导外源质粒进入微生物细胞并能引起诱变效应。故低能 n 离子注入对微生物细胞的诱变效应和介导外源d n a 转化效应的有机结合将使离 子注入技术在生物学基础研究中有着广泛的应用前景。本研究筛选到了一株非已知 大肠杆菌t a t 基因编码的t a t 系统受阻的突变菌株，说明除了已知编码t a t 系统的 几种蛋白质之外，必定还有其它的成分参与蛋白质的转运，这无疑对完善t a t 转运 系统的组成，建立完善的转运模型和了解其机理奠定了一定的基础。 关键词：n 离子注入诱变效应t a t 转运系统突变菌株 a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，t h et e c h n i q u eo ft h el o we n e r g yn i t r o g e ni o nb e a mi m p l a n t a t i o nw a s u s e dt om u t a t et h ew i l dt y p es t r a i no fe s c h e r i c h i ac o i li no r d e rt og e tm u t a n t sw h o s et a t p r o t e i np a t h w a y h a db e e nb l o c k e d s e v e nt r a n s f o r m a n t sw e r e g e t a f t e rt r a n s f o r m e dp 8 7 6 0i n t os t r a i nm c 4 1 0 0 a i m p l a n t e db yn i t r o g e ni o nb e a m t h e y w e r ed i f f e r e n tf r o ms t r a i nm c 4 1 0 0 a f o r e x a m p l e ，t r a n s f o r m a n t s c e l la r r a yi nl i n e ，w h i l em c 4 1 0 0 a 1c e l li ss i n g l e t h ef o r m e r g r o ww e a k l yo n2 s d sp l a t ea n dc a l l tg r o wi nm 9 m e d i u ma n a e r o b i c l y s os o m e i m p o r t a n tc h a r a c t e r so f t h e s es e v e n s t r a i n sw e r es a l n ew i t ht a tm u t a n t ，s u c ha sb 1 l k o a b u tt h e ya l s oh a v ed i f f e r e n tp r o p e r t i e sw i t hb1l k o a t h e s em u t a n t sg r o ws l o w l ya t 3 7 cw h i l et h e yc a l lf o r mc o l o n yo fd i a m e t e ra b o u to 5 m ma t4 。ca f t e rt h r e ed a y s t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h es i t eo fm u t a t i o nm a yr e l a t ew i t hf u n c t i o no ft a t p a t h w a y i no r d e rt ot e ：；tw h e t h e rt h em u t a t i o ni ss a m ew i t ht a t a 、t a t b 、：a t ca n dt a t eo rn o t ， s e v e r a ls t r a i n sw - ，r ee l i m i n a t e dp l a s m i do fp 8 7 6 0a n dw e r et r a n s f e ：l n e di n t op l a s m i do f p 8 7 3 7 w eo b s e r v e dt h a tt h e i rc h a n g e dc h a r a c t e r s c a n tr e c o v e rt ot h ew i l dt y p e l s t h i s r e s u l tc o n f i r mt h a tm u t a t i o nw a so c g u t i n d e p e n d l y i nt a tg e n e a g e n