（物理化学专业论文）以pna为识别系统的人工内切酶的研究.pdf

! ：壅些照叁兰些璺嬗二! 笙塞 颤鐾 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o no fc h e m i c a lm o l e c u l e sa n db i o l o g i c a lo n e s ，e s p e c i a l l ys e q u e n c es p e c i f i c r e c o g n i t i o na n ds i t e s p e c i f i cc l e a v a g eo fd n a h a v em a n ya p p l i c a t i o n ss u c ha si n d n as e q u e n c e d e t e r m i n a t i o n s ，c h r o m o s o m ea n a l y s e s ，g e n et h e r a p e u t i c s ，a n d r e c o m b i n a n td n a m a n i p u l a t i o n s o i ti s s i g n i f i c a n tt od e v e l o pa r t i f i c i a le n z y m e sf o rt h e s c i s s i o no f n u c l e i ca c i dw i t hh i g ha c t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y 艇n o r m a lc o n d i t i o n m e a n w h i l e ，w i t ht h e n a n o p a r t i c l ep e r v a d i n gi n t ot h eb i o l o g i c a ls c i e n c e s ，u s i n gt h en a n o t e c h n o l o g y t os t u d ya n dr e s o l v e t h ep r o b l e mo fl i f es c i e n c e si sb e c o m i n go o eo ft h em o s ta d v a n c e df i e l d s ，i nt h i st h e s i s ，w eh a d s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h et w oi t e m sa n d o b t a i n e ds e v e r a lc o n c l u s i o n sb e l o w ( 1 ) i ti sn e c e s s a r yt os t u d yt h er e c o g n i t i o no fr e c o g n i z i n gs y s t e mt ot h et a r g e ti no r d e rt o s t u d yt h ec l e a v a g eo f t h es i t e - s p e c i f i ca r t i f i c i a ln u c l e a s e an e wm e t h o d f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g a n dt h e p r o b es t ( s a f r a n i n en w a su s e dt od e t e c tt h ef o r m a t i o no fp n a - d n ah y b r i da n d d i s s o c i a t i o n t h ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eh y b r i do fp n a d n ac a t f o r me a s i l yu n d e rt h e n o r m a lc o n d i t i o n sa n di tw o u l d n td i s s o c i a t eu n t i l8 5 c i ti so u to fq u e s t i o nt ob eu s e di nt h e s i t e s p e c i f i cc l e a v i n ge x p e r i m e n t s a t p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ( 2 ) i t sa l s on e c e s s a r y 协i n v e s t i g a t et h ec l e a v a g es y s t e mi no r d e rt os t u d yt h es i t e - s p e c i f i c a r t i f i c i a ln u c l e a s e u l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e