（微生物学专业论文）聚β羟基丁酸酯解聚酶性质的研究.pdf

摘要 聚一0 一羟基丁酸酯( p h b ) 是由多种革兰氏阳性和阴性菌作为菌体内含物所生成 的一种结构简单的大分子聚合物，通常是在细菌非平衡生长时体内碳源和能源的储藏 物质，其最典型特征是具有生物降解性和生物相容性。在“白色污染”日益严重的今 天，以p h b 代替传统通用塑料已引起普遍关注。 本实验利用高效降解p h b 的菌株，分离纯化其胞外解聚酶，进行酶学和蛋白质学 研究，主要结果如下： 1 、以青霉( p e n i c i l l i u ms p ) d s 9 7 0 1 0 9 a 菌株为出发菌株，测定其每曰酶活 值，产酶高峰为9 6 小时。发酵液经过离心、超滤浓缩、硫酸铵沉淀、层析纯化后， 得p h b 解聚酶，纯化倍数为3 7 9 ，回收率1 1 8 1 。分别利用s d s p a g e 电泳，高效液 相色谱和生物质谱鉴定酶蛋白。 2 、酶蛋白的基本性质：质谱显示该蛋白的相对分子质量约为4 4 8 k d ，双向电泳 检测等电点为6 7 ，双倒数作图法求出酶动力学i ( i n 值为0 1 2 8m g m l 。该酶最适反应 温度和反应p h 值分别为5 0 和5 0 ，化学试剂e d t a 、s d s 和巯基乙醇强烈抑制酶活 性，而h = o ：和尿素对酶活性的抑制作用不大。 3 、经过1 l o h c i 水解蛋白质，a g i l e n tz o r b a xc 1 8 色谱柱测定氨基酸组成， 含有1 6 种常规氨基酸，对色氨酸未进行检测。蛋白电泳样品以3 一( 环己氨基) 一卜 丙磺酸( c a p s ) 为缓冲液转聚偏氟乙烯( p v d f ) 膜后，依据e d m a n 降解原理应用a b i 4 9 1 a 型氨基酸测序仪测定蛋白质n 末端序列，第一个氨基酸可能是丙氨酸( a l a ) 或 天冬酰胺( a s n ) ，第二个可能是苏氨酸( t h r ) 或缬氨酸( v a l ) ，第三个可能是苏氨 酸( t h r ) 。 4 、应用c d 光谱检测蛋白质的二级结构，当溶液中不含( n 也) ：s o 。时，q 一螺旋和 1 3 一转角分别占6 5 8 0 和3 4 2 0 ；当溶液中含有( n 地) ：s o 。盐时，一螺旋、b 一转角和 任意卷曲分别占7 9 0 、2 9 3 0 和6 2 8 0 。 关键词：聚一b 一羟基丁酸酯( p h b ) ；生物降解；p h b 解聚酶； l a b s t r a c t p o l y ( b - h y d r o x y b u t y r a t e ) ( p h b ) i s as t r u c t u r a l l ys i m p l em a c r o m o l e c u l es y n t h e s i z e d b ym a n yg r a m - p o s i t i v ea n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a a si n c l u s i o nb o d i e s 1 1 1 e p o l y m e r f u n c t i o n sa sb o t hc a r b o na n de n e r g yr e s e r v e s ，a n du s u a l l ya c c u m u l a t e su n d e ru n b a l a n c e d g r o w t hc o n d i t i o n s t h eu n i q u ef e a t u r eo f p h bi st h a ti ti sc o m p l e t e l yb i o d e g r a d a b l e , p h b h a sg a i n e dm u c ha t t e n t i o na sp o t e n t i a lr e p l a c e m e n t p o l y m e r i nt h ep l a s t i cn d u s t r y t h i si s e s p e c i a l l yi m p o r t a n t s i n c e p l a s t i c - w a s t e a c c u m u l a t i o ni nl a n d f i l l sh a sb e c o m ea n e n v i r o n m e n t a lc o n c e r n a ne x t r a c e l l u l a rp h bd e p o l y m e r a s ew a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r e s u p e m a t a n to faf u n g u sw h i c hc a nd e g r a d ep h be f f i c i e n t l y i n v e s t i g a t ei t se n z y m ea n d p r o t e i np r o p