el i b r a r yo f t h eg e n o m i cd n ao fm c 4 1 0 0 aw a st r i e dt or e c o n s t r u c tf o rt h e s a k eo ff i n d i n gt h es i t eo fm u t a t i o n t h i sg e n o m i cd n aw a sp u r i f i e da n dt h e nb r o k e n r a n d o m l yi n t of r a g m e n t st h a ta r et h ec o r r e c ts i z ef o rc l o n i n gi n t ot h ec h o s e nv e c t o ro f p b r 3 2 2 n o w w ea r e c h o o s i n g t h ep r o p e re n z y m et ob r o k et h eg e n o m i cd n a t h i sr e s e a r c hc o n f i r m st h a tt h ei o ni m p l a n t a t i o nc a ni n d u c e sg e n et r a n s f o r mi n t o c e l l sa n dc a u s e sm u t a g e n e s i s m e a n w h i l e ，w ei s o l a t e dam u t a n tt h a tw a st a t - l i k es t r a i n ， b u ti tw a sd i f f e r e n tw i t ht h et a t p a t h w a yw e h a v ek n o w n s ow ec a nc e r t a i nt h e r ei ss t i l l h a v eo t h e rc o m p o n e n t p a r t i c i p a t e i nt h et a t t r a n s p o r ts y s t e m s u r e l yo u r w o r ke s t a b l i s h e d t h eb a s eo fp e r f e c t i n gi t sc o n s t i t u t e sa n dc r e a t i n gm o d e lm e c h a n i s mo ft a tt r a n s p o r t s y s t e m k e y w o r d s ：ni o n i m p l a n t a t i o nm u t a g e n e s i s e f f e c tt a tt r a n s p o r ts y s t e m m u t a n t s 1 1 1 缩写 t a t t m a o a r a s d s u v s h p a m p v b j d m s o 英文全名 缩略表 中文全名 t w i n a r g i n i n et r a n s l o e a t i o n双精氨酸转运 t r i m e t h y l a m i n en o x i d ed i h y d r a t e三甲氨氮氧化物 a r a b i n o s e 阿拉伯糖 d o d e e y ls u l f a t es o d i u m十二烷基磺酸钠 a m p i c i l l i n 紫外线 三黄片 氨苄青霉素 t h i a m i n eh y d r o c h l o r i d e 盐酸硫胺 d i m e t h ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 独创性声明 。矿7 3 7 6 6 6 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间： 卫即歹年占月卵 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 喜。逾 | 时间：加多年；月g r 第一导师签名：i 堡垒8时间：晰i 月。f 日 竹 综述 1 大肠杆菌t a t 蛋白质转运系统( _twing r g i n i n et r a n s l o c a t i o n ) t a t 蛋白质转运系统可介导含双精氨酸( r r ) 保守序列信号肽的折叠蛋白质进行 穿膜转运，使这些蛋白质进入细胞周质空间或定位于细胞内膜上。研究表明，t a t 转运系统是大肠杆菌中重要的转运系统。 