e t r o p h o t o m e t r y ( u v ) a n dc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) w e r e u s e dt o s t u d yt h ec o m p l e x e so fs e v e r a l k i n d so fa m i n oa c i d s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t c o m p l e x e sf o r m e du n d e rt h ec o n d i t i o no fw e a ka c i d i t y w ea l s os y n t h e s i z e dan e w t r i n u c l e a r c o p p e r ( i i ) c o m p l e x 【c u 3 ( l ) 2 ( c 1 0 4 ) 2a n dt h ec o m p l e xh a sb e e nf o u n dt op r o m o t ec l e a v a g e o f p b r 3 2 2d n a f r o ms u p e r c o i l e df o r mlt ot h eo p e nc i r c u l a rf o r ml la n dl ol i n e a r i z e df o r mi i i s p e c t r o s c o p yw a s u t i l i z e dt oe x p l o r et h ei n t e r a c t i o n a lm e c h a n i s m ( 3 ) p n a c e r i u mc o m p l e x w a ss y n t h e s i z e da n dw o r k e da st h ea r t i f i c i a ls i t e - s p e c i f i cn u c l e a s e , a n di tw a sc h a r a c t e r i z e db ym a l d i m t o fm a s ss p e c t r o s c o p y a n df l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gw f l s u s e dt o i n v e s t i g a t e t h e h y b r i d i z a t i o n o f1 0m e r sp n aa n d2 6m e r so d nw h i c hw a s c o m p l e m e n t a r yp a r t i a l l y 瓤艟nt h es e q u e n c e - s p e c i f i cc l e a v a g eo f 2 6 - m e r so d nw a ss t u d i e db y c e 4 + c o m p l e x w i t hp n a s e q u e n c er e c o g n i z i n gm o i e t ya n d t h e e l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n t a lr e s u l t s w e r e s a t i s f a c t o r y a d d i t i o n a l l y , t h ea r t i f i c i a ln u c l e a s ew a sl i n k e dw i t hn a n o p a r t i c l ea n dt h es t e r i ee f f e c to fa u c o l l i d et ot h ep c rw a sr e s e a r c h e d ， k e y w o r d s ：a r t i f i c i a ls i t e s p e c i f i cn u c l e a s e ；h y d r o l y s i s ；d n a ；f l u o r e s c e n c es p e c t r u m ；c y c l i c v o l t a m m e t r y ( c v ) ；e l e c t r o p h o r e s i s ；c o p p e rc o m p l e x ；p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p e r ) 2 河师把人掌理学坝 论文 第一帚 第一章文献综述 一研究意义 生命体系是目前化学研究最重要的对象之一。分子以上层次的化学是研究化学、生物 学复杂系统的一部分，它将会在从生物医学到化学之间的辽阔领域展现出新的活力。但是， 真正在分子水平上对生物体系进行比较详细的研究，需要多学科的参与以及发展一些新的理 论和新的研究手段。