e r t i e s t h em a i n r e s u l t so b t a i n e df r o mt h i sw o r ka l ea sf o l l o w s ： 1 、u s i n gt h ef u n g u s ( p e n i c i l l i u ms p d s 9 7 0 1 - 0 9 a ) d e t e r m i n e di t sd e p o l y m e r a s e a c t i v i t ye v e r yd a y , a n di ts h o w e dt h em o s ta c t i v i t yw a si n9 6 h t h ep i - i bd e p o l y m e r a s e w a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e db yc e n t r i f u g a t i o n ，u l t r a f i l t r a t i o n ，( n h 4 ) 2 s 0 4s a l t i n go u ta n dg e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h es p e c i f i ca c t i v i t yo ft h ep u r i f i e de n z y m ew a si n c r e a s e db y 3 7 9f o l d so v e rc r u d ee x t r a c t a n dt h e r e c o v e r yy i e l d w a s1 1 8 1 t h es d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n d m a s s s p e c t r o m e t e r h a db e e nu s e dt ot e s tt h ep r o t e i n 2 、e n z y m ep r o p e r t i e s ：n em o l e c u l a r m a s so f t h e p u r i f i e de n z y m e w a se s t i m a t e dt ob e a b o u t4 4 8 k d ab ym a l d it o fm a s ss p e c t r o m e t e r , a n dp iw a s6 7b yt w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o m s i s t h ek i n e t i c so fe n z y m e - c a t a l y z e dr e a c t i o n sk m w a s0 1 2 8m g m 1 t h e o p t i m u ma c t i v i t yo fe n z y m ew a so b s e r v e d a tt h e t e m p e r a t u r e5 0 。ca n d a tp h5 0 s o m eo f t h ec h e m i c a l ss u c ha se t h y l e n ed i a m i n e t e r t r a c e t i ca c i d ( e d t a ) ，s o d i u md od e c y ls u l f a t e ( s d s ) a n dm e m a p t o e t h a n o li n h i b i t e dt h ed e p o l y m e r a s ea c t i v i t ys t r o n g l y 3 、t h e p r o t e i nw a sh y d r o l y z e da t1 1 0 b yh c l u s i n ga g i l e n tz o r b a xh p l cc 1 8 c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nt od e t e r m i n et h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o n i tc o n t a i n e d16k i n d s o fn o r m a la m i n oa c i d sa n dd i dn o t h i n g 嘶t 1 1t 印1 kn - t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c eo f h t h e p u r i f i e de n z y m e w a sd e t e r m i n e d b yu s i n g as e q u e n c ea n a l y z e r ( m o d e l4 9 1 a ；a b i ) w i t h t h em e t h o do fe