1 1 t a t 系统的发现 1 9 9 8 年，s e t t l e s l l l 发现了玉米不能编码蛋白h e f t 0 6 ( h i g h c h l o r o p h y l if l u o l - e s c e n t ) 的突变株。该突变株因为不能转运很多与光合作用有关的蛋白质到类囊体中，最终 幼苗因不能进行光合作用而死亡。同时s e t t l e s 还在己知全序列d n a 的细菌中发现 了 e ，= 0 6 的相似片断，因而推断植物类囊体蛋白质p h 转运系统也存在于细菌中， 并且来源于细菌。随后加拿大、法国和英国科学家进行的开创性实验表明，除 s e c ( s e c r e t o r y ) 转运系统外，在大肠杆菌中确实存在着一类新的蛋白质转运系统。 w e i n e r ，s a n t i n i ，b o g s c h 2 - 4 1 等人的研究也说明了细菌中确实存在一类新的转运系统， 并认为该系统由t a t a 、t a t b 、t a l c 和t a l e 组成，转运含有t a t 信号肽的折叠蛋白进 i j 穿膜转运和定位于细胞内膜上，其转运底物一般为细菌厌氧呼吸有关的酶类，转 运所需的能量来源于跨膜质子梯度。 1 2t a t 系统转运底物的特征 t a t 转运系统转运底物的一个显著特征就是其信号肽中含有双精氨酸 s t - r r - x f - l k 的保守序列核心，在蛋白质t a t 转运系统中双精氨酸起到了决定性 作用，若人为地取代一个或两个精氨酸，转运效率会降低或完全丧失。与s e c 转运 系统的信号肽相比，t a t 信号肽的h 一区疏水性低，在昏区还有由高赖氨酸、高精氨 酸构成的避开s e c 系统的信号肽。由于信号肽中的双精氨酸转运效率有着定的位 置效应，即第二个精氨酸比第一个精氨酸重要。表明双精氨酸对信号肽的功能有很 大的影响，精氨酸可能不仅通过其极性基团与t a t 转运酶相互作用，还必须具有一 定的高级结构才能发挥作用【5 6 1 。 除了t a t 信号肽这一共同特征外，还有一个主要特征即通过t a t 系统转运的蛋白 质前体在转运前已处于折叠状态并以此状态转运。通过对依赖于t a t 系统转运的蛋 白质研究发现它们绝大多数为带有辅因子的酶，特别是含金属的、与细菌厌氧呼吸 有关的酶，按辅因子的类别可将之分为含镍、钼、铜和n a d p 的酶及铁硫蛋白五类。 这些蛋白质都是在细胞质中先与辅因子结合后才能转运到周质空间或插入到细胞膜 上。辅因子的缺失将阻止转运的进行，重新加入辅因子可恢复正常的转运。脱辅基 蛋白与辅因子的结合是在胞内其它蛋白质因子的作用下进行的，这种蛋白质因子与 脱辅基蛋白之间的相互作用说明了蛋白质前体己处于折叠状态，这一特性是通过t a t 系统转运的蛋白质的主要特性。 1 3t a t 转运酶的组成及功能 一般认为大肠杆菌中t a t 转运系统是由t a r a 、t a t b 、t a t c 和 f a t e 四种蛋白质组 成的，其它细菌的相应蛋白质称为t a t 相似蛋白质( t a t l i k ep r o t e i n s ) ，编码这些蛋 白质的基因定位于大肠杆菌染色体1 4 ( y b e c ) 和8 6 ( y b e t u w ) 分钟处，现统称为 t a t 娃w i n - _ a r g i n i n e _ t r a n s l a t i o n ) 基因，包括t a t e ( y b e c j 和r a t a 、m t b 、t a t c 和t a t d b e t u w ) ， 但t a t d 的产物与t a t 系统无关。 在随后的研究中m j ，用基因插入和缺失的方法获得了各r 讲基因的突变株用于 相关蛋白质转运系统的研究。根据这些菌株对相关酶转运的影响可知t a t a 、t a t b 和 t a t c 是t a t e 系统的重要组成成分。随后人们对各成分的功能及其组成进行了广泛深 入的研究，蛋白质结构分析表明，t a t a 、t a t b 和t 乱c 均为穿膜蛋白，分别含有8 9 、 1 7 1 和2 5 8 个氨基酸残基，分子量分别为9 6 k d a 、1 8 4 k d a 和2 8 9k d a 。 t a t a 在细胞中存在量大，且以同源多聚体的形式存在。t a r a 和1 毫t b 的穿膜片 断对于其自身与细胞膜的结合以及t a r a 和t a t b 在各自形成同源多聚体时是十分必 要的。研究还揭示t a t a 和t a t b 与细胞臆的结合是独立进行的不需其它t a t 蛋白的 存在。在t a t 转运酶的复合体中，t a t b 和t a t c 结合紧密，并以1 ：l 组合形成分子 量为6 0 0 k d a 的多聚体。在这个复合体中含有大量的t a r a ，t a r a 通过t a t c 与t a f t 3 结合。