因此，在2 0 世纪就已经在研究生命过程中发挥巨大作用的化学学科的 几个分支生物有机化学、生物无机化学、生物分析化学、生物结构化学以及研究内容不断 深化的天然产物化学。将会在新的世纪里被赋予新的内容和活力。这些分支学科能够发挥更 大作用的背景是：随着分子生物学、细胞生物学以及神经科学等相关生物学科的发展，特别 是人类基因组计划的完成，人类已经发现并阐明许多基因以及相应的蛋白质的结构，并逐步 了解其相应的功能，对其功能的研究也逐步由静态的水平发展到动态的水平，从对结果的研 究发展到对过程的研究，由对个体的研究发展到对群体现象的研究。这些新的研究课题无疑 给化学家提供了新的机遇和挑战。另一方面，随着化学合成的现代技术、化合物分离手段和 化学分子结构解析技术的发展，以及分子识别、分子间相互作用的理论和研究技术的进展， 人们对于小分子化合物如何与生物大分子相互作用的认识也达到了一个前所未有的高度。这 样的研究，如果可以有效地与目前蓬勃发展的生命科学相结台，不仅有利于人类在分子水平 上对生命过程的了解和调控，同时也将促进化学学科本身的发展。为此，近年来国际上出现 了“化学生物学”这一新兴交叉学科，井己逐渐被科学界所接受。 化学生物学的中，1 1 , 任务就是用小分子达到对生命过程的调控。( 还可以看作是对分子生 物学的补充，分子生物学是采用定点突变的方法来改变生物分子如蛋白质和核酸的功能：而 化学生物学是采用化学的手段，如运用小分子或人工设计合成的分子作为配体来直接改变生 物分子的功能。) 其中，人工核酸切割试剂的研究是这一研究方向中最为活跃的前沿领域之 一【1 - 5 1 。 核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。它在生物的生长、发育、繁殖等正 常生命活动中具有十分重要的作用，但另一方面，核酸与生命的异常情况，如肿瘤的发生、 放射损伤和遗传疾病等也密切相关。所以，对核酸的研究己成为现代分子生物学、医学和化 学生物学研究的重要课题。选择性的切断( 也就是定点切断) 核酸中的磷酸二酯键是基因工程 的重要问题，但是，在生理条件及非酶存在下，核酸具有很高的稳定性。如在p h ；7 及温度 为2 5 c 的环境中，d n a 和r n a 中磷酸二酯键的半衰期分别为8 亿年和2 亿年i 6 l o 目前， i 。淘帅拖人学理学硕l 论文 筻一章 水解切断核酸除用天然酶外还没有其它有效的办法，但天然酶识别序列短，一般仅为4 - - 8 个碱基切割碎片1 f 常多，很难进一步利用。而定点切割试剂的识别系统能识别的核苷酸序 列可以远远大于8 个碱基，因而其专一性非常高。所以开发出高效的人1 = 核酸切割试剂具有 非常重要的理论意义和应用价值【7 j 。 另一方面，纳米技术是8 0 年代末逐步发展起来的新技术，在材料、环境、生物医学、 化学等方面有广泛的应用前景。随着纳米技术向生命科学领域的不断渗透。利用纳米技术研 究和解决生命科学领域中的重大问题，推动纳米生物技术的发展，正成为当前重要的前沿研 究领域之一。目前，纳米材料( 主要是纳米粉体) 在生物医药方面的应用主要在如下几个方 面：1 、利用纳米颗粒作为药物的载体进行靶向给药。特别是利用磁性纳米颗粒作为主要的 药物载体，在外磁场作用下将抗癌药物定位于肿瘤靶区的药物浓度，并使药物以受控的方式 从载体中释放，从而达到有效化疗癌肿并降低药物对全身的毒副作用的研究受到了高度重视 吼2 、磁性纳米颗粒用于细胞的分离f g - l o 。3 、将磁性纳米颗粒应用于临床磁共振成像f l l 】。4 、 利用纳米粒子提高物质检测的灵敏度和最低检测限f 1 2 】。金溶胶纳米粒子，由于其特殊的光 学性质高度的分散性和很好的生物相容性，在d n a 序列检测、分子探针和微型d n a 芯 片等方面有很好的应用前景，所以将金纳米粒子与引物连接，利用固相p c r 技术，研究其 对d n a 的p c r 的影响，不仅可以推动生命科学的发展。同时也将促进纳米技术和化学方 法的发展。 二研究进展 限制性内切酶之所以能特异切割核酸分子，是因为其中的酶蛋白能够识别特殊的核苷酸 序列并与之结合，并由酶分子中的化学基团切断核酸分子中的磷酸二酯键。化学合成的人工 核酸切割试剂也由两部分组成：一是断裂系统s ( s p l i t ) ，为某种核酸切割试剂，主要包括 金属和非金属，多胺和抗生素等：二是识别系统r ( r e c o g n i z r 丑t i o n ) ，它能识别核苷酸上的 序列并与之结合，主要包括寡聚脱氧核苷酸( o d n ) 。肽核酸( p n a ) ，多酰胺等物质。所 以人工内切酶可以简写为r - s ，理论上它可以在核酸底物的特定部位将其断裂。显示出与限 制性内切酶类似的生物功能，因此人工核酸切割试剂也被称为人工核酸酶。图1 1 是人工核 酸定位切断试剂的示意图。 ! ：堕堕些点堂些堂塑! 堡皇星二：堂 c h c l l c d b o n d s p h t 。p c e i f i c a l l y r e e o 嗍m o ”t y s o s l o t 图1 1人 核酸酶定位切断核酸示意图 f i g i 1t h es k e t c hm a po f n u c l e i ca c i d sc l e a v a g e db ya r t i f i c i a ln u c l e a s e 1 断裂系统 核酸的化学断裂系统主要是通过定的方式实现对核苷酸的断裂，它在人工合成的核酸 定位断裂工具中起着重要的作用。