d m a n sd e g r a d a t i o n t h ef i r s ta m i n oa c i dw a sa l a n i n e ( 越a ) o ra s p a r a g i n e ( a s n ) ，t h es e c o n d w a s t h r e o n i n e ( t h r ) o rv a l i n e ( v a l ) ，t h e “r dw a st h r e o n i n e ( t h r ) 4 、t h es e c o l l d a r ys t r u c t u r eo f t h e p r o t e i nw a s d e t e r m i n e db yc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r u m t h ea h e l i xa n dp - t u mw e r e6 5 8 0 a n d3 4 2 0 w h e nw i t h o u t ( n h 4 ) 2 8 0 4 t h e 一h e l i x ，b t u r na n dr a n d o m w e r e7 9 0 ，2 9 3 0 a n d6 2 8 0 w i t h c n h 4 ) 2 s 0 4 k e y w o r d s ：p o l y ( b h y d r o x y b u t y r a t e ) ( p h b ) ；b i o d e g r a d a t i o n ；p h bd e p o l y m e r a s e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名日期 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位 论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇 编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：魁鸪星：指导教师签名：! 鱼鱼士 日 期：2 z i z 笸：f 日期：兰! 竺羔! 笸! r 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话： 邮编： 引言 面对日益严重的白色污染，目前对于塑料废弃物的治理主要有填埋、回收再利 用、焚烧和降解三种方法。填埋需要更多的投资来开辟新的填埋场地，回收再利用 存在经济效益问题，而焚烧会产生二次污染，加剧温室效应。因此，研究开发塑料 降解技术，已被认为是塑料废弃物治理的一条新的技术途径。降解塑料是指在一定 使用期内具有与普通塑料同样的使用功能，而在完成它的使用功能后，其化学结构 发生重大变化，能与自然同化的一类聚合物材料。 一、降解塑料的种类n 3 降解塑料可分为光降解塑料、生物降解塑料和光生物双重降解塑料三种。其 中具有完全降解特性的完全生物降解塑料和具有双重降解特性的光生物降解塑料 是目前材料领域的研究热点。 ( 一) 光降解塑料 光降解塑料是在塑料中引入光增敏基团或加入光敏性物质，使其在吸收太阳 紫外光后引起的光化学反应，从而使塑料大分子链断裂成为小分子，最终导致性能 变差的一类塑料。按制备方法可分为共聚型和添加型两种。 1 共聚型光降解塑料 通常采用含有光增敏基团( c 0 ) 的单体或烯酮类( 如甲基乙烯酮、甲基丙烯酮) 与烯烃类单体共聚，从而可合成含有羰基结构的光降解型聚乙烯( p e ) 、聚丙烯( p p ) 、 聚氯乙烯( p v c ) 、聚苯乙烯( p s ) 、聚对苯二甲酸乙撑酯( p e t ) 等。其中以p e 类 研究较多。 2 添加型降解塑料 在塑料中添加光敏剂和其他助剂，在紫外光的作用下光敏剂吸收光后产生出具 有活性的自由基，进而引发塑料发生氧化反应，使高分子链断裂以达到降解之目的。 典型的光敏剂有过渡金属络合物( 如二硫代氨基甲酸盐) 、硬脂酸盐、卤化物( 如 n 一卤化乙内酰脲) 、羧基化合物、酮类化合物( 如二苯甲酮) 、二茂铁衍生物等。 由于光降解塑料只有在日光作用下才能降解，因此能降解为小分子化合物进入 生态循环的塑料只是极小部分，绝大部分魏料只怒逐步崩解变为磷片或者粉末，魄 许肉眼看不见，但它们长期在土壤中被微嫩物吸收的情况尚未明了。塑料废弃物部 分蠼在壤中或熬个俸力垃圾填蠼在地下融，困缺光或缺簸、缺本嚣不会黪矮，只 能将污染由可见变为不可见，而且对生态环境带来更大的潜在危害。另外由于受紫 努线强度、迪理黟境、季节气候、农佟物赫秽等因素豹铡终较大，辫解速攀缀礁控 制，使其成用受到定限制。因此，发展生物降解塑料对蹩个生物圈将有积极的意 义。近年米，国肉夕 鼹擎缝嚣竞繇解塑鞍豹研究蠢经逐步减少，焉将重点转囱生物 降解塑料和光生物降解絮料的研究上。 ( ：) 垒貔降解鋈辩 生物降解塑料是指在自然环境中通过微生物的生命活动而产生降解的一类瓿 辩。