由于大多数t a t a 随着分离过程的进行易于从复合体中脱落，所以推测t a r a 与复合体结合的方式是松散的，或形成独立于t a r a 、t a t b 和t a t c 形成的t a t 转运酶 复合体外的多聚体。 t a t 信号肽除了具有上述特征外，还具有种属特异性和多样性。t a t 信号肽只能 与自身的t a t 转运酶相互识别【引，因而具有一定的种属特异性。研究表明大肠杆菌的 t a t c 与枯草杆菌的t a t ( ；在功能上不能互补，这也在一定程度上说明信号肽与转运 酶相互识别的专一性，并说明t a t c 可能是与信号肽相互识别的部位。随着对t a t 系 统研究的深入，发现信号肽还具有多样性，并不是所有的t a t 转运系统的蛋白质的 信号肽保守序列核心上都具有双精氨酸，信号肽上天然缺陷一个精氨酸的酶仍可以 通过t a t 转运系统转运。 2 离子束注入 离子注入是2 0 世纪8 0 年代初兴起的一项高新技术，应用于诱变育种始于1 9 8 6 年。但离子注入诱变育种技术作为一门新兴的交叉学科，显示了巨大优势。离子注 入集化学诱变和物理诱变于一身、损伤轻、突变率高、突变谱广1 9 】且操作简单。由 于微生物具有繁殖快、变异广等诸多特点。加之离子束介导转基因的可能性，使其 在微生物育种中也得到广泛应用 1 0 】，如对麦角甾醇酵母的选育 1 1 、1 3 】、2 - 酮基一l 古龙 酸高产菌系i p p m 一1 0 2 8 的选育l l 、右旋糖酐生产菌肠膜状明串菌株的选育“、长 链二元酸生产菌热带假丝酵母的选育【i6 j 以及利福酶素、a 一淀粉酶、糖化酶、多不饱 和脂肪酸等高产菌株的选育都获得了成功。 2 1 离子注入的生物效应及机理 2 1 1 离子注入的生物效应“7 1 离子注入生物效应原初过程有4 个方面，即能量的沉积、动量的传递、粒子注 入和电荷交换。 2 1 2d n a 损伤以及外源d n a 的导入 离子注入生物材料后，一部分离子能量转换成靶原子的动量，引起二次离子发 射，即所谓离子溅射。另一方面，由于电荷交换，或者入射离子能量转移给靶原子 电子，引起入射离子径迹上靶原子电离，这种瞬时的电荷积累在库仑斥力作用下， 引起“库仑爆炸”，将生物分子或碎片抛射出来，这就是所谓的“电子溅射”。离子束 的溅射好比一把手术刀，对生物进行微细加工，使生物表面层层剥离【l ”。因此奋剂 量较大的情况下，尽管先注入的离子触及不到细胞的遗传物质d n a ，但它们起到先 遣兵_ 样的作用，为后继注入的离子开通前进的通道，如此下去，后继注入的离j 二 就能穿透细胞壁、细胞膜和细胞顷，并最终象“子弹”一样深入到细胞内部“击中剁 胞的遗传物质d n a m ，从而导致d n a 的损伤。低能离子注入介导外源转基因技术， 是根据离子束对细胞壁和细胞膜的溅射作用，形成一些可修复的微孔，便于细胞摄 取外源d n a ：同时，注入带正电的离子，在微通道内的沉积，可吸引带负电的外源 d n a 进入细胞。进入受体细胞的外源d n a 可通过复制、重组等过程整合到受体基 因组，离子注入对受体细胞造成的损伤可诱导修复作用的发生，这也增加了外源 d n a 整合到受体基因缎的几率幽j 。 2 2 离子束注入微生物的生物效应 离子注入是一种集物理和化学诱变于一身的综合诱变方法，与传统的诱变源相 比，它具有以下鲜明的特点： 2 2 1 菌体存活曲线呈“马鞍型” 即存活率随注入剂量的增大，表现为先降后升再降的变化，而y 一射线诱变的存 活曲线一般呈指数型或肩型。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物效应 2 1 , 2 2 1 。 2 2 2 突变菌体的高效性 离子注入的四大生物效应表明它是集理、化诱变于一身的综合诱变方法，它能 够引起染色体发生倒位、易位和缺失，或使d n a 断链、取代和补充，从而抑制损 伤的修复，为变异创造有利的条件。通过电、能、质的共同作用，离子注入可在损 伤较轻，存活率较高的情况下，得到较高的突变率和较广的突变谱，为筛选有益突 变株提供了较为广阔的空间 1 7 】。 2 2 3 菌体表面的刻蚀性 离子注入生物体的动量传递，可以根据直观的表面现象进行观察、研究，注入 的离子就像“手术刀”对细胞表面进行刻蚀，留下非常整齐的创面。动量传递的结果 引起生物组织或细胞的表面溅射，造成细胞形态的变异。最近的研究也表明，离子 注入微生物细胞的动量转移，同样导致细胞表面的刻蚀，且菌体刻蚀程度及修复能 力随注入剂量的不同而有差别口孙。宋道军【2 4 ，y u 2 ”，b p h a n c h a i s r i 2 5 】等的研究证明 了这一点。 2 3 离子束的应用 2 3 1 离子束的诱变应用于植物品种的改良 离子注入可引起明显的当代效应和遗传效应，尽管当代生理效应中负效应居多， 但在适当的能量和剂量下，离子注入对农作物当代的产量和品质有明显的改良效果。 