化学断裂系统按其切割机理可以分为自由基机理、消去机 理和酯水解机理三大类。 1 1 按自由基机理氧化切割核酸的试剂 此类切割试剂主要包括过渡金属配合物和一些抗生素类药物。由于r n a 比d n a 容易 发生水解，有关r n a 的水解大多按水解机理进行，所以按自由基机理切割核酸的研究主要 集中在d n a 上。此类试剂主要有f e ( i i ) - e d t a h 2 0 2 体系( e d t a 与f e ( 1 0 形成配合物，促 使h 2 0 2 还原生成- o h 自由基作用于d n a 的脱氧核糖，从而导致d n a 链的断裂 1 3 - 1 5 。) f e ( i i ) - p e n t a d e n t a t e h 2 0 2 体系( 在i - 1 2 0 2 存在下能氧化切断d n a 16 1 ) 、三核铬配合物体系( h 2 0 2 存在的条件下，能通过产生的自由基切断d n a i ”1 ) 、光化学切割试剂f 7 1 ( 光照的条件下生成 - o h 自由基或单线态氧从而导致d n a 链的断裂) ，另外就是一些铜配合物体系1 1 8 - 2 2 1 如： c u ( i i 卜胆红素胆绿素体系、c u ( i i 卜血清素体系、c u ( e n ) 2 2 + 或c u ( e d t a ) ”0 2 体系、大环铜 配合物用2 0 2 体系，该类切割体系也主要是通过铜与h 2 0 2 的作用产生一些o h 自由基，进 而破坏了磷酸的碱基或戊糖环而导致d n a 链的断裂。这种断裂核酸的方式存在较多的缺点： 首先，严重破坏核酸链上碱基和脱氧核糖环，最终产物往往为3 和5 磷酸末端、游离碱基 及其它一些碎片，切割产生的末端不同于酶解产生的末端因此不能再用连接酶重新连接。 其次，由于这类试剂产生的自由基很容易扩散，会造成多个位点切割，用这类切割系统的定 位切割试剂很难进行真正的定位切割。第三，自由基对生物活体有毒副作用，无论是用于进 行细胞内研究或作为药物都是不利的。最后，此类切割试剂往往需要氧化还原活性的辅助因 子，增加体系的复杂性。 1 2 按酯水解机理切割核酸的试剂 核酸中磷酸二酯键的水解也可以导致核酸的断裂，此类切割试剂主要包括一些核酸酶的 i 舞哪藏大学瑾学颟论文 第一章 模拟物、二胺和多元胺1 2 4 2 5 1 、二肽和多元肽、碱士金属m g 及其配合物1 、稀土金 属离子和配合物等以及少鼙的c u 、c o 稀z n 的配合物2 ”甜。这类试剂不仅可以与赢链单链 d n a 、双链d n a 俘蠲，瑟置可以砖p b r 3 2 2 震裁d n a 捧瘸，速些试刘与拨簸中的磷酸二 醋键的作鲻橇铡擞然不尽糖嗣+ 毽燕产生弱辚酸末臻避霹眭进一步裁蠲。其中戮蹋大琢多壤 铜配合物和稀土盎属离子配台物对核酸进行黯水觯在目前备受荧注。研究较多。 1 3l ；l 消除机理切割核酸的试荆 菹涟滁梳理搿害l 核酸豹试裁芬不雾觅，魏翦爻霄1 9 8 1 年h e l e n e 和l a v a | 豹研究，j 、组发 褒戆赣篷较三效( k w k ) ，该试瓣苓投霹戳谈粼d n a 牵瓣瓣碱鏊郏位，菇显鼍鞋拄该黎证产 生切懿，其艨因可& 是由于色氮黢残基号核酸之淘熬藏基耀稷捧餍嚣占据了黢碱萋豁位鼹避 的位鬣，从而使赖氨酸残蒸接近脱碱熬部位，而脱碱藻的核糖存在半缩醛和歼环的醚的互变 异构，因而该点非常容荔被切断。 辩魄兰耪落i l 梃瑾采瀵，式解型拐害l 试裁使嗣较舞方疆瓣辩迄具寄摄多静貔煮：首毙， 生痰兹碎片菇夺3 戴5 磷酸寒矮，慧碱基耪棱糖黪不会被酸臻，溷j 逄霹戮鬻连接酶重薪连 接；其次这类试剂不产生易扩散魄自由基，因她有利乎金成褒度序列专一性的定位切割试裁； 第三，该体系无需坯原性的辅助因子，对生物体的毒害鞍小。也正鉴于以上这魑原因，此娄 拐害8 试帮，甑括稀金属离子及萁配奢物；铁、铜、镭、貅和镁的配合物类试剂可以作为定 谴韬鬟试鬣懿最毽韬裁幕绞之； 2 化学识别系统 化学识别系统能够识别核酸上某段核苷酸序列，并与之特异结合，常用的主要脊寡聚脱 氯核苷黢( o d n ) 、蕊按酸( p e p t i d e n u c l e i ca c i d s ，p n a ) 、摄自鹱、多获、抗氅素、d n a 结 含药秘、懿睫昧瞧多蘸黩等。它们遴遗共赞键或 # 莛傍键鸟援酸分子上豹特定碱基序列、 d n a 秘r n a 款二级缝搀特定区域谈嬲缝会， 断裂位点和断裂产物。 2 1 寡聚脱觏核苷敬 爱常使粥麴核黢谖鄹系统整豢聚核蕾酸， 形残越级髂蘩，出藏确是黠d n a 靼r n a 鹁 窕其熬寡聚袋鼠核蒋酸( o d n ) 。它掬识别襟 粼是接酸串懿碱基鬣替配对，寡聚强裁棱瞢酸通过与革链d n a 或r n a 杂交形成赦链，或 以h o o g s t e e n 域反h o o g s l e e n 氢键缱台至”霄特定痔列蛇双镶烈a ( d s 翻硒大海处，形成三黢 螺旋，究成对像们的特异识别。醚黄寡聚核昔酸合成技术的不断发展，人们可以根据糯要合 成任意痔列的褰聚按苷酸谈捌系统，强预先设计的位点切断d n a 。m o s e r i “峰利用寡聚脱 6 l 海师范大学理学硕卜论文 第一章 氧核苷酸e d t a - f e ( i i ) 配合物，通过形成三螺旋结构，对双链的质粒p d m a g l 0d n a 片断 成功进行了断裂反应。