对塑料降解越作用的怒细菌、霉菌、粪菌和放线菌等微生物，引起降解的作用 形式主要肖3 种“3 ：( 1 ) 焦：物物理 乍用，出于微生物细胞靛增长对塑料材料起到物 理性的机械破坏作用；( 2 ) 生物化学作用，微生物产生的某些物质对塑料起化学作 用；( 3 ) 瓣的直接接用，微生物戆酶载本鹱是蛋黩质，藤蕉自质楚由2 0 多耱氨綦 酸组成的，氨基酸分子里除含有氨基和羧凝外，有的还含有羟基躐巯基等，这些撼 黧既霹雩# 兔电孑馁俸，也可终鸯笺受薅。它髓能秘攫糕势予羲氧分子发生吸鬻 睾爱， 这些带电质子构成了酶的催化活性中心，使被吸附的塑料分子和氧分子的反应活化 镌降低，簸嚣鸯l 遮了望辩麓生耪酶群反应。辇瓣静生匏降解主要还凝决予塑料分子 的结构和大小、微生物的种类和环境因素( 湿度、温度、p h 值及营养的可利用性等) 强3 ，所戳襁无先、离滠、大量无枫盐帮青效碳源存在静条件下，黧物降解道程易避 行。理想的生物降解塑料是一种舆宥优良的使用燃能、废弃后可被环境微生物完全 分解、最终被无机化而成为自然界中碳素循环的一个组成部分的商分子材料。众所 周知，“纸”是一j 申典型的生物降解材料，藕“合成塑料”则是典型的离分子材料。 那么，生物降解塑料是兼有“纸”和“合成塑料”这两种材料性质的高分子材料。 生糖蹲解塑辩，按童凌簿鳃过程霹分蠹寇全生毖爨辏窝生物藩l 坏凝鹳嚣类。 1 完全生物降解塑料 竞全生凌簿瓣塑料在缍蓥或箕瘩解酶俸溪下，最终分解戒e 毡帮承等貔矮目爨 自然，所以被称为“绿色耀料”。从制备方法上可分为3 种：微生物发酵法、化举 合成稻天然高分予共湛。 ( 1 ) 微生物发酵法是指以有机物为碳源，通过微生物的发酵而得到的缴 耪降解塑秘。主要淡聚羟麓脂肪酸酯类较多，聚烃基脂肪酸腊 。瞧互c o l i 却可以利用各种碳源，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、水糖等，选择便宜的底物进一步降 低了残零。圈嚣，遮建工程萤也溪骧在分子瘩乎滋露“掺穆裁剪”，人为控到产物 缁构。1 9 8 9 年i c i 公司利用d e n n i s 组建的工程茵生产的p h b 占菌体干熏8 0 以上。 受缝稳壤穗纳大学在蕴建王程大磁稃菌豹麓对零l 入热敏曦蘩体溶簇基霞，使缀麓 易裂解释放p h b ，降低了提取成本。 ( - - ) 整耱生产糯嘲 植物转基因投术不仅是生命科学基础理论研究的有力手段，同时也为实现商 效、优质、高产农业提供了捷径。利用转基日技术改庭俸物蛋自质、淀粉、脂肪的 成分，摄糍营养价值，增强植物抗逆境能力和瓜果耐贮能力，培鬻抗病虫和抗除草 6 剂的工程植株，已在农业生产中显示出了巨大的经济效益。现在已经可以利用植物 作为生物反应器生产次生代谢物质、激素、抗体和多肽活性物质。问题是目前大多 物质在转基因植物中表达量不高，且纯度远远低于微生物发酵系统。但植物系统可 以对真核蛋白进行正确的翻译后加工，形成有活性的分子，且不需要复杂的发酵产 物后加工过程，而且自身底物丰富，不需要昂贵的发酵底物，成本相对低廉。以乙 酰c o a 为底物生产p h b ，产量在理论上可以达到淀粉、油脂的水平，因此，利用转 基因植物生产p h b ，以生物降解塑料取代化学合成塑料根治“白色污染”前景乐观。 1 9 9 2 年美国科学家首次进行了植物生产p h b 的尝试，并将c a m v 3 5 s 启动子控制 的爿e u t r o p h u sp h b 合成途径中的p h b b 、p h b c 导入拟南芥菜中，并利用植物本身 的酮硫裂解酶合成了一定量的p h b ，颗粒大小形状与细菌中相似“。虽然p h b 合成 量很少，约i 0 0 l ag g f w t ，转基因植株生长却严重受阻，p h b 颗粒在胞质、液泡， 甚至核内出现，但质体内不存在。p h b b 、p h b c 基因缺少特异性表达的信号，应该在 胞质内表达。而液泡、核中却有p h b 颗粒存在，表明p h b 颗粒可能可以穿越液泡膜、 核膜。胞质内乙酰c o a 含量少，并生成丙二酰c o a 、乙酰乙酰c o a ，这些都是植物 体内重要化合物类黄酮、植物激素、甾醇等内源生成物的前体。p h b 的合成竞争乙 酰c o a ，同时核内p h b 颗粒的存在有可能干扰核的正常功能。z e n e c as e e d s 公司科 研人员在油菜中重复以上试验，结果植株生长发育受阻，p h b 含量很低。这一阶段 产物分析表明，p h b 合成量还不足以进行生化分析，通过细胞悬浮培养后分析发现， 植物中产生的p h b 与细菌合成的p h b 在化学结构、物理性质上均相同。 s o m e r v i l l e s 小组于1 9 9 4 年改进了策略，将p h b 定位于质体“3 、“3 。质体中富含 乙酰c o a ，而且质体内可容纳大量淀粉，暗示着同样可以贮存大量的p h b 。他们分 别在p h b b 、p h b a 、p h b c 基因上连入一段编码豌豆叶绿体r u b i s c o 小亚基转运肽的 d n a 片断，将表达产物定位于质体，通过杂交手段将三个基因在同一株拟南芥菜中 表达。结果p h b 累积量高达干重的1 4 ，而且转基因植株发育正常。第一代含p h b 基因的转基因植物中，质体中没有p h b 产物，表明p h b 颗粒不能穿过质体双层膜。 因此将p h b 定位于质体的另一个优点就是不会造成p h b 的泄漏而干扰植物的正常生 理功能，也不会阻碍一些内源机制的运转。