先后有不少工作者对甜菊、烟草、棉花、番茄、水稻、甘薯、大豆、玉米及茶树等作 物品种的改良均取得了不同程度的进展【2 6 q0 1 。因此离子注入的应用为作物品种的改良 提供了一条新的技术途径，同时也创造了一批有特点的新的基因型材料。 2 3 2 离子束的诱至应用于动物和微生物品种的改良 离子注入技j r 应用于动物品种的改良工作是李圣【3 l 】等应用n 。筇子注入蚕卵和蚕 蛹，不仅观察到一些特殊的生物效应，而且选育出了一批优良的基因型材料。离子注 入技术在微生物上应用起步较晚，但成果显著。 + 2 3 3 离子注入介导外源d n a 的转导 鉴于离子注入能导致细胞表面刻蚀，细胞内外电性改变以及d n a 的损伤和断裂， 离子注入的应用又扩展到外源d n a 的转导。吴丽芳 3 2 1 等将几丁质酶基因在低能离子 的介导下注入小麦，获得了高表达几丁质酶的小麦株系；郑卫红【3 3 等将外源基因转入 烟草，获得了3 株抗性植株；吴立芳等将大豆总d n a 转入小麦中，得到蛋白含量高达 2 5 的小麦新品种；吴跃进等将玉米总d n a 转入水稻中，得到光合效率提高8 0 的玉 米水稻；虞龙等将v c 生产菌大菌基因组d n a 转入小菌中，得到具有双亲性的新菌株。 第一章引言 1 2 国内外研究动态 大肠杆菌蛋白质双精氨酸转运系统是1 9 9 8 年在大肠杆菌中发现的一种蛋白质 转运系统，因被转运底物信号肽上含有双精氨酸( r r ) 保守序列核心 s t - r r x f l k t 3 4 q9 1 ，所以称为1 乱转运系统( _ t w i n a r g i n i n et _ r a n s l o c a t i o n ) 。，i 乱转运 系统可介导含双精氨酸( r r ) 保守序列信号肽的折叠蛋白质进行穿膜转运，使这些 蛋白质进入细胞周质空间或定位于细胞内膜上。一系列的研究表明t a t 转运系统是 大肠杆菌中重要的转运系统3 , 3 5 , 4 0 4 6 。底物蛋白除含有双精氨酸信号肽( t a t 信号肽) 这一特性外，还以折叠的形式转运，未折叠的线状蛋白质则通过s e c r e t o r y ( s e c ) 转运 系统。 目前发现大肠杆菌t a t 转运系统的功能单位t a t 转运酶由4 种t a t 蛋白( t a t a 、 t a t b 、t 。1 c 和t a t c e ) 组成。前期通过相关基因的缺失和插入的研究表明，t a t b 和 t a t c 是n 转运酶的重要成分，t a t c 的氨基酸种类和分布对转运功能有着重要的影 响【4 7 瑚】。由于t a t a 和t a r e 功能的互补性，t a r a 和t a t e 同时缺失才能使转运终止， 因而t a 值的重要性没有受到广泛的重视。近来的研究结果表明，t a t a 也是转运系 统的重要组成成分。但t a t 转运系统的转运机理尚不清楚。为了建立完整的转运模 型，基于蛋白质从合成到装配成折叠形式，到与t a t 转运酶相互识别的过程中，必 定存在着很多的细胞质内的成分如分子伴侣等维持着这些过程的正常进行，所以除 了对现有的t a t 蛋白的结构和功能以及相互关系进行广泛的研究以外，人们还在继 续寻找是否还有其它的成分参与蛋白质的转运，现在发现大肠杆菌中的分子伴侣 d n a k 和特异的分子伴侣类似物d m s d 可与d m s o 还原酶的t a t 信号肽结合【5 ，但 现有的研究成果还不能完全解释t a t 蛋白质转运系统的机理，因而有必要对t a t 转运 系统进行更广泛的研究。 离子束注入技术最初被用于半导体和金属表面改性研究1 5 “。八十年代，中国科 学家独辟蹊径，开始了注入离子与生物体相互作用过程的探索。1 9 8 6 ，中国科学院 等离子体物理研究所余增亮发现，低能离子注入( 能量在1 0 4 e v 1 0 5 e v ，原子序数大 于氦的剥离原子核) 生物体后，会产生一定的诱变效应【4 1 , 6 2 ，并将这一原理应用于 诱变育种、细胞加工和基因转移，由此开创了离子束生物工程的先河。经过l o 多年 的探索，离子束生物工程已从探索性研究阶段进入到理论研究与实际应用相结合的 阶段，在植物、动物和工业微生物品种改良方面取得了良好的效果。1 9 9 1 年，余增 亮研究员在已发现的低能离子注入可以造成植物细胞壁的刻蚀并产生局部穿孑l 现象 一7 j 的基础上，提出了低能离子介导外源d n a 转化的设想。随后，离子束成功地应 用于棉花、水稻、玉米中外源基因的转入，并获得了有一定优良特性的植物新品种 1 5 5 - 6 1 ，从而使低能离子注入技术成为一项新的转基因技术。在近2 0 年的研究中首 先以植物为实验材料发现离子注入可以引起染色体断裂、缺失等大片段的损伤。