s i g m a n i ”岍究小组将 c u ( p h e n ) f 与一段r n a 相连后用于切割单 链或双链的d n a 。k o m i y a m a 3 3 - 3 4 1 等则提出了一种制各带有1 9 个碱基片断的寡聚脱氧核苷 酸的c e ( i v ) 配合物( d n ai d a c e ( i v ) ) f l 自简单程序，该程序对寡聚脱氧核苷酸碱基序列及长 度无任何限制，在p h = 7 5 ，3 0 c 时，用制备的d n ai d a c e ( i v ) 去切断一个含4 0 个碱基的 单链d n a ，d n ai d a 中的1 9 个碱基与底物d n a 中互补的1 9 个碱基配位，而连接在d n a i d a 端的c e ( i v ) 离子定位在底物的a 3 1 和c 3 2 间，对其进行切割。电泳图显示切割正好发 生在a 3 1 与c 3 2 间，切割效率为6 0 。 2 2 蛋白质和多肽 许多天然存在的蛋白质和多肽能与d n a 的特定部位结合，对基因表达起一定的调控作 用。李许卿p m 等人认为蛋白质对双螺旋核酸专一性识别的一种可能方式可能涉及到双螺旋 d n a 的一种特别的拓扑性质，称为d n a 片断的碱基空间模型( b a s es p a t i a lp a r e m 。b s p ) 。博 莱霉素( b l m ) 是一种天然存在的糖肽，临床上常用来治疗头、颈及磷状细胞癌，其结构 通常可分为3 个功能区：n 端，主要与金属离子和氧结合并切断d n a ；糖残基被认为是分 子对细胞表面进行识别的功能区：由二噻唑与不同阳离子取代基所构成的c 端则构成d n a 的识别区。e b r i g h t t 3 6 1 等将c a p 与p h e n 共价结合生成具有核酸酶活性的c a p ，p h e n 作用于 含有c a p 识别位点的d n a 上，可在结合位点进行断裂。n a g a o k a l 3 7 l 等人以及d e r v a n l 3 8 1 的 研究小组则分别将甘甘组三肽与n i 2 + 或c u ”的络合物共价连接到一个具有锌指结构的d n a 结合蛋白或是h i n 重组酶的n 端，得到的试剂对d n a 的切割也具有序列特异性。i v e r s o n i ”】 等报道用单克隆抗体与c o ( 1 1 1 ) ，z n ( i i ) 等结合能断裂与其特异结合的多肽。如能制各出可与 某段d n a 特异结合的单克隆抗体，将其与化学断裂系统结合，即可获得多种d n a 定位断 裂工具。但是蛋白质对d n a 的识别较为复杂，目前已认识到，不存在能用于描述所有蛋白 质对d n a 的识别规律。但是上述的实例也表明，一种单一的蛋白质结构家族成员对d n a 的识别规律是存在的。 2 3 抗生素 抗生素类药物”u j 也能识别d n a 。乙撑亚胺型d n a 靶向分子是一类重要的烷化剂，丝 裂霉素c ( m i t o m y c i nc ，m c ) 作为一种临床上常用的重要抗肿瘤剂，是这类化合物的代表 物研究表明，m c 所具有的抗肿瘤能力及强细胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力 有关。作为一种生物还原性烷化剂，m c 在与d n a 结合之前，必须经一还原活化过程，活 化后的m c 先与d n a 结合使之单烷基化，然后产生双烷基化产物1 ，进一步的研究表明f 4 2 1 m c 在单烷基化d n a 时具有高度的序列选择性即优先与5 c g 和5 g g 序列上的鸟嘌呤结 合。而纺锤菌素则以经典的小沟结合分子与d n a 结合。 2 4 p n a 一种新的识别系统 7 海师范大学理学硕 论文 第。章 天然o n s 有最好的识别特异性和亲和性，但在实际应用上仍存在缺陷，主要是生物稳 定性差易被核酶降解。因此必须对天然o n s 进行结构修饰，过去2 0 年m f 合成了大量 修饰结构的寡核苷酸，这些修饰方法包括磷酸二酯骨架修饰、碱基修饰、核糖环修饰以及将 一些嵌入分子共价连接在寡聚核酸的末端。但就生物稳定性、溶解度、药代动力学性质及合 成的难易程度等因素综合衡量，这些寡聚核酸类似物仍不够理想，所以为了加强杂交能力， 提高对核酸酶的抗性及膜通透性，许多新的寡核苷酸类似物相继被研制出来，例如：p h o n a 4 3 1 ，p n a ( p e p t i d e n u c l e i ca c i d ，肽核酸) “，其中，肽核酸是一种结构变化较大的d n a 模 拟物，它是9 0 年代初丹麦科学家n i e l s e n pe 发明的一种全新的d n a 类似物，即以中性的 肽链酰胺2 - 氨基乙基甘氨酸键取代了d n a 中的戊糖磷酸二酯键骨架( 结构式如图1 2 ) ，其 余的与d n a 相同。 c 口 飞。 图1 2p n a 结构示意图 f i g 1 2 t h es k e t c hm a po f p n a 2 4 1p n a 的物理性质 由于p n a 的中性骨架和其合适的碱基间距，p n a 可以通过w a t s o n c r i c k 碱基配对的形 式识别并结合d n a 或r n a 序列，形成稳定的双螺旋结构。