但是研究发现植株幼叶成长期p h b 含量 超过3 0 0 4 0 0ug g f w t 时，在后期( 5 0 6 0 天后) 叶片有轻微的黄化现象。p h b 颗粒积累太多可能对叶绿体的正常功能有不利的影响。有趣的是在扩展叶中，并非 所有叶绿体累积p h b ，而老叶中几乎所有叶绿体都含有p h b ，且老叶中p h b 的水平 是扩展叶的8 1 3 倍。英国z e n i c a 公司将p h b a 、p h b b 、p h b c 基因导入了油菜，利 用r u b i s c o 小亚基转运肽将三个基因定位于叶绿体中表达，提高了产量。美国 m o n s a n t o 公司的科研人员正在同时进行转基因油菜和大豆生产p h b 的研究。 图2 在胞质和质体中分别表达p h b 合成途径 淀粉类作物的产量一般比较高，块茎或块根往往作为贮藏器官，非再生所必需。 向马铃薯、甘薯、萝h 等作物中移植p h b 合成途径，可以在块茎或块根中合成p h b 。 但是淀粉的合成是以蔗糖而非乙酰c o a 作为底物，因而碳源向p h b 流动的途径不很 清楚。德国t r e t h e w e y 利用马铃薯在块茎的胞质和线粒体中合成p h b “”，正在进行 代谢调节的研究，试图负调节淀粉合成途径使碳源向p h b 合成途径流动。将p h b 定 位于线粒体中合成，很可能是同糖酵解和三羧酸循环途径整合在一起。降低淀粉的 形成可以通过抑制淀粉合成的关键酶a d p g l u c o s e 焦磷酸化酶来实现。利用反义技 术来抑制淀粉合成，淀粉含量可降到野生型的5 ，蔗糖的含量因此而增加。 然而，合成p h b 的最佳部位是油料作物的种子。种子中贮存脂类可达干重的4 4 ， 乙酰c o a 含量特别高。将p h b 产物限定在特定的组织及特定的生长阶段，避免了p h b 产物对植物整个生长发育的不利影响。p h b 的收获也会相应简化。油料作物中脂肪 酸代谢途径与p h b 的合成途径的底物都是乙酰c o a ，p h b 产量的提高可以通过直接 调节脂肪酸代谢途径实现。相反，淀粉作物中淀粉的合成是以蔗糖为底物的，碳源 向p h b 流动的途径不很清楚，而且淀粉作物中p h b 的提取要比油料作物困难得多。 n a w r a t h 等“”从拟南芥的1 2 s 种子特异性贮藏蛋白的c r b 基因中分离出c r b 启动子， 将p h b 关键酶的表达定位于种子的胚中。 8 p a d g e t t e 等“。在研究转基因植物生产p h b 的同时将植物生产共聚物p h b v 也摆 上了日程。他们超表达了苏氨酸脱氨酶以增加苏氨酸向b 一丁酮酸的转化。内源丙 酮酸脱氢酶会将b 一丁酮酸转化为丙酰c o a 进而生成p h b v 。但从a e u t r o p h u s 中克 隆的p h b a 基因不能有效地将丙酰c o a 和乙酰c o a 合成b 一酮戊酰c o a 。他们又从 a e u r o p h u s 中克隆了另一个b 一酮硫裂解酶的基因，这个基因产物可以有效地合成 b 一酮戊酰c o a 。 ( 四) 咖的合成途径及关键酶的基因克隆 p h b 可以作为许多细菌的碳源、能源物质，而且p h b 的积累可以增强细菌对紫 外线、干燥、渗透胁迫等恶劣因子的抵抗力。有些细菌在碳源丰富而缺乏某种营养 成分如n 、p 、k 、m g 、0 或s 时累积p h b ，如a e u r u o h p u sp r o t o m o n a se x t o r q u e n s p s e u d o m o n a so j e o v o t a n s 等。有些细菌不需要限定某种营养成分就可以累积p h b ， 如a a t u s 及含有a e u t r o p h u sp h a 合酶的重组ec o l i 。p h b 的合成途径主要有两 条，三步合成途径和五步台成途径“”。 大多数微生物如ae u t r o p h u s ，a z o t o b a c t e rb e j e r i n k i i ，z o o g l o e ar a m i g e r a 等通过三步代谢途径合成p h b 。第一步：b 一酮硫裂解酶催化乙酰c o a 生成乙酰乙酰 c o a ；第二步：在依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶的作用下把乙酰乙酰c o a 还原成 d 一( 一) 一3 一羟基丁酰c o a ；第三步：单体的d 一( 一) 一3 - 羟基丁酰c o a 由p h b 合酶催 化聚合生成p h b 。其中b 一酮硫裂解酶受游离辅酶a 的强烈抑制。在非胁迫条件下， 游离辅酶a 含量高因而抑制了b 一酮硫裂解酶的合成，同时阻碍了p h b 的积累。当 能源物质充足而缺乏某种营养成分时游离辅酶a 含量可能很低，b 一酮硫裂解酶执 行催化功能，p h b 就可以顺利合成。在a e u t r o p h u s 中同时存在五步合成途径。