这 些研究使人们对低能离子注入的诱变机理有了一定的认识。在此同时，获得了维生 素c 、花生四烯酸和乳酸等的高产菌株【6 4 , 6 5 。但是利用低能离子注入技术寻找特定 功能基因的基础理论研究还未见报道。 在离子注入诱变菌体的同时将外源报告蛋白基因导入微生物细胞，对于寻找特 定功能的基因可能是一种简单易行的方法。为了证实这一设想，本文利用了低能n 离子对微生物细胞的诱变效应和对细胞表面的蚀刻效应，成功地将带有绿色荧光蛋 白基因的质粒转入大肠杆菌中，并进行大肠杆菌蛋白质t a t 转运系统缺失菌株的筛 选，获得了七株表型与t a t 转运系统相关基因缺失株相似的突变菌株。 1 2 研究目的与意义 t a t 转运系统是广泛存在于细菌中的一种折叠蛋白质转运系统，它与细菌的生命 活动有着极其重要的关系。早期对t a t 转运底物的遗传学分析表明含t a t 信号肽的蛋 白质多与厌氧呼吸过程中所需要的含金属的氧化还原酶有关，如氢化酶( h y d ) 、 m a o 还原酶( t o r a ) 、d m s o 还原酶( d i m e t h l s u l f o x i d er e d u c t a s e ) 、硝酸还原酶( n i t r a t e r e d u c t a s e n a p ) 、甲酸脱氢酶( f o r m a t ed e h y d r o g e n a s ef d h n ) ”，因而认为r i 乱转运 系统对于细菌的有氧生活是无关的。但是组成t a t 转运酶的各蛋白蜃合成却是组成 型的【6 7 】，在有氧和无氧条件下均能表达，只是表达量有所不同。研究还表明t a t 缺 失株的细胞外壁有不同程度的损伤，导致了细胞对s d s 和溶菌酶的敏感性提高，并 有细胞内容物外泻，所以t a t 转运系统的存在必定有着更为重要的意义。 2 0 0 3 年i z e 和b e r n h a r d t 6 9 1 的研究表明位于细胞膜上的酰胺酶a m i a 和a m i c 是 t a t 转运系统的底物，t a t 转运系统的阻断，使酰胺酶不能到达周质空间，圈而壁间 质的n 一乙酰胞壁酸与l 一丙氨酸的连接不可切断 7 0 l ，使细胞不能分离。这成功的解 释了，谢基因的缺失会使细胞丧失分裂后分离的功能而呈链状排列。由于细胞壁和细 胞膜上的蛋白在t a t 基因缺失株中不能转运至周质空间，损伤细胞的外壁进而可使一 些有毒力菌株的毒力下降，内容物泄露，这将有利于一些细菌性疾病的治疗。 f a t 转运系统还可应用于有经济价值的工业酶的转运，所以对1 a t 系统的研究有着一定 的理论和实践意义。 离子注入集化学诱变和物理诱变于一身、损伤轻、突变率高、突变谱广且操作 简单。离子注入的诱变效应和导入外源d n a 的生物学效应，除了在微生物诱变育 种中有很重要的作用外，在生物学的基础研究中也有广泛的应用前景。特别是介导 外源d n a 的转入这一技术有别于传统的转入技术，它不仅能导入外源基因，同时 还伴有诱变作用，可充分利用这特性，选择合适的报告蛋白基因来寻找特定基斟 突变的功能菌株。同时微生物又具有繁殖快、变异广等诸多特点，加之离子束介导 转基因的可能性，使其在微生物中有更广泛的应用前景。低能离子注入可以造成胞 壁的刻蚀并产生局部穿孔现象，从而使低能离子介导外源d n a 转化获得初步成功。 t a t 蛋白质转运系统是大肠杆菌中重要的转运系统，但t a t 转运系统的转运机理 尚不清楚。为了建立完整的转运模型，人们还在继续寻找是否还有其它的成分参与 蛋白质的转运。同时由于离子注入对微生物细胞具有诱变效应和导入外源d n a 的 生物学效应。因此本研究利用n 离子注入的方法诱变大肠杆菌m c 4 1 0 0 a 菌株，试 图筛选出非已知t a t 蛋白编码的t a t 转运系受阻的突变株，从而为完善t a t 系统的组 成，阐明t a t 系统的转运机制奠定一定的基础。 2 1 材料 2 1 1 菌种与质粒 第二章材料与方法 s y r a i w p j ! 塑脚照9 触? 9 p e ， 一 一一 s o u r c e m c 4 1 0 0 a f 。a ( a r g f - l a c ) u 1 6 9a r a d l 3 9r p s l l 5 0t h i ，b 5 3 0 1d e o c 7p t s f 2 5l a b o r a t o r ys t o c k 诧1 , 4 ia r b i l k o am c 4 1 0 0 a b u t d l a t c l a b o r a t o r ys t o c k z s yt h i sw o r k p 8 7 6 0a m p ，曲g e n e c l o n e di np r r c o w l a b o r a t o r ys t o c k p 8 7 5 4a m p ，e n c o d e ec o l iv g e n e ，c v a c g e n ec l o n e d i np b a d 8 7 3 0l a b o r a t o d s t o c k p 8 7 3 7a m p 7 t a r a b c e l a b o r a t o r ym o c k p b a d 2 4 a m o r l a b o r a t o r ys t o c ：z 。