p n a 能以平行或反平行的方式 与互补链结合，且反向平行方式居多。n m r 研究表明p n a 与r n a 形成的复合物类似于 一个a 型螺旋，而p n a - d n a 双螺旋同时具有a 型及b 型结构。x 射线晶体成像结果显示， p n a 2 d n a 复合物形成了独特的三股螺旋结构1 4 5 1 。 p n a 也能够与双螺旋d n a 结合，这种p n a 必须具有由7 个以上含有相同嘧啶的单体， p n a 与双链d n a 的结合是通过置换出的非互补链，而与互补链形成i 整j ( p n a ) 2 d n a 三螺旋 结构，其中一个是p n a 与d n a 以w a t s o n c r i c k 碱基配对的形式结合的，另一个是以 h o o g s t e e n 的形式结合的，三螺旋d n a 中w a t s o n c r i c k 和h o o g s t e e n 的碱基配对形式见f 图， s 二海师范大学理学碗论义 第一聋 t s ， | f c e t n 6 一c c 一6 a t 呐、：； t - - a l * c - 6 - c t - a t t - n - t c - 6 - c 卜a - t 1 - a - t 1 - a - l 夕b c 一- 1 5 一一 曲 t a 6 c c e n t 图l _ 3 三螺旋中w a t s o n - c r i c k 和h o o g s t e e n 的碱基配对形式及p - 环稳定结构的形成 f i g 1 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f ap - l o o pi nw h i c h a v e r ys t a b l e ，i n t e r n a lp n a 2 d n at r i p l e xi s f o r m e dw i t ht h e c o m p l e m e n t a r yh o m o p u r i n ed n a s t r a n dv i ac o n v e n t i o n a lw a g o n - c r i c ka n d h o o g s t e e nb a s ep a i r i n g 被置换出的d n a 链形成d 环。d - 环的形成方式可能通过三种途径( 如图1 3 示) 。这种机 制对于在转录水平上研究基因的表达和调控是很有意义的。值得注意的是能形成 ( p n a ) 2 d n a 结构的p n a 才能完成链置换，并且置换反应只能在p h5 7 范围内进行，同 时也最好在低盐浓度下进行。 由于p n a 不带负电荷，与d n a 和r n a 之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特 异性都大为提高，这主要表现在p n a - d n a 碱基对错配杂交分子的不稳定性比d n a d n a 碱基对错配杂交分子的不稳定性更高。p n a - d n a 间出现一个碱基错配其结合效率就会明显 下降，出现两个碱基错配，则完全不能杂交。可利用这一点来检测d n a 在p c r 扩增时的 单碱基对的变异。不同于d n a 与d n a 或r n a 间的杂交，p n a 与d n a 或r n a 的杂交几 乎不受杂交体系盐浓度影响，与d n a 或r n a 分子的杂交能力远优于d n a d n a 或 d n a r n a ，表现了很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力。 p n a 不易被核酸酶和蛋白酶水解，使得p n a 在血清及细胞提取物中的生物稳定性都大 为提高。某些蛋白质与d n a 或r n a 有亲和力能与它们发生相互作用，而p n a 几乎不能 9 呲川 海帅旭人学理学碗上论文 第一章 以序列特异性或以其它方式与这些蛋白质作用。这样就提高了p n a 在细胞内选择性结合靶 序列的能力。鉴丁+ 上述诸多d n a 分子不具备的优点，近十年来，人们为p n a 在许多高技 术领域找到了用途。 2 4 2p n a 的应用 2 4 2 1 在p c r 反应中的应用 p c r 发夹( p c r c l a m p i n g ) ：p n a 与d n a 配对的特异性高于d n a 或r n a ，此特性可 用来检出点突变，以代替传统的d n a 测序法。方法是将p n a ( 与野生型配对的) 和一对引 物( 其中一个与突变型基因配对，另一个是正常的反向引物) 共同加入反应体系中。p c r 反应中，野生型p n a 与突变的寡聚核苷酸竞争引物位点。如果出现突变，则有突变产物， 反之，p n a 就结合在引物位点上阻碍复制，则无扩增反应产物出现 4 6 1 0 同时，由于阻断了链内与链间的相互作用，p n a 与模扳链的结合还可减少退火过程中 引物的错配，从而减少了相似产物和梯形产物的产生。另外采用p c r 方法合成的d n a 链 的长度是有限的，用p n a 可改善这一情况 4 7 | o 2 4 2 2 对转录过程的调节 p n a 插入双链d n a 形成稳定的杂合体后，对基因的转录既可起抑制作用，亦可起促进 作用。