首 先，f 3 一酮硫裂解酶催化乙酰c o a 生成乙酰乙酰c o a ；其次，依赖n a d p h 的乙酰乙酰 c o a 还原酶催化l 一( + ) 一3 - 羟基丁酰c o a 的形成；l 一( + ) 一3 - 羟基丁酰c o a 经过两 个立体专一的烯酰基c o a 水合酶先后作用而转变成d 一( 一) 一3 - 羟基丁酰c o a ，最后 聚合生成p h b 。 现己从二十多种细菌中克隆到p h a 聚合酶基因，其中从a e u t r o p h u s 中分离的 p h b 合成关键酶的策略和方法最为典型。有三个实验室分别采用不同的策略从 卅e u t r o p h u s 中分离到包含p h b a ( b 一酮硫裂解酶) 、p h b b ( 依赖n a d p h 的乙酰乙酰 c o a 还原酶) 和p h b c ( p h b 合酶) 的d n a 片段。d e n n i s 等通过部分酶切a e u t r o p h u s h 1 6 的基因组d n a 建立一个c o s m i d 文库，通过分析克隆的b 一酮硫裂解酶活性，进 一步找到同时表达依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶和p h b 合酶的克隆；s c h u b e r t 等利用转座获得p i t b 阴性突变体，克隆t n 5 ：m o b 的e c o r i 酶切限制性片段从 l 4 7 9 基因文库中获得完整基因；p e o p l e s 和s i n s k e y 等用从zr a m i g e r a 分离到的酮硫裂 解酶基因作为异源探针从建立的p u c 文库中筛选到三个基因，他们还通过 a e u t r o p h u s h l 6p h b 阴性突变体的结合互补分离到这三个基因。p h b a 基因( 1 2 k b ) 编码一个4 1 k d 蛋白，3 一酮硫裂解酶由四个4 1 k d 亚基组成。p h b b 基因( 7 6 0 b p ) 编 码一个2 6 k d 蛋白，依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶由四个2 6 k d 亚基组成。p h b c 基因( 1 8 k b ) 编码一个6 5 k d 蛋白，其亚基数目前还不清楚。a e u t r o p h u s 中合成 p h b 的三个基因位于同一个操纵子上，由共同的启动子调控表达。现在三个基因已 被克隆到大肠杆菌及其它菌株中，进而获得可利用不同底物的菌株生产p h i ) 。 p h b 合酶是控制p h b 合成的最关键酶 1 8 3 , 但此酶难于纯化且纯化后不稳定。 g e r n g r o s s 等成功地从重组叵c 0 1 1 中提纯此酶至同质状态。研究表明，p h b 合酶的 结构特性类似脂肪酸合酶，活性中心位于3 1 9 位的半胱氨酸上。根据p h a 合酶的一 级结构及其底物特异性可将其分为三类“：第一类是催化合成短链p h a s 的合酶， 如a e u t r o p h u s 的合酶，此类合酶有3 7 3 9 的氨基酸同源性；第二类是催化中等 链p e a s 的合酶，如尸o l e o v o r h n s 和只p u t i d a 的合酶，两者的氨基酸同源性为5 4 5 8 ；第三类合酶是在c h r o m a t i u mv l n o s u m 和t h j o c a p s av i o l a c a e 中发现的，氨 基酸组成与前两类相比只有2 1 2 7 的同源性，这类p h b c 基因编码的蛋白链比前 两类短3 5 4 0 。 ( 五) 咖的降解及娜解聚酶 p h b 能为土壤及海水中存在的许多微生物所降解。一般在厌氧污水中降解最快， 在海水中降解最慢。酶解机制可分为两步，第一步是p h b 表面的一o h 和一c o o h 基团 数量增加。第二步是细菌解聚反应，酶将高聚物降解成单体，较低的p h 能阻止聚 合物的分解。假单胞菌的解聚酶可将p h b 降解为3 h b 单体、二聚体和三聚体从而进 入细胞参与代谢。3 h b 二聚体进入细胞内，诱导该假单胞菌产生并释放更多的p h b 解聚酶。色谱分析表明p h b 分解产物有b 一羟丁酸、乙酰乙酸和少量乙酸。有氧情 况下，除产生极少b 一羟丁酸外，大多被氧化为二氧化碳和水。 a f a e c a l i s ，p s e u d o m o n a s e m o i g n e ，c o m a m o n a sa c i d o v o r a n s ， ct e s t o s t e r o n ，p a e c i l o m y c e “i l a c i n u s 等都可以向培养基中分泌p h b 解聚酶， 而且从同一种菌的培养基中又可以分离到几种不同的解聚酶。解聚酶蛋白质结构主 要由三个部位组成，催化部位( c 域) 、纤连蛋白型组件类似部位( f 域) 、底物 结合部位( s 域) 。此外还存在一个分泌解聚酶所需的信号肽。f 域连接催化部位和 底物结合部位由9 0 个氨基酸组成，这一区域也与真核细胞外基质蛋白类似。在 p l e m o i g n e i 的五种解聚酶中四种含有一富含苏氨酸的区域，而在c o m a m o n a ss p 1 0 解聚酶中却不存在。