, p b r j 黧曼黧：_ 矍二点燃磐、e c t o r 一土! 螋鬟曼孵! ， 2 1 2 主要仪器 离子注入机( 中国科学院等离子体物理研究所) 荧光显微镜( l e i c am i c r o s y s t e m s ，g e r m a n y ) v i s 7 2 2 0 可见分光光度计( j l 京瑞利分析仪器公司) 核酸及蛋白质电泳仪电泳槽( 北京六一仪器产) g i s 智能凝胶成象系统( t a n o n g i s 2 0 0 8 ) 紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器有限责任公司， t u 一1 8 0 0 p c ，1 u 1 8 0 0 s p c ) 2 1 3 试剂 主要试剂 酵母提取物( y e a s t e x t r a c to x o i d l t d ，b a s i n g s t o k e ，h a m p s h i r e ，e n g l a n d ) 蛋白胨( t r y p t mo x o i dl t d ，b a s i n g s t o k e ，h a m p s h i r e ，e n g l a n d ) 多聚蛋白胨( o x o i dl t d ，b a s i n g s t o k e ，h a m p s h i r e ，e n g l a n d ) 三甲氨氮氧化物( t m a o ，t r i m e t h y l a m i n en o x i d ed i h y d r a t e ，s i g m a a l d r i c h s w i t z e r l a n d ) 阿拉伯糖( a r a ，北京新经科生物技术公司) 十二烷基磺酸钠( s d st i a n j i n ，h & y b i o c o ；l t d ) 三黄片( s h p 四川康福来药业集团有限公司) 盐酸硫胺( v b l 中国医药上海化学试剂公司) 氨苄青霉素( a m p 天津市灏洋生物制品科技责任有限责任公司进口分装) 标准d n a ( d n a m a r k e rd l1 5 0 0 0 ，宝生物工程有限公司) 试剂配制 质粒提取试剂： a 液：5 m 0 1 l t r i s ，1 m 0 1 l e d t a ，1 g l u ，p h = 8 2 b 液( 体积比) ：h 2 0 ：n a o h ( 1 m 0 1 l 。) ：s d s ( 1 0 ) = 7 ：2 ：1 c 液：h 2 0 ：h o a c ：k o a c ( 5 m 0 1 l “) = 3 ：715 质粒转化试剂： t s b 溶液：蛋白胨1 0 9 l ，酵母浸膏5 9 l - j ，氯化钠1 0 9 l 一，p e g 4 0 0 01 0 0 9 l ， 高压灭菌后加入m 9 2 + 2 0 m m 0 1 l 。( m g c l 2 ：m g s 0 4 = l ：1 ) 和二甲基皿砜 ( d m s o ) 5 0 m m 0 1 l ，其中d m s o 过除菌 电泳试剂： 】 5 x p h 8 3 t r i s 一硼酸一e d t a 缓冲液( t b e ) ( 电泳缓冲液，使用浓度05 x ) 2 o 5 溴酚蓝5 0 蔗糖溶液( 加样缓冲液) 3 o 5 r a g m l 。溴化：0 啶染色液 4 琼脂糖 5 标准d n a ( d n a m a r k d l1 5 ，0 0 0 宝生物工程有限公司) 6 r n a s e a ：r n a 酶( r n a s e a ) 溶于p h 8 0 的t e 缓冲液中( 1 0 m m 0 1 l t r i s h c l ， 1 m m 0 1 l 1 e d t a ) ，r n a 酶的浓度为1 0 m g m l ，煮沸1 0 m i n ，分装，- 2 0 v 贮存待用。 7 酶终止反应液：0 5 溴酚蓝，5 0 蔗糖水溶液 2 j 4 培养基 2 1 4 ，1 l b 培养基：蛋白胨1 0 9 、酵母提取物5 9 、n a c l l o g ，p h 7 2 ，定容至1 l ，1 2 1 赢压灭菌2 0 m i n 。