例如：由链置换而形成的d 环可作为一个人造的转录启动子，而与p n a 互补的链则 可抑制其下游的转录而增强其上游的转录1 4 8 1 0 总之p n a 对转录的影响很复杂，随条件的变 化还可能出现其它一些情况。由于p n a 具有这种能够在双链d n a 水平上抑制转录和复制 的性质，所以可以作为反基因药物。此外，p n a 与r n a 结合可抑制逆转录 4 9 1 a 2 4 2 3p n a 对端粒酶活性的抑制作用 近来n o r t o n 等研究了p n a 作用的一个新靶端粒酶。端粒酶是负责维持复制过程中 端粒长度的酶，它具有的r n a 起模板的作用，使染色体末端延伸。体外实验结果表明与 r n a 模板序列互补的p n a 能以序列特异性方式有效地抑制端粒酶活性。通过比较p n a 和 硫代寡核苷酸对端粒酶的抑制作用。发现p n a 优势明显低浓度的p n a 即可做到特异抑制， 而硫代寡核苷酸以非特异性方式起作用 5 0 lp 此外，端粒酶中的r n a 靶序列由于与蛋白质 相连而呈现一定的构象。但p n a 仍能识别它。与一般的体细胞不同，大多数肿瘤细胞具端 粒酶活性，故端粒酶可作为肿瘤细胞中的一个有效靶位。 2 4 2 4p n a 对逆转录酶的作用 对所有的逆转录病毒来说，将其基因组r n a 进行逆转录是在细胞内复制的第一步，故 导向c d n a 合成过程显然是抗逆转录病毒治疗的一种策略。针对h i v lg a g 基因r n a 不同 i o 海师范大学理学顾l 论文 第一章 靶位的p n a 均能有效抑制h i v 1 ，m m l v 和a m v 逆转录酶的作用，通过分析r n a 序列， 发现逆转录酶的作用被p n a r n a 复合物在预定位点抑制，r n a 并未被降解，故p n a 是通 过空间位阻起作用的，并未活化逆转录酶的r n a 酶h 活性。当h i s - p n a l g a gr n a 的摩尔 比为6 ：1 时，能完全抑制逆转录酶的活性，g a gr n a 的体外翻译过程不受影响1 5 1 | 。可见 病毒r n a 基因组能作为p n a 的靶基因。只要p n a 能在体内到达病毒基因组，即可开发为 有效的抗病毒药。 2 4 2 5p n a 的体内活性 p n a 没有整体毒性，没有非特异性蛋白结合作用及其在人血清和细胞提取物中的稳定 性是将其作为基因靶向药物的潜在优势目前p n a 体内应用的难点在于如何使之有效地进 入细胞并且使其在细胞内的分布方式能保证它与靶m r n a 或d n a 结合，体外实验表明。 p n a 与硫代寡核苷酸显示同样的低细胞摄入率，但硫代寡核苷酸在体内有较好的药代动力 学行为且在一些动物模型中也显示了有效性，因此，需进行p n a 在整体水平摄入方面的 研究，获得p n a 行为学上更真切的描述。不过，p n a 的低摄入可以通过连接一个载体分子 或以脂质体包裹而改善1 5 2 1 p n a 这一新的识别系统的出现，丰富了反义及反基因技术的手段。l o h s e ”1 等人曾将次 氨基- - 7 , 酸共价连接到一段p n a 上，连接后所得的试剂与d n a 底物形成三螺旋结构而产 生识别作用。b i g e y r “l 等人则将卟啉和m n ”的络合物连接到一段p n a 上，进行了切断双链 d n a 的尝试。另外，j e r o e nc v e r h e i j e n ”5 1 等人还利用p n a 二乙烯基三胺连接物进行了定 位切断r n a 的研究。 总之p n a 有许多独特的性质，已经成为了分子生物学和化学生物学研究中一个有力 的工具，并在肿瘤、艾滋病、病毒感染和其它难治性疾病的治疗方面有着广泛的应用前景。 三研究方法 由于人工核酸定位切断试剂以及纳米材料在生命科学中的应用的研究已经引起了人们 的广泛兴趣越来越多的研究方法和技术已被引入此领域。例如：高效液相色谱( h p l c ) 和核磁共振法( n m r ) 、凝胶电泳法、电化学石英晶体微天平技术、拉曼光谱技术、荧光光 谱、紫外光谱等波谱技术以及聚合酶链式反应( p c r ) 和电化学方法，这里仅就本论文所涉 及到的部分研究方法作一简要综述。 i 荧光光谱法 当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而 1 1 f 。海帅范大学理学坝i 论史 第章 当紫外光停止照射时。这种光线也很快消失，这种光线称为“荧光”。荧光是一种光致发光， 是一种一：次光。 荧光光谱现已被广泛地用于生物人分子结构的研究，如在一定的物理化学条件f 的平衡 结构的研究，不均匀体系中的结构类型分布的研究，结构类型分布及结构随条件的变化、生 物分子与溶荆的相互作用、底物分子与生物大分子的结构等研究。当生物大分子本身具有荧 光生色团或利用生物分子荧光生色团不能给出充分的结构信息时，常常需通过一定的物理、 化学方法引入适当的外源荧光，即荧光探针。利用这种信号探测大分子信息所用的外源荧光 探剂，叫做“荧光探针”或“荧光探剂”。通过荧光探针的方法可以分析和测定核酸的含量、 结构，分析药物分子与核酸的作用机理，并且发现新的可能具有抗癌、抗菌等活性的药物。 