n o j i r i 等利用a f n e o a l i s 的解聚酶组建结构域缺失、倒位、 嵌合及额外f 域突变体，发现缺失f 域后解聚酶水解活性丧失。重组结构域以 p e m o i g n e f 解聚酶的富苏氨酸域代替f 域及组建额外f 域获得突变体，p h b 水解 活性及p h b 结合活性都和野生型相同。 当以p ( 3 h b ) 、p ( 3 h b c o 一3 h v ) 等作为唯一底物时，ca c i d o v o r a n s 就可以向 培养基中分泌p h b 解聚酶，从n e i d o v o r a n s 基因组文库克隆到此基因，编码4 9 4 氨基酸的蛋白质( m i v 5 1 0 1 8 ) ，成熟酶分子量为4 8 6 2 8 ，包括c 域、f 域和s 域三部 分。几种解聚酶的基因已被克隆到c o l i 中，如t e s t o s t e r o n i ， a ，a e c a l f s 等。在ec o l i 中表达的p h b 解聚酶催化性质与野生型p h b 解聚酶基本相同。序列 分析表明，a f a e c a l i sp h b 解聚酶基因为1 9 0 5 b p ，6 3 5 个氨基酸残基，分子量6 5 2 0 8 ， 与其它的p h b 解聚酶相比底物结合部位分为两部分，与p h b 专一结合的部分和与p h v 专一结合的部分，两部分有一连接区域相连。 不同种类的p h a s 随其中船和 v 的比例不同物理特性也相应变化。p ( 3 h b c o 一4 h b ) 共聚物中4 h b 由4 0 增至1 0 0 ，拉伸强度从1 7 增加到i 0 4 m p a ，p f i b 解聚酶分解共聚物的速率却随h b 的上升而降低。m u k a i 等采用三种p h b 解聚酶来分 解不同的共聚物p ( 3 h b c o 一4 h b ) 、p ( 3 h b ) 和p ( 3 h b c o 一4 h v ) 。两种解聚酶来自 尸l e m o i g n e i 的培养上清，另一种来自f a e c a i i st 1 。结果发现三种解聚酶酶解 趋势十分相似，但p ( 3 h b c o 一4 h b ) 的降解速率最快，p ( 3 h b c o 一4 h v ) 降解最慢。 三、本论文的工作目的 p h b 是一种胞内的贮存物质，但当它被从细胞中分离出来后，其状态发生很大 变化，由原来的非晶体变为结晶度6 0 以上的半晶态，其生物降解特性发生巨大变 化。因此，在开发p h b 生物合成和应用的同时，研究其生物降解特性及过程显得十 分重要。但关于p h b 降解菌的分离及鉴定方面报道甚少，并且仅是对于原始菌株降 解特性的研究。对高产菌降解酶的研究更是少有报道。本项研究采用诱变后获得的 高效降解p h b 的青霉为实验菌株，发酵后提取p h b 胞外解聚酶，并对其酶学性质进 行较深入的研究，旨在为进一步开展分子生物学方面的研究及p h b 产品的应用与开 发奠定理论基础。 一、实验材料与方法 1 1 实验材料 1 - 1 1 菌株来源 青霉( p e n i c i l l i u ms p ) ，编号d s 9 7 0 1 0 9 a ，为东北师范大学微生物研究室保藏菌 株。 1 1 2 聚3 - 羟基丁酸醴( 咖) 由中科院北京微生物所提供，是由微生物发酵的白色粉末，熔点1 7 3 8 0 c ，相对 分子质量7 3 l x l 0 5 。 1 2 培养基( w v ) p h b 0 1 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 ，n h 4 c l0 1 ，c a c l 2 2 h 2 0o 0 0 0 5 ，k h 2 p 0 4 0 5 5 4 ，n a 2 p 0 4 1 2 h 2 01 1 9 4 ，p h6 8 。 1 3 酶活的测定( 比浊法) 1 3 1 舳悬浮液的制备p 司 将p h b 粉末溶于氯仿中，所得溶液与十二烷基磺酸钠溶液混合，混合液经超声 波处理5 r a i n ，制得p h b 乳化液，7 5 加热9 0 r a i n 除去氯仿，得到p h b 悬浮液。 1 3 2 酶活测定及酶活单位定义7 7 棚1 以p h b 为底物，用分光光度计测定p i - i b 降解酶活力。取3 m l 悬浮液置于4 0 恒温水浴，待温度平衡后加入一定量的酶液，反应3 0 m i n 后，于6 5 0 h m 波长下测其光 吸收( 降低) 。 一个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收降低0 0 0 1 ( a 6 5 0 n m ) 单位所需的酶 量。 1 4 发酵液酶活高峰的检测 将活化后的菌株接种至装有液体培养基的三角瓶中，置2 5 。c 摇床振荡培养， 1 1 0 r m i n ，分别于第2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 ，1 2 0h 取出发酵液，4 c ，1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n 除去菌丝体，倾出上清液，检测p h b 解聚酶的活力。 