必要时添加葡萄糖( o 2 ) ( o l u ) 、氨苄青霉素( 1 0 0 u g m l 一1 ) ( a m p ) n 5 - j 拉伯糖( o 2 ) ( a p a ) 或葡萄糖( o 2 ) ( a p g ) 、十二烷基磺酸钠鉴定培养基 是在a p g 中加入适量的十二烷基磺酸钠( s d s ) 、十二烷基磺酸钠质粒消除培养基是 在l b 中加入适量的十二烷基磺酸钠、三黄片质粒消除培养基在l b 中加入适量的三 黄片粉末。 2 1 4 2m 9 培养基基本成分：n a 2 h p 0 4 1 2 8 9 ，k - - 1 2 p 0 43 9 ，n a c l 0 5 9 ，n h 4 c i l g ， 定容至1 l ，1 2 1 高压灭菌2 0 r a i n 后加入以下各成分：( 1 ) 2 m l m 0 1 l 1 硫酸镁；( 2 ) 0 1 m l l m 0 1 l 。氯化钙；( 3 ) f r a i l 硫胺素；( 4 ) i m l 钼硒溶液( i m m 0 1 l 。p o l a s s i u m s e l e n i t ea n dl m m 0 1 l “a m m o n i u mm o l y b d a t e ) ：( 5 ) 终浓度为5 的甘油：( 6 ) 终浓 9 度为o 4 的三甲胺( t m a ot r i m e t h y l a m i n e ) 。以上溶液除钼硒溶液和硫胺素需过滤 除荫外，其余均采用高压蒸汽灭菌。 2 143h 2 s 培养基：牛肉膏7 5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l 5 9 ，琼脂1 5 9 ，明胶1 0 0 1 2 0 9 ， p h 7 0 ，定容至1 l ，1 2 1 高压灭菌2 0 r a i n 。分装5 m l 后加1 0 的f e c l 2 ，立即置冰 水中冷却凝固。 2 1 4 4 甲基红培养基( m r v p 肉汤，mr ) ：多聚蛋白胨或缓冲性蛋白胨7 0 2 ，葡萄 糖5 0 9 ，k 2 h p 0 4 5 0 9 ，p h 6 9 ，定容至1 l ，分装后1 2 1 高压灭菌1 0 m i n 。 m r 试剂：o 1 9 甲基红溶于3 0 0 m 1 9 5 的酒精，然用蒸馏水定容至5 0 0 m l 。 2 14 5 吲哚培养基：1 的胰胨水溶液，p h 7 2 76 ，分装1 3 l 4 管，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8 9 ，乙醇( 9 5 ) 7 6 0 m l ，浓h c l l 6 0 m l 。配制 时醛先溶于乙醇然后加酸，避光，冰箱保存。 11 4 6 伊红美蓝培养基( e m b ) ：蛋白胨水琼脂培养基1 0 0 m l ，p h 7 6 、2 0 乳糖溶 液2 m l ，2 伊红水溶液2 m l ，o 5 美蓝水溶液2 m l 。以上各组分单独于1 1 5 灭菌 2 0 r a i n 后再混合。 2 2 方法 2 2 1n 离子诱幕i 及外源d n a 的转化 2 2 1 1 生长曲线的测定 接种供试菌株单菌落于5 m l l b 液体培养基中，3 7 1 2 0 r m i n 振荡过夜培养后 测o d 6 0 0 值，并取4 m l ( 4 接种量) 菌液接种于1 0 0 m l l b 培养基中再3 7 。c 1 2 0 r r a i n 振荡培养，每隔2 h 取样，适当稀释后测o d 6 0 0 值。 2 2 1 2 低能n 离子注入处理大肠杆菌 前培养：挑取m c 4 1 0 0 a 单菌落接种于5 m l g l u 液体培养基中过夜培养，3 7 1 2 0 r r a i n 振荡过夜培养。 制备菌膜：离心收集过夜培养的菌体，以l b 或t b s 制成菌悬液，根据过夜培 养的菌液浓度，取o 2 0 3 m l 菌液涂于直径9 c m 的无菌平皿中，晾干成菌膜。 低能n 离子注入：将含菌膜平皿放入真空室中进行离子注入，总能量1 0 k e v ， 注入剂量分别为2 0 x 1 0 h i o n s e m 2 、4 0 x 1 0 1 4 i o n s c m 2 、6 0 x 1 0 1 4 i o n s c m 2 并设真空处理 为对照组。对照平皿用l m l l b 或t s b 洗脱，洗脱液稀释至1 0 1 0 8 梯度后，分别 涂于g l u 平板上，3 7 培养，2 4 h 后计菌落数。 2 2 1 。3 质粒的提取 接种m c 4 1 0 0 a 菌株的单菌落于5 m l l b 培养基中，过夜振荡培养。取1 5 m l 前 培养的菌液于e p p e n d o r f 管中，1 4 0 0 0 f f m i n 离心2 m i n ，弃上