h o c h e s t 荧光探针、d a p i 荧光探针、溴化乙锭( e b ) 、y o y o 、吖啶橙( a o ) 等有机 小分子均可作为核酸荧光探针“”1 。另外，近年来还发展起来金属离子及金属络合物核酸 荧光探针。金属离子主要涉及到稀土金属，如t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 等，是基于稀土离子本身的发 光特性，由此可提供有关d n a 及其组成、构型的信息“。“。 2 电化学方法 电化学研究的领域十分广泛，其理论方法和技术应用已越来越多地与其它自然科学或技 术科学相互交叉渗透，其方法有很多，这里主要用到的是电化学循环伏安法( c y c l i c v o l t a m m e t r y ) 。电化学循环伏安法是基于物质氧化还原反应及氧化还原性质的研究，是在研 究电极与参比电极之间施加一随时间线性变化的电位扰动信号，记录电极电流对电位的响应 曲线。采用循环伏安法能够较快地观测较宽的电位范围内发生的电极过程，为电极过程的研 究提供丰富的信息：另方面又能通过对曲线形状及特征量如峰电流i p , 峰电位e d 等的分析， 估算电极反应参数，判断电极反应的可逆性，同时还可以根据物质的氧化还原性质的不同从 而确定不同物质的生成等。 3 聚合酶链式反应( p c r ) p c r 是目前分子生物学实验室中常用的技术，也广泛应用于医学中的临床诊断。p c r 技术有助于鉴定某一特定d n a 片断，因为它能在短时间内精确地复制成百万的d n a 片断， 它使一度非常稀有的实验所需的遗传物质变得非常丰富。 p c r 技术的原理与细胞内发生的d n a 复制过程十分类似。首先是双链d n a 分子在高 温下加热时分离成两条单链d n a 分子，然后d n a 聚合酶以单链d n a 为模板并利用反应 混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸( d n t p s ) 合成新的d n a 互补链。此外，d n a 聚合酶同样 需要有一小段双链d n a 来启动引导新链的合成。因此，新合成的d n a 链的起点，是由反 i2 l 海师范人学理学硕士论文 第一章 应混合物中的一对寡核苷酸引物与模板d n a 链两端的退火付点决定的。这是p c r 的第一 个特点，即它能够指导特定d n a 序列的合成。 当p c r 反应体系中存在分别与两条链互补的一对引物时，两条单链d n a 都可作为模 板合成新的互补链。并且每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反 链延伸，这样在每一条新合成的d n a 链上都有新的引物结合位点。然而反应混合物经再次 加热使新、旧两条链分开，并加入f 轮的反应循环，即引物退火、d n a 延伸和链的变性分 离。p c r 反应的最后结果是经n 次循环以后，反应混合物总共所含有的双链d n a 分子数， 即两条引物结合位点之间的d n a 区段的拷贝数，理论上的最高值应为2 “。这就是p c r 技 术的第二个特点，即能使特定的d n a 区段得到迅速大量的扩增。p c r 扩增能力是十分惊人 的，理论上讲经过3 0 次的循环反应，便可使靶d n a 得到1 0 9 倍的扩增。有人报道即使反 应混合物中只含有一个拷贝的靶d n a 分子，亦能被有效地扩增。正因为p c r 技术具有如 此高的扩增敏感性，所以任何d n a 样品或实验试剂均应避免发生可能的污染同时这也意 味着分子生物学分析现在己可应用于只含有痕量d n a 的样品，包括一根头发、血迹等，这 对于法医学具有特别的应用价值。 4 凝胶电泳法 1 9 3 7 年，瑞典的t i s e l i u s 晟早建立并使用电泳技术，他成功地将血清蛋白分成五个主要 成份。目前随着电泳技术的不断进步，它已成为生物化学、分子生物学和化学生物学研究 1 ：= 作中不可缺少的工具，被广泛应用于生物大分子如蛋白质、酶、核酸的分离分析和性质研 究。它的基本原理是荷电分子在电场的作用下，向着与其电荷相反的电极移动。常用泳动度 ( m ) 表示带电颗粒在单位电场中泳动的速度。 v d t d l m e 瓦2 丽 式中v 为荷电分子的移动速度( c m s ) ：e 为电场强度( v c m ) ：d 为荷电分子的泳动距离 ( c m ) ：l 为支持物的有效长度( c m ) ：t 为通电时间( s ) ；v 为加在支持物两端的实际电压( v ) 。 影响泳动度的因素有两个方面，一方面是待分离物质本身的结构和性质，即待分离物质 的荷电性质、质量以及颗粒形状：另一方面是电泳条件，也就是外部因素，包括支持介质， 溶液介质和电场强度等三个方面。 在人工核酸切割试剂切割核酸的研究中应用较为广泛的就是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯 酰胺凝胶电泳【6 1 i 。 四本论文的研究目的及内容 我们实验室己用h p l c 、拉曼、电化学e q c m 以及电泳等方法对核酸的性质以及一些 二海师范大学理学硕士论文 第谭 小分子化合物与生物大分子的相互作用及相互作用后所产生的效应作过一些系统的研究和 探讨 f i 2 - 7 2 1 就人工核酸定位切断试剂方面我们实验室刚刚