1 5 酶的分离纯化方法o “7 2 ”i ”1 1 5 1 酶液的制备 经9 6 h 发酵后的5 0 0 0 m l 发酵液于4 c 、1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n ，弃取沉淀，上清 液经滤纸过滤后即为粗酶液。 1 2 1 5 2 超滤浓缩 根据分子量大小，使用超滤膜( 截留分子量1 0 0 0 0 ) 超滤浓缩。 1 5 3 盐析 在搅拌条件下，缓慢向浓缩粗酶液中加入( n h 4 ) 2 s 0 4 粉末至3 5 - - 4 0 饱和度， 静止过夜，4 c ，1 2 0 0 0 g 离心3 0r a i n ，弃去沉淀。在上清液中继续添加( n i - h ) 2 s 0 4 粉末至7 0 饱和度，静止过夜，4 c ，1 2 0 0 0 g 离心3 0m i n ，沉淀即为粗酶。 1 5 4 透析脱盐 将沉淀物用1 0 r a mh a c - n a a c ( p h = 5 o ) 缓冲液 含1 s m ( n h 4 ) 2 s 0 4 溶解， 装入透析袋中，4 c 下对蒸馏水透析4 8 h ，中间换水数次，用b a c l 2 检查s 0 4 2 。，直至 透析液中无沉淀为止。 1 5 5 冷冻干燥 将透析脱盐后的酶液经冷冻干燥，储存于一2 0 冰箱中。 1 5 6 s e p h a d e xg - 1 0 0 凝胶色谱 用l o m m h a c - n a a c ( p h = 5 o ) 缓冲液 含1 5 m ( n h 4 ) 2 s 0 4 平衡s e p h a d e x g 1 0 0 柱，然后将冷冻干燥后的酶溶于同样的缓冲液中上柱分离，洗脱液与平衡用缓冲液相 同，流速8 m l h ，分部收集洗脱液，每管4 m l ，于2 8 0 n m 自动监测，记录洗脱液的吸 收值变化。 1 6 蛋白单一性检测哑“朝 1 6 1 电泳检测 采用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - - p a g e ) 法。采用不连续垂直板电泳系统， 分离胶浓度1 2 ，浓缩胶浓度5 ，采用t r i s - h e l 缓冲体系。考马斯亮蓝r 2 5 0 染色。 1 6 2 高效液相色谱检测 t s kg 3 0 0 0 p w s 分析柱，以纯水为流动相，检测蛋白图谱。 1 6 3 质谱检测 应用v o y a g e r d es t rm a l d it o fm a s ss p e c t r o m e t e r ( 激光解吸电离飞行时间 质谱仪) ，基本参数如下： m o d eo fo p e r a t i o n ：l i n e a rl a s e rr e pr a t e ：2 0 0 h z p o l a r i t y ：p o s i t i v e c a l i b r a t i o nm a t r i x ：s i n a p i n i ca c i d a c c e l e r a t i n gv o l t a g e ：2 5 0 0 0 v g r i dv o l t a g e ：9 0 g u i d ew i r e0 ：0 1 5 e x t r a c t i o nd e l a yt i m e ：7 5 0n s e c a c q u i s i t i o n m a s sr a n g e ：5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 d a n u m b e ro fl a s e rs h o t s ：10 0 s p e c t r u m l a s e ri n t e n s i t y ：2 6 6 7 1 3 1 7 酶的k m 的测定( 双倒数作图法) 配置不同底物浓度的p h b 悬浮液，求出各浓度下的反应初速度。再采用双倒数 作图法以1 v 对1 s 作图。 1 8 酶的最适反应温度的测 【删 将p h b 悬浮液分别置于2 0 c 、2 8 。c 、3 5 。c 、4 0 c 、4 5 、5 0 。c 、5 5 。c 、6 0 c 、 6 5 。c 、7 0 c 的水浴中预热1 0 m i n ，然后加入一定量的酶液，保温3 0 m i n ，以蒸馏水做 空白对照。测定酶液在不同反应温度下的酶活力单位。 1 9 酶的最适反应p h 的测定”m 配置1 0 种从p h 3 6 - 1 0 0 的不同p h 的p h b 悬浮缓冲液( p h3 6 5 0 乙酸一乙酸 钠缓冲液，p h 5 8 - 8 0 磷酸盐缓冲液，p h8 6 - 1 0 0 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液) ，再用 p h 计校正，以保证溶液的p h 值。将一定量的酶液加入不同p h 值的p h b 悬浮缓冲液 中，构成一系列酶反应体系，于4 0 测酶活性，绘制酶活性州曲线，找出所对应 